TW202043262A - 針對含有g12r突變之ras之hla第ii類限制性t細胞受體 - Google Patents

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瑪麗亞 Ｒ 帕克赫斯特
安娜 帕塞托
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Abstract

本發明揭示一種經分離或經純化之T細胞受體(TCR)，其中該TCR對於在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性。亦提供相關多肽及蛋白質，以及相關核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群體及醫藥組合物。亦揭示檢測哺乳動物中癌症存在之方法，及治療或預防哺乳動物之癌症的方法。

Description

針對含有G12R突變之RAS之HLA第II類限制性T細胞受體
一些癌症可具有極有限之治療選擇，尤其在癌症變得轉移及不可切除時。儘管在諸如手術、化學療法及輻射療法等治療中取得一定進展，但許多癌症(例如胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌及前列腺癌)之預後可能較差。因此，存在對於其他癌症治療之未滿足需求。
本發明之一實施例提供經分離或經純化T細胞受體(TCR)，其中TCR對在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性，其中突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列，且   其中位置12分別係參照野生型(WT)人類KRAS蛋白、WT人類HRAS蛋白或WT人類NRAS蛋白所定義。
本發明之另一實施例提供包括本發明TCR之功能部分之經分離或經純化多肽，其中該功能部分包括以下胺基酸序列：(a) SEQ ID NO: 1-3之全部、(b) SEQ ID NO: 4-6之全部、(c) SEQ ID NO: 7-9之全部、(d) SEQ ID NO: 10-12之全部、(e) SEQ ID NO: 1-6之全部或(f) SEQ ID NO: 7-12之全部。
本發明之再一實施例提供包括至少一種本發明多肽之經分離或經純化蛋白質。
本發明實施例另外提供與本發明TCR、多肽及蛋白質相關之核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群體及醫藥組合物。
本發明之一實施例提供自5’至3’包括第一核酸序列及第二核苷酸序列之經分離或經純化核酸，其中第一及第二核苷酸序列分別編碼以下SEQ ID NO之胺基序列：13及14；14及13；15及16；16及15；30及31；31及30；32及33；33及32；34及35；35及34；36及37；37及36；41及42；42及41；43及44；44及43；45及46；46及45；47及48；48及47；49及50；50及49；51及52；或52及51。
本發明實施例另外提供檢測哺乳動物癌症之存在之方法、治療或預防哺乳動物之癌症之方法、誘導哺乳動物中針對癌症之免疫反應之方法、產生表現對SEQ ID NO: 39之肽具有抗原特異性之TCR之宿主細胞之方法及產生本發明TCR、多肽及蛋白質之方法。
相關申請案之交叉參考
本專利申請案主張2019年1月22日提出申請之美國臨時專利申請案第62/795,203號之權益，該申請案之全部內容以引用方式併入本文中。 關於聯邦政府資助之研究或研發之聲明
本發明係在政府支持下以項目編號ZIABC010984由國立衛生研究院(National Institutes of Healthy)/國家癌症研究院(National Cancer Institute)獲得。政府擁有本發明之某些權利。 以電子方式所提交材料之引用性併入
與本文同時提交且鑑別如下之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表之全部內容以引用方式併入本文中：一個名稱為「741425_ST25.txt」之74,093位元組ASCII (文本)檔案，日期2020年1月15日。
RAS家族蛋白屬小GTPase之大家族。不受限於特定理論或機制，據信，在突變時，RAS蛋白可參與許多人類癌症之腫瘤形成早期之信號轉導。單一胺基酸取代可活化蛋白質。突變RAS蛋白產物可組成型活化。突變RAS蛋白可表現於各種人類癌症(例如胰臟癌(例如胰臟癌瘤)、結腸直腸癌、肺癌(例如肺腺癌)、子宮內膜癌、卵巢癌(例如上皮卵巢癌)及前列腺癌)中之任一者中。人類RAS家族蛋白包含KRAS、HRAS及NRAS。
KRAS亦稱為GTPase KRas、V-Ki-Ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因或KRAS2。存在KRAS之兩種轉錄變體：KRAS變體A及KRAS變體B。WT KRAS變體A具有SEQ ID NO: 17之胺基酸序列。WT KRAS變體B具有SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。在下文中，除非另外指定，否則所提及之「KRAS」 (突變或未突變(WT))係指變體A及變體B二者。在活化時，突變KRAS結合至5'-三磷酸鳥苷(GTP)且將GTP轉化成5'-二磷酸鳥苷(GDP)。
HRAS係RAS蛋白家族之另一成員。HRAS亦稱為Harvey大鼠肉瘤病毒致癌蛋白、V-Ha-Ras Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物或Ras家族小GTP結合蛋白H-Ras。WT HRAS具有SEQ ID NO: 19之胺基酸序列。
NRAS係RAS蛋白家族之再一成員。NRAS亦稱為GTPase NRas、V-Ras神經母細胞瘤RAS病毒致癌基因同系物或NRAS1。WT NRAS具有SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
本發明之一實施例提供經分離或經純化TCR，其中TCR對在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性，其中突變人類RAS胺基酸序列係突變人類KRAS、突變人類HRAS或突變人類NRAS胺基酸序列，且其中位置12分別係參照WT人類KRAS蛋白、WT人類HRAS蛋白或WT人類NRAS蛋白所定義。在下文中，除非另外指定，否則所提及之「TCR」亦係指TCR之功能部分及功能變體。
突變人類RAS胺基酸序列可為突變人類KRAS胺基酸序列、突變人類HRAS胺基酸序列或突變人類NRAS胺基酸序列。WT人類KRAS、NRAS及HRAS蛋白之胺基酸序列各自具有188或189個胺基酸殘基之長度且彼此具有高度一致性。舉例而言，WT人類NRAS蛋白之胺基酸序列與WT人類KRAS蛋白之胺基酸序列86.8%一致。WT人類NRAS蛋白及WT人類KRAS蛋白之胺基酸殘基1-86 100%一致。WT人類HRAS蛋白之胺基酸序列與WT人類KRAS蛋白之胺基酸序列86.3%一致。WT人類HRAS蛋白及WT人類KRAS蛋白之胺基酸殘基1-94 100%一致。在下文中，除非另外指定，否則所提及「RAS」 (突變或未突變(WT))共同地係指KRAS、HRAS及NRAS。
在本發明之一實施例中，突變人類RAS胺基酸序列包括在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之人類RAS胺基酸序列，其中位置12係參照相應WT RAS蛋白所定義。WT RAS蛋白可為WT KRAS蛋白(SEQ ID NO: 17或18)、WT HRAS蛋白(SEQ ID NO: 19)或WT NRAS蛋白(SEQ ID NO: 20)中之任一者，此乃因如上文所闡釋，WT人類NRAS蛋白及WT人類KRAS蛋白之胺基酸殘基1-86 100%一致，且WT人類HRAS蛋白及WT人類KRAS蛋白之胺基酸殘基1-94 100%一致。因此，WT KRAS、WT HRAS及WT NRAS蛋白中之每一者之位置12之胺基酸殘基相同，亦即甘胺酸。
突變人類RAS胺基酸序列在位置12之甘胺酸經精胺酸取代。就此而言，本發明實施例提供對含有G12R突變之任一人類RAS蛋白、多肽或肽胺基酸序列具有抗原特異性之TCR。
RAS之突變及取代在本文中係參照相應WT RAS蛋白之胺基酸序列所定義。因此，RAS之突變及取代在本文中係參照以下形式所闡述：存在於WT RAS蛋白中之特定位置(亦即位置12)之胺基酸殘基，隨後係位置編號，隨後係在所論述特定突變或取代中代替該殘基之胺基酸殘基。RAS胺基酸序列(例如RAS肽)可包括少於全長WT RAS蛋白之所有胺基酸殘基之胺基酸殘基。因此，位置12在本文中係參照WT全長RAS蛋白(亦即SEQ ID NO: 17-20中之任一者)所定義，且應理解，相應殘基在RAS胺基酸序列之特定實例中之實際位置可有所不同。在位置係根據SEQ ID NO: 17-20中之任一者所定義時，術語「G12」係指通常存在於SEQ ID NO: 17-20中之任一者之位置12之甘胺酸，且「G12R」指示，通常存在於SEQ ID NO: 17-20中之任一者之位置12之甘胺酸由精胺酸代替。舉例而言，在RAS胺基酸序列之特定實例係(例如) TEYKLVVVGAG GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 25) (對應於SEQ ID NO: 17之鄰接胺基酸殘基2至24之實例性WT KRAS肽)時，「G12R」係指SEQ ID NO: 25中之加下劃線甘胺酸經纈胺酸取代，但 SEQ ID NO: 25中之加下劃線甘胺酸之實際位置係11。含有G12R突變之人類RAS胺基酸序列在下文中稱為「G12R RAS」。
含有G12R突變之全長RAS蛋白之實例陳述於下文表1中。 表1
突變全長 RAS 蛋白 SEQ ID NO:
G12R KRAS變體A 21
G12R KRAS變體B 22
G12R HRAS 23
G12R NRAS 24
在本發明之一實施例中，TCR對上文所闡述含有G12R突變之RAS肽具有抗原特異性，其中G12R RAS肽具有任一長度。在本發明之一實施例中，G12R RAS肽具有任一適於結合至本文所闡述之任一HLA第II類分子之長度。舉例而言，TCR可對含有G12R突變之RAS肽具有抗原特異性，該RAS肽具有約11至約30個胺基酸殘基、約12至約24個胺基酸殘基或約18至約20個胺基酸殘基之長度。G12R RAS肽可包括突變RAS蛋白中包含G12R突變之任何鄰接胺基酸殘基。在本發明之一實施例中，TCR可對含有G12R突變之RAS肽具有抗原特異性，該突變RAS肽具有以下長度：約30個胺基酸殘基、約29個胺基酸殘基、約28個胺基酸殘基、約27個胺基酸殘基、約26個胺基酸殘基、約25個胺基酸殘基、約24個胺基酸殘基、約23個胺基酸殘基、約22個胺基酸殘基、約21個胺基酸殘基、約20個胺基酸殘基、約19個胺基酸殘基、約18個胺基酸殘基、約17個胺基酸殘基、約16個胺基酸殘基、約15個胺基酸殘基、約14個胺基酸殘基、約13個胺基酸殘基、約12個胺基酸殘基、約11個胺基酸殘基或前述值中之任兩者之範圍。可由本發明TCR識別之含有G12R突變之具體肽之一實例係MTEYKLVVVGAR GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 39)。在本發明之一實施例中，TCR對SEQ ID NO: 39之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性。在本發明之一實施例中，TCR對SEQ ID NO: 40之野生型人類RAS胺基酸序列不具有抗原特異性。
在本發明之一實施例中，本發明TCR能夠識別由HLA第II類分子呈現之G12R RAS。就此而言，TCR可在結合至HLA第II類分子背景內之G12R RAS時誘發免疫反應。本發明TCR能夠識別由HLA第II類分子呈現之G12R RAS且可結合至除G12R RAS外之HLA第II類分子。
在本發明之一實施例中，HLA第II類分子係HLA-DR異二聚體。HLA-DR異二聚體係包含α鏈及β鏈之細胞表面受體。HLA-DR α鏈係由HLA-DRA基因編碼。HLA-DR β鏈係由HLA-DRB1基因、HLA-DRB3基因、HLA-DRB4基因或HLA-DRB5基因編碼。由HLA-DRB1基因編碼之分子之實例可包含(但不限於) HLA-DR1、HLA-DR2、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR5、HLA-DR6、HLA-DR7、HLA-DR8、HLA-DR9、HLA-DR10、HLA-DR11、HLA-DR12、HLA-DR13、HLA-DR14、HLA-DR15、HLA-DR16及HLA-DR17。HLA-DRB3基因編碼HLA-DR52。HLA-DRB4基因編碼HLA-DR53。HLA-DRB5基因編碼HLA-DR51。在本發明之一實施例中，HLA第II類分子係HLA-DRB5:HLA-DRA異二聚體。在一尤佳實施例中，HLA第II類分子係由HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01等位基因(亦即HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體)表現。
在本發明之另一實施例中，HLA第II類分子係HLA-DQ異二聚體。HLA-DQ異二聚體係包含α鏈及β鏈之細胞表面受體。HLA-DQ α鏈係由HLA-DQA1基因編碼。HLA-DQA1等位基因可包含DQA1*01:01、DQA1*01:02、DQA1*01:03、DQA1*01:04、DQA1*02:01、DQA1*03:01、DQA1*03:02、DQA1*03:03、DQA1*04:01、DQA1*05:01、DQA1*05:05及DQA1*06:01。HLA-DQ β鏈之由HLA-DQB1基因編碼。HLA-DQB1等位基因可包含HLA-DQB1*02:01、HLA-DQB1*02:02、HLA-DQB1*02:03、HLA-DQB1*03:01、HLA-DQB1*03:02、HLA-DQB1*03:03、HLA-DQB1*03:04、HLA-DQB1*03:05、HLA-DQB1*04:01、HLA-DQB1*04:02、HLA-DQB1*05:01、HLA-DQB1*05:02、HLA-DQB1*05:03、HLA-DQB1*05:04、HLA-DQB1*06:01、HLA-DQB1*06:02、HLA-DQB1*06:03、HLA-DQB1*06:04、HLA-DQB1*06:05及HLA-DQB1*06:09。在本發明之一實施例中，HLA第II類分子係HLA-DQA1:HLA-DQB1異二聚體。在一尤佳實施例中，HLA第II類分子係由HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01等位基因(亦即HLA-DQA1*05:05: HLA-DQB1*03:01異二聚體)表現。
本發明之TCR可提供多種優點中之任一者或多者，包含在由細胞表現時用於接受性細胞轉移。G12R RAS係由癌細胞表現且未由正常、非癌性細胞表現。不受限於特定理論或機制，據信，本發明TCR有利地破壞癌細胞且同時最小化或消除正常、非癌性細胞之破壞，由此減小(例如藉由最小化或消除)毒性。此外，因G12R突變可能發生於腫瘤形成早期，故G12R RAS突變可表現於實質上所有患者癌細胞上。本發明TCR可有利地且成功地治療或預防不對其他類型治療(例如化學療法、手術或輻射)具有反應之G12R RAS陽性癌症。另外，本發明TCR可高度親合性地識別G12R RAS，此可使得能夠識別未操縱腫瘤細胞(例如未進行以下處理之腫瘤細胞：經干擾素(IFN)-γ處理、經編碼G12R RAS及HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01中之一或兩者、G12R RAS及HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01中之一或兩者之載體轉染、經G12R RAS肽脈衝化或其組合)。此外，HLA-DRB5*01等位基因以約18%之頻率表現於人類群體中，且HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01以約11%表現於美國高加索種族人中。因此，本發明TCR可增加免疫療法合格癌症患者之數量以包含彼等表現HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01等位基因及HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01等位基因中之一或兩者且可能不適用於使用識別由其他MHC分子所呈現G12R RAS之TCR之免疫療法的患者。基於在美國各種癌症中之HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01及HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01等位基因之頻率及G12R RAS表現之估計，據估計，每年有大於約1000名胰臟癌患者潛在地適用於使用一種本發明TCR之治療。舉例而言，KRAS G12R突變表現於大於約8%之胰臟癌患者中。
本文所用之片語「抗原特異性」意指，TCR可以高親合力特異性結合至且免疫性識別G12R RAS。舉例而言，在與(a)經低濃度G12R RAS肽(例如約0.05 ng/mL至約10 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、8 ng/mL、10 ng/mL或由前述值中之任兩者界定之範圍)脈衝化之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞或(b)引入編碼G12R RAS之核苷酸序列以便表現G12R RAS之靶細胞之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞一起共培養後，若約1 × 104 至約1 × 105 個表現TCR之T細胞分泌至少約200 pg/mL或更多(例如200 pg/mL或更多、300 pg/mL或更多、400 pg/mL或更多、500 pg/mL或更多、600 pg/mL或更多、700 pg/mL或更多、1000 pg/mL或更多、5,000 pg/mL或更多、7,000 pg/mL或更多、10,000 pg/mL或更多、20,000 pg/mL或更多或由前述值中之任兩者界定之範圍)之IFN-γ，則TCR可考慮對G12R RAS具有「抗原特異性」。在與經較高濃度G12R RAS肽脈衝化之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞一起共培養後，表現本發明TCR之細胞亦可分泌IFN-γ。HLA第II類分子可為本文所闡述之任一HLA第II類分子(例如HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體)。
替代地或另外，在與(a)經低濃度G12R RAS肽脈衝化之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞或(b)引入編碼G12R RAS之核苷酸序列從而靶細胞表現G12R RAS之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞一起共培養後，若與由陰性對照表現之IFN-γ量相比表現TCR之T細胞分泌至少兩倍多之IFN-γ，則TCR可視為對G12R RAS具有「抗原特異性」。陰性對照可為(例如) (i)表現TCR且與(a)經相同濃度之不相關肽(例如具有來自G12R RAS肽之不同序列之一些其他肽)脈衝化之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞或(b)引入編碼不相關肽之核苷酸序列以便靶細胞表現不相關肽之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞一起共培養的T細胞；或(ii)與(a)經相同濃度G12R RAS肽脈衝化之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞或(b)引入編碼G12R RAS之核苷酸序列以便靶細胞表現G12R RAS之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞一起共培養的未轉導T細胞(例如衍生自不表現TCR之PBMC)。由陰性對照之靶細胞表現之HLA第II類分子與由與所測試T細胞一起共培養之靶細胞表現的HLA第II類分子相同。HLA第II類分子可為本文所闡述之任一HLA第II類分子(例如HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體)。可藉由業內已知方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA))量測IFN-γ分泌。
替代地或另外，在與(a)經低濃度G12R RAS肽脈衝化之抗原陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞或(b)引入編碼G12R RAS之核苷酸序列以便靶細胞表現G12R RAS抗原之陰性、HLA第II類分子陽性靶細胞一起共培養後，與分泌IFN-γ之陰性對照T細胞之數量相比，若至少兩多多數量之表現TCR之T細胞分泌IFN-γ，則TCR可視為對G12R RAS具有「抗原特異性」。HLA第II類分子、肽濃度及陰性對照可如本文針對本發明之其他態樣所闡述。可藉由業內已知方法(例如ELISPOT)量測分泌IFN-γ之細胞數。
替代地或另外，在使用表現G12R RAS之靶細胞刺激之後，若表現TCR之T細胞上調一或多種T細胞活化標記物之表現(如例如藉由流式細胞術所量測)，則TCR可視為對G12R RAS具有「抗原特異性」。T細胞活化標記物之實例包含4-1BB、OX40、CD107a、CD69及在抗原刺激時上調之細胞介素(例如腫瘤壞死因子(TNF)、介白素(IL)-2等)。
本發明之一實施例提供包括兩種多肽(亦即多肽鏈)之TCR，該等多肽鏈係(例如) TCR之阿爾法(α)鏈、TCR之貝塔(β)鏈、TCR之伽馬(γ)鏈、TCR之德爾塔(δ)鏈或其組合。本發明TCR之多肽可包括任一胺基酸序列，條件係TCR對G12R RAS具有抗原特異性。在一些實施例中，TCR係非天然的。
在本發明之一實施例中，TCR包括兩條多肽鏈，該等多肽鏈中之每一者包括含有TCR之互補決定區(CDR)1、CDR2及CDR3之可變區。在本發明之一實施例中，TCR包括：第一多肽鏈，其包括含有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之CDR1(4268 TCR之α鏈之CDR1)、含有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之CDR2 (4268 TCR之α鏈之CDR2)及含有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之CDR3 (4268 TCR之α鏈之CDR3)；及第二多肽鏈，其包括含有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之CDR1 (4268 TCR之β鏈之CDR1)、含有SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之CDR2 (4268 TCR之β鏈之CDR2)及含有SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之CDR3 (4268 TCR之β鏈之CDR3)。
在本發明之另一實施例中，TCR包括：第一多肽鏈，其包括含有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之CDR1 (4270 TCR之α鏈之CDR1)、含有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之CDR2 (4270 TCR之α鏈之CDR2)及含有SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之CDR3 (4270 TCR之α鏈之CDR3)；及第二多肽鏈，其包括含有SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之CDR1 (4270 TCR之β鏈之CDR1)、含有SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之CDR2 (4270 TCR之β鏈之CDR2)及含有SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之CDR3 (4270 TCR之β鏈之CDR3)。
就此而言，本發明TCR可包括選自由SEQ ID NO:1-12組成之群之胺基酸序列中任一者或多者。在本發明之一實施例中，TCR包括以下胺基酸序列：(a) SEQ ID NO: 1-3之全部、(b)SEQ ID NO: 4-6之全部、(c) SEQ ID NO: 7-9之全部、(d) SEQ ID NO: 10-12之全部、(e) SEQ ID NO: 1-6之全部或(f) SEQ ID NO: 7-12之全部。在一尤佳實施例中，TCR包括以下胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 1-6之全部或(ii) SEQ ID NO: 7-12之全部。
在本發明之一實施例中，TCR包括含有上述CDR之TCR之可變區之胺基酸序列。就此而言，TCR可包括以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 13 (具有N端信號肽之4268 TCR之α鏈之可變區)；SEQ ID NO: 14 (具有N端信號肽之4268 TCR之β鏈之可變區)；SEQ ID NO: 15 (具有N端信號肽之4270 TCR之α鏈之可變區)；SEQ ID NO: 16 (具有N端信號肽之4270 TCR之β鏈之可變區)；SEQ ID NO: 43 (不具有N端信號肽之4268 TCR之α鏈之可變區)；SEQ ID NO: 44 (不具有N端信號肽之4268 TCR之β鏈之可變區)；SEQ ID NO: 41 (不具有N端信號肽之4270 TCR之α鏈之可變區)；SEQ ID NO: 42 (不具有N端信號肽之4270 TCR之β鏈之可變區)；SEQ ID NO: 13及14二者；SEQ ID NO: 15及16二者；SEQ ID NO: 41及42二者；或SEQ ID NO: 43及44二者。較佳地，TCR包括以下胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 13及14二者；(ii) SEQ ID NO: 15及16二者；(iii) SEQ ID NO: 41及42二者；或(iv) SEQ ID NO: 43及44二者。
本發明TCR可進一步包括α鏈恆定區及β鏈恆定區。恆定區可衍生自任一適宜物種，例如人類或小鼠。在本發明之一實施例中，TCR進一步包括鼠類α及β鏈恆定區或人類α及β鏈恆定區。如本文中所使用，在提及TCR或本文所闡述TCR之任一組分(例如CDR、可變區、恆定區、α鏈及/或β鏈)時，術語「鼠類」或「人類」意指分別衍生自小鼠或人類之TCR (或其組分)，亦即分別源自小鼠T細胞或人類T細胞或由其一次性表現之TCR (或其組分)。
本發明之一實施例提供包括人類可變區及鼠類恆定區之嵌合TCR，其中TCR對在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性。鼠類恆定區可提供任一或多種優點。舉例而言，鼠類恆定區可減弱本發明TCR與引入本發明TCR之宿主細胞之內源性TCR之失配。替代地或另外，與具有人類恆定區之相同TCR相比，鼠類恆定區可增加本發明TCR之表現。嵌合TCR可包括SEQ ID NO: 28 (WT鼠類α鏈恆定區)、SEQ ID NO: 29 (WT鼠類β鏈恆定區)或SEQ ID NO: 28及29二者之胺基酸序列。較佳地，本發明TCR包括SEQ ID NO: 28及29二者之胺基酸序列。嵌合TCR可包括本文所闡述之任一鼠類恆定區與如本文針對本發明之其他態樣所闡述之任一CDR區的組合。就此而言，TCR可包括以下胺基酸序列：(a) SEQ ID NO: 1-3及28之全部；(b) SEQ ID NO: 4-6及29之全部；(c) SEQ ID NO: 7-9及28之全部；(d) SEQ ID NO: 10-12及29之全部；(e) SEQ ID NO: 1-6及28-29之全部；或(f) SEQ ID NO: 7-12及28-29之全部。在本發明之另一實施例中，嵌合TCR可包括本文所闡述之任一鼠類恆定區與本文針對本發明之其他態樣所闡述之任一可變區的組合。就此而言，TCR可包括以下胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 13及28二者；(ii) SEQ ID NO: 14及29二者；(iii) SEQ ID NO: 15及28二者；(iv) SEQ ID NO: 16及29二者；(v)SEQ ID NO: 13-14及28-29之全部；或(vi)SEQ ID NO: 15-16及28-29之全部。
在本發明之另一實施例中，TCR包括以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 34 (具有WT鼠類恆定區及N端信號肽之4268 TCR α鏈)、SEQ ID NO: 35 (具有WT鼠類恆定區及N端信號肽之4268 TCR β鏈)、SEQ ID NO: 36 (具有WT鼠類恆定區及N端信號肽之4270 TCR α鏈)、SEQ ID NO: 37 (具有WT鼠類恆定區及N端信號肽之4270 TCR β鏈)、SEQ ID NO: 49 (具有WT鼠類恆定區且不具有N端信號肽之4268 TCR α鏈)、SEQ ID NO: 50 (具有WT鼠類恆定區且不具有N端信號肽之4268 TCR β鏈)、SEQ ID NO: 51 (具有WT鼠類恆定區且不具有N端信號肽之4270 TCR α鏈)、SEQ ID NO: 52 (具有WT鼠類恆定區且不具有N端信號肽之4270 TCR β鏈)、SEQ ID NO: 34-35二者、SEQ ID NO: 36-37二者、SEQ ID NO: 49-50二者或SEQ ID NO: 51-52二者。
在本發明之一個實施例中，TCR包括含有可變區及恆定區之α鏈及含有可變區及恆定區之β鏈。就此而言，TCR可包括(a)包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之α鏈(具有N端信號肽之4268 TCR之α鏈)，其中：(i) SEQ ID NO: 30之位置180之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 30之位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)SEQ ID NO: 30之位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 30之位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之β鏈(具有N端信號肽之4268 TCR之β鏈)，其中SEQ ID NO: 31之位置198之X係Ser或Cys；(c)包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之α (具有N端信號肽之4270 TCR之α鏈)，其中：(i) SEQ ID NO: 32之位置188之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 32之位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 32之位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 32之位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(d)包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之β鏈(具有N端信號肽之4270 TCR之β鏈)，其中SEQ ID NO: 33之位置191之X係Ser或Cys；(e) (a)及(b)二者；(f) (c)及(d)二者；(g)包括SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之α鏈(不具有N端信號肽之4268 TCR之α鏈)，其中：(i) SEQ ID NO: 45之位置161之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 45之位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 45之位置227之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 45之位置228之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(h)包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之β鏈(不具有N端信號肽之4268 TCR之β鏈)，其中SEQ ID NO: 46之位置178之X係Ser或Cys；(i)包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之α鏈(不具有N端信號肽之4270 TCR之α鏈)，其中：(i) SEQ ID NO: 47之位置168之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 47之位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 47之位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 47之位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(j)包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之β鏈(不具有N端信號肽之4270 TCR之β鏈)，其中SEQ ID NO: 48之位置171之X係Ser或Cys；(k) (g)及(h)二者；或(l) (i)及(j)二者。
在本發明之一實施例中，TCR包括經取代恆定區。就此而言，TCR可包括本文所闡述之任一TCR之胺基酸序列，其中在α及β鏈中之一或兩者之恆定區中具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。較佳地，TCR包括鼠類恆定區，其中在α及β鏈中之一或兩者之鼠類恆定區中具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代。在一尤佳實施例中，TCR包括鼠類恆定區，其中在α鏈之鼠類恆定區中具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代且在β鏈之鼠類恆定區中具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，與包括未取代(野生型)恆定區之親代TCR相比，包括經取代恆定區之TCR有利地提供以下優點中之一或多者：增加之G12R RAS+ 靶識別、增加之宿主細胞表現、減弱之內源性TCR失配及增加之抗腫瘤活性。一般而言，TCR α及β鏈之鼠類恆定區之經取代胺基酸序列SEQ ID NO: 26及27分別對應於未取代鼠類恆定區胺基酸序列SEQ ID NO: 28及29之全部或一部分，其中SEQ ID NO: 26與SEQ ID NO: 28相比具有一個、兩個、三個或四個胺基酸取代且SEQ ID NO: 27與SEQ ID NO: 29相比具有一個胺基酸取代。就此而言，本發明之一實施例提供包括以下胺基酸序列之TCR：(a) SEQ ID NO: 26 (α鏈之恆定區)，其中(i)位置48之X係Thr或Cys；(ii)位置112之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)位置114之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv)位置115之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b) SEQ ID NO: 27 (β鏈之恆定區)，其中位置57之X係Ser或Cys；或(c) SEQ ID NO: 26及27二者。在本發明之一實施例中，包括SEQ ID NO: 26之TCR不包括SEQ ID NO: 28 (α鏈之未取代鼠類恆定區)。在本發明之一實施例中，包括SEQ ID NO: 27之TCR不包括SEQ ID NO: 29 (β鏈之未取代鼠類恆定區)。
在本發明之一實施例中，經取代恆定區包含α及β鏈中之一或兩者之恆定區中之半胱胺酸取代以提供經半胱胺酸取代之TCR。α鏈及β鏈中之相對半胱胺酸提供二硫鍵，該二硫鍵使經取代TCR之α鏈及β鏈之恆定區彼此連接且不存在於包括未取代鼠類恆定區之TCR中。就此而言，TCR可為經半胱胺酸取代之TCR，其中SEQ ID NO: 28中位置48之天然Thr (Thr48)及SEQ ID NO: 29中位置57之天然Ser (Ser57)中之一或兩者可經Cys取代 。較佳地，SEQ ID NO: 28之天然Thr48及SEQ ID NO: 29之天然Ser57二者皆經Cys取代 。經半胱胺酸取代之TCR恆定區序列之實例陳述於表2中。在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代之TCR包括(i) SEQ ID NO: 26、(ii) SEQ ID NO: 27或(iii)SEQ ID NO: 26及27二者，其中SEQ ID NO: 26及27二者皆係如表2中所定義。除本文所闡述之任一CDR或可變區外，本發明之經半胱胺酸取代之TCR亦可包含經取代恆定區。
在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代之嵌合TCR包括全長α鏈及全長β鏈。經半胱胺酸取代之嵌合TCRα鏈及β鏈序列之實例陳述於中表2。在本發明之一實施例中，TCR包括(i) SEQ ID NO: 30、(ii) SEQ ID NO: 31、(iii) SEQ ID NO: 32、(iv) SEQ ID NO: 33、(v) SEQ ID NO: 30及31二者、(vi) SEQ ID NO: 32及33二者、(vii) SEQ ID NO: 45、(viii) SEQ ID NO: 46、(ix) SEQ ID NO: 47、(x) SEQ ID NO: 48、(xi) SEQ ID NO: 45及46二者或(xii) SEQ ID NO:47及48二者，其中SEQ ID NO: 30-33及45-48皆係如表2中所定義。 表2
SEQ ID NO: 「X 」之定義
SEQ ID NO: 26 (恆定區α鏈) 位置48之X係Cys， 位置112之X係Ser， 位置114之X係Met，且 位置115之X係Gly。
SEQ ID NO: 27 (恆定區β鏈) 位置57之X係Cys
SEQ ID NO: 30 (4268 TCR α鏈) (具有N端信號肽) 位置180之X係Cys， 位置244之X係Ser， 位置246之X係Met，且 位置247之X係Gly。
SEQ ID NO: 31 (4268 TCR β鏈) (具有N端信號肽) 位置198之X係Cys
SEQ ID NO: 32 (4270 TCR α鏈) (具有N端信號肽) 位置188之X係Cys， 位置252之X係Ser， 位置254之X係Met，且 位置255之X係Gly。
SEQ ID NO: 33 (4270 TCR β鏈) (具有N端信號肽) 位置191之X係Cys
SEQ ID NO: 45 (4268 TCR α鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置161之X係Cys， 位置225之X係Ser， 位置227之X係Met，且 位置228之X係Gly。
SEQ ID NO: 46 (4268 TCR β鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置178之X係Cys
SEQ ID NO: 47 (4270 TCR α鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置168之X係Cys， 位置232之X係Ser， 位置234之X係Met，且 位置235之X係Gly。
SEQ ID NO: 48 (4270 TCR β鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置171之X係Cys
在本發明之一實施例中，經取代胺基酸序列在α及β鏈中之一或兩者之恆定區之跨膜(TM)結構域中的一個、兩個或三個胺基酸經疏水性胺基酸取代以提供經疏水性胺基酸取代之TCR (亦在本文中稱為「經LVL修飾之TCR」)。與在TM結構域中沒有疏水性胺基酸取代之TCR相比，TCR之TM結構域中之疏水性胺基酸取代可增加TCR之TM結構域之疏水性。就此而言，TCR係經LVL修飾之TCR，其中SEQ ID NO: 28之天然Ser112、Met114及Gly115中之一者、兩者或三者可獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、較佳地Leu、Ile或Val取代。較佳地，SEQ ID NO: 28之天然Ser112、Met114及Gly115三者皆可獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、較佳地Leu、Ile或Val取代。在本發明之一實施例中，經LVL修飾之TCR包括(i) SEQ ID NO: 26、(ii) SEQ ID NO: 27或(iii) SEQ ID NO: 26及27二者，其中SEQ ID NO: 26及27二者皆係如表3中所定義。除本文所闡述之任一CDR或可變區外，本發明之經LVL修飾之TCR亦可包含皆取代恆定區。
在本發明之一實施例中，經LVL修飾之TCR包括全長α鏈及a全長β鏈。經LVL修飾之TCR α鏈及β鏈序列之實例陳述於表3中。在本發明之一實施例中，經LVL修飾之TCR包括(i) SEQ ID NO: 30、(ii) SEQ ID NO: 31、(iii) SEQ ID NO: 32、(iv) SEQ ID NO: 33、(v) SEQ ID NO: 30及31二者、(vi) SEQ ID NO: 32及33二者、(vii) SEQ ID NO: 45、(viii) SEQ ID NO: 46、(ix) SEQ ID NO: 47、(x) SEQ ID NO: 48、(xi) SEQ ID NO: 45及46二者或(xii) SEQ ID NO:47及48二者，其中SEQ ID NO: 30-33及45-48皆係如表3中所定義。 表3
SEQ ID NO: 「X 」之定義
SEQ ID NO: 26 (恆定區α鏈) 位置48之X係Thr； 位置112之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置112之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置112之X係Leu； 位置114之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置114之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置114之X係Ile；且 位置115之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置115之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置115之X係Val； 其中SEQ ID NO: 26不包括SEQ ID NO: 28 (α鏈之未取代恆定區)
SEQ ID NO: 27 (恆定區β鏈) 位置57之X係Ser
SEQ ID NO: 30 (4268 TCR α鏈) (具有N端信號肽) 位置180之X係Thr； 位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置244之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置244之X係Leu； 位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置246之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置246之X係Ile；且 位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置247之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置247之X係Val， 其中SEQ ID NO: 30不包括SEQ ID NO: 34 (未取代4268 TCRα鏈)
SEQ ID NO: 31 (4268 TCR β鏈) (具有N端信號肽) 位置198之X係Ser
SEQ ID NO: 32 (4270 TCR α鏈) (具有N端信號肽) 位置188之X係Thr； 位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置252之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置252之X係Leu； 位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置254之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置254之X係Ile；且 位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置255之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置255之X係Val； 其中SEQ ID NO: 32不包括SEQ ID NO: 36 (未取代α鏈)
SEQ ID NO: 33 (4270 TCR β鏈) (具有N端信號肽) 位置191之X係Ser
SEQ ID NO: 45 (4268 TCR α鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置161之X係Thr； 位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置227之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置228之X係Leu； 位置225之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置227之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置228之X係Ile；且 位置225之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置227之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置228之X係Val， 其中SEQ ID NO: 45不包括SEQ ID NO: 49 (未取代4268 TCRα鏈)
SEQ ID NO: 46 (4268 TCR β鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置178之X係Ser
SEQ ID NO: 47 (4270 TCR α鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置168之X係Thr； 位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置234之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置235之X係Leu； 位置232之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置234之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置254之X係Ile；且 位置232之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置234之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置235之X係Val； 其中SEQ ID NO: 47不包括SEQ ID NO: 51 (未取代α鏈)
SEQ ID NO: 48 (4270 TCR β鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置171之X係Ser
在本發明之一實施例中，經取代胺基酸序列包含以下取代之組合：α及β鏈中之一或兩者之恆定區中之半胱胺酸取代；及在恆定區α及β鏈中之一或兩者之跨膜(TM)結構域中一個、兩個或三個胺基酸經疏水性胺基酸取代(亦在本文中稱為「經半胱胺酸取代、經LVL修飾之TCR」)。就此而言，TCR係經半胱胺酸取代、經LVL修飾之嵌合TCR，其中SEQ ID NO: 28之天然Thr48經Cys取代；SEQ ID NO: 28之天然Ser112、Met114及Gly115中之一者、兩者或三者獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、較佳地Leu、Ile或Val取代；且SEQ ID NO: 29之天然Ser57經Cys取代。較佳地，SEQ ID NO: 28之天然Ser112、Met114及Gly115三者皆可獨立地經Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp、較佳地Leu、Ile或Val取代。在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代、經LVL修飾之TCR包括(i) SEQ ID NO: 26、(ii) SEQ ID NO: 27或(iii) SEQ ID NO: 26及27二者，其中SEQ ID NO: 26及27二者皆係如表4中所定義。除本文所闡述之任一CDR或可變區外，本發明之經半胱胺酸取代、經LVL修飾之TCR可包含經取代恆定區。
在一實施例中，經半胱胺酸取代、經LVL修飾之TCR包括全長α鏈及a全長β鏈。在本發明之一實施例中，經半胱胺酸取代、經LVL修飾之TCR包括(i) SEQ ID NO: 30、(ii) SEQ ID NO: 31、(iii) SEQ ID NO: 32、(iv) SEQ ID NO: 33、(v) SEQ ID NO: 30及31二者、(vi) SEQ ID NO: 32及33二者、(vii) SEQ ID NO: 45、(viii) SEQ ID NO: 46、(ix) SEQ ID NO: 47、(x) SEQ ID NO: 48、(xi) SEQ ID NO: 45及46二者或(xii) SEQ ID NO:47及48二者，其中SEQ ID NO: 30-33及45-48皆係如表4中所定義。 表4
SEQ ID NO: 「X 」之定義
SEQ ID NO: 26 (恆定區α鏈) 位置48之X係Cys； 位置112之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置112之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置112之X係Leu； 位置114之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置114之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置114之X係Ile；且 位置115之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置115之X係Leu、Ile或Val；且尤佳地，其中位置115之X係Val， 其中SEQ ID NO: 26不同時包括位置112之Ser、位置114之Met及位置115之Gly之全部。
SEQ ID NO: 27 (恆定區β鏈) 位置57之X係Cys
SEQ ID NO: 30 (4268 TCR α鏈) (具有N端信號肽) 位置180之X係Cys； 位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置244之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置244之X係Leu； 位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置246之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置246之X係Ile；且 位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置247之X係Leu、Ile或Val；且尤佳地，其中位置247之X係Val， 其中SEQ ID NO: 30不同時包括位置244之Ser、位置246之Me及位置247之Gly之全部。
SEQ ID NO: 31 (4268 TCR β鏈) (具有N端信號肽) 位置198之X係Cys
SEQ ID NO: 32 (4270 TCR α鏈) (具有N端信號肽) 位置188之X係Cys； 位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置252之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置252之X係Leu； 位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置254之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置254之X係Ile；且 位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置255之X係Leu、Ile或Val；且尤佳地，其中位置255之X係Val， 其中SEQ ID NO: 32不同時包括位置252之Ser、位置254之Met及位置255之Gly之全部。
SEQ ID NO: 33 (4270 TCR β鏈) (具有N端信號肽) 位置191之X係Cys
SEQ ID NO: 45 (4268 TCR α鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置161之X係Cys； 位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置227之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置228之X係Leu； 位置225之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置227之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置228之X係Ile；且 位置225之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置227之X係Leu、Ile或Val；且尤佳地，其中位置228之X係Val， 其中SEQ ID NO: 45不同時包括位置225之Ser、位置227之Met及位置228之Gly之全部。
SEQ ID NO: 46 (4268 TCR β鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置178之X係Cys
SEQ ID NO: 47 (4270 TCR α鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置168之X係Cys； 位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置232之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置232之X係Leu； 位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp； 較佳地，其中位置234之X係Leu、Ile或Val； 尤佳地，其中位置234之X係Ile；且 位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； 較佳地，其中位置235之X係Leu、Ile或Val；且尤佳地，其中位置235之X係Val， 其中SEQ ID NO: 47不同時包括位置232之Ser、位置234之Met及位置235之Gly之全部。
SEQ ID NO: 48 (4270 TCR β鏈) (不具有N端信號肽之預測序列) 位置171之X係Cys
本發明亦提供包括本文所闡述之任一TCR之功能部分之多肽。本文所用之術語「多肽」包含寡肽且係指由一或多個肽鍵連結之胺基酸單鏈。
就本發明多肽而言，功能部分可為任一包括作為其一部分之TCR之鄰接胺基酸之部分，條件係功能部分特異性結合至G12R RAS。術語「功能部分」在提及TCR使用時係指本發明TCR之任一部分或片段，該部分或片段保留作為其一部分之TCR (親代TCR)之生物活性。功能部分涵蓋(例如) TCR中仍能夠與親代TCR相比以類似程度、相同程度或較高程度特異性結合至G12R RAS (例如在HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體之背景內)或檢測、治療或預防癌症之彼等部分。參照親代TCR，功能部分可包括(例如)約10%、約25%、約30%、約50%、約68%、約80%、約90%、約95%或更多之親代TCR。
功能部分可在該部分之胺基或羧基末端或兩個末端包括其他胺基酸，該等其他胺基酸未發現於親代TCR之胺基酸序列中。期望地，其他胺基酸並不干擾功能部分之生物功能(例如特異性結合至G12R RAS及/或能夠檢測癌症、治療或預防癌症等)。更期望地，與親代TCR之生物活性相比，其他胺基酸可增強生物活性。
多肽可包括本發明TCR之α及β鏈中之任一者或兩者之功能部分，例如包括本發明TCR中α鏈及/或β鏈之可變區之CDR1、CDR2及CDR3中之一或多者的功能部分。在本發明之一實施例中，多肽可包括SEQ ID NO: 1 (α鏈之CDR1)、SEQ ID NO: 2 (α鏈之CDR2)、SEQ ID NO: 3 (α鏈之CDR3)、SEQ ID NO: 4 (β鏈之CDR1)、SEQ ID NO: 5 (β鏈之CDR2)、SEQ ID NO: 6 (β鏈之CDR3)或其組合之胺基酸序列。在本發明之另一實施例中，多肽可包括SEQ ID NO: 7 (α鏈之CDR1)、SEQ ID NO: 8 (α鏈之CDR2)、SEQ ID NO: 9 (α鏈之CDR3)、SEQ ID NO: 10 (β鏈之CDR1)、SEQ ID NO: 11 (β鏈之CDR2)、SEQ ID NO: 12 (β鏈之CDR3)或其組合之胺基酸序列。
就此而言，本發明多肽可包括選自由SEQ ID NO: 1-12組成之群之胺基酸序列中之任一者或多者。在本發明之一實施例中，TCR包括以下胺基酸序列：(a) SEQ ID NO: 1-3之全部、(b) SEQ ID NO: 4-6之全部、(c) SEQ ID NO: 7-9之全部、(d) SEQ ID NO: 10-12之全部、(e) SEQ ID NO: 1-6之全部或(f) SEQ ID NO: 7-12之全部。在一較佳實施例中，多肽包括以下胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 1-6之全部或(ii) SEQ ID NO: 7-12之全部。
在本發明之一實施例中，本發明多肽可包括(例如)包括上述CDR區之組合之本發明TCR之可變區。就此而言，多肽可包括以下胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 13 (α鏈之可變區)、(ii) SEQ ID NO: 14 (β鏈之可變區)、(iii) SEQ ID NO: 13及14二者、(iv) SEQ ID NO: 15 (α鏈之可變區)、(v) SEQ ID NO: 16 (β鏈之可變區)、(vi) SEQ ID NO: 15及16二者、(vii) SEQ ID NO: 41 (α鏈之可變區)、(viii) SEQ ID NO: 42 (β鏈之可變區)、(ix) SEQ ID NO: 41及42二者、(x) SEQ ID NO: 43 (α鏈之可變區)、(xi) SEQ ID NO: 44 (β鏈之可變區)或(xii) SEQ ID NO: 43及44二者。較佳地，多肽包括以下胺基酸序列：(i) SEQ ID NO: 13及14二者、(ii) SEQ ID NO: 15及16二者、(iii) SEQ ID NO: 41及42二者或(iv) SEQ ID NO: 43及44。
在本發明之一實施例中，本發明多肽可進一步包括上述本發明TCR之恆定區。就此而言，多肽可進一步包括以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 28 (α鏈之WT鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 29 (β鏈之WT鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 26 (α鏈之經取代鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 27 (β鏈之經取代鼠類恆定區)、SEQ ID NO: 28及29二者或SEQ ID NO: 26及27二者。較佳地，多肽進一步包括SEQ ID NO: 26及27二者或SEQ ID NO: 28及29二者之胺基酸序列與本文針對本發明之其他態樣所闡述之任一CDR區或可變區的組合。在本發明之一實施例中，多肽之SEQ ID NO: 26及27中之一或兩者係如表2-4中之任一者中所定義。
在本發明之一實施例中，本發明多肽可包括本文所闡述TCR之α或β鏈之整個長度。就此而言，本發明多肽可包括以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 30-31二者、SEQ ID NO: 32-33二者、SEQ ID NO: 34-35、SEQ ID NO: 36-37二者、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 45及46二者、SEQ ID NO: 47及48二者、SEQ ID NO: 49及50二者或SEQ ID NO: 51及52二者。或者，本發明多肽可包括本文所闡述TCR之兩條鏈。
舉例而言，本發明多肽可包括(a) SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 30之位置180之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 30之位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 30之位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 30之位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b) SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 31之位置198之X係Ser或Cys；(c) SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 32之位置188之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 32之位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 32之位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 32之位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(d) SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 33之位置191之X係Ser或Cys；(e) (a)及(b)二者；(f) (c)及(d)二者；(g) SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 45之位置161之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 45之位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 45之位置227之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 45之位置228之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(h) SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 46之位置178之X係Ser或Cys；(i) SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 47之位置168之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 47之位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 47之位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 47之位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(j) SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 48之位置171之X係Ser或Cys；(k) (g)及(h)二者；或(l) (i)及(j)二者。在本發明之一實施例中，多肽之SEQ ID NO: 30-33及45-48中之任一者或多者係如表2-4中之任一者中所定義。
本發明另外提供包括本文所闡述之至少一種多肽之蛋白質。「蛋白質」意指包括一或多條多肽鏈之分子。
在一實施例中，本發明蛋白質可包括(a)包括SEQ ID NO: 1-3之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 4-6之胺基酸序列之第二多肽鏈；或(b)包括SEQ ID NO: 7-9之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 10-12之胺基酸序列之第二多肽鏈。
在本發明之另一實施例中，蛋白質可包括(i)包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之第二多肽鏈；(ii)包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之第二多肽鏈；(iii)包括SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之第二多肽鏈；或(iv)包括SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之第二多肽鏈。
本發明蛋白質可進一步包括本文針對本發明之其他態樣所闡述之任一恆定區。就此而言，在本發明之一實施例中，(i)第一多肽鏈可進一步包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列且第二多肽鏈可進一步包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列；或(ii)第一多肽鏈可進一步包括SEQ ID NO: 28之胺基酸序列且第二多肽鏈可進一步包括SEQ ID NO: 29之胺基酸序列。在本發明之一實施例中，蛋白質之SEQ ID NO: 26及27中之一或兩者係如表2-4中之任一者中所定義。
替代地或另外，本發明之一實施例之蛋白質可包括(a)第一多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 30之位置180之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 30之位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 30之位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 30之位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(b)第二多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 31之位置198之X係Ser或Cys；(c)第一多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 32之位置188之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 32之位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 32之位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 32之位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(d)第二多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 33之位置191之X係Ser或Cys；(e) (a)及(b)二者；(f) (c)及(d)二者；(g)第一多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 45之位置161之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 45之位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 45之位置227之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 45之位置228之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(h)第二多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 46之位置178之X係Ser或Cys；(i)第一多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，其中：(i) SEQ ID NO: 47之位置168之X係Thr或Cys；(ii) SEQ ID NO: 47之位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii) SEQ ID NO: 47之位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且(iv) SEQ ID NO: 47之位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(j)第二多肽鏈，其包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 48之位置171之X係Ser或Cys；(k) (g)及(h)二者；或(l) (i)及(j)二者。在本發明之一實施例中，SEQ ID NO: 30-33及45-48中之一或多者係如表2-4中之任一者中所定義。
本發明蛋白質可為TCR。或者，舉例而言，若蛋白質包括含有SEQ ID NO: 30及31二者、SEQ ID NO: 32及33二者之胺基酸序列之單一多肽鏈，或若蛋白質之第一及/或第二多肽鏈進一步包括其他胺基酸序列(例如編碼免疫球蛋白或其部分之胺基酸序列)，則本發明蛋白質可為融合蛋白。就此而言，本發明亦提供包括本文所闡述之至少一種本發明多肽以及至少一種其他多肽之融合蛋白。其他多肽可以融合蛋白之單獨多肽形式存在，或可以與本文所闡述之一種本發明多肽同框(串聯)表現之多肽形式存在。其他多肽可編碼任一肽或蛋白質分子或其部分(包含(但不限於)免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(例如CD1a、CD1b、CD1c、CD1d)等)。
融合蛋白可包括一或多個拷貝之本發明多肽及/或一或多個拷貝之其他多肽。舉例而言，融合蛋白可包括1、2、3、4、5或更多個拷貝之本發明多肽及/或其他多肽。製備融合蛋白之適宜方法為業內已知，且包含例如重組方法。
在本發明之一些實施例中，本發明之TCR、多肽及蛋白質可表現為包括連接α鏈及β鏈之連接肽之單一蛋白質。就此而言，本發明之TCR、多肽及蛋白質可進一步包括連接肽。連接肽可有利地促進重組TCR、多肽及/或蛋白質在宿主細胞中表現。連接肽可包括任一適宜胺基酸序列。連接肽可為可裂解連接肽。舉例而言，連接肽可為包括SEQ ID NO:38之胺基酸序列之弗林蛋白酶(furin)-SGSG-P2A連接體。在藉由宿主細胞表現包含連接肽之構築體時，連接肽可裂解，造成分離之α及β鏈。在本發明之一個實施例中，TCR、多肽或蛋白質可包括含有全長α鏈、全長β鏈及位於α鏈與β鏈之間之連接肽之胺基酸序列。
本發明蛋白質可為包括至少一種本文所述之本發明多肽之重組抗體或其抗原結合部分。如本文中所使用，「重組抗體」係指包括至少一種本發明之多肽及抗體或其抗原結合部分之多肽鏈之重組(例如基因改造)蛋白。抗體或其抗原結合部分之多肽可為抗體之重鏈、輕鏈、重鏈或輕鏈之可變或恆定區、單鏈可變片段(scFv)，或Fc、Fab或F(ab)2 '片段等。抗體或其抗原結合部分之多肽鏈可以重組抗體之分離多肽存在。或者，抗體或其抗原結合部分之多肽鏈可以與本發明多肽同框(串聯)表現之多肽存在。抗體或其抗原結合部分之多肽可為任一抗體或任一抗體片段(包含本文所述之任一抗體及抗體片段)之多肽。
本發明範圍包含本文所闡述之本發明TCR、多肽或蛋白質之功能變體。本文所用之術語「功能變體」係指與親代TCR、多肽或蛋白質具有實質性或顯著性序列一致性或類似性之TCR、多肽或蛋白質，該等功能變體保留作為其變體之TCR、多肽或蛋白質之生物活性。功能變體涵蓋(例如)本文所闡述之TCR、多肽或蛋白質(親代TCR、多肽或蛋白質)之仍能夠與親代TCR、多肽或蛋白質相比以類似程度、相同程度或較高程度特異性結合至G12R RAS (親代TCR對其具有抗原特異性或親代多肽或蛋白質與其特異性結合)之彼等變體。參照親代TCR、多肽或蛋白質，功能變體可(例如)分別與親代TCR、多肽或蛋白質之胺基酸序列至少約30%、約50%、約75%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高程度一致。
功能變體可(例如)包括具有至少一種保守胺基酸取代之親代TCR、多肽或蛋白質之胺基酸序列。保守胺基酸取代為業內所已知，且包含其中一種具有某些物理及/或化學性質之胺基酸交換為另一具有相同化學或物理性質之胺基酸之胺基酸取代。舉例而言，保守胺基酸取代可為一種酸性胺基酸取代為另一酸性胺基酸(例如Asp或Glu)，一種具有非極性側鏈之胺基酸取代為另一具有非極性側鏈之胺基酸(例如Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)，一種鹼性胺基酸取代為另一鹼性胺基酸(Lys、Arg等)，一種具有極性側鏈之胺基酸取代為另一具有極性側鏈之胺基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)，等等。
替代地或另外，功能變體可包括親代TCR、多肽或蛋白質中具有至少一種非保守胺基酸取代之胺基酸序列。在此情形下，較佳地，非保守胺基酸取代並不干擾或抑制功能變體之生物活性。較佳地，非保守胺基酸取代增強功能變體之生物活性，從而功能變體之生物活性大於親代TCR、多肽或蛋白質。
TCR、多肽或蛋白質可基本上由本文所闡述之一或多個指定胺基酸序列組成，從而TCR、多肽或蛋白質之其他組分(例如其他胺基酸)並不實質性改變TCR、多肽或蛋白質之生物活性。就此而言，本發明TCR、多肽或蛋白質可(例如)基本上由以下胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 30-31二者、SEQ ID NO: 32-33二者、SEQ ID NO: 34-35二者或SEQ ID NO: 36-37二者。同樣，舉例而言，本發明TCR、多肽或蛋白質可基本上由以下胺基酸序列組成：(i) SEQ ID NO: 13、(ii) SEQ ID NO: 14、(iii) SEQ ID NO: 15、(iv) SEQ ID NO: 16、(v) SEQ ID NO: 13及14二者或(vi) SEQ ID NO: 15及16二者。另外，本發明TCR、多肽或蛋白質可基本上由以下胺基酸序列組成：(a) SEQ ID NO: 1-12中之任一者或多者；(b) SEQ ID NO: 1-3之全部；(c) SEQ ID NO: 4-6之全部；(d) SEQ ID NO: 7-9之全部；(e) SEQ ID NO: 10-12之全部；(f) SEQ ID NO: 1-6之全部；或(g) SEQ ID NO: 7-12之全部。
本發明之TCR、多肽及蛋白質可具有任一長度，亦即可包括任一數量之胺基酸，條件係TCR、多肽或蛋白質保留其生物活性(例如能夠特異性結合至G12R RAS；檢測哺乳動物之癌症；或治療或預防哺乳動物之癌症等)。舉例而言，多肽之長度可在約50至約5000個胺基酸之範圍內，例如長約50、約70、約75、約100、約125、約150、約175、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000或更多個胺基酸。就此而言，本發明多肽亦包含寡肽。
本發明之TCR、多肽及蛋白質可包括合成胺基酸來代替一或多種天然胺基酸。該等合成胺基酸為業內所已知，且包含(例如)胺基環己烷甲酸、正白胺酸、α-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯基胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-及反式-4-羥基脯胺酸、4-胺基苯基丙胺酸、4-硝基苯基丙胺酸、4-氯苯基丙胺酸、4-羧基苯基丙胺酸、β-苯基絲胺酸、β-羥基苯基丙胺酸、苯基甘胺酸、α-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、二氫吲哚-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N’-苄基-N’-甲基-離胺酸、N’,N’-二苄基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、α-胺基環戊烷甲酸、α-胺基環己烷甲酸、α-胺基環庚烷甲酸、α-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、α,β-二胺基丙酸、高苯基丙胺酸及α-第三丁基甘胺酸。
本發明之TCR、多肽及蛋白質可經由(例如)二硫橋發生醣基化、醯胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、N-醯基化、環化，或轉化成酸加成鹽及/或視情況發生二聚合或聚合，或發生偶聯。
可藉由業內已知方法(例如重新合成)獲得本發明之TCR、多肽及/或蛋白質。另外，可以重組方式使用本文所闡述之核酸且使用標準重組方法來產生多肽及蛋白質。例如參見Green及Sambrook,Molecular Cloning:  A Laboratory Manual ，第4版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。或者，本文所闡述之TCR、多肽及/或蛋白質可以商業方式由公司(例如Synpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)及Multiple Peptide Systems (San Diego, CA))合成。就此而言，本發明TCR、多肽及蛋白質可為合成的、重組的、經分離及/或經純化的。本發明之一實施例提供由本文針對本發明之其他態樣所闡述任一核酸或載體編碼的經分離或經純化之TCR、多肽或蛋白質。本發明之另一實施例提供經分離或經純化之TCR、多肽或蛋白質，其係藉由在細胞中表現本文針對本發明之其他態樣所闡述之任一核酸或載體所產生。本發明之再一實施例提供產生本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之方法，該方法包括培養本文所闡述之任一宿主細胞或宿主細胞群體，從而產生TCR、多肽或蛋白質。
本發明範圍包含偶聯物(例如生物偶聯物)，其包括本發明TCR、多肽或蛋白質(包含任一功能部分或其變體)、核酸、重組表現載體、宿主細胞、宿主細胞群體或抗體或其抗原結合部分中之任一者。一般而言，業內已知偶聯物以及合成偶聯物之方法。
本發明之一實施例提供包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列之核酸。本文所用之「核酸」包含「多核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸分子」，且通常意指DNA或RNA之聚合物，其可為單鏈或雙鏈，可含有天然、非天然或經改變之核苷酸，且可含有天然、非天然或經改變之核苷酸間鍵聯(例如胺基磷酸酯鍵聯或硫代磷酸酯鍵聯)來代替發現於未修飾寡核苷酸之核苷酸之間之磷酸二酯。在一實施例中，核酸包括互補DNA (cDNA)。通常較佳地，核酸不包括任何插入、缺失、倒轉及/或取代。然而，在一些情況下，如本文所論述，核酸可適宜地包括一或多種插入、缺失、倒轉及/或取代。
較佳地，本發明核酸係重組的。如本文中所使用，術語「重組」係指(i)分子係藉由使天然或合成核酸區段接合至可複製於活細胞中之核酸分子而構築於活細胞外部，或(ii)分子係源自上文(i)中所闡述者之複製。出於本文之目的，複製可為活體外複製或活體內複製。
可基於化學合成及/或酶促連接反應使用業內已知程序來構築核酸。例如參見Green及Sambrook等人之上述文獻。舉例而言，核酸可以化學方式使用天然核苷酸或設計以增加分子之生物穩定性或增加在雜交時所形成雙鏈體之物理穩定性之各種經修飾核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物及經吖啶取代之核苷酸)來合成。可用於生成核酸之經修飾核苷酸之實例包含(但不限於)5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基尿苷、5-羧基甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷、肌苷、N6 -異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6 -取代腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫基尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6 -異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷、2-硫基胞嘧啶、5-甲基-2-硫基尿嘧啶、2-硫基尿嘧啶、4-硫基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。或者，本發明之一或多種核酸可購自諸如Macromolecular Resources (Fort Collins, CO)及Synthegen (Houston, TX)等公司。
核酸可包括任一編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列。在本發明之一實施例中，核酸包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之密碼子最佳化核苷酸序列。不受限於任一特定理論或機制，據信，核苷酸序列之密碼子最佳化增加了mRNA轉錄物之轉譯效率。核苷酸序列之密碼子最佳化可涉及使用另一編碼相同胺基酸但可藉由更易於獲得於細胞內之tRNA轉譯之密碼子取代天然密碼子，由此增加轉譯效率。核苷酸序列之最佳化亦可減少干擾轉譯之二級mRNA結構，由此增加轉譯效率。
本發明亦提供包括以下之核酸：與本文所闡述任一核酸之核苷酸序列互補之核苷酸序列；或在嚴格條件下雜交至本文所闡述任一核酸之核苷酸序列之核苷酸序列。
在嚴格條件下雜交之核苷酸序列較佳地在高嚴格度條件下發生雜交。「高嚴格度條件」意指核苷酸序列以可檢測地強於非特異性雜交之量特異性雜交至靶序列(本文所闡述任一核酸之核苷酸序列)。高嚴格度條件包含區分具有嚴格互補序列之多核苷酸或僅含少數零散失配者與恰好少數較小區域(例如3-10個鹼基)匹配核苷酸序列之隨機序列之條件。該等具有互補性之較小區域較14-17或更多個鹼基之全長補體更易於融化，且高嚴格度雜交使得其可容易地區分。相對較高嚴格度條件包含(例如)低鹽及/或高溫條件，例如由約0.02-0.1 M NaCl或等效物在約50-70℃之溫度下所提供。該等高嚴格度條件耐受核苷酸序列與模板或靶鏈之間之較少(若存在)失配，且尤其適於檢測任一者發明TCR之表現。通常贏應瞭解，可藉由添加增加量之甲醯胺來使條件更為嚴格。
本發明之一實施例亦提供包括與本文所闡述之任一核酸至少約70%或一致(例如約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%一致)之核苷酸序列之核酸。就此而言，核酸可基本上由本文所闡述之任一核苷酸序列組成。
本發明之一實施例提供自5’至3’包括第一核酸序列及第二核苷酸序列之經分離或經純化核酸，其中第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分別編碼以下胺基序列：SEQ ID NO: 13及14；14及13；15及16；16及15；30及31；31及30；32及33；33及32；34及35；35及34；36及37；37及36；41及42；42及41；43及44；44及43；45及46；46及45；47及48；48及47；49及50；50及49；51及52；或52及51。
在本發明之一實施例中，經分離或將純化核酸進一步包括插入第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間之第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列編碼可裂解連接肽。在本發明之一實施例中，可裂解連接肽包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。
本發明核酸可納入重組表現載體中。就此而言，本發明提供包括本發明之任一核酸之重組表現載體。在本發明之一實施例中，重組表現載體包括編碼α鏈、β鏈及連接肽之核苷酸序列。
出於本文之目的，術語「重組表現載體」意指經基因修飾之寡核苷酸或多核苷酸構築體，在該構築體包括編碼mRNA、蛋白質、多肽或肽之核苷酸序列且使載體與細胞在足以使mRNA、蛋白質、多肽或肽表現於宿主細胞內之條件下接觸時，該構築體允許藉由該細胞表現mRNA、蛋白質、多肽或肽。本發明載體整體而言並非天然的。然而，載體之一部分可為天然的。本發明重組表現載體可包括任一類型之核苷酸，該核苷酸包含(但不限於) DNA及RNA，其可為單鏈或雙鏈，經合成或部分地自天然來源獲得，且可含有天然、非天然或經改變核苷酸。重組表現載體可包括天然、非天然核苷酸間鍵聯或兩種類型之鍵聯。較佳地，非天然或經改變核苷酸或核苷酸間鍵聯並不阻礙載體之轉錄或複製。
本發明之重組表現載體可為任一適宜重組表現載體，且可用於轉變或轉染任一適宜宿主細胞。適宜載體包含經設計用於繁殖及擴增或用於表現或用於二者者，例如質體及病毒。載體可選自由以下組成之群：pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene, LaJolla, CA)、pET系列(Novagen, Madison, WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)及pEX系列(Clontech, Palo Alto, CA)。亦可使用噬菌體載體，例如λGT10、λGT11、λZapII (Stratagene)、λEMBL4及λNM1149。植物表現載體之實例包含pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及pBIN19 (Clontech)。動物表現載體之實例包含pEUK-Cl、pMAM及pMAMneo (Clontech)。較佳地，重組表現載體係病毒載體，例如逆轉錄病毒載體。在一尤佳實施例中，重組表現載體係MSGV1載體。在本發明之一實施例中，重組表現載體係轉位子或慢病毒載體。
可使用闡述於(例如) Greem及Sambrook等人之上述文獻中之標準重組DNA技術來製備本發明之重組表現載體。可製備含有在原核或真核宿主細胞中發揮作用之複製系統之圓形或線性表現載體之構築體。複製系統可衍生自(例如) ColEl、2 μ質體、λ、SV40、牛乳頭瘤病毒及諸如此類。
期望地，在適當時且考慮載體係基於DNA抑或RNA，重組表現載體包括對擬引入載體之宿主細胞類型(例如細菌、真菌、植物或動物)具有特異性之調控序列，例如轉錄及轉譯起始密碼子及終止密碼子。
重組表現載體可包含一或多種容許選擇經轉變或經轉染宿主細胞之標記基因。標記基因包含殺生物抗性(例如對抗生素、重金屬等之抗性)、營養缺陷宿主細胞中之互補作用(用以提供原養性)及諸如此類。用於本發明表現載體在適宜標記基因包含(例如)新黴素(neomycin)/G418抗性基因、潮黴素(hygromycin)抗性基因、組胺醇(histidinol)抗性基因、四環素(tetracycline)抗性基因及胺苄西林(ampicillin)抗性基因。
重組表現載體可包括可操作地連接至編碼TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列或互補於或雜交至編碼TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列的核苷酸序列之天然或非天然啟動子。熟習此項技術者熟知啟動子之選擇(例如強、弱、可誘導、組織特異性及發育特異性)。類似地，熟習此項技術者亦熟知核苷酸序列與啟動子之組合。啟動子可非病毒啟動子或病毒啟動子，例如巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子及發現於鼠類幹細胞病毒之長末端重複中之啟動子。
本發明重組表現載體可經設計以用於瞬時表現、穩定表現或用於二者。同樣，重組表現載體可經製備用於組成型表現或可誘導表現。
另外，可製備包含自殺基因之重組表現載體。如本文中所使用，術語「自殺基因」係指導致表現自殺基因之細胞死亡之基因。自殺基因可為賦予表現基因之細胞藥劑(例如藥物)敏感性且在細胞接觸或暴露於藥劑時導致細胞死亡之基因。自殺基因為業內所已知且包含(例如)單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基還原酶及可誘導半胱天冬酶(caspase) 9基因系統。
本發明之另一實施例另外提供包括本文所闡述之任一重組表現載體之宿主細胞。如本文中所使用，術語「宿主細胞」係指可含有本發明重組表現載體之任一類型之細胞。宿主細胞可為真核細胞(例如植物、動物、真菌或藻類細胞)，或可為原核細胞(例如細菌或原生動物細胞)。宿主細胞可為經培養細胞或原代細胞(亦即自生物體、例如人類直接分離)。宿主細胞可為附著細胞或懸浮細胞(亦即在懸浮液中生長之細胞)。適宜宿主細胞為業內所已知且包含(例如) DH5α大腸桿菌(E . coli )細胞、中國倉鼠卵巢細胞、猴VERO細胞、COS細胞、HEK293細胞及諸如此類。出於擴增或複製重組表現載體之目的，宿主細胞較佳係原核細胞，例如DH5α細胞。出於產生重組TCR、多肽或蛋白質之目的，宿主細胞較佳係哺乳動物細胞。最佳地，宿主細胞係人類細胞。儘管宿主細胞可為任一細胞類型、可源自任一類型組織且可為任一發育階段，但宿主細胞較佳係周邊血淋巴球(PBL)或周邊血單核細胞(PBMC)。更佳地，宿主細胞係T細胞。在本發明之一實施例中，宿主細胞係人類淋巴球。在本發明之另一實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：T細胞、天然殺手T (NKT)細胞、不變之天然殺手T (iNKT)細胞及天然殺手(NK)細胞。本發明之再一實施例提供產生表現對SEQ ID NO: 39之肽具有抗原特異性之TCR之宿主細胞的方法，該方法包括使細胞與本文所闡述之任一載體在容許將載體引入細胞中之條件下接觸。
出於本文之目的，T細胞可為任一T細胞，例如經培養T細胞(例如原代T細胞，或來自經培養T細胞系(例如Jurkat、SupT1等)之T細胞，或自哺乳動物獲得之T細胞)。若自哺乳動物獲得，則T細胞可自多種來源獲得，包含(但不限於)血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或流體。T細胞亦可經富集或經純化。較佳地，T細胞係人類T細胞。T細胞可為任一類型T細胞且可為任一發育階段，包含(但不限於) CD4+ /CD8+ 雙重陽性T細胞、CD4+ 輔助性T細胞(例如Th1 及Th2 細胞)、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞(例如細胞毒性T細胞)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、記憶性T細胞(例如中央記憶性T細胞及效應記憶性T細胞)、幼稚T細胞及諸如此類。
本發明亦提供包括本文所闡述之至少一種宿主細胞之細胞群體。細胞群體可為異質群體，其包括含有任一所闡述重組表現載體之宿主細胞以及至少一種其他細胞(例如不包括任一重組表現載體之宿主細胞(例如T細胞)或除T細胞外之細胞(例如B細胞、巨噬球、嗜中性球、紅血球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等))。或者，細胞群體可為實質上均質之群體，其中該群體主要包括含有重組表現載體之宿主細胞(例如基本上由其組成)。該群體亦可為純系細胞群體，其中該群體之所有細胞皆係包括重組表現載體之單一宿主細胞之純系，從而該群體之所有細胞皆包括重組表現載體。在本發明之一實施例中，細胞群體係包括含有如本文所闡述之重組表現載體之宿主細胞之純系群體。
在本發明之一實施例中，群體中之細胞數可快速擴增。可藉由業內已知之諸多方法中之任一者來擴增T細胞數，如例如以下文獻中所闡述：美國專利8,034,334；美國專利8,383,099；美國專利申請案公開案第2012/0244133號；Dudley等人，J. Immunother ., 26:332-42 (2003)；及Riddell等人，J. Immunol. Methods , 128:189-201 (1990)。在一實施例中，藉由一起培養T細胞與OKT3抗體、IL-2及飼養PBMC (例如經輻照同種異體PBMC)來擴增T細胞數。
可分離及/或純化本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體及宿主細胞(包含其群體)。本文所用之術語「經分離」意指自其天然環境取出。本文所用之術語「經純化」意指具有增加之純度，其中「純度」係相對術語，且無需解釋為絕對純度。舉例而言，純度可為至少約50%，可大於約60%、約70%、約80%、約90%、約95%，或可為約100%。
本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體及宿主細胞(包含其群體，在下文中通稱為「本發明TCR材料」)可調配成組合物(例如醫藥組合物)。就此而言，本發明提供一種醫藥組合物，其包括本文所闡述之TCR、多肽、蛋白質、核酸、表現載體及宿主細胞(包含其群體)中之任一者及醫藥上可接受之載劑。含有任一本發明TCR材料之本發明醫藥組合物可包括一種以上之本發明TCR材料(例如多肽及核酸)或兩種或更多種不同TCR。或者，醫藥組合物可包括本發明TCR材料與另一醫藥活性劑或藥物(例如化學治療劑)之組合，該等化學治療劑係(例如)天門冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、胺甲喋呤(methotrexate)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)等。
較佳地，載劑係醫藥上可接受之載劑。對於醫藥組合物而言，載劑可通常用於所考慮特定本發明TCR材料之任一者。製備可投與組合物之方法為熟習此項技術者所已知或明瞭且更詳細地闡述於(例如)Remington: The Science and Practice of Pharmacy ，第22版，Pharmaceutical Press (2012)。較佳地，醫藥上可接受之載劑係在使用條件下無有害副效應或毒性者。
載劑之選擇部分地取決於特定本發明TCR材料以及用於投與本發明TCR材料之特定方法。因此，本發明之醫藥組合物存在各種適宜調配物。適宜調配物可包含用於非經腸、皮下、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、腫瘤內或腹膜腔內投與之任一者。可使用一種以上途徑來投與本發明TCR材料，且在某些情況下，特定途徑可提供較另一途徑更迅速且更有效之反應。
較佳地，本發明TCR材料係藉由注射(例如經靜脈內)來投與。在時，本發明TCR材料係表現本發明TCR之宿主細胞(或其群體)，用於注射用細胞之醫藥上可接受之載劑可包含任一等滲載劑(例如生理鹽水(於水中之約0.90% w/v NaCl、於水中之約300 mOsm/L NaCl或約9.0 g NaCl/公升水)、NORMOSOL R電解質溶液(Abbott, Chicago, IL)、PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL)、於水中之約5%右旋糖或林格氏乳酸鹽(Ringer's lactate))。在一實施例中，醫藥上可接受之載劑補充有人類血清蛋白。
出於本發明目的，所投與本發明TCR材料之量或劑量(例如在本發明TCR材料係一或多種細胞時之細胞數)應足以在個體或動物中經適當時間範圍產生一定效應(例如治療性或防治性反應)。舉例而言，本發明TCR材料之劑量應足以在投與後於約2小時或更長(例如12至24或更多小時)之時段內結合至癌症抗原(例如G12R RAS)或檢測、治療或預防癌症。在某些實施例中，該時間段可甚至更長。劑量取決於特定本發明TCR材料之效能及動物(例如人類)之病狀以及擬治療動物(例如人類)之體重。
業內已知用於測定投與劑量之許多分析。出於本發明目的，可使用包括以下過程之分析來測定擬投與哺乳動物之起始劑量：在一組各自給予不同劑量之T細胞之哺乳動物中，比較在向哺乳動物投與既定劑量之該等T細胞後靶細胞裂解或藉由表現本發明TCR、多肽或蛋白質之T細胞分泌IFN-γ之程度。可藉由業內已知方法來分析在投與某一劑量後靶細胞裂解或IFN-γ分泌之程度。
本發明TCR材料之劑量亦取決於任何可伴隨投與特定本發明TCR材料之不良副效應之存在、性質及程度。通常，在考慮各種因素(例如年齡、體重、整體健康狀況、飲食、性別、擬投與之本發明TCR材料、投與途徑及所治療癌症之嚴重程度)後，主治醫師經決定擬治療每一個別患者之本發明TCR材料之劑量。在本發明TCR材料係細胞群體之實施例中，每一輸注所投與之細胞數可(例如)自約1 × 106 至約1 × 1012 個細胞或更多有所變化。在某些實施例中，可投與少於1 × 106 個細胞。
熟習此項技術者易於瞭解，本發明之發明性TCR材料可以任一數量之方式來進行修飾，從而經由修飾來增加本發明TCR材料之治療性或防治性效能。舉例而言，本發明TCR材料可直接或經由橋間接偶聯至化學治療劑。業內已知使化合物偶聯至化學治療劑之實踐。熟習此項技術者認識到，本發明TCR材料上並非本發明TCR材料之功能所需之位點係用於附接橋及/或化學治療劑之適宜位點，條件係橋及/或化學治療劑在附接至本發明TCR材料後並不干擾本發明TCR材料之功能(亦即能夠結合至G12R RAS或檢測、治療或預防癌症)。
本發明醫藥組合物、TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞及細胞群體預計可用於治療或預防癌症之方法中。不受限於特定理論，據信，本發明TCR特異性結合至G12R RAS，從而TCR (或相關之本發明多肽或蛋白質)在由細胞表現時能夠調介針對表現G12R RAS之靶細胞之免疫反應。就此而言，本發明之一實施例提供治療或預防哺乳動物之癌症之方法，其包括以有效治療或預防哺乳動物之癌症之量向哺乳動物投與本文所闡述之任一醫藥組合物、TCR、多肽或蛋白質、任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽、蛋白質之核苷酸序列之核酸或重組表現載體或任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之重組載體之宿主細胞或細胞群體。
本發明之一實施例提供在哺乳動物中誘導針對癌症之免疫反應之方法，其包括以在哺乳動物中有效誘導針對癌症之免疫反應之量向哺乳動物投與本文所闡述之任一醫藥組合物、TCR、多肽或蛋白質、任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列之核酸或重組表現載體或任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之重組載體之宿主細胞或細胞群體。
本發明之一實施例提供本文所闡述之任一醫藥組合物、TCR、多肽或蛋白質、任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽、蛋白質之核苷酸序列之核酸或重組表現載體或任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之重組載體之宿主細胞或細胞群體，其用於治療或預防哺乳動物之癌症。
本發明之一實施例提供本文所闡述之任一醫藥組合物、TCR、多肽或蛋白質、任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之核苷酸序列之核酸或重組表現載體或任一包括編碼本文所闡述之任一TCR、多肽或蛋白質之重組載體之宿主細胞或細胞群體，其用於在哺乳動物中誘導針對癌症之免疫反應。
本文所用之術語「治療」及「預防」以及其源於其之詞語未必意味著100%或完全治療或預防。而是，存在熟習此項技術者認為具有潛在益處或治療效應之不同治療或預防程度。就此而言，本發明方法可在哺乳動物中提供癌症之任何量之任何水準的治療或預防。另外，由本發明方法提供之治療或預防可包含治療或預防所治療或預防癌症之一或多種病狀或症狀。舉例而言，治療或預防可包含促進腫瘤消退。同樣，出於本文中之目的，「預防」可涵蓋延遲癌症或其症狀或病狀之發作。替代地或另外，「預防」可涵蓋預防或延遲癌症或其症狀或病狀之發作。
亦提供檢測哺乳動物中之癌症之存在之方法。該方法包括(i)使包括一或多種來自哺乳動物之細胞之試樣與本文所闡述之任一本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞、細胞群體或醫藥組合物接觸，由此形成複合物，及檢測複合物，其中複合物之檢測指示在哺乳動物中存在癌症。
就檢測哺乳動物之癌症之本發明方法而言，細胞試樣可為包括全細胞、其溶解物或全細胞溶解物之一部分(例如細胞核或細胞質部分、全蛋白部分或核酸部分)之試樣。
出於檢測癌症之本發明方法之目的，接觸可發生於哺乳動物之活體外或活體內。較佳地，接觸係在活體外進行。
同樣，可經由業內已知之任一數量方式來檢測複合物。舉例而言，本文所闡述之本發明TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表現載體、宿主細胞或細胞群體可經可檢測標記(例如放射性同位素、螢光團(例如螢光黃異硫氰酸酯(FITC)、藻紅素(PE))、酶(例如鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)及元素顆粒(例如金顆粒))標記。
出於投與宿主細胞或細胞群體之本發明方法之目的，細胞可為哺乳動物之同種異體或自體細胞。較佳地，細胞對哺乳動物係自體的。
就本發明方法而言，癌症可為任一癌症，包含以下中之任一者：急性淋巴球性癌症、急性骨髓樣白血病、肺泡橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳癌、肛門癌、肛管癌或直腸肛門癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓樣癌症、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、子宮頸癌、胃腸道類癌腫瘤、神經膠質瘤、何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰臟癌、腹膜癌、網膜癌及隔膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌及膀胱癌。較佳癌症係胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。較佳地，肺癌係肺腺癌，卵巢癌係上皮卵巢癌，且胰臟癌係胰臟腺癌。在本發明之一實施例中，癌症表現在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列，其中突變人類RAS胺基酸序列係突變人類KRAS、突變人類HRAS或突變人類NRAS胺基酸序列，且其中位置12係分別參照WT人類KRAS、WT人類HRAS或WT人類NRAS蛋白所定義。由癌症表現之突變人類KRAS、突變人類HRAS及突變人類NRAS可如本文針對本發明之其他態樣所闡述。
本發明方法中所提及之哺乳動物可為任一哺乳動物。如本文中所使用，術語「哺乳動物」係指任一哺乳動物，包含(但不限於)嚙齒目之哺乳動物(例如小鼠及倉鼠)及兔形目之哺乳動物(例如兔)。較佳地，哺乳動物係來自食肉目，包含貓科(貓)及犬科(狗)。更佳地，哺乳動物係來自偶蹄目(包含牛科(牛)及豬科(豬))或奇蹄目(包含馬科(馬))。最佳地，哺乳動物係靈長目、猿目或猴目(猴)或類人猿目(人類及類人猿)。尤佳哺乳動物係人類。
下列實例進一步闡釋本發明，但當然不應解釋為以任一方式限制其範圍。 實例1
此實例顯示對含有G12R突變且由HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體呈現之人類KRAS具有抗原特異性之TCR之分離。
自轉移性胰臟癌患者(患者4270)之TIL分離對含有G12R突變且由HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體呈現之人類KRAS具有抗原特異性之TCR。自針對KRAS G12R展示特異性識別且針對WT KRAS並不展示特異性識別之TIL來分離TCR。
為對反應性4270 TCR進行測序，藉由螢光活化細胞分選(FACS)基於T細胞活化標記物4-1BB之上調來分選反應性TIL。隨後，裂解細胞，且對TCR轉錄物實施桑格測序(Sanger sequenced)。4270 TCR α及β鏈可變區之胺基酸序列展示於表5中。對CDR加下劃線。 表5
TCR 名稱 TCR 鏈 胺基酸序列
4270 TCR α (TRAV29)(具有N端信號肽) MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDY FLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDK NEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGNTGTASKLTFGTGTRLQVTL(SEQ ID NO: 15)
β (TRBV19*02) (具有N端信號肽) MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDA MYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVND FQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSNQLVTGGYGYTFGSGTRLTVV(SEQ ID NO: 16)
α (TRAV29) (不具有N端信號肽之預測序列) SQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDY FLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDK NEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASGNTGTASKLTFGTGTRLQVTL (SEQ ID NO: 41)  
β (TRBV19*02) (不具有N端信號肽之預測序列) GGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDA MYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVND FQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSNQLVTGGYGYTFGSGTRLTVV (SEQ ID NO: 42)  
實例2
此實例證實，經實例1中所分離4270 TCR轉導之細胞特異性識別G12R RAS肽。
將編碼實例1之G12R RAS反應性4270 TCR且包含經半胱胺酸取代、經LVL修飾之鼠類恆定區之核酸序列選殖至逆轉錄病毒表現載體中。α鏈鼠類恆定區包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，其中位置48之X係Cys，位置112之X係Leu，位置114之X係Ile，且位置115之X係Val。β鏈恆定區包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，其中位置57之X係Cys。包括RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)之胺基酸序列之連接體位於α鏈恆定區與β鏈可變區之間。使用逆轉錄病毒表現載體轉導同種異體PBMC。
將轉導細胞與經WT RAS肽MTEYKLVVVGAG GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 40)或G12R RAS肽MTEYKLVVVGAR GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 39)之連續稀釋液脈衝化之自體DC一起共培養過夜。藉由酶聯免疫斑點法(ELISpot)評價IFNγ分泌。結果展示於圖1中。
如圖1中所展示，經4270 TCR轉導之細胞特異性識別G12R RAS肽。 實例3
此實例證實，經實例1中所分離4270 TCR轉導之細胞識別呈現於HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體之背景中之G12R RAS肽。
使用實例2之逆轉錄病毒表現載體以病毒方式轉導同種異體PBMC。使用由患者4270表現且展示於圖2中之HLA分子中之一者轉染靶COS7細胞。然後使用G12R RAS肽MTEYKLVVVGAR GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 39)將經轉染COS7細胞脈衝化。將4270 TCR轉導細胞與經脈衝化、轉染之COS7細胞一起共培養過夜。藉由ELISA評價IFNγ分泌。結果展示於圖2中。
如圖2中所展示，經實例1中所分離4270 TCR轉導之細胞特異性識別呈現於HLA-DRB5*01:HLA-DRA*01:01異二聚體之背景中之G12R RAS肽。 實例4
此實例顯示對含有G12R突變且由HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體呈現之人類KRAS具有抗原特異性之TCR之分離。
自轉移性結腸癌患者(患者4268)之TIL分離對含有G12R突變且由HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體呈現之人類KRAS具有抗原特異性之TCR。自針對KRAS G12R展示特異性識別且針對WT KRAS並不展示特異性識別之TIL來分離TCR。
為對反應性4268 TCR進行測序，基於T細胞活化標記物4-1BB之上調來對反應性TIL進行FACS分選。隨後，裂解細胞，且對TCR轉錄物實施桑格測序。4268 TCR α及β鏈可變區之胺基酸序列展示於表6中。對CDR加下劃線。 表6
TCR 名稱 TCR 鏈 胺基酸序列
4268 TCR α (TRAV12*-2*01) (具有N端信號肽) MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQS FFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGD KEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVEGAGSYQLTFGKGTKLSVIP(SEQ ID NO: 13)
β (TRBV20-1*01) (具有N端信號肽) MLLLLLLLGPGISLLLPGSLAGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATT MFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKA TYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSASNRLAVNEQFFGPGTRLTVL(SEQ ID NO: 14)
α (TRAV12*-2*01) (不具有N端信號肽之預測序列) SQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQS FFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGD KEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAVEGAGSYQLTFGKGTKLSVIP (SEQ ID NO: 43)  
β (TRBV20-1*01) (不具有N端信號肽之預測序列) AGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATT MFWYRQFPKQSLMLMATSNEGSKA TYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSASNRLAVNEQFFGPGTRLTVL (SEQ ID NO: 44)  
實例5
此實例證實，經實例4中所分離之4268 TCR轉導之細胞特異性識別G12R RAS肽。
將編碼實例4之G12R RAS反應性4268 TCR且包含經半胱胺酸取代、經LVL修飾之鼠類恆定區之核酸序列選殖至逆轉錄病毒表現載體中。α鏈鼠類恆定區包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，其中位置48之X係Cys，位置112之X係Leu，位置114之X係Ile，且位置115之X係Val。β鏈恆定區包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，其中位置57之X係Cys。包括RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 38)之胺基酸序列之連接體位於α鏈恆定區與β鏈可變區之間。使用逆轉錄病毒表現載體轉導同種異體PBMC。
將經轉導細胞與經WT RAS肽MTEYKLVVVGAG GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 40)或G12R RAS肽MTEYKLVVVGAR GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 39)之連續稀釋液脈衝化之自體DC一起共培養過夜。藉由ELIspot評價IFNγ分泌。結果展示於圖3中。
如圖3中所展示，經4268 TCR轉導之細胞特異性識別G12R RAS肽。 實例6
此實例證實，經實例4中所分離之4268 TCR轉導之細胞識別呈現於HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體之背景中之G12R RAS肽。
使用實例5之逆轉錄病毒表現載體以病毒方式轉導同種異體PBMC。使用由患者4268表現且展示於圖4中之HLA分子中之一者轉染靶COS7細胞。然後使用G12R RAS肽MTEYKLVVVGAR GVGKSALTIQLI (SEQ ID NO: 39)將經轉染COS7細胞脈衝化。將4268 TCR轉導細胞與經脈衝化、轉染之COS7細胞一起共培養過夜。藉由ELISA評價IFNγ分泌。結果展示於圖4中。
如圖4中所展示，經實例4中所分離之4268 TCR轉導之細胞特異性識別呈現於HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體之背景中之G12R RAS肽。
本文所引用之所有參考文獻(包含出版物、專利申請案及專利)皆以引用方式併入本文中，其併入程度如同每一參考文獻個別地且具體地指示為以引用方式併入且其全文陳述於本文中一般。
在闡述本發明之背景中(尤其在下列申請專利範圍之背景中)，除非另外指示於本文中或與上下文明顯矛盾，否則術語「一個(a及an)」及「該(the)」及「至少一個」以及類似指示詞之使用擬解釋為涵蓋單數及複數。除非另外指示於本文中或與上下文明顯矛盾，否則後接有一或多個物項之清單之術語「至少一個」 (例如「A及B中之至少一者」)擬解釋為意指一個選自所列示物項之物項(A或B)或所列示物項中之兩者或更多者之組合(A及B)。除非另有所述，否則術語「包括(comprising)」、「具有(having)」、「包含(including)」及「含有(containing)」擬解釋為開放性術語(亦即意指「包含(但不限於)」)。除非另外指示於本文中，否則本文中值範圍之列舉僅意欲用作個別地提及落入該範圍內之每一單獨值之簡寫方法，且每一單獨值併入本說明書中，如圖其個別地列舉於本文中一般。除非另外指示於本文中或另外與上下文明顯矛盾，否則本文所闡述之所有方法皆可以任一適宜順序來實施。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或實例性語言(如(例如))之使用僅意欲更佳地闡釋本發明且並不對本發明範圍施加限值。本說明書中之任何語言皆不應解釋為指示對於本發明實踐必不可少之任何未主張要素。
本文闡述本發明之較佳實施例，包含發明者已知用於實施例本發明之最佳模式。熟習此項技術者在閱讀前述說明後可明瞭彼等較佳實施例之變化形式。發明者期望熟習此項技術者適宜地採用該等變化形式，且發明者期望較本文所具體闡述以其他方式來實踐本發明。因此，本發明包含適用法律所允許之隨附申請專利範圍中所列舉之標的物之所有修改及等效物。另外，除非另外指示於本文中或另外與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋其所有可能變化形式中之上述要素之任一組合。
圖1係展示在共培養4270 TCR轉導細胞與自體DC後檢測之干擾素γ (IFNγ)陽性斑點數/2 × 104 (2E4)個細胞之圖形。在共培養之前，使用WT RAS肽(正方形)或G12R RAS肽(圓)之連續稀釋液(ng/mL)將自體DC脈衝化。
圖2係展示在共培養4270 TCR轉導細胞與COS7細胞後檢測之IFNγ濃度(pg/mL)之圖形。在共培養之前，使用所指示HLA分子中之一者轉染COS7細胞且然後使用G12R RAS肽脈衝化。HLA-DRA01:01係DRB1*11:01、DRB1*15:01、DRB3*02:02、DRB4*01:01及DRB5*01中之每一者之異二聚體之第二成員。
圖3係展示在共培養4268 TCR轉導細胞與自體DC後檢測之IFNγ陽性斑點數/2E4個細胞之圖形。在共培養之前，使用WT RAS肽(正方形)或G12R RAS肽(圓)之連續稀釋液(ng/mL)將自體DC脈衝化。
圖4係展示在共培養4268 TCR轉導細胞與COS7細胞後檢測之IFNγ濃度(pg/mL)之圖形。在共培養之前，使用所指示HLA分子中之一者轉染COS7細胞且然後使用G12R RAS肽脈衝化。HLA-DRA01:01係DRB1*11:01、DRB1*12:01、DRB3*02、DRB4*01及DRB5*01中之每一者之異二聚體之第二成員。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036

Claims (52)

  1. 一種經分離或經純化之T細胞受體(TCR)，其中該TCR對於在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列具有抗原特異性， 其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)，或突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列，且 其中位置12係分別參照野生型人類KRAS蛋白、野生型人類HRAS蛋白或野生型人類NRAS蛋白定義。
  2. 如請求項1之TCR，其中該突變人類RAS胺基酸序列係SEQ ID NO: 39。
  3. 如請求項1或2之TCR，其中該TCR對SEQ ID NO: 40之野生型人類RAS胺基酸序列不具有抗原特異性。
  4. 如請求項1或2之TCR，其中該突變人類RAS胺基酸序列係由人類白血球抗原(HLA)第II類分子呈現。
  5. 如請求項4之TCR，其中該HLA第II類分子係HLA-DR異二聚體或HLA-DQ異二聚體。
  6. 如請求項4之TCR，其中該HLA第II類分子係HLA-DRB5:HLA-DRA異二聚體或HLA-DQA1:HLA-DQB1異二聚體。
  7. 如請求項4之TCR，其中該HLA第II類分子係HLA-DRB5*01: HLA-DRA*01:01異二聚體或HLA-DQA1*05:05:HLA-DQB1*03:01異二聚體。
  8. 如請求項1或2之TCR，其包括以下胺基酸序列： (a) SEQ ID NO: 1至3之全部， (b) SEQ ID NO: 4至6之全部， (c) SEQ ID NO: 7至9之全部， (d) SEQ ID NO: 10至12之全部， (e) SEQ ID NO: 1至6之全部，或 (f) SEQ ID NO: 7至12之全部。
  9. 如請求項1或2之TCR，其包括以下胺基酸序列： (i) SEQ ID NO: 13， (ii) SEQ ID NO: 14， (iii) SEQ ID NO: 15， (iv) SEQ ID NO: 16， (v) SEQ ID NO: 13及14二者， (vi) SEQ ID NO: 15及16二者， (vii) SEQ ID NO: 41， (viii) SEQ ID NO: 42， (ix) SEQ ID NO: 43， (x) SEQ ID NO: 44， (xi) SEQ ID NO: 41及42二者，或 (xii) SEQ ID NO: 43及44二者。
  10. 如請求項1或2之TCR，其進一步包括： (a)包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之α鏈恆定區，其中： (i) SEQ ID NO: 26之位置48之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 26之位置112之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 26之位置114之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 26之位置115之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b)包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之β鏈恆定區，其中SEQ ID NO: 27之位置57之X係Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)二者。
  11. 如請求項1或2之經分離或經純化之TCR，其包括： (a)包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之α鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 30之位置180之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 30之位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 30之位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 30之位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b)包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之β鏈，其中SEQ ID NO: 31之位置198之X係Ser或Cys； (c)包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之α鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 32之位置188之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 32之位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 32之位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 32之位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (d)包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之β鏈，其中SEQ ID NO: 33之位置191之X係Ser或Cys； (e) (a)及(b)二者； (f) (c)及(d)二者； (g)包括SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之α鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 45之位置161之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 45之位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 45之位置227之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 45之位置228之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (h)包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之β鏈，其中SEQ ID NO: 46之位置178之X係Ser或Cys； (i)包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之α鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 47之位置168之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 47之位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 47之位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 47之位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (j)包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之β鏈，其中SEQ ID NO: 48之位置171之X係Ser或Cys； (k) (g)及(h)二者；或 (l) (i)及(j)二者。
  12. 一種經分離或經純化之多肽，其包括如請求項1至11中任一項之TCR之功能部分，其中該功能部分包括以下胺基酸序列： (a) SEQ ID NO: 1至3之全部， (b) SEQ ID NO: 4至6之全部， (c) SEQ ID NO: 7至9之全部， (d) SEQ ID NO: 10至12之全部， (e) SEQ ID NO: 1至6之全部，或 (f) SEQ ID NO: 7至12之全部。
  13. 如請求項12之經分離或經純化之多肽，其中該功能部分包括以下胺基酸序列： (i) SEQ ID NO: 13， (ii) SEQ ID NO: 14， (iii) SEQ ID NO: 15， (iv) SEQ ID NO: 16， (v) SEQ ID NO: 13及14二者， (vi) SEQ ID NO: 15及16二者， (vii) SEQ ID NO: 41， (viii) SEQ ID NO: 42， (ix) SEQ ID NO: 43， (x) SEQ ID NO: 44， (xi) SEQ ID NO: 41及42二者，或 (xii) SEQ ID NO: 43及44二者。
  14. 如請求項12或13之經分離或經純化之多肽，其進一步包括： (a) SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 26之位置48之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 26之位置112之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 26之位置114之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 26之位置115之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b) SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 27之位置57之X係Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)二者。
  15. 如請求項12或13之經分離或經純化之多肽，其包括： (a) SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 30之位置180之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 30之位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 30之位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 30之位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b) SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 31之位置198之X係Ser或Cys； (c) SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 32之位置188之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 32之位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 32之位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 32之位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (d) SEQ ID NO: 33之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 33之位置191之X係Ser或Cys； (e) (a)及(b)二者； (f) (c)及(d)二者； (g) SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 45之位置161之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 45之位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 45之位置227之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 45之位置228之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (h) SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 46之位置178之X係Ser或Cys； (i) SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，其中： (i) SEQ ID NO: 47之位置168之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 47之位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 47之位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 47之位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (j) SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，其中SEQ ID NO: 48之位置171之X係Ser或Cys； (k) (g)及(h)二者；或 (l) (i)及(j)二者。
  16. 一種經分離或經純化之蛋白質，其包括至少一種如請求項12至15中任一項之多肽。
  17. 如請求項16之經分離或經純化之蛋白質，其包括： (a)包括SEQ ID NO: 1至3之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 4至6之胺基酸序列之第二多肽鏈；或 (b)包括SEQ ID NO: 7至9之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 10至12之胺基酸序列之第二多肽鏈。
  18. 如請求項16或17之經分離或經純化之蛋白質，其包括： (i)包括SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之第二多肽鏈； (ii)包括SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之第二多肽鏈； (iii)包括SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之第二多肽鏈；或 (iv)包括SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之第一多肽鏈及包括SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之第二多肽鏈。
  19. 如請求項16或17之經分離或經純化之蛋白質，其進一步包括： (a)包括SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之第一多肽鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 26之位置48之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 26之位置112之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 26之位置114之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 26之位置115之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b)包括SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之第二多肽鏈，其中SEQ ID NO: 27之位置57之X係Ser或Cys；或 (c) (a)及(b)二者。
  20. 如請求項16或17之經分離或經純化之蛋白質，其包括： (a)包括SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之第一多肽鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 30之位置180之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 30之位置244之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 30之位置246之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 30之位置247之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (b)包括SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之第二多肽鏈，其中SEQ ID NO: 31之位置198之X係Ser或Cys； (c)包括SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之第一多肽鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 32之位置188之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 32之位置252之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 32之位置254之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 32之位置255之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (d)包括SEQ ID NO: 33之胺基酸序列之第二多肽鏈，其中SEQ ID NO: 33之位置191之X係Ser或Cys； (e) (a)及(b)二者； (f) (c)及(d)二者； (g)包括SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之第一多肽鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 45之位置161之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 45之位置225之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 45之位置227之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 45之位置228之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (h)包括SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之第二多肽鏈，其中SEQ ID NO: 46之位置178之X係Ser或Cys； (i)包括SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之第一多肽鏈，其中： (i) SEQ ID NO: 47之位置168之X係Thr或Cys； (ii) SEQ ID NO: 47之位置232之X係Ser、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (iii) SEQ ID NO: 47之位置234之X係Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe或Trp；且 (iv) SEQ ID NO: 47之位置235之X係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp； (j)包括SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之第二多肽鏈，其中SEQ ID NO: 48之位置171之X係Ser或Cys； (k) (g)及(h)二者；或 (l) (i)及(j)二者。
  21. 一種經分離或經純化之核酸，其包括編碼如請求項1至11中任一項之TCR、如請求項12至15中任一項之多肽或如請求項16至20中任一項之蛋白質之核苷酸序列。
  22. 一種經分離或經純化之核酸，其自5’至3’包括第一核酸序列及第二核苷酸序列，其中該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列分別編碼以下胺基酸序列：SEQ ID NO: 13及14；14及13；15及16；16及15；30及31；31及30；32及33；33及32；34及35；35及34；36及37；37及36；41及42；42及41；43及44；44及43；45及46；46及45；47及48；48及47；49及50；50及49；51及52；或52及51。
  23. 如請求項22之經分離或經純化之核酸，其進一步包括第三核苷酸序列插入該第一核苷酸序列及該第二核苷酸序列之間，其中該第三核苷酸序列編碼可裂解連接肽。
  24. 如請求項23之經分離或經純化之核酸，其中該可裂解連接肽包括SEQ ID NO: 38之胺基酸序列。
  25. 一種重組表現載體，其包括如請求項21至24中任一項之核酸。
  26. 如請求項25之重組表現載體，其係轉位子或慢病毒載體。
  27. 一種經分離或經純化之TCR，其係由如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之載體編碼。
  28. 一種經分離或經純化之多肽，其係由如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之載體編碼。
  29. 一種經分離或經純化之蛋白質，其係由如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之載體編碼。
  30. 一種經分離或經純化之TCR，其係由如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之載體在細胞中表現產生。
  31. 一種經分離或經純化之多肽，其係由如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之載體在細胞中表現產生。
  32. 一種經分離或經純化之蛋白質，其係由如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之載體在細胞中表現產生。
  33. 一種產生表現對於SEQ ID NO: 39之肽具有抗原特異性之TCR之宿主細胞的方法，該方法包括使細胞與如請求項25或26之載體在容許該載體引入該細胞中之條件下接觸。
  34. 一種經分離或經純化之宿主細胞，其包括如請求項21至24中任一項之核酸或如請求項25或26之重組表現載體。
  35. 如請求項34之宿主細胞，其中該細胞係人類淋巴球。
  36. 如請求項34或35之宿主細胞，其中該細胞係選自由以下組成之群：T細胞、天然殺手T (NKT)細胞、不變(invariant)之天然殺手T (iNKT)細胞，及天然殺手(NK)細胞。
  37. 一種經分離或經純化之細胞群體，其包括如請求項34至36中任一項之宿主細胞。
  38. 一種產生如請求項1至11、27或30中任一項之TCR、如請求項12至15、28或31中任一項之多肽或如請求項16至20、29或32中任一項之蛋白質之方法，該方法包括培養如請求項34至36中任一項之宿主細胞或如請求項37之宿主細胞群體，從而產生該TCR、該多肽或該蛋白質。
  39. 一種醫藥組合物，其包括(a)如請求項1至11、27或30中任一項之TCR、如請求項12至15、28或31中任一項之多肽或如請求項16至20、29或32中任一項之蛋白質、如請求項21至24中任一項之核酸、如請求項25或26之重組表現載體、如請求項34至36中任一項之宿主細胞或如請求項37之細胞群體，及(b)醫藥上可接受之載劑。
  40. 一種檢測哺乳動物中癌症存在之方法，該方法包括： (a)使包括癌細胞之試樣與如請求項1至11、27或30中任一項之TCR、如請求項12至15、28或31中任一項之多肽或如請求項16至20、29或32中任一項之蛋白質、如請求項21至24中任一項之核酸、如請求項25或26之重組表現載體、如請求項34至36中任一項之宿主細胞、如請求項37之細胞群體或如請求項39之醫藥組合物接觸，由此形成複合物；及 (b)檢測該複合物， 其中該複合物之檢測指示該哺乳動物中存在癌症。
  41. 如請求項40之方法，其中該癌症表現在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列， 其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列，且 其中位置12係分別參照野生型人類KRAS蛋白、野生型人類HRAS蛋白或野生型人類NRAS蛋白定義。
  42. 如請求項41之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)胺基酸序列。
  43. 如請求項41之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列。
  44. 如請求項41之方法，其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)胺基酸序列。
  45. 如請求項40至44中任一項之方法，其中該癌症係胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。
  46. 一種如請求項1至11、27或30中任一項之TCR、如請求項12至15、28或31中任一項之多肽或如請求項16至20、29或32中任一項之蛋白質、如請求項21至24中任一項之核酸、如請求項25或26之重組表現載體、如請求項34至36中任一項之宿主細胞、如請求項37之細胞群體或如請求項39之醫藥組合物之用途，其用以製造用於在哺乳動物中誘導針對癌症之免疫反應之藥劑。
  47. 一種如請求項1至11、27或30中任一項之TCR、如請求項12至15、28或31中任一項之多肽或如請求項16至20、29或32中任一項之蛋白質、如請求項21至24中任一項之核酸、如請求項25或26之重組表現載體、如請求項34至36中任一項之宿主細胞、如請求項37之細胞群體或如請求項39之醫藥組合物之用途，其用以製造用於治療或預防哺乳動物之癌症之藥劑。
  48. 如請求項46或47之用途，其中該癌症表現在位置12之甘胺酸經精胺酸取代之突變人類RAS胺基酸序列， 其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)、突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)或突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列，且 其中位置12係分別參照野生型人類KRAS蛋白、野生型人類HRAS蛋白或野生型人類NRAS蛋白定義。
  49. 如請求項48之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(KRAS)胺基酸序列。
  50. 如請求項48之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類神經母細胞瘤大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(NRAS)胺基酸序列。
  51. 如請求項48之用途，其中該突變人類RAS胺基酸序列係突變人類Harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同系物(HRAS)胺基酸序列。
  52. 如請求項46或47之用途，其中該癌症係胰臟癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。
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