JP2024502034A - Ｃｄ８ポリペプチド、組成物、及びそれらの使用方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）をＣＤ８ポリペプチドと一緒に共発現することができるＴ細胞、及び養子細胞療法におけるそれらの使用に関する。本開示は、改変ＣＤ８配列、ベクター、及びそれらの関連する方法を更に提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、特許協力条約に基づく国際出願であり、２０２０年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２，８２４号、２０２１年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／２４７，７７５号、及び２０２１年１月４日に出願された独国仮特許出願第１０２０２１１０００３８．６号の優先権を主張し、その内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
配列表の公式コピーは、２０２１年１２月２８日に作成され、５１４，６１０キロバイトのサイズを有する「３００００１１－０２２９７７＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿Ｆｉｎａｌ．ｔｘｔ」という名前のファイルを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）をＣＤ８ポリペプチドと一緒に共発現することができるＴ細胞、及び養子細胞療法におけるそれらの使用に関する。本開示は、改変ＣＤ８配列、ベクター、組成物、形質転換Ｔ細胞、及びそれらの関連する方法を更に提供する。
ＣＤ８及びＣＤ４は、抗原応答がそれぞれクラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子によって制限されるＴリンパ球の異なる集団に特徴的な膜貫通糖タンパク質である。それらは、胸腺発達中のＴ細胞の分化及び選択と、抗原提示細胞に応答する成熟Ｔリンパ球の活性化と、の両方において主要な役割を果たす。ＣＤ８及びＣＤ４は両方とも、免疫グロブリンスーパーファミリータンパク質である。それらは、抗原ペプチドを提示する領域とは異なる界面でＭＨＣ分子に結合することによって抗原拘束を決定するが、それらの類似の機能における構造的基礎は非常に異なると思われる。それらの配列類似性は低く、ＣＤ４は細胞表面上でモノマーとして発現されるが、ＣＤ８は、ααホモ二量体（例えば、図５５Ｃ）又はαβヘテロ二量体（例えば、図５５Ａ）として発現される。ヒトにおいて、このＣＤ８ααホモ二量体は、機能的にＣＤ８αβヘテロ二量体の代わりになり得る。ＣＤ８は、クラスＩ ＭＨＣのα３ドメイン内の酸性ループと接触し、それにより、その標的に対するＴ細胞の結合活性を増加させる。ＣＤ８はまた、そのα鎖細胞質尾部とチロシンキナーゼｐ５６ｌｃｋとの会合を介したＣＴＬ活性化につながるリン酸化事象に関与している。
免疫療法のための増強された、特異的な細胞傷害活性を有するＴ細胞を製造する方法を開発することが望ましい。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、ＣＤ８α免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＣＤ８β領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞質ドメインを含み得る。別の実施形態において、ＣＤ８β領域は、ＣＤ８βストーク領域又はドメインである。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含むＣＤ８β領域、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む膜貫通ドメイン、及び（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む細胞質ドメインを含み得る。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合した配列番号６、配列番号２９３、又は配列番号２９４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有するシグナルペプチドを含み得る。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、（ａ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号１、（ｂ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号２、（ｃ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号３、及び（ｄ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号４を含み得る。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、ＣＤ８α又は改変ＣＤ８αポリペプチドであり得る。
実施形態において、本開示は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸を提供する。
実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
実施形態において、ベクターは、α鎖及びβ鎖を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を含み得る。別の実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ－Ｔをコードする核酸を含み得る。
実施形態において、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖は、配列番号１５及び１６、１７及び１８、１９及び２０、２１及び２２、２３及び２４、２５及び２６、２７及び２８、２９及び３０、３１及び３２、３３及び３４、３５及び３６、３７及び３８、３９及び４０、４１及び４２、４３及び４４、４５及び４６、４７及び４８、４９及び５０、５１及び５２、５３及び５４、５５及び５６、５７及び５８、５９及び６０、６１及び６２、６３及び６４、６５及び６６、６７及び６８、６９及び７０、７１及び３０３、３０４及び７４、７５及び７６、７７及び７８、７９及び８０、８１及び８２、８３及び８４、８５及び８６、８７及び８８、８９及び９０、並びに９１及び９２から選択され得る。
実施形態において、ベクターは、ＣＤ８βポリペプチドをコードする核酸を含み得る。
実施形態において、ＣＤ８βポリペプチドは、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
実施形態において、ベクターは、改変ＣＤ８αポリペプチドをコードする核酸とＣＤ８βポリペプチドをコードする核酸との間に配置された２Ａペプチドをコードする核酸又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。
実施形態において、ベクターは、ＴＣＲα鎖をコードする核酸とＴＣＲβ鎖をコードする核酸との間に配置された２Ａペプチドをコードする核酸を含み得る。
実施形態において、２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（配列番号９３）、Ｔ２Ａ（配列番号９４）、Ｅ２Ａ（配列番号９５）、又はＦ２Ａ（配列番号９６）から選択され得る。
実施形態において、ＩＲＥＳは、ピコルナウイルスからのＩＲＥＳ、フラビウイルスからのＩＲＥＳ、ペスチウイルスからのＩＲＥＳ、レトロウイルスからのＩＲＥＳ、レンチウイルスからのＩＲＥＳ、昆虫ＲＮＡウイルスからのＩＲＥＳ、及び細胞ｍＲＮＡからのＩＲＥＳからなる群から選択され得る。
実施形態において、ベクターは、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）及びそのバリアント、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）、又はそれらの組み合わせから選択される転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列を更に含み得る。
実施形態において、ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含む改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、又はそれらの組み合わせから選択されるプロモーターを更に含み得る。
実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。
実施形態において、ベクターは、アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、フラウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、又はそれらの組み合わせから選択され得る。
実施形態において、ベクターは、天然のネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、ＲＤ１１４のキメラ型（ＲＤ１１４ＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ＧＡＬＶのキメラ型（ＧＡＬＶ－ＴＲ）、両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ ４０７０Ａ）、バキュロウイルス（ＧＰ６４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、トリペストウイルス（ＦＰＶ）、エボラウイルス（ＥｂｏＶ）、又はヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、又はそれらの組み合わせから選択されるウイルスのエンベロープタンパク質で偽型化され得る。
実施形態において、ベクターは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を更に含み得る。
別の実施形態において、ベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を更に含み得る。
実施形態において、単離された核酸は、α鎖及びβ鎖を含むＴ細胞受容体と、α鎖及びβ鎖を含むＣＤ８ポリペプチドと、をコードする核酸配列を含み得る。単離された核酸は、配列番号２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９５、２９７、２９９、又は３０１の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸を含み得る。単離された核酸は、配列番号２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９５、２９７、２９９、又は３０１の核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。態様において、本明細書に記載の配列は、単離されたか、又は組換えの配列であり得る。
実施形態において、単離された核酸は、配列番号２６７の核酸配列を含む。
実施形態において、単離された核酸は、配列番号２７９の核酸配列を含む。
実施形態において、単離されたポリペプチドは、本明細書に記載の核酸によってコードされ得る。
実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９６、２９８、３００、又は３０２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含み得る。アミノ酸配列は、配列番号２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９６、２９８、３００、又は３０２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。別の態様において、配列番号２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９６、２９８、３００、又は３０２は、１、２、３、４、５、１０、１５、又は２０個以上のアミノ酸置換又は欠失を含む。更に別の態様において、配列番号２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９６、２９８、３００、又は３０２は、最大で１、２、３、４、５、１０、１５、又は２０個のアミノ酸置換又は欠失を含む。
実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号２６８のアミノ酸配列を含み得る。
実施形態において、単離されたポリペプチドは、配列番号２８０のアミノ酸配列を含み得る。実施形態において、細胞は、ベクターで形質導入され得る。
実施形態において、細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、又はそれらの組み合わせを含み得る。
実施形態において、αβＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。
実施形態において、免疫療法のためのＴ細胞を調製する方法は、ヒト対象の血液試料からＴ細胞を単離することと、単離したＴ細胞を活性化することと、活性化したＴ細胞をベクターで形質導入することと、形質導入したＴ細胞を増殖することと、を含み得る。
実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞であり得る。
実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞であり得、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドを発現し得る。
実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞であり得、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチド、例えば、改変ＣＤ８αポリペプチド、又はＣＤ８βストーク領域を有する改変ＣＤ８αポリペプチド、例えば、構築物番号１１及び番号１２におけるｍ１ＣＤ８α（図４）及びＣＤ８α＊（図５５Ｂ）を発現し得る。
実施形態において、がんを有する患者を治療する方法は、患者に、増殖したＴ細胞の集団を含む組成物を投与することを含み得、Ｔ細胞は、表面でＭＨＣ分子との複合体にペプチドを提示するがん細胞を殺傷し、ペプチドは、配列番号９８～２５５から選択され、がんは、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
実施形態において、組成物は、アジュバントを更に含み得る。
実施形態において、アジュバントは、抗ＣＤ４０抗体、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）及び誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、ポリ（ラクチドコ－グリコリド）（ＰＬＧ）を有する微粒子製剤、ビロソーム、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、又はそれらの組み合わせから選択され得る。
実施形態において、がんを有する患者における免疫応答を誘発する方法は、患者に、増殖したＴ細胞の集団を含む組成物を投与することを含み得、Ｔ細胞は、表面でＭＨＣ分子との複合体にペプチドを提示するがん細胞を殺傷し、ペプチドは、配列番号９８～２５５から選択され、がんは、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、前立腺がん、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本開示は、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、配列番号５、７、２５８、２５９、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列と、Ｔ細胞受容体と、を含む外因性ＣＤ８共受容体を提示する改変Ｔ細胞の集団を更に提供する。
代表的なＣＤ８αサブユニット、例えば、配列番号２５８（ＣＤ８α１）を示す。この実施形態において、ＣＤ８α１は、５つのドメイン：（１）シグナルペプチド、（２）Ｉｇ様ドメイン－１、（３）ストーク領域、（４）膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び（５）ｌｃｋ結合モチーフを含む細胞質尾部（Ｃｙｔｏ）を含む。 ＣＤ８α１（配列番号２５８）とｍ１ＣＤ８α（配列番号７）との間の配列アライメントを示す。 ＣＤ８α２（配列番号２５９）とｍ２ＣＤ８α（配列番号２６２）との間の配列アライメントを示し、１１２位でのシステイン置換が矢印によって示される。 本開示の態様によるベクターを示す。 図５Ａ：図４に示されるウイルスベクターの力価を示す。図５Ｂ：本開示の実施形態による更なるウイルスベクターの力価を示す。構築物番号１３、構築物番号１４、構築物番号１５、構築物番号１６、構築物番号１７、構築物番号１８、構築物番号１９、構築物番号２１、構築物番号１０ｎ、構築物番号１１ｎ、及びＴＣＲ：ＰＲＡＭＥ－００４（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）（配列番号１４７）に結合するＲ１１ＫＥＡ（配列番号１５及び配列番号１６）（構築物番号８）。構築物番号１０及び番号１０ｎは、同じ構築物の異なるバッチ（配列番号２９１及び２９２）であり、構築物番号１１及び番号１１ｎは、同じ構築物の異なるバッチ（配列番号２８５及び２８６）であることに留意されたい。 Ｔ細胞製造を示す。 図７Ａ：ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞における活性化の前及び後の活性化マーカーの発現を示す。図７Ｂ：ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞における活性化の前及び後の活性化マーカーの発現を示す。 図８Ａ：ドナー番号１からの様々な構築物で形質導入した細胞の増殖倍率を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。構築物番号９及び番号９ｂは、同じ構築物の異なるバッチ（配列番号２８７及び２８８）であることに留意されたい。図８Ｂ：ドナー番号２からの様々な構築物で形質導入した細胞の増殖倍率を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）（構築物番号８）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 図９Ａ：構築物番号９で形質導入した細胞のフロープロットを示す。図９Ｂ：本開示の一実施形態による構築物番号１０で形質導入した細胞のフロープロットを示す。 図９Ｃ：構築物番号１１で形質導入した細胞のフロープロットを示す。図９Ｄ：構築物番号１２で形質導入した細胞のフロープロットを示す。 ドナー番号１及びドナー番号２について様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋％を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ型（ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋のＴｅｔ％を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞のＴｅｔ ＭＦＩ（ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋）を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８α ＭＦＩ（ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋）を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞の（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋ＣＤ４％を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞の（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋％を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ型（ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞のＴｅｔ ＭＦＩ（ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋）を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８α ＭＦＩ（ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋）を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞の（ＣＤ３＋のうちの）Ｔｅｔ＋％を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 様々な構築物で形質導入した細胞のＶＣＮ（上側パネル）及びＣＤ３＋Ｔｅｔ＋／ＶＣＮ（下側パネル）を示す。構築物は以下の通りである：構築物番号９ｂ、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、ＴＣＲ＝Ｒ１１ＫＥＡ．ＷＰＲＥｗｔ（野生型ＷＰＲＥによるＴＣＲ）、ＮＴ＝非形質導入Ｔ細胞（陰性対照として）。 図２０Ａ～２０Ｃ：異なるレベルで抗原を発現する標的陽性細胞株（細胞当たり１０８１コピーのＵＡＣＣ２５７、細胞当たり５０コピーのＡ３７５）に対する細胞傷害性を媒介する際に、構築物（番号１０、番号１１、及び番号１２）がＴＣＲのみに匹敵することを示すデータを示す。 同上 同上 図２１Ａ～２１Ｂ：ＵＡＣＣ２５７に応答するＩＦＮγ分泌が構築物間で同等であるが、Ａ３７５では、番号１０発現が、全ての構築物の中で最も高いことを示すデータを示す。しかしながら、番号９を、野生型及び改変ＣＤ８共受容体を発現する番号１１とそれぞれ比較すると、番号１１で形質導入したＴ細胞は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプレートからの上清中で定量化されたＩＦＮγとして測定された、より強いサイトカイン応答を誘導した。構築物番号９、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、構築物番号８＝Ｒ１１ＫＥＡ ＴＣＲのみ。 ＵＡＣＣ２５７及びＡ３７５標的に応答したＰＢＭＣ由来生成物によるＤＣ成熟及びサイトカイン分泌を評価するための例示的な実験設計を示す。Ｎ＝２。 図２３Ａ～２３Ｂ：Ａ３７５に応答するＩＦＮγ分泌が、ｉＤＣの存在中で増加することを示すデータを示す。ｉＤＣを添加した三共培養において、ＩＦＮγ分泌は、他の構築物と比較して、構築物番号１０において高い。しかしながら、構築物番号９を、野生型及び改変ＣＤ８共受容体を発現する構築物番号１１とそれぞれ比較すると、番号１１で形質導入したＴ細胞は、ドナーＤ６００１１５を使用した三元共培養、Ｅ：Ｔ：ｉＤＣ：：１：１／１０：１／４の培養上清において定量化されたＩＦＮγとして測定された、より強いサイトカイン応答を誘導した。構築物番号９、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、構築物番号８＝Ｒ１１ＫＥＡ ＴＣＲのみ。 図２４Ａ～２４Ｂ：Ａ３７５に応答するＩＦＮγ分泌が、ｉＤＣの存在中で増加することを示すデータを示す。ｉＤＣとの三共培養において、ＩＦＮγ分泌は、他の構築物と比較して、構築物番号１０において高かった。ＩＦＮγは、ドナーＤ１５００８１を使用した三元培養、Ｅ：Ｔ：ｉＤＣ：：１：１／１０：１／４の培養上清中で定量化した。構築物番号９、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、構築物番号８＝Ｒ１１ＫＥＡ ＴＣＲのみ。 図２５Ａ～２５Ｂ：ＵＡＣＣ２５７に応答するＩＦＮγ分泌が、ｉＤＣの存在中で増加することを示すデータを示す。ｉＤＣとの三共培養において、ＩＦＮγ分泌は、他の構築物と比較して、構築物番号１０において高い。しかしながら、番号９を、野生型及び改変ＣＤ８共受容体を発現する番号１１とそれぞれ比較すると、構築物番号１１で形質導入したＴ細胞は、ドナーＤ６００１１５を使用した三元共培養、Ｅ：Ｔ：ｉＤＣ：：１：１／１０：１／４の培養上清において定量化されたＩＦＮγとして測定された、より強いサイトカイン応答を誘導した。構築物番号９、構築物番号１０、構築物番号１１、構築物番号１２、構築物番号１、構築物番号２、構築物番号８＝Ｒ１１ＫＥＡ ＴＣＲのみ。 本開示の一実施形態によるＴ細胞製造を示す。 図２７Ａ：ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞における活性化の前及び後の活性化マーカーの発現を示す。図２７Ｂ：本開示の一実施形態による、ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞における活性化の前及び後の活性化マーカーの発現を示す。 様々な構築物で形質導入した細胞の増殖倍率を示す。 図２９Ａ及び２９Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋％を示す。 図３０Ａ及び３０Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋のＴｅｔ％を示す。 図３１Ａ及び３１Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞のＴｅｔ ＭＦＩ（ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋）を示す。 図３２Ａ及び３２Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞の（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋ＣＤ４＋％を示す。 図３３Ａ及び３３Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞の（ＣＤ３＋細胞のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋％を示す。 図３４Ａ及び３４Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞のＴｅｔ ＭＦＩ（ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋）を示す。 図３５Ａ及び３５Ｂ：本開示の一実施形態による、様々な構築物で形質導入した細胞の（ＣＤ３＋のうちの）Ｔｅｔ＋％を示す。 図３６Ａ及び３６Ｂ：本開示の一実施形態による様々な構築物で形質導入した細胞のＶＣＮを示す。 同上 本開示の一実施形態によるＴ細胞製造を示す。 様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋のＴｅｔ％を示す。 様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋のＴｅｔ ＭＦＩを示す。 様々な構築物で形質導入した細胞のＣＤ８＋Ｔｅｔ＋のＴｅｔ ＭＦＩを示す。 様々な構築物で形質導入したＣＤ３＋細胞のＴｅｔ＋％を示す。 様々な構築物を形質導入した細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す。 様々な構築物で形質導入した細胞中のＴ細胞サブセット％を示す。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ３＋ＴＣＲ＋でゲーティングした。 図４４Ａ及び図４４Ｂ：様々な構築物で形質導入した細胞におけるＴ細胞サブセット％を示す。ＦＡＣＳ分析は、図４４ＡではＣＤ４＋ＣＤ８＋で、図４４ＢではＣＤ４＋ＣＤ８＋ＴＣＲ＋でゲーティングした。 同上 図４５Ａ及び図４５Ｂ：高レベルの抗原（細胞当たり１０８１コピー）を発現するＵＡＣＣ２５７標的陽性細胞株に対する細胞傷害性を媒介する際に、構築物番号１３及び番号１０がＴＣＲのみに匹敵することを示すデータを示す。構築物番号１５も効果的であったが、構築物番号１３と番号１０と比較して殺傷が遅かった。これらの結果を得るために使用したエフェクター：標的比は、４：１だった。 同上 ＵＡＣＣ２５７細胞株で応答するＩＦＮγ分泌が、構築物番号１０と比較して構築物番号１３で高かったことを示す。ＩＦＮγは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプレートからの上清中で定量した。これらの結果を得るために使用したエフェクター：標的比は、４：１だった。 ＩＣＩマーカー頻度（２Ｂ４、４１ＢＢ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ３９＋ＣＤ６９＋、及びＣＤ３９－ＣＤ６９－）を示す。 図４８Ａ～４８Ｇ：他の構築物と比較して、構築物番号１０（ＷＴシグナルペプチド、ＣＤ８β１）で形質導入したＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦαの増加した発現を示す。ＦＡＣＳ分析は、ＵＡＣＣ２５７に対してＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でゲーティングした、４：１のＥ：Ｔ。 同上 同上 同上 図４９Ａ～４９Ｇ：他の構築物と比較して、構築物番号１０（ＷＴシグナルペプチド、ＣＤ８β１）で形質導入したＣＤ４－ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＭＩＰ－１β、及びＴＮＦαの増加した発現を示す。ＦＡＣＳ分析は、ＵＡＣＣ２５７に対してＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋細胞でゲーティングした、４：１のＥ：Ｔ。 同上 同上 同上 図５０Ａ～５０Ｇ：他の構築物と比較して、構築物番号１０（ＷＴシグナルペプチド、ＣＤ８β１）で形質導入したＣＤ３＋ＴＣＲ＋細胞によるＩＬ－２及びＴＮＦαの増加した発現を示す。ＦＡＣＳ分析を、ＵＡＣＣ２５７に対してＣＤ３＋ＴＣＲ＋細胞でゲーティングした、４：１のＥ：Ｔ。 同上 同上 同上 図５１Ａ～図５１Ｃ：Ａ３７５に対してＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でゲーティングしたＦＡＣＳ分析の結果を示す、４：１のＥ：Ｔ。 図５２Ａ～図５２Ｃ：Ａ３７５に対してＣＤ４－ＣＤ８＋細胞でゲーティングしたＦＡＣＳ分析の結果を示す、４：１のＥ：Ｔ。 図５３Ａ～図５３Ｃ：Ａ３７５に対してＣＤ３＋ＴＣＲ＋細胞でゲーティングしたＦＡＣＳ分析の結果を示す、４：１のＥ：Ｔ。 本開示の一実施形態によるＴ細胞製造を示す。 図５５Ａ～５５Ｃ：ＴＣＲとＣＤ８αβヘテロ二量体との複合体（図５５Ａ、例えば、Ｔ細胞を構築物番号２、番号３、番号４、番号１０、番号１３、番号１４、番号１５、番号１６、番号１７、番号１８、又は番号２１で形質導入することによって産生された）、ＴＣＲとＣＤ８βストーク領域で置き換えたそのストーク領域を有するホモ二量体ＣＤ８α（ＣＤ８αα＊）との複合体（図５５Ｂ、例えば、Ｔ細胞を構築物番号１１、番号１２、又は番号１９で形質導入することによって産生された）、及びＴＣＲとＣＤ８αホモ二量体の複合体（図５５Ｃ、例えば、Ｔ細胞を構築物番号１、番号５、番号６、番号７、又は番号９で形質導入することによって産生された）との複合体に結合することによる、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のペプチド／ＭＨＣ複合体とＴ細胞との間の相互作用を示す。 本開示の一実施形態による構築物番号１０又は番号１１及び未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）で形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞の存在における樹状細胞（ＤＣ）によるＩＬ－１２分泌のレベルを示す。 本開示の一実施形態による構築物番号１０又は番号１１及び未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）で形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞の存在における樹状細胞（ＤＣ）によるＴＮＦ－α分泌のレベルを示す。 本開示の一実施形態による構築物番号１０又は番号１１及び未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）で形質導入したＣＤ４＋Ｔ細胞の存在における樹状細胞（ＤＣ）によるＩＬ－６分泌のレベルを示す。 本開示の一実施形態による、様々な構築物及び標的細胞で形質導入したＰＢＭＣの存在における樹状細胞（ＤＣ）によるサイトカイン分泌のレベルを決定するスキームを示す。 本開示の一実施形態による様々な構築物及び標的細胞で形質導入したＰＢＭＣの存在における樹状細胞（ＤＣ）によるＩＬ－１２分泌のレベルを示す。 本開示の一実施形態による、様々な構築物及び標的細胞で形質導入したＰＢＭＣの存在における樹状細胞（ＤＣ）によるＴＮＦ－α分泌のレベルを示す。 本開示の一実施形態による様々な構築物及び標的細胞で形質導入したＰＢＭＣの存在における樹状細胞（ＤＣ）によるＩＬ－６分泌のレベルを示す。 図６３Ａ～６３Ｃ：本開示の一実施形態によるドナー番号１（図６３Ａ）、ドナー番号２（図６３Ｂ）、及びドナー番号３（図６３Ｃ）から得られた形質導入ＣＤ４＋選択Ｔ細胞からのＩＦＮγ産生を示す。図６３Ｄ：図６３Ａ～６３ＣにおけるＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）を示す。 同上 図６４Ａ～６４Ｃ：本開示の一実施形態によるドナー番号４（図６４Ａ）、ドナー番号１（図６４Ｂ）、及びドナー番号３（図６４Ｃ）から得られた形質導入ＰＢＭＣからのＩＦＮγ産生及びそれらのそれぞれのＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）を示す。 同上 同上 図６４Ｄ：図６４Ａ～６４Ｃの異なるドナー間のＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）の比較を示す。 図６５Ａ～６５Ｃ：本開示の一実施形態による単一ドナーからの形質導入されたＰＢＭＣ（図６５Ａ）、ＣＤ８＋選択Ｔ細胞（図６５Ｂ）、及びＣＤ４＋選択Ｔ細胞（図６５Ｃ）からのＩＦＮγ産生、並びにそれらのそれぞれのＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）を示す。 同上 同上
改変ＣＤ８ポリペプチド
本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチド（任意選択的）、ＣＤ８α免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ＣＤ８β領域（ドメイン）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞質ドメインの一般的構造を含み得る。本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドは、ＴＣＲ及びＣＤ８ポリペプチドを発現するベクターで共形質導入したＴ細胞の機能性に予想外の改善を示した。
本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチド（任意選択的）、ＣＤ８α免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、ストークドメイン又は領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、及びＣＤ８α細胞質ドメインの一般的構造を含み得る。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む領域、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む膜貫通ドメイン、及び（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の細胞質ドメインを含み得る。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、Ｔ細胞においてＴ細胞受容体又はＣＡＲ－Ｔと共発現され得、養子細胞療法（ＡＣＴ）の方法で使用され得る。Ｔ細胞は、αβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
別の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性、（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性、及び（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含み得る。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、Ｔ細胞においてＴ細胞受容体又はＣＡＲ－Ｔと共発現され得、養子細胞療法（ＡＣＴ）の方法で使用され得る。Ｔ細胞は、αβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
別の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、（ａ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号１、（ｂ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号２、（ｃ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号３、及び（ｄ）１、２、３、４、又は５個のアミノ酸置換を含む配列番号４を含み得る。実施形態において、置換は、保存的アミノ酸置換である。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、Ｔ細胞においてＴ細胞受容体又はＣＡＲ－Ｔと共発現され得、養子細胞療法（ＡＣＴ）の方法で使用され得る。Ｔ細胞は、γδＴ細胞又はγδ（αβ）Ｔ細胞であり得る。
ＣＤ８は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によるペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体の抗原認識のための共受容体として機能し、胸腺におけるＴ細胞発達及び末梢におけるＴ細胞活性化において重要な役割を果たす、膜結合型糖タンパク質である。機能性ＣＤ８は、２つのα鎖（ＣＤ８αα）又はα鎖及びβ鎖（ＣＤ８αβ）のいずれかから成り立つ二量体タンパク質であり、β鎖の表面発現は、ＣＤ８αβヘテロ二量体を形成するために、共発現したα鎖との会合を必要とし得る。ＣＤ８αα及びＣＤ８αβは、様々なリンパ球で差次的に発現され得る。ＣＤ８αβは、主にαβＴＣＲ＋Ｔ細胞及び胸腺細胞の表面で発現され、ＣＤ８ααは、αβＴＣＲ＋のサブセット、γδＴＣＲ＋腸上皮内リンパ球、ＮＫ細胞、樹状細胞、及び小画分のＣＤ４＋Ｔ細胞で発現される。
例えば、ヒトＣＤ８遺伝子は、２３５個のアミノ酸のタンパク質を発現し得る。図１は、ＣＤ８αタンパク質（ＣＤ８α１－配列番号２５８）を示し、態様において、以下のドメイン（アミノ末端から始まり、ポリペプチドのカルボキシ末端で終わる）に分割される：（１）シグナルペプチド（アミノ酸－２１～－１）、細胞表面への受容体の輸送中にヒト細胞内で切断され得、したがって成熟した活性受容体の一部を構成し得ない、（２）免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（この実施形態において、アミノ酸１～１１５）、免疫系の調節に関与する他の多くの分子であるタンパク質の免疫グロブリンファミリーの構造で類似している、免疫グロブリンフォールドと呼ばれる構造を仮定し得る。ヒトＭＨＣ分子ＨＬＡ－Ａ２との複合体におけるＣＤ８αα受容体の結晶構造は、ＣＤ８αα受容体のＩｇドメインがリガンドにどのように結合するかを実証している、（３）膜近位領域（この実施形態において、アミノ酸１１６～１６０）、ＣＤ８αα受容体が、ＭＨＣの上部を超えてＴ細胞の表面から、それが結合するＭＨＣのａ３ドメインにまで「達する」ことを可能にする伸長リンカー領域であり得る。ストーク領域は、グリコシル化され得、非可撓性であり得る、（４）膜貫通ドメイン（本実施形態において、アミノ酸１６１～１８８）、細胞膜内にＣＤ８αα受容体を固定し得、したがって可溶性組換えタンパク質の一部ではない、（５）細胞質ドメイン（この実施形態において、アミノ酸１８９～２１４）、リン酸化事象のＴ細胞活性化カスケードに関与し得るｐ５６ｌｃｋとのその会合を介してＴ細胞におけるシグナル伝達機能を媒介することができる。
ＣＤ８α配列は、一般に、ＭＨＣに結合できるのに十分な免疫グロブリンドメインの部分を有し得る。一般に、ＣＤ８α分子は、ＣＤ８αの免疫グロブリンドメインの全て又は実質的な部分、例えば、配列番号２５８を含み得るが、態様において、免疫グロブリンドメインの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、又は１１５個のアミノ酸を含み得る。本開示のＣＤ８α分子は、好ましくは二量体（例えば、ＣＤ８αα又はＣＤ８αβ）であり得るが、ＣＤ８αモノマーは、本開示の範囲内に含まれ得る。態様において、本開示のＣＤ８αは、ＣＤ８α１（配列番号２５８）及びＣＤ８α２（配列番号２５９）を含み得る。
ＣＤ８α及びβサブユニットは、Ｉｇ様ドメイン、３０～４０個のアミノ酸のストーク領域、膜貫通領域、及び約２０個のアミノ酸の短い細胞質ドメインを含む、類似の構造モチーフを有し得る。ＣＤ８α及びβ鎖は、それらのアミノ酸配列内で２０％未満の同一性を共有する、Ｉｇ様ドメイン内に、それぞれ２つ及び１つのＮ結合グリコシル化部位を有する。ＣＤ８βストーク領域は、ＣＤ８αストークよりもアミノ酸が１０～１３個短く、Ｏ－結合炭水化物で高度にグリコシル化されている。αではなく、βストーク領域におけるこれらの炭水化物は、胸腺細胞の発達段階及びＴ細胞の活性化時に差次的に調節され得る、複雑なシアリル化のために非常に不均一であるように思われる。グルカン付加物は、糖タンパク質の機能及び免疫応答において、調節的役割を果たすことが示されている。膜貫通ドメインの近位であるグリカンは、隣接モチーフの配向に影響を及ぼすことができる。ＣＤ８β鎖ストーク領域の独自の生化学的特性は、共受容体機能を調節する妥当性のある候補を提示し得る。
ＣＤ８ポリペプチドは改変され得、ＣＤ８α領域、例えばストーク領域は、ＣＤ８β領域に置き換えられ得る。別の態様において、ＣＤ８α－ＣＤ８βポリペプチドを作製するためである。実施形態において、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む領域を有し得る。本明細書に記載の改変ＣＤ８αポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有し得る。改変ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む膜貫通ドメインを有し得る。本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を含む細胞質尾部を有し得る。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、ｍＣＤ８αポリペプチドのＮ末端に融合したか、又はＣ末端に融合した、配列番号６又は配列番号２９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含むシグナルペプチドを含み得る。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し得る。
Ｔ細胞
Ｔ細胞は、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドを発現し得る。例えば、Ｔ細胞は、本明細書に記載されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び改変ＣＤ８ポリペプチドを共発現し得る。Ｔ細胞はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ類似体、又はＣＡＲ誘導体を発現し得る。
Ｔ細胞は、集団にある場合、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、又はそれらの組み合わせであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
Ｔ細胞受容体
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗原結合タンパク質、又はその両方を、表３に列挙されるもの（配列番号１５～９２）を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドとともに共発現し得る。更に、Ｔ細胞は、米国特許出願公開第２０１７／０２６７７３８号、米国特許出願公開第２０１７／０３１２３５０号、米国特許出願公開第２０１８／００５１０８０号、米国特許出願公開第２０１８／０１６４３１５号、米国特許出願公開第２０１８／０１６１３９６号、米国特許出願公開第２０１８／０１６２９２２号、米国特許出願公開第２０１８／０２７３６０２号、米国特許出願公開第２０１９／００１６８０１号、米国特許出願公開第２０１９／０００２５５６号、米国特許出願公開第２０１９／０１３５９１４号、米国特許第１０，５３８，５７３、米国特許第１０，６２６，１６０号、米国特許出願公開第２０１９／０３２１４７８号、米国特許出願公開第２０１９／０２５６５７２号、米国特許第１０，５５０，１８２号、米国特許第１０，５２６，４０７号、米国特許出願公開第２０１９／０２８４２７６号、米国特許出願公開第２０１９／００１６８０２号、米国特許出願公開第２０１９／００１６８０３号、米国特許出願公開第２０１９／００１６８０４号、米国特許第１０，５８３，５７３号、米国特許出願公開第２０２０／０３３９６５２号、米国特許第１０，５３７，６２４号、米国特許第１０，５９６，２４２号、米国特許出願公開第２０２０／０１８８４９７号、米国特許第１０，８００，８４５号、米国特許出願公開第２０２０／０３８５４６８号、米国特許第１０，５２７，６２３号、米国特許第１０，７２５，０４４号、米国特許出願公開第２０２０／０２４９２３３号、米国特許第１０，７０２，６０９号、米国特許出願公開第２０２０／０２５４１０６号、米国特許第１０，８００，８３２号、米国特許出願公開第２０２０／０１２３２２１号、米国特許第１０，５９０，１９４号、米国特許第１０，７２３，７９６号、米国特許出願公開第２０２０／０１４０５４０号、米国特許第１０，６１８，９５６号、米国特許出願公開第２０２０／０２０７８４９号、米国特許出願公開第２０２０／００８８７２６、及び米国特許出願公開第２０２０／０３８４０２８号（本明細書に記載されているこれらの出版物及び配列表の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＴＣＲ及び抗原結合タンパク質を発現し得る。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞であり得る。ナチュラルキラー細胞。実施形態において、本明細書に記載されるＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ又は可溶性ＴＣＲである。
更に、Ｔ細胞において本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドと共発現され得るＴＣＲは、アルファ鎖（ＴＣＲα）及びベータ鎖（ＴＣＲβ）からなるＴＣＲであり得る。ＴＣＲに使用され得るＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖は、Ｒ１１ＫＥＡ（配列番号１５及び１６）、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７（配列番号１７及び１８）、Ｒ７Ｐ１Ｄ５（配列番号１９及び２０）、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２（配列番号２１及び２２）、Ｒ１０Ｐ１Ａ７（配列番号２３及び２４）、Ｒ４Ｐ１Ｄ１０（配列番号２５及び２６）、Ｒ４Ｐ３Ｆ９（配列番号２７及び２８）、Ｒ４Ｐ３Ｈ３（配列番号２９及び３０）、Ｒ３６Ｐ３Ｆ９（配列番号３１及び３２）、Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１（配列番号３３及び３４）、Ｒ５３Ｐ２Ａ９（配列番号３５及び３６）、Ｒ２６Ｐ１Ａ９（配列番号３７及び３８）、Ｒ２６Ｐ２Ａ６（配列番号３９及び４０）、Ｒ２６Ｐ３Ｈ１（配列番号４１及び４２）、Ｒ３５Ｐ３Ａ４（配列番号４３及び４４）、Ｒ３７Ｐ１Ｃ９（配列番号４５及び４６）、Ｒ３７Ｐ１Ｈ１（配列番号４７及び４８）、Ｒ４２Ｐ３Ａ９（配列番号４９及び５０）、Ｒ４３Ｐ３Ｆ２（配列番号５１及び５２）、Ｒ４３Ｐ３Ｇ５（配列番号５３及び５４）、Ｒ５９Ｐ２Ｅ７（配列番号５５及び５６）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３（配列番号５７及び５８）、Ｒ１６Ｐ１Ｃ１０（配列番号５９及び６０）、Ｒ１６Ｐ１Ｅ８（配列番号６１及び６２）、Ｒ１７Ｐ１Ａ９（配列番号６３及び６４）、Ｒ１７Ｐ１Ｄ７（配列番号６５及び６６）、Ｒ１７Ｐ１Ｇ３（配列番号６７及び６８）、Ｒ１７Ｐ２Ｂ６（配列番号６９及び７０）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＫＥ（配列番号７１及び３０３）、Ｒ３９Ｐ１Ｃ１２（配列番号３０４及び７４）、Ｒ３９Ｐ１Ｆ５（配列番号７５及び７６）、Ｒ４０Ｐ１Ｃ２（配列番号７７及び７８）、Ｒ４１Ｐ３Ｅ６（配列番号７９及び８０）、Ｒ４３Ｐ３Ｇ４（配列番号８１及び８２）、Ｒ４４Ｐ３Ｂ３（配列番号８３及び８４）、Ｒ４４Ｐ３Ｅ７（配列番号８５及び８６）、Ｒ４９Ｐ２Ｂ７（配列番号８７及び８８）、Ｒ５５Ｐ１Ｇ７（配列番号８９及び９０）、又はＲ５９Ｐ２Ａ７（配列番号９１及び９２）から選択され得る。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞であり得る。
表１は、ペプチドがＭＨＣ分子との複合体にあるとき、ＴＣＲが結合するペプチドの例を示す。（ヒトにおけるＭＨＣ分子は、ＨＬＡ、ヒト白血球抗原と称され得る）。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドは、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチド構築物、方法、及び実施形態とともに使用され得る。例えば、本明細書に記載のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に結合するとき、ＴＡＡペプチドに特異的に結合し得る。これは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子としても知られている。ヒトのＭＨＣ分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる。
本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドとともに使用され得る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドには、表３に列挙されるもの並びに米国特許出願公開第２０１６／０１８７３５１号、米国特許出願公開第２０１７／０１６５３３５号、米国特許出願公開第２０１７／００３５８０７号、米国特許出願公開第２０１６／０２８０７５９号、米国特許出願公開第２０１６／０２８７６８７号、米国特許出願公開第２０１６／０３４６３７１号、米国特許出願公開第２０１６／０３６８９６５号、米国特許出願公開第２０１７／００２２２５１号、米国特許出願公開第２０１７／０００２０５５号、米国特許出願公開第２０１７／００２９４８６号、米国特許出願公開第２０１７／００３７０８９号、米国特許出願公開第２０１７／０１３６１０８号、米国特許出願公開第２０１７／０１０１４７３号、米国特許出願公開第２０１７／００９６４６１号、米国特許出願公開第２０１７／０１６５３３７号、米国特許出願公開第２０１７／０１８９５０５号、米国特許出願公開第２０１７／０１７３１３２号、米国特許出願公開第２０１７／０２９６６４０号、米国特許出願公開第２０１７／０２５３６３３号、米国特許出願公開第２０１７／０２６０２４９号、米国特許出願公開第２０１８／００５１０８０号、米国特許出願公開第２０１８／０１６４３１５号、米国特許出願公開第２０１８／０２９１０８２号、米国特許出願公開第２０１８／０２９１０８３号、米国特許出願公開第２０１９／０２５５１１０号、米国特許第９，７１７，７７４号、米国特許第９，８９５，４１５号、米国特許出願公開第２０１９／０２４７４３３号、米国特許出願公開第２０１９／０２９２５２０号、米国特許出願公開第２０２０／００８５９３０、米国特許第１０，３３６，８０９号、米国特許第１０，１３１，７０３号、米国特許第１０，０８１，６６４号、米国特許第１０，０８１，６６４号、米国特許第１０，０９３，７１５号、米国特許第１０，５８３，５７３号、及び米国特許出願公開第２０２０／０００８５９３０号（本明細書に記載されているこれらの出版物、配列、及び配列表の各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に記載の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドは、ＨＬＡ（ＭＨＣ分子）に結合され得る。ＨＬＡに結合する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドは、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドと任意選択的に共発現される本明細書に記載のＴＣＲによって認識され得る。
Ｔ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０に由来するリガンド結合ドメイン、又は抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ若しくは抗ＥＧＦＲなどの抗腫瘍抗体、並びにＣＤ３－ζ、Ｄａｐ１０、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、及びＣＤ４０Ｌから得られるシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作され得る。いくつかの例において、キメラ受容体は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＲＯＮ、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、アルファ－フェトタンパク質（ＡＦＰ）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ－１、グリコ脂質Ｆ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ－１、ＳＴＥＡＰ－２、ｃ－ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、ネクチン－４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ－１、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（ＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異型ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、若しくはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、又はＣＭＶに結合する。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞であり得る。
Ｔ細胞の培養
導入遺伝子発現に使用され得るＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤性リンパ球、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、並びにＴ細胞の活性化、形質導入、及び／又は増殖のための方法が、本明細書に記載されている。Ｔ細胞は、α－及び／又はβ－ＴＣＲ陽性細胞を枯渇しながら、活性化、形質導入、及び増殖され得る。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、又はナチュラルキラーＴ細胞であり得る。
養子移植療法のための操作されたγδＴ細胞の集団のエクスビボ増殖のための方法が、本明細書に記載されている。本開示の操作されたγδＴ細胞は、エクスビボで増殖され得る。本明細書に記載の操作されたＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化なしに、又はＡＰＣとの共培養及びアミノホスフェートなしに、インビトロで増殖させることができる。Ｔ細胞を形質導入する方法は、２０１９年６月１３日に公開された米国特許出願第２０１９／０１７５６５０号に記載されており、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。Ｔ細胞の形質導入及び培養のための他の方法が使用され得る。
γδＴ細胞を含むＴ細胞は、インビトロで培養される複合試料から単離され得る。実施形態において、単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞などの特定の細胞集団の事前の枯渇なしに、全ＰＢＭＣ集団を活性化及び増殖することができる。実施形態において、豊富化したＴ細胞集団は、それらの特定の活性化及び増殖の前に産生することができる。実施形態において、γδＴ細胞の活性化及び増殖は、天然又は操作された抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在の有無にかかわらず行われ得る。実施形態において、腫瘍標本からのＴ細胞の単離及び増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体を含むＴ細胞マイトジェン、及びレクチンを含む他のγδＴＣＲ活性化剤を使用して行うことができる。実施形態において、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離及び増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体を含む固定化Ｔ細胞マイトジェン、及びレクチンを含む他のγδＴＣＲ活性化剤が存在せずに行うことができる。
γδＴ細胞を含むＴ細胞は、対象、例えば、ヒト対象の白血球アフェレーシスから単離され得る。実施形態において、γδＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されない。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を使用して、任意選択的に、組換えヒトインターロイキン－２（ｒｈＩＬ－２）、例えば、約５０～１５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を用いて単離され得る。
単離されたＴ細胞は、１つ以上の抗原との接触に応答して急速に増殖することができる。Ｖγ９Ｖδ２＋Ｔ細胞などのいくつかのγδＴ細胞は、組織培養中にプレニル－ピロリン酸塩、アルキルアミン、及び代謝物又は微生物抽出物などのいくつかの抗原との接触に応答してインビトロで急速に増殖することができる。刺激されたＴ細胞は、複合試料からのＴ細胞の単離を容易にすることができる多数の抗原提示、共刺激、及び接着分子を表すことができる。複合試料内のＴ細胞は、少なくとも１つの抗原を用いて１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、又は別の好適な期間、インビトロで刺激することができる。好適な抗原を用いたＴ細胞の刺激は、インビトロでＴ細胞集団を増殖させることができる。
γδＴ細胞の活性化及び増殖は、本明細書に記載の活性化剤及び共刺激剤を使用して行い、特定のγδＴ細胞増殖及び持続性集団を誘発することができる。実施形態において、異なる培養物からのγδＴ細胞の活性化及び増殖は、異なるクローン又は混合ポリクローン集団サブセットを達成することができる。実施形態において、異なるアゴニスト剤を使用して、特定のγδ活性化シグナルを提供する薬剤を特定することができる。実施形態において、特異的γδ活性化シグナルを提供する薬剤は、γδＴＣＲに対して指向される異なるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であることができる。実施形態において、細胞エネルギー及びアポトーシスの誘導なしに、特定のγδＴ細胞増殖を誘発するのに役立つコンパニオン共刺激剤を使用することができる。これらの共刺激剤は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸアクセサリー分子－１（ＤＮＡＭ－１）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、及びＣＤ２８などのγδ細胞で発現される受容体に結合するリガンドを含むことができる。実施形態において、共刺激剤は、ＣＤ２及びＣＤ３分子における独自のエピトープに対して特異的な抗体であることができる。ＣＤ２及びＣＤ３は、αβ又はγδＴ細胞で発現されるとき、異なる立体構造を有することができる。実施形態において、ＣＤ３及びＣＤ２に対する特異的抗体は、γδＴ細胞の別個の活性化をもたらすことができる。
インビトロで複合試料からγδＴ細胞を含むＴ細胞の増殖を刺激するために使用され得る抗原の非限定的な例には、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）などのプレニルピロリン酸、アルキル－アミン、ヒト微生物病原体の代謝物、共生細菌の代謝物、メチル－３－ブテニル－１－ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブタ－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢ－ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ））、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸（ＤＭＡＰ）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、エチル－アデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル－アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、ピロリン酸モノエチル（ＭＥＰＰ）、３－ホルミル－１－ブチル－ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ－ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３－ホルミル－１－ブチルウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３－ホルミル－１－ブチル－デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイルピロリン酸、ジメチルアリル－γ－ウリジン三リン酸、クロトイル－γ－ウリジン三リン酸、アリル－γ－ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、イソアミルアミン、及び窒素含有ビスホスホネートが含まれ得る。
γδＴ細胞を含む、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の操作の前に、エクスビボで増殖され得る。インビトロでＴ細胞集団の増殖を促進するために使用することができる試薬の非限定的な例には、抗ＣＤ３若しくは抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－９、ＩＬ－３３、ＩＬ－１８、若しくはＩＬ－２１、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、植物性凝集素（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＰＨＡ）、コンカバリン（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）、ヤマゴボウ（ＰＷＭ）、タンパク質ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）、ダイズアグルチニン（ＳＢＡ）、Ｌｅｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓアグルチニン（ＬＣＡ）、Ｐｉｓｕｍ Ｓａｔｉｖｕｍアグルチニン（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、又はＴ細胞増殖を刺激することができる別の好適なマイトジェンが含まれ得る。更に、Ｔ細胞は、ＭＣＳＦ、ＩＬ－６、エオタキシン、ＩＦＮ－アルファ、ＩＬ－７、ガンマ誘導性タンパク質１０、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＭＩＰ－１アルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－１３、ＭＩＰ－１ベータ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１５、及びそれらの組み合わせを使用して増殖され得る。
γδＴ細胞が広範囲の抗原を認識する能力は、γδＴ細胞の遺伝子操作によって増強することができる。γδＴ細胞は、インビボで選択される抗原を認識する普遍的な同種異系療法を提供するように操作することができる。γδＴ細胞の遺伝子操作は、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの腫瘍認識部分を発現する構築物を安定的に組み込むことを含み得、抗原結合及びＴ細胞活性化機能の両方を単一受容体、その抗原結合断片に結合させて、又はリンパ球活性化ドメインを、単離されたγδＴ細胞、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－３３、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－２３、又はＩＬ１β）に結合させて、Ｔ細胞の増殖、生存、並びにエクスビボ及びインビボでの機能を増強する。単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作はまた、ＭＨＣ遺伝子座などの単離されたγδＴ細胞のゲノム中の１つ以上の内在性遺伝子からの遺伝子発現を欠失又は破壊することを含み得る。
γδＴ細胞を含む、操作された（又は形質導入された）Ｔ細胞は、抗原提示細胞又はアミノビスホスホネートによる刺激なしに、エクスビボで増殖させることができる。本開示の抗原反応性操作Ｔ細胞は、エクスビボ及びインビボで増殖され得る。実施形態において、操作されたＴ細胞の活性集団は、抗原提示細胞、抗原ペプチド、非ペプチド分子、又はアミノビスホスホネートなどの小分子化合物による抗原刺激を伴わずにエクスビボで増殖され得るが、特定の抗体、サイトカイン、マイトジェン、又はＩＬ－１７ Ｆｃ融合、ＭＩＣＡ Ｆｃ融合、及びＣＤ７０ Ｆｃ融合などの融合タンパク質を使用する。γδＴ細胞集団の増殖に使用することができる抗体の例には、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、又は抗ＣＤ２抗体が含まれ、サイトカインの例には、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－９、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－３３が含まれ、マイトジェンの例には、ヒトＣＤ２７に対するリガンドであるＣＤ７０、植物性凝集素（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、タンパク質ピーナッツアグルチニン（ＰＮＡ）、ダイズアグルチニン（ＳＢＡ）、レスクリナリス（ｌｅｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）アグルチニン（ＬＣＡ）、エンドウ（ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）アグルチニン（ＰＳＡ）、Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａアグルチニン（ＨＰＡ）、Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａレクチン（ＶＧＡ）、又はＴ細胞増殖を刺激することができる別の好適なマイトジェンが含まれ得る。
γδＴ細胞を含む、操作されたＴ細胞の集団は、６０日未満、４８日未満、３６日未満、２４日未満、１２日未満、又は６日未満で増殖させることができる。実施形態において、操作されたＴ細胞の集団は、約７日～約４９日、約７日～約４２日、約７日～約３５日、約７日～約２８日、約７日～約２１日、又は約７日～約１４日で増殖させることができる。Ｔ細胞は、約１～２１日間増殖され得る。例えば、Ｔ細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日間増殖され得る。
実施形態において、同じ方法論を使用して、αβＴ細胞を単離、活性化、及び増殖し得る。
実施形態において、同じ方法論を使用して、γδＴ細胞を単離、活性化、及び増殖し得る。
ベクター
操作されたＴ細胞は、文献で認識されるものを含む、様々な方法を使用して生成され得る。例えば、腫瘍認識、又は別のタイプの認識部分を含む発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザーゼシステム、又はレンチウイルス若しくはレトロウイルスシステムなどのウイルスベースの遺伝子導入システム、又はトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、オルモシルなどのナノ工学物質などの別の好適な方法、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、若しくは別の好適な方法を含むウイルス送達方法によって、Ｔ細胞に安定的に導入することができる。多くのウイルス方法が、ＷＯ１９９３／０２０２２１（その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている方法などのヒト遺伝子療法に使用されている。Ｔ細胞を操作するために使用することができるウイルス方法の非限定的な例には、γ－レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、又はアデノウイルス関連ウイルス方法を含み得る。Ｔ細胞は、αβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
Ｔ細胞のトランスフェクションのために使用されるウイルスには、天然に存在するウイルス並びに人工的ウイルスが含まれる。ウイルスは、エンベロープウイルス又は非エンベロープウイルスのいずれであり得る。パルボウイルス（ＡＡＶなど）は、非エンベロープウイルスの例である。ウイルスは、エンベロープウイルスであり得る。Ｔ細胞のトランスフェクションのために使用されるウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであり得る。真核生物細胞のウイルス感染を促進することができるウイルスエンベロープタンパク質には、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、改変ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）（配列番号９７）、及び改変テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）からのエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）で偽型化されたレンチウイルスベクター（ＬＶ）に由来するＨＩＶ－１が含まれ得る。これらのエンベロープタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む、パルボウイルスなどの他のウイルスの侵入を効率的に促進することができ、それによってそれらの広範な効率を実証する。例えば、使用される他のウイルスエンベロープタンパク質には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）４０７０ ｅｎｖ（Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなど）、ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏ又はＲＤｐｒｏ（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０；２３５：１２６９－１２７６（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるなど、ＲＤ１１４のＲペプチド切断配列をＨＩＶ－１マトリックス／カプシド（ＭＡ／ＣＡ）で置き換えることによって構築されたＲＤ１１４－ＨＩＶキメラである）、バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０８６９－１０８７８，２００７（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるなど）、若しくはＧＡＬＶ ｅｎｖ（Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるなど）、又はそれらの誘導体が含まれる。
単一のレンチウイルスカセットを使用して、単一のレンチウイルスベクターを作成することができ、二量体を細胞表面に共発現するように、単一のマルチシストロニックｍＲＮＡから２つの異なる二量体の少なくとも４つの個々の単量体タンパク質を発現する。例えば、レンチウイルスベクターの単一コピーの組み込みは、Ｔ細胞を形質転換して、ＴＣＲαβ及びＣＤ８αβ、任意選択的に、αβＴ細胞又はγδＴ細胞を共発現させるのに十分だった。
ベクターは、１つ超、２つ超、３つ超、４つ超の遺伝子、５つ超の遺伝子、又は６つ超の遺伝子を発現することができる単一ベクター内にマルチシストロンカセットを含み得、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドは、互いに相互作用し得、又は二量体を形成し得る。二量体は、ホモ二量体、例えば、二量体を形成する２つの同一のタンパク質、又はヘテロ二量体、例えば、二量体を形成する２つの構造的に異なるタンパク質であり得る。
加えて、複数のベクターを使用して、本明細書に記載の構築物及び配列で細胞をトランスフェクトし得る。例えば、ＴＣＲ導入遺伝子は、１つのベクター上にあり得、本明細書に記載のポリペプチドをコードするＣＤ８導入遺伝子は、認識された方法を同時的又は連続的ないずれかで使用してトランスフェクトされる第２のベクター上にあり得る。Ｔ細胞株は、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドをコードするＣＤ８導入遺伝子で安定的にトランスフェクトされ、次いで、ＴＣＲ導入遺伝子で順次トランスフェクトされ得、この逆もあり得る。
いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、１つ以上のマルチシストロンエレメントを更に含み得、マルチシストロンエレメントは、例えば、ＴＣＲα若しくはその一部をコードする核酸配列とＴＣＲβ若しくはその一部をコードする核酸配列との間、ＣＤ８α若しくはその一部をコードする核酸配列とＣＤ８β若しくはその一部をコードする核酸配列との間、又はＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ８α、及びＣＤ８βをコードする任意の２つの核酸配列の間に位置することができる。いくつかの実施形態において、マルチシストロンエレメントは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、若しくはＦ２Ａ、又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の中から選択されるリボソームスキップエレメントをコードする配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、「自己切断２Ａペプチド」という用語は、グリシンと最後のプロリンとの間の正常なペプチド結合の形成を妨げ、リボソームが次のコドンにスキップし、新生ペプチドがＧｌｙとＰｒｏとの間の切断することによって、共翻訳的に作用する比較的短いペプチド（起源のウイルスに応じて、アミノ酸２０個の長さの程度）を指す。切断後、短い２Ａペプチドは、「上流」タンパク質のＣ末端に融合したままであり、一方、プロリンが、「下流」タンパク質のＮ末端に付加される。自己切断２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、又はこれらの任意の組み合わせから選択され得る（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１８５５６，２０１１、２Ａ核酸及びアミノ酸配列を含む内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。自己切断２Ａ配列の前にリンカー配列（ＧＳＧ又はＳＧＳＧ（配列番号２６６））を付加することによって、これは、生物学的に活性なタンパク質、例えば、ＴＣＲの効率的な合成を可能にし得る。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、５'キャップ構造に依存せずに翻訳を開始することができる、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に位置するヌクレオチド配列を指す。ＩＲＥＳは通常、５'非翻訳領域（５'ＵＴＲ）に位置するが、ｍＲＮＡの他の位置にも配置され得る。一実施形態において、ＩＲＥＳは、ウイルスからのＩＲＥＳ、細胞ｍＲＮＡからのＩＲＥＳ、特に、ポリオ、ＥＭＣＶ、及びＦＭＤＶなどのピコルナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのフラビウイルス、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）などのペストウイルス、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのレトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）などのレンチウイルス、及びコオロギ麻痺ウイルス（ＣＲＰＶ）などの昆虫ＲＮＡウイルスからのＩＲＥＳ、並びに細胞ｍＲＮＡ、例えば、ｅＩＦ４Ｇ及びＤＡＰ５などの転写開始因子、ｃ－Ｍｙｃ及びＮＦ－κＢ抑制因子（ＮＲＦ）などの転写因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ－２）、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ－Ｂ）などの増殖因子、アンテナペディアなどのホメオティック遺伝子、Ｘ連鎖アポトーシス抑制物質（ＸＩＡＰ）及びＡｐａｆ－１などの生存タンパク質、並びにＢｉＰなどの他の細胞ｍＲＮＡからのＩＲＥＳから選択され得る。
本明細書に記載の構築物及びベクターは、２０１９年６月１３日に公開された米国特許出願公開第２０１９／０１７５６５０号に記載の方法論とともに使用され、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
非ウイルスベクターはまた、本明細書に記載の配列、構築物、及び細胞とともに使用され得る。
細胞は、リポフェクション（リポソームベースのトランスフェクション）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、微粒子送達（例えば、遺伝子銃）、マイクロインジェクション、又はそれらの組み合わせを含む、当該技術分野で既知の他の手段によってトランスフェクトされ得る。細胞をトランスフェクトする様々な方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）Ｖｏｌｕｍｅｓ １－３（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ＆Ｎａｒｖｅｋａｒ "Ｎｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ．"Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．（２０１５）９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６を参照されたい。
組成物
組成物は、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドを含み得る。更に、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドを発現するＴ細胞を含み得る。本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドを発現するＴ細胞、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、任意選択的に、ヒト白血球抗原のために、ヒトでＨＬＡと称される抗原提示タンパク質、例えば、ＭＨＣと複合体化された本明細書に記載のＴＡＡのうちの１つに特異的に結合するＴＣＲを含み得る。
投与を容易にするために、本明細書に記載のＴ細胞は、薬学的に許容される担体又は希釈剤とともに、インビボでの投与に適した医薬組成物に生成するか、又はインプラントに生成することができる。かかる組成物又はインプラントを生成する手段は、当技術分野に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ，ｅｄ．（１９８０）を参照されたい。
本明細書に記載のＴ細胞は、カプセル、溶液、注入、又は注射などの半固体又は液体形態の調製物に製剤化することができる。当技術分野で既知の手段を利用して、組成物が標的組織又は器官に到達するまで、組成物の放出及び吸収を防止又は最小限に抑えるか、又は組成物の時限放出を確実にすることができる。しかしながら、望ましくは、細胞がＣＡＲ又はＴＣＲを発現することを妨げない薬学的に許容される形態が採用される。したがって、望ましくは、本明細書に記載のＴ細胞を、担体を含む医薬組成物にすることができる。本明細書に記載のＴ細胞は、生理学的に許容される担体又は賦形剤とともに製剤化して、医薬組成物を調製することができる。担体及び組成物は、無菌であることができる。好ましい担体には、例えば、平衡塩溶液、好ましくはハンクス平衡塩溶液、又は生理食塩水が含まれる。製剤は、投与様式に適合するものでなければならない。好適な薬学的に許容される担体には、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、並びにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。医薬調製物は、必要に応じて、Ｔ細胞と有害に反応しない補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤と混合することができる。Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチド、任意選択的に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
本発明の組成物は、単位投与形態で提供することができ、各投与単位、例えば、注射は、単独で、又は他の活性剤との適切な組み合わせで、所定量の組成物を含有する。
本明細書に記載の組成物は、医薬組成物であり得る。本明細書に記載の医薬組成物は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、インターフェロン－アルファ、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、コロニー刺激因子からなる群から選択されるアジュバントを更に含み得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、及びレシキモドからなる群から選択されるアジュバントを含み得る。
好ましいアジュバントには、シクロホスファミド、イミキモド、又はレシキモドが含まれるが、これらに限定されない。更により好ましいアジュバントは、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、ポリ－ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、及び抗ＣＤ４０ ｍＡＢ、又はそれらの組み合わせである。
有用なアジュバントの他の例には、化学的に修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）及びそれらの誘導体（例えば、ＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ－（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ－Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）などのｄｓＲＮＡ類似体、非ＣｐＧ細菌ＤＮＡ又はＲＮＡ、並びにシクロホスファミド、スニチニブ、免疫チェックポイント阻害剤であるイピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びシミプリマブ、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロミド、テムシロリムス、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４，免疫系の主要構造を標的とする他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦベータ、抗ＴＮＦアルファ受容体）並びにＳＣ５８１７５などの免疫反応性小分子及び抗体が含まれ、治療的に、かつ／又はアジュバントとして作用し得る。本発明の文脈において有用なアジュバント及び添加剤の量及び濃度は、過度な実験を伴わずに、当業者によって容易に決定され得る。
他のアジュバントには、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び誘導体、ポリ－（Ｉ：Ｃ）及び誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、並びにポリ（ラクチドコ－グリコリド）（ＰＬＧ）、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸－ポリ－ｌ－リジンカルボキシメチルセルロース（ポリ－ＩＣＬＣ）、ビロソーム、及び／又はインターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２３を有する粒子製剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｎａｒａｙａｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００３）４６（２３）：５０３１－５０４４；Ｐｏｈａｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７ １４５９８（２０１７）、Ｇｒａｊｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００５）３３（１１）：３５５０－３５６０、Ｍａｒｔｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１５）１４（３）：４４７－５９）を参照されたい。
本明細書に記載の組成物はまた、１つ以上のアジュバントを含み得る。アジュバントは、免疫応答（例えば、抗原に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞及びヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される免疫応答）を非特異的に増強又は強化する物質であり、したがって、本発明の薬剤において有用であると考えられる。好適なアジュバントには、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリン又はフラジェリン由来のＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１、ＩＬ－２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２１としてのインターロイキン、インターフェロンアルファ又はベータ、又はそのペグ化誘導体、ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ１３１２、モンタニドＩＳＡ２０６、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、油中水型及び水中油型エマルジョン、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクターシステム、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］ベースデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソーム及びその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、ベータ－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニン、マイコバクテリア抽出物、及び合成細菌細胞壁模倣物に由来するＡｑｕｉｌａのＱＳ２１スチムロン、並びにＲｉｂｉ'ｓ Ｄｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ、Ｓｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自のアジュバントが含まれるが、これらに限定されない。フロイント又はＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞に対して特異的ないくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）及びそれらの調製物は、既に報告されている。また、サイトカインも使用され得る。いくつかのサイトカインは、リンパ系組織への樹状細胞遊走に影響を与えること（例えば、ＴＮＦ－）、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟化を加速させること（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、及びＩＬ－４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ）に直接関連付けられている。
ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドはまた、ワクチン設定におけるアジュバントの効果を増強することが報告されている。理論に拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を介して先天（非適応）免疫系を活性化することによって作用する。ＣｐＧ誘発したＴＬＲ９活性化は、予防及び治療ワクチンの両方において、ペプチド又はタンパク質抗原、生きているか又は殺傷されたウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、及び多糖体コンジュゲートを含む、多種多様な抗原に対する抗原特異的体液性及び細胞応答を増強する。更に重要なことに、それは樹状細胞の成熟及び分化を増強し、ＣＤ４Ｔ細胞の助けがない場合でさえ、ＴＨ１細胞の増強した活性化及び強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常、ＴＨ２バイアスを促進するミョウバン又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバントの存在でさえ維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントとともに、又は微粒子、ナノ粒子、脂質エマルション、若しくは類似の製剤などの製剤中で、製剤化又は共投与された場合、更に大きなアジュバント活性を示し、抗原が比較的弱いときに強い応答を誘導するために特に必要である。それらはまた、免疫応答を加速し、抗原用量を約２桁の大きさで減少させることを可能にし、いくつかの実験では、ＣｐＧを有しない全用量ワクチンと同等の抗体応答を有する（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５（Ｂ１）号には、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、及び抗原の組み合わせた使用が記載されている。ＣｐＧ ＴＬＲ９アンタゴニストは、本発明の医薬組成物の好ましい成分であるＭｏｌｏｇｅｎ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によるｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節剤）である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／又はＴＬＲ９などの他のＴＬＲ結合分子も使用され得る。
治療方法及び調製方法
操作されたＴ細胞は、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドを発現し得る。更に、操作されたＴ細胞は、本明細書に記載のＴＣＲを発現し得る。操作されたＴ細胞によって発現されるＴＣＲは、本明細書に記載されるように、ＨＬＡに結合されたＴＡＡを認識し得る。本開示の操作されたＴ細胞は、状態、例えば、本明細書に記載のがんの治療を必要とする対象を治療するために使用することができる。Ｔ細胞は、改変ＣＤ８ポリペプチド、任意選択的に、本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
本明細書に記載のＴ細胞で対象における状態（例えば、病気）を治療する方法は、対象に、治療有効量の本明細書に記載の操作されたＴ細胞、任意選択的にγδＴ細胞を投与することを含み得る。本明細書に記載のＴ細胞は、様々なレジメン（例えば、タイミング、濃度、投与量、治療間の間隔、及び／又は製剤）で投与され得る。対象はまた、本開示の操作されたＴ細胞を受ける前に、例えば、化学療法、放射線、又は両方の組み合わせで前処置することができる。操作されたＴ細胞の集団はまた、対象に投与される前に凍結又は凍結保存され得る。操作されたＴ細胞の集団は、同一、異なる、又は同一及び異なる腫瘍認識部分の組み合わせを発現する２つ以上の細胞を含むことができる。例えば、操作されたＴ細胞集団は、異なる抗原、又は同じ抗原の異なるエピトープを認識するように設計されたいくつかの異なる操作されたＴ細胞を含むことができる。Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチド、任意選択的に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
αβＴ細胞及びγδＴ細胞を含む、本明細書に記載のＴ細胞は、様々な状態を治療するために使用され得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８ポリペプチド、任意に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。本明細書に記載のＴ細胞は、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含むがんを治療するために使用され得る。がんの非限定的な例には、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、エイズ関連がん、エイズ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、例えば小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、ヘアリー細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、島細胞がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞肺がん及び小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発性潜伏性転移性扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん島細胞、副鼻腔及び鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂及び尿管移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚がんメルケル細胞、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発部位不明のがん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍が含まれる。
本明細書に記載されるＴ細胞は、感染症を治療するために使用され得る。本明細書に記載されるＴ細胞は、感染性疾患を治療するために使用され得、感染性疾患は、ウイルスを原因とし得る。本明細書に記載のＴ細胞は、自己免疫疾患などの免疫疾患を治療するために使用され得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８ポリペプチド、任意に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
本明細書に記載のＴ細胞、任意選択的にγδＴ細胞による治療は、対象に、状態の臨床的発症の前、間、及び後に提供され得る。治療は、対象に、疾患の臨床的発症の１日後、１週後、６ヶ月後、１２ヶ月後、又は２年後提供され得る。治療は、対象に、疾患の臨床的発症後、１日、１週、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年以上にわたって提供され得る。治療は、対象に、疾患の臨床的発症後、１日、１週、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、又は２年未満にわたって提供され得る。治療はまた、臨床試験でヒトを治療することを含み得る。治療は、対象に、本明細書に記載の操作されたＴ細胞を含む医薬組成物を投与することを含むことができる。Ｔ細胞は、ＣＤ８ポリペプチド、任意に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
実施形態において、対象への本開示の操作されたＴ細胞の投与は、対象の体内の内因性リンパ球の活性を調節し得る。実施形態において、対象への操作されたＴ細胞の投与は、内因性Ｔ細胞に抗原を提供し得、免疫応答を増強し得る。実施形態において、メモリＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。実施形態において、メモリＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。実施形態において、対象への本開示の操作されたＴ細胞の投与は、別の免疫細胞の細胞傷害性を活性化し得る。実施形態において、他の免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。実施形態において、他の免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞であり得る。実施形態において、対象への本開示の操作されたγδＴ細胞の投与は、調節Ｔ細胞を抑制し得る。実施形態において、調節Ｔ細胞は、ＦＯＸ３＋Ｔｒｅｇ細胞であり得る。実施形態において、調節Ｔ細胞は、ＦＯＸ３－Ｔｒｅｇ細胞であり得る。本開示の操作されたＴ細胞によって活性を調節することができる細胞の非限定的な例には、造血幹細胞、Ｂ細胞、ＣＤ４、ＣＤ８、赤血球細胞、白血球細胞、樹状抗原提示細胞を含む樹状細胞、白血球、マクロファージ、メモリＢ細胞、メモリＴ細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球顆粒球、Ｔヘルパー細胞、及びＴキラー細胞が含まれる。Ｔ細胞は、ＣＤ８ポリペプチド、任意に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
ほとんどの骨髄移植の間、シクロホスファミドと全身放射線照射との組み合わせは、従来、対象の免疫系による移植における造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶を予防するために用いられ得る。実施形態において、ドナー骨髄におけるキラーリンパ球の生成を増強するために、ドナー骨髄とインターロイキン－２（ＩＬ－２）のエクスビボでのインキュベーションが行われ得る。インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、野生型リンパ球の成長、増殖、及び分化に必要であり得るサイトカインである。γδＴ細胞のヒトへの養子移入の現在の試験は、γδＴ細胞及びインターロイキン－２の同時投与を必要とし得る。しかし、低投与量及び高投与量の両方のＩＬ－２は、非常に有毒な副作用を有し得る。ＩＬ－２毒性は、複数の臓器／系、最も顕著には、心臓、肺、腎臓、及び中枢神経系に現れる可能性がある。実施形態において、本開示は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１などの天然サイトカイン又はその改変型の同時投与を伴わずに、操作されたＴ細胞を対象に投与するための方法を提供する。実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＬ－２と同時投与することなく対象に投与することができる。実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＩＬ－２の同時投与なしに、骨髄移植などの処置中に対象に投与され得る。
実施形態において、本方法は、化学療法剤を投与することを更に含み得る。化学療法剤の投与量は、患者のＴ細胞集団を枯渇させるのに十分なものであり得る。化学療法は、Ｔ細胞投与の約５～７日前に投与され得る。化学療法剤は、シクロホスファミド、フルダラビン、又はそれらの組み合わせであり得る。化学療法剤は、シクロホスファミドの約４００～６００ｍｇ／ｍ２／日での投与を含み得る。化学療法剤は、フルダラビンの約１０～３０ｍｇ／ｍ２／日での投与を含み得る。
実施形態において、方法は、Ｔ細胞を含む組成物の投与前に、低線量放射線での患者の前処置を更に含み得る。低線量放射線は、Ｔ細胞を含む組成物の投与前に、１～６日間、好ましくは約５日間、約１．４Ｇｙを含み得る。
実施形態において、患者は、ＨＬＡ－Ａ＊０２であり得る。
実施形態において、患者は、ＨＬＡ－Ａ＊０６であり得る。
実施形態において、方法は、抗ＰＤ１抗体を投与することを更に含み得る。抗ＰＤ１抗体は、ヒト化抗体であり得る。抗ＰＤ１抗体は、ペムブロリズマブであり得る。抗ＰＤ１抗体の投与量は、約２００ｍｇであり得る。抗ＰＤ１抗体は、Ｔ細胞投与後３週毎に投与され得る。
実施形態において、Ｔ細胞の投与量は、約０．８～１．２×１０９個のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞の投与量は、約０．５×１０８～約１０×１０９個のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞の投与量は、約１．２～３×１０９個のＴ細胞、約３～６×１０９個のＴ細胞、約１０×１０９個のＴ細胞、約５×１０９個のＴ細胞、約０．１×１０９個のＴ細胞、約１×１０８個のＴ細胞、約５×１０８個のＴ細胞、約１．２～６×１０９個のＴ細胞、約１～６×１０９個のＴ細胞、又は約１～８×１０９個のＴ細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、３回用量で投与され得る。Ｔ細胞用量は、用量ごとに漸増し得る。Ｔ細胞は、静脈内注入によって投与され得る。
実施形態において、本明細書に記載のＣＤ８配列並びに関連する生成物及び組成物は、養子細胞療法の自己又は同種異系の方法を使用し得る。別の実施形態において、ＣＤ８配列、そのＴ細胞、及び組成物は、例えば、米国特許出願公開第２０１９／０１７５６５０号、米国特許出願公開第２０１９／０２１６８５２号、米国特許出願公開第２０１９／０２４７４３号、及び米国仮特許出願第６２／９８０，８４４号に記載される方法において使用され得、これらの各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
本開示はまた、本明細書に記載の外因性ＣＤ８ポリペプチド及びＴ細胞受容体を提示する改変Ｔ細胞集団を提供し、改変Ｔ細胞集団は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の組み合わせによって活性化及び増殖される。別の実施形態において、改変Ｔ細胞集団は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びゾレドロネートの組み合わせによって増殖及び／又は活性化される。更に別の実施形態において、改変Ｔ細胞集団は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びゾレドロネートの組み合わせによって活性化され、一方、ゾレドロネートを伴わずにＩＬ－２、ＩＬ－１５の組み合わせによって増殖される。本開示は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、及びそれらの組み合わせなどの、活性化及び／又は増殖中の他のインターロイキンの使用を更に提供する。
態様において、ＩＬ－２１、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、又はそれらの組み合わせは、本明細書に記載の方法、及び／又は本明細書に記載のＡＣＴプロセスを用いて、がん治療の分野で利用され得る。実施形態において、本開示は、ＩＬ－２１と一緒に少なくとも１つのＨＤＡＣｉとともにエフェクターＴ細胞を培養することを含む、エフェクターＴ細胞を中央記憶表現型に再プログラミングするための方法を提供する。代表的なＨＤＡＣｉとしては、例えば、トリコスタチンＡ、トラポキシンＢ、フェニルブチレート、バルプロ酸、ボリノスタット（スベラニロヒドロキサム酸）、ベリノスタット、パノビノスタット、ダシノスタット、エンチノスタット、タセジナリン、及びモセチノスタットが挙げられる。
本明細書に記載の操作されたＴ細胞を含む組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与され得る。治療適用において、組成物は、疾患又は状態に既に罹患している患者に、疾患又は状態の症状を治癒又は少なくとも部分的に停止するのに十分な量で投与することができる。操作されたＴ細胞はまた、状態を発症、罹患、又は悪化する可能性を低減するために投与することができる。治療的使用のための操作されたＴ細胞集団の有効量は、疾患又は状態の重症度及び経過、以前の療法、対象の健康状態、体重、及び／若しくは薬物への反応、並びに／又は担当医師の判断に基づいて変化し得る。Ｔ細胞は、本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチド、及び任意選択的に本明細書に記載のＴＣＲを発現するように操作されたαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。Ｔ細胞療法は、様々ながんを治療する上で成功してきている。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ４（３５）：（２０１９）、参照によりその全体が組み込まれる。
投与の方法
本明細書に記載の１つ又は複数の操作されたＴ細胞集団は、任意の順序で、又は同時に対象に投与され得る。同時である場合、複数の操作されたＴ細胞は、例えば、静脈内注入などの単一の、統一された形態で、又は、例えば、複数の静脈内注入、皮下注射、又はピルとして、複数の形態で提供することができる。操作されたＴ細胞は、単一のパッケージ又は複数のパッケージで、一緒に又は別々にパッケージングすることができる。操作されたＴ細胞のうちの１つ又は全ては、複数回用量で投与することができる。同時でない場合、複数回投与の間のタイミングは、約１週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又は約１年まで変化し得る。実施形態において、操作されたＴ細胞は、対象への投与後、対象の体内で、インビボで増殖することができる。操作されたＴ細胞を凍結して、同じ細胞調製物を用いた複数の治療のために細胞を提供することができる。本開示の操作されたＴ細胞、及びそれを含む医薬組成物は、キットとしてパッケージングすることができる。キットは、操作されたＴ細胞及びそれを含む組成物の使用に関する指示（例えば、書面による指示）を含み得る。
がんを治療する方法は、対象に、治療有効量の操作されたＴ細胞を投与することを含み得、投与は、がんを治療する。実施形態において、治療有効量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０秒、３０秒、１分、１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、又は１年間投与され得る。実施形態において、治療有効量の操作されたＴ細胞は、少なくとも１週間投与され得る。実施形態において、治療有効量の操作されたＴ細胞は、少なくとも２週間投与され得る。
本明細書に記載の操作されたＴ細胞、任意選択的にγδＴ細胞は、疾患又は状態の発生の前、間、又は後に投与することができ、操作されたＴ細胞を含む医薬組成物を投与するタイミングは変化し得る。例えば、操作されたＴ細胞は、予防薬として使用することができ、疾患又は状態の発生の可能性を低減するために、状態又は疾患に対する傾向を有する対象に連続的に投与することができる。操作されたＴ細胞は、対象に、症状の発症中又は発症後できるだけ早く投与することができる。操作されたＴ細胞の投与は、症状の発症内、症状の発症の最初の３時間以内、症状の発症の最初の６時間以内、症状の発症の最初の２４時間以内、症状の発症の４８時間以内、又は症状の発症からの任意の期間内に、直ちに開始することができる。初期投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用して、本明細書に記載の任意の経路など、実際的な任意の経路を介することができる。実施形態において、本開示の操作されたＴ細胞の投与は、静脈内投与であり得る。操作されたＴ細胞の１つ又は複数の投与量は、がん、感染症、免疫疾患、敗血症の発症、又は骨髄移植に伴う発症後できるだけ早く、免疫疾患の治療に必要な期間、例えば、約２４時間～約４８時間、約４８時間～約１週、約１週～約２週、約２週～約１ヶ月、約１ヶ月～約３ヶ月などで投与することができる。がんの治療のために、操作されたＴ細胞の１つ又は複数の投与量は、がんの発症後数年、及び他の治療の前又は後に投与され得る。実施形態において、操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、又は少なくとも５年の間投与することができる。治療期間は、対象ごとに異なり得る。Ｔ細胞は、本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチド、任意選択的に本明細書に記載のＴＣＲを発現するαβＴ細胞又はγδＴ細胞であり得る。
本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチド、任意選択的にαβＴ細胞又はγδＴ細胞を発現する操作されたＴ細胞は、組成物中に、少なくとも１×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも２×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも３×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも４×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも５×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも６×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも７×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも８×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも９×１０３個／ｍｌの細胞、少なくとも１×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも２×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも３×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも４×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも５×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも６×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも７×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも８×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも９×１０４個／ｍｌの細胞、少なくとも１×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも２×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも３×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも４×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも５×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも６×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも７×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも８×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも９×１０５個／ｍｌの細胞、少なくとも１×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも２×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも３×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも４×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも５×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも６×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも７×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも８×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも９×１０６個／ｍｌの細胞、少なくとも１×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも２×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも３×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも４×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも５×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも６×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも７×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも８×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも９×１０７個／ｍｌの細胞、少なくとも１×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも２×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも３×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも４×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも５×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも６×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも７×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも８×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも９×１０８個／ｍｌの細胞、少なくとも１×１０９個／ｍｌ以上の細胞、約１×１０３個／ｍｌ～約少なくとも１×１０８個／ｍｌの細胞、約１×１０５個／ｍｌ～約少なくとも１×１０８個／ｍｌの細胞、又は約１×１０６個／ｍｌ～約少なくとも１×１０８個／ｍｌの細胞で存在し得る。
配列
本明細書に記載の配列は、配列番号１～９７、２５６～２６６、２９３、及び２９４のうちのいずれかの配列と約８０％、約８５％、約９０％、約８５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％、又は１００％の同一性を含み得る。本明細書に記載の配列は、配列番号１～９７及び２５６～２６６のうちのいずれかの配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を含み得る。「参照配列と少なくとも８５％同一である」配列は、その全長において、参照配列の全長と８５％以上、特に、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。
別の実施形態において、本開示は、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２５６）、又はＷＰＲＥ ２型、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２５７）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一性の配列を提供する。別の態様において、本開示は、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２５６）、又はＷＰＲＥ ２型、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２５７）における少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、又は２０個のアミノ酸置換を提供する。別の態様において、本開示は、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２５６）、又はＷＰＲＥ ２型、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２５７）における最大で１、２、３、４、５、１０、１５、又は２０個のアミノ酸置換を提供する。別の態様において、配列置換は、保存的置換である。
同一性のパーセンテージは、全体的な対アラインメントを使用して計算され得る（例えば、２つの配列は、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当技術分野で周知である。２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を、それらの全長を考慮して見出すために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用する、≪ｎｅｅｄｌｅ≫プログラムが、例えば、使用され得る。ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで入手可能であり、以下の出版物に更に記載されている（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ．２７６－２７７）。本発明による、２つのポリペプチド間の同一性のパーセンテージは、１０．０に等しい「Ｇａｐ Ｏｐｅｎ」パラメータ、０．５に等しい「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」パラメータ、及びＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスを用いたＥＭＢＯＳＳ：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラムを使用して計算される。
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一」のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換などの変異を含み得る。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列よりも別の種に由来する相同配列に対応し得る。
アミノ酸置換は、保存的又は非保存的であり得る。好ましくは、置換は、１つのアミノ酸が類似の構造的特性及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換されている保存的置換である。
保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆによって「Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５」、Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（その内容は、それらの全体が参照により組み込まれる）に記載されているものを含み得る。例えば、実施形態において、以下のグループのうちの１つに属するアミノ酸は、互いに交換することができ、したがって、保存的交換を構成する：グループ１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グループ２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）、グループ３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グループ４：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、グループ５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びグループ６：アスパラチン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。実施形態において、保存的アミノ酸置換は、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ａ、Ａ→Ｉ、Ｔ→Ｖ、Ａ→Ｍ、Ｔ→Ｉ、Ａ→Ｖ、Ｔ→Ｇ、及び／又はＴ→Ｓから選択され得る。
保存的アミノ酸置換は、同じクラス、例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、（２）非電荷極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及び（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含み得る。他の保存的アミノ酸置換もまた、以下のように作製することができる：（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、（２）プロトンドナー：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、及び（３）プロトンアクセプター：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（例えば、米国特許第１０，１０６，８０５号（それらの全体が参照により組み込まれる）を参照されたい）。
保存的置換は、表Ａに従って作製され得る。タンパク質改変に対する耐性を予測するための方法は、例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５－９２１０（２００４）（その内容は、その全体が参照によって組み込まれる）に見出され得る。
本明細書に記載の配列は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、又は３０個のアミノ酸又はヌクレオチドの変異、置換、欠失を含み得る。配列番号１～９７、２５６～２６６、２９３、及び２９４のうちのいずれか１つは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、又は３０個の変異、置換、又は欠失を含み得る。別の態様において、配列番号１～９７、２５６～２６６、２９３、及び２９４のうちのいずれか１つは、最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、又は３０個の変異、置換、又は欠失を含み得る。態様において、変異又は置換は、保存的アミノ酸置換であり得る。
本明細書に記載のポリペプチドにおける保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下の表Ｂに示されるものであり得る。かかる置換が生物学的活性に変化をもたらす場合、表Ｂで「例示的置換」と表記される、より実質的な変化が導入され得、必要に応じて生成物がスクリーニングされ得る。
別段の指示がない限り、本明細書で使用される全ての用語は、当業者に対するものと同じ意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の参照を含む。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で使用される「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されているＴ細胞の状態を広く指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能に関連することができる。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、増殖しているＴ細胞を指す。
本明細書で使用される「抗体」は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、抗原との特異的な結合を保持する、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'－ＳＨ、（Ｆａｂ'）２Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二価ｓｃＦｖ、及びＦｄ断片を含むがこれらに限定されない抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、並びに抗体及び非抗体タンパク質の抗原特異的標的化領域を含む融合タンパク質を広く指す。抗体は、５つのクラス－ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＭに体系化される。
「抗原」又は「抗原性」は、本明細書で使用される場合、抗体によって結合することができ、加えてその抗原のエピトープに結合することができる抗体を産生するように動物を誘導することができる、ペプチド又はペプチドの一部を広く指す。抗原は、１つのエピトープを有し得るか、又は１つ超のエピトープを有し得る。本明細書に言及される特異的反応は、抗原が、その対応する抗体と高度に選択的な手段で反応し、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体とは反応しないことを指す。
本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」若しくは「ＣＡＲ（複数）」は、抗原特異性を細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、及び幹細胞に移植する遺伝子改変受容体を広く指す。ＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、ヒンジ又はストークドメイン、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、１つ以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）、及び細胞内活性化ドメイン（ＩＡＤ）を含むことができる。特定の実施形態において、ＣＳＤは任意選択的である。別の実施形態において、ＣＡＲは、２つの異なる抗原又はエピトープに特異的である、二重特異性ＣＡＲである。ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合した後、ＩＡＤが細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＡＤは、選択された標的にＴ細胞特異性及び反応性を非ＭＨＣ拘束手段でリダイレクトすることができ、抗体の抗原結合特性を利用する。非ＭＨＣ拘束抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングから独立した抗原を認識する能力を与え、したがって、腫瘍逃避の主要機構をバイパスする。更に、Ｔ細胞内で発現される場合、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
本明細書で使用される「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、その表面でＣＤ８を発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を広く指す。かかる細胞は、好ましくは、抗原経験のある「メモリ記憶」Ｔ細胞（ＴＭ細胞）であり得る。
本明細書で使用される「有効量」、「治療有効量」、又は「効果的な量」は、疾患を治療するために哺乳類又は他の対象に投与される場合、疾患のためのかかる治療に影響を与えるのに十分である薬剤の量、又は２つの薬剤の組み合わせ量を広く指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、並びに治療する対象の年齢、体重などに応じて異なるであろう。
本明細書で使用される「遺伝子改変した」は、外因性核酸が細胞のゲノムに組み込まれているか否かにかかわらず、外因性核酸を細胞に導入する方法を広く指す。本明細書で使用される「遺伝子改変した細胞」は、外因性核酸が細胞のゲノムに組み込まれているか否かにかかわらず、外因性核酸を含有する細胞を広く指す。
本明細書で使用される「免疫細胞」は、骨髄「免疫細胞」で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球細胞（白血球）を広く指し、「免疫細胞」には、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）細胞）及び骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれるが、これらに限定されない。「Ｔ細胞」には、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ制御細胞（Ｔｒｅｇ）及びガンマ－デルタＴ細胞、並びにＮＫ Ｔ細胞（ＣＤ３＋及びＣＤ５６＋）を含む、ＣＤ３を発現する全ての種類の免疫細胞が含まれる。当業者は、本開示を通して使用される場合、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、Ｔ細胞のみ、ＮＫ細胞のみ、又はＴ細胞及びＮＫ細胞の両方を含むことができることを理解するであろう。本明細書に提供される特定の例示的な実施形態及び態様において、Ｔ細胞は、活性化され、形質導入されている。更に、Ｔ細胞は、本明細書に提供される特定の例示的な組成物の実施形態及び態様において提供される。「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害性応答を媒介することができる細胞である、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ－Ｔ細胞、γδＴ細胞、及び好中球を含む。
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、本明細書において互換的に使用される場合、ヒト、ネズミ（例えば、ラット、マウス）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、及び有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）を含むが、これらに限定されない哺乳動物を広く指す。
本明細書で使用される「末梢血単核細胞」又は「ＰＢＭＣ」は、丸い核を有する任意の末梢血細胞を広く指す。ＰＢＭＣには、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞などのリンパ球、並びに単球が含まれる。
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書で互換的に使用される場合、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を広く指す。したがって、この用語には、一本鎖－、二本鎖－、若しくは多重鎖－ＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された非天然、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、本明細書で使用する場合、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球を広く指す。特定の実施形態における使用に好適なＴ細胞の例示的な集団には、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴＣＲを発現するＴ細胞（αβＴ細胞）、γδＴＣＲを発現するＴ細胞（γδＴ細胞）、又はＴ細胞の任意の他のサブセットが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態における使用に好適な他の例示的なＴ細胞集団には、以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＨＬＡ－ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞が含まれるが、これらに限定されず、所望の場合、陽性又は陰性選択技法によって更に単離することができる。
本発明において、「相同」という用語は、２つのアミノ酸配列、例えば、ペプチド又はポリペプチド配列の配列の間の同一性の程度（上記のパーセント同一性を参照）を指す。前述の「相同性」は、比較される配列に対して最適な条件下で整列された２つの配列を比較することによって決定される。かかる配列相同性は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用してアラインメントを作成することによって計算することができる。一般的に利用可能な配列解析ソフトウェア、より具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ、又は他のツールは、公開データベースによって提供される。
「配列相同性」又は「配列同一性」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の配列相同性又は配列同一性のパーセンテージを決定するために、配列が最適な比較目的のためにアライメントされることがここに定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップを導入し得る。かかるアライメントは、比較される配列の全長にわたって実行することができる。代替的に、アライメントは、より短い長さにわたって、例えば、約５、約１０、約２０、約５０、約１００個以上のヌクレオチド又はアミノ酸にわたって実行され得る。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の同一である一致のパーセンテージである。
配列の比較及び２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。当業者は、２つの配列を整列させ、２つの配列間の同一性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識するであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．Ｉｎ Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ ｗａｒｐｓ， ｓｔｒｉｎｇ ｅｄｉｔｓ ａｎｄ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間、又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定され得る。（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３）。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の両方は、アルゴリズムによって整列させることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムが使用された（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ，ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）２７６－２７７，ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。アミノ酸配列では、ＥＢＬＯＳＵＭ６２が置換マトリックスのために使用される。ヌクレオチド配列では、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者であれば、これらの異なるパラメータの全てが、わずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用する場合、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性が顕著には変化しないことを理解するであろう。
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、クエリ配列と本発明の配列との間の配列同一性のパーセンテージは、以下のように計算される。両方の配列で同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示すアライメントにおける対応する位置の数を、アライメントにおけるギャップの総数を減じた後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ－ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」として表示される。本発明のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を特定するために、配列データベースに対する検索を行うための「クエリ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」として更に使用することができるかかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍａｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。本発明のポリヌクレオチドと相同のヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができる。本発明のポリペプチドと相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができる。比較目的でギャップドアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
本明細書で使用される「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」は、アルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体からなるＴ細胞上のタンパク質受容体を広く指すが、一部の細胞では、ＴＣＲは、ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖からなる。ＴＣＲは、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリＴ細胞、調節Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、又はガンマデルタＴ細胞を含む、ＴＣＲを含む任意の細胞で改変され得る。
ＴＣＲは、一般に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に一般的に関与するＴリンパ球（又はＴ細胞）の表面に認められる。それは、Ｔ細胞の９５％ではアルファ及びベータ鎖からなるヘテロ二量体であり、一方、Ｔ細胞の５％は、ガンマ及びデルタ鎖からなるＴＣＲを有する。抗原及びＭＨＣとのＴＣＲの会合は、関連する酵素、共受容体、及び特殊なアクセサリー分子によって媒介される一連の生化学的事象を介して、そのＴリンパ球の活性化をもたらす。免疫学では、ＣＤ３抗原（ＣＤは、分化クラスターを表す）は、哺乳類における４つの異なる鎖（ＣＤ３－γ、ＣＤ３δ、及び２回のＣＤ３ε）からなるタンパク質複合体であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖として知られる分子と会合して、Ｔリンパ球内で活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子は、一緒にＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３－γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーに非常に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、これらの鎖が正に帯電したＴＣＲ鎖（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）と会合することを可能にする特性である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ又は略してＩＴＡＭとして知られる単一の保存されたモチーフを含有し、これは、ＴＣＲのシグナル伝達能力に不可欠である。
「治療」、「治療すること」などは、本明細書で使用される場合、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを広く指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に予防する点で予防的であり得、かつ／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する副作用の部分的若しくは完全な治癒の点で治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患が発生することを防止することと、（ｂ）疾患を阻害すること、例えば、その発症を阻止することと、（ｃ）疾患を軽減すること、例えば、疾患の退行を引き起こすことと、を含む。
樹状細胞（ＤＣ）が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化及び増殖する能力は、ＤＣ成熟段階に依存し得、ＤＣは、細胞溶解性免疫応答を誘発するために、ＩＬ－１２産生に関連する「ライセンス化」シグナルを受信する必要があり得る。特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＣでのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）－ＣＤ４０相互作用を介したシグナルの提供は、それぞれ、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞のＤＣライセンス化及び誘導にとって重要であると考えられ得る。ＤＣライセンス化は、共刺激分子の上方調節、ＤＣの増加した生存率及びより良好な交差提示能力をもたらし得る。このプロセスは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して媒介され得る［Ｓ．Ｒ．Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，"Ｈｅｌｐ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＣＤ４０ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，"Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８４）：４７８－４８０（１９９８）、Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，"Ｔ－ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，"Ｎａｔｕｒｅ ３９３（６６８４）：４８０－４８３（１９９８）］が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ非依存メカニズムも存在する（ＣＤ７０、ＬＴβＲ）。加えて、ＤＣで発現されたＣＤ４０Ｌと、ＣＤ８＋Ｔ細胞で発現されたＣＤ４０との間の直接相互作用も示唆されており、ヘルパー非依存性ＣＴＬ応答の生成について考えられる説明を提供する［Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｌｐｅｒ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｂｙ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＣＤ４０Ｌ ｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，"Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３０（２）：２１８－２２７（２００９）］。
実施例１
例示的な核酸配列及びアミノ酸配列

本発明者らは、ベクターにおける様々なＣＤ８エレメントが、発現及び活性に驚くべき増加をもたらすことを見出した。例えば、構築物番号１０は、構築物番号９ｂ、番号１１、及び番号１２よりも低いウイルス力価を有するという観察（図５Ａ）にもかかわらず、最も低いウイルス体積濃度、例えば、１．２５μｌ／細胞１０６個でＣＤ８αβヘテロ二量体及びＴＣＲを発現する構築物番号１０で形質導入したＴ細胞は、ＣＤ８α及びＴＣＲを発現する構築物番号９ｂ（４２．３％、図９Ａ）、ＣＤ８α膜貫通及び細胞内ドメイン及びＴＣＲを有するＣＤ８αＣＤ８βストークを発現する構築物番号１１（５１．６％、図９Ｃ）、並びに神経接着分子１（ＮＣＡＭ１）膜貫通及び細胞内ドメイン及びＴＣＲを有するＣＤ８αＣＤ８βストークを発現する構築物番号１２（１４．９％、図９Ｄ）、で形質導入したものよりも高いＣＤ８＋ＣＤ４＋ＴＣＲ＋細胞（５６．７％、図９Ｂ）を生成した。
ベクターは、配列番号２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９５、２９７、２９９、又は３０１の核酸配列のうちのいずれか１つを含み得る。
Ｔ細胞は、配列番号２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９５、２９７、２９９、又は３０１の核酸を発現するように形質導入され得る。
表２における構築物のいくつかのエレメントは、表３に記載されている。







































表２の構築物は、表３に記載の個々の構成要素の集合体であり得る。本発明者らは、表２に記載されるような表３からの転写エンハンサーの組み合わせ、順序、及び包含が、トランスフェクション効率、発現レベル、及び細胞傷害性Ｔ細胞活性例えば、ＩＬ－１２分泌、ＩＦＮ－γ分泌、ＴＮＦ－α分泌、グランザイムＡ分泌、ＭＩＰ－１ａ分泌、ＩＰ－１０分泌、グランザイムＢ分泌、及びそれらの組み合わせの誘導における予想外の改善をもたらすことを見出した。
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）
ＭＨＣクラスＩ依存性免疫反応では、ペプチドは、腫瘍細胞によって発現される特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合することができなければならないだけでなく、それらはその後また、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞によって認識されなければならない。
タンパク質がＴリンパ球によって腫瘍特異的又は関連抗原として認識され、療法に使用されるためには、特定の前提条件を満たさなければならない。抗原は主に腫瘍細胞によって発現され、正常で健常な組織によって発現されないか、又は比較的少量で発現されるべきである。好ましい実施形態において、ペプチドは、正常で健常な組織と比較して、腫瘍細胞によって過剰に提示されるべきである。更に、それぞれの抗原は、腫瘍のタイプに存在するだけでなく、また高濃度（例えば、細胞当たりのそれぞれのペプチドのコピー数）で存在することが望ましい。腫瘍特異的及び腫瘍関連抗原は、例えば細胞周期制御又はアポトーシスの抑制において、それらの機能に起因して、正常細胞から腫瘍細胞への形質転換に直接関与するタンパク質に由来することが多い。加えて、形質転換を直接的に引き起こすタンパク質の下流標的は、上方調節され得、したがって、間接的に腫瘍関連であり得る。かかる間接的な腫瘍関連抗原はまた、ワクチン接種アプローチの標的であり得る。Ｓｉｎｇｈ－Ｊａｓｕｊａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５３（２００４）：１８７－１９５。エピトープは、抗原のアミノ酸配列に存在し、ペプチドを「免疫原性ペプチド」にさせており、腫瘍関連抗原に由来しており、インビトロ及びインビボの両方でＴ細胞応答をもたらす。
ＭＨＣ分子に結合することができる任意のペプチドは、Ｔ細胞エピトープとして機能し得る。Ｔ細胞応答の誘導のために、ＴＡＡは、対応するＴＣＲを有するＴ細胞を提示されなければならず、宿主は、この特定のエピトープに対する免疫学的寛容を有してはならない。本明細書に記載のＣＤ８ポリペプチドとともに使用され得る例示的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、本明細書に開示される。



実施例２
ＣＤ８α分子
ＣＤ８αホモ二量体（ＣＤ８αα）は、ストーク領域で２つのジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのαサブユニットから構成され得る。図１は、ＣＤ８αポリペプチド、例えば、配列番号２５８（ＣＤ８α１）を示し、以下の５つのドメイン：（１）１つのシグナルペプチド（－２１～－１）、例えば、配列番号６、（２）１つのＩｇ様ドメイン－１（１～１１５）、例えば、配列番号１、（３）１つのストーク領域（１１６～１６０）、例えば、配列番号２６０、（４）１つの膜貫通（ＴＭ）ドメイン（１６１～１８８）、例えば、配列番号３、及び（５）ｌｃｋ結合モチーフを含む１つの細胞質尾部（Ｃｙｔｏ）（１８９～２１４）、例えば、配列番号４、を含む。ＣＤ８αサブユニットの別の例、例えば、ＣＤ８α２（配列番号２５９）は、ＣＤ８α１とは１１２位で異なり、その位置に、ＣＤ８α２がシステイン（Ｃ）を含有し、ＣＤ８α１がチロシン（Ｙ）を含有する。
改変ＣＤ８ポリペプチド
ＣＤ８αポリペプチド、例えば、ＣＤ８α１（配列番号２５８）及びＣＤ８α２（配列番号２５９）とは異なり、改変ＣＤ８αポリペプチド、例えば、ｍ１ＣＤ８α（配列番号７）及びｍ２ＣＤ８α（配列番号２６２）は、ＣＤ８βポリペプチドからの配列伸長などの追加の領域を含有し得る。実施形態において、配列番号２又はそのバリアントは、ＣＤ８αポリペプチドとともに使用される。他の実施形態において、ＣＤ８αポリペプチドの一部、例えば、配列番号２６０は、除去されるか、又は本明細書に記載の改変ＣＤ８ポリペプチドに含まれない。図２は、ＣＤ８α１（配列番号２５８）とｍ１ＣＤ８α（配列番号７）との間の配列アライメントを示す。図３は、ＣＤ８α２（配列番号２５９）とｍ２ＣＤ８α（配列番号２６２）との間の配列アライメントを示し、システイン置換が矢印によって示される。ストーク領域が枠内に示される。
改変ＣＤ８発現細胞は、ＴＣＲで形質導入した元のＣＤ８発現Ｔ細胞と比較して、細胞傷害性及びサイトカイン応答に関して改善された機能性を示した。
実施例３
レンチウイルスベクター
本明細書で使用されるレンチウイルスベクターは、ベクター機能を増強するいくつかのエレメントを含有し、これには、改善された複製及び核輸入のための中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）、いくつかの細胞型でベクターサイレンシングを減少させるマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）からのプロモーター（配列番号２６３）、改善された転写終結のためのウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答性エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号２６４）が含まれ、骨格は、安全性、持続的な遺伝子発現、及び抗サイレンシング特性を改善する欠失した３'－ＬＴＲ自己不活性化（ＳＩＮ）ベクター設計だった。Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１４１１－１４２３。
実施形態において、本明細書に記載のベクター、構築物、又は配列は、ＷＰＲＥの変異形態を含む。実施形態において、本明細書に記載の配列又はベクターは、ＷＰＲＥ １型、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２５６）、又はＷＰＲＥ ２型、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２５７）に変異を含む。構築物番号９及び構築物番号９ｂは、ＷＰＲＥｍｕｔ２と同じ配列番号２５７を含有する構築物を有する２つのＬＶ産生バッチを表し、構築物番号９と構築物番号９ｂとの間の差は、表４（表５）と一致する力価である。実施形態において、ＷＰＲＥ変異体は、最大で１個の変異、最大で２個の変異、最大で３個の変異、少なくとも４個の変異、又は最大で５個の変異を含む。実施形態において、本明細書に記載のベクター、構築物、又は配列は、ＷＰＲＥを含まない。態様において、米国特許出願公開第２０２１／０２８５０１１号（その内容はその全体が参照により組み込まれる）に記載されるＷＰＲＥ配列は、本明細書に記載のベクター、配列、又は構築物とともに使用され得る。
実施形態において、本明細書に記載のベクター、構築物、又は配列は、Ｘタンパク質プロモーターを含まない。本明細書に記載のＷＰＲＥ変異体は、Ｘタンパク質を発現しない。ＷＰＲＥは、導入遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を促進するために、ヌクレオソームから細胞質へのｍＲＮＡの輸出を促進するように理論化された、ｍＲＮＡの蓄積を促進する。
形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又はγδＴ細胞において、ＴＣＲαβ、ｍＣＤ８α（例えば、ｍ１ＣＤ８α（配列番号７）及びｍ２ＣＤ８α（配列番号２６２））、及びＣＤ８β（例えば、ＣＤ８β１～７（配列番号８～１４）のうちのいずれか１つ）の最適な共発現レベルを得るために、様々な設計を有するレンチウイルスベクターを作製した。Ｔ細胞は、２つの別個のレンチウイルスベクター（２－イン－１）で形質導入され得、例えば、ＴＣＲαβ及びＣＤ８αβヘテロ二量体の共発現のために、片方がＴＣＲα及びＴＣＲβを発現して、他方がｍＣＤ８α及びＣＤ８βを発現し、又はＴＣＲαβ及びｍＣＤ８αホモ二量体の共発現のために、片方がＴＣＲα及びＴＣＲβを発現して、他方がｍＣＤ８αを発現する。代替的に、Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ及びＣＤ８αβヘテロ二量体の共発現のために、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ｍＣＤ８α、及びＣＤ８βを共発現する単一レンチウイルスベクター（４－イン－１）で形質導入され得る。４－イン－１ベクターにおいて、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ｍＣＤ８α鎖、及びＣＤ８β鎖をコードするヌクレオチドは、様々な順序、例えば、５'から３'方向に、ＴＣＲα－ＴＣＲβ－ｍＣＤ８α－ＣＤ８β、ＴＣＲα－ＴＣＲβ－ＣＤ８β－ｍＣＤ８α、ＴＣＲβ－ＴＣＲα－ｍＣＤ８α－ＣＤ８β、ＴＣＲβ－ＴＣＲα－ＣＤ８β－ｍＣＤ８α、ｍＣＤ８α－ＣＤ８β－ＴＣＲα－ＴＣＲβ、ｍＣＤ８α－ＣＤ８β－ＴＣＲβ－ＴＣＲα、ＣＤ８β－ｍＣＤ８α－ＴＣＲα－ＴＣＲβ、及びＣＤ８β－ｍＣＤ８α－ＴＣＲβ－ＴＣＲαでシャッフルされ得る。このようにして生成された様々な４－イン－１ベクターを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又はγδＴ細胞を形質導入し、続いて、当該技術分野で既知の技術、例えば、フローサイトメトリーを使用して、形質導入した細胞のＴＣＲαβ／ｍＣＤ８α／ＣＤ８β共発現レベルを測定し得る。同様に、Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ及びｍＣＤ８αホモ二量体の共発現のために、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、及びｍＣＤ８α（例えば、ｍ１ＣＤ８α及びｍ２ＣＤ８α）を共発現する単一レンチウイルスベクター（３－イン－１）で形質導入され得る。３－イン－１ベクターでは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ｍＣＤ８α鎖をコードするヌクレオチドは、様々な順序、例えば、ＴＣＲα－ＴＣＲβ－ｍＣＤ８α、ＴＣＲβ－ＴＣＲα－ｍＣＤ８α、ｍＣＤ８α－ＴＣＲα－ＴＣＲβ、及びｍＣＤ８α－ＴＣＲβ－ＴＣＲαでシャッフルされ得る。このようにして生成された様々な３－イン－１ベクターを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及び／又はγδＴ細胞を形質導入し、続いて、当該技術分野で既知の技術を使用して、形質導入した細胞のＴＣＲαβ／ｍＣＤ８α共発現レベルを測定し得る。
ＴＣＲαβ並びにｍＣＤ８α及び／又はＣＤ８βを共発現するレンチウイルスベクターを生成するために、フューリンリンカー（ＧＳＧ又はＳＧＳＧ（配列番号２６６））－２Ａペプチドをコードするヌクレオチドを、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖との間、ｍＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖との間、及びＴＣＲ鎖とＣＤ８鎖との間に配置して、非常に効率的な遺伝子発現を可能にし得る。２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（配列番号９３）、Ｔ２Ａ（配列番号９４）、Ｅ２Ａ（配列番号９５）、又はＦ２Ａ（配列番号９６）から選択され得る。
レンチウイルスベクターはまた、ＷＰＲＥ（配列番号２６４）、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２５６）、又はＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２５７）などの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含有して、核及び細胞質のｍＲＮＡレベルの両方を増加させることによって、導入遺伝子の発現を増強し得る。マウスＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、サルレトロウイルスタイプ１（ＳＲＶ－１）の構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）、及びヒトヒートショックタンパク質７０の５'非翻訳領域（Ｈｓｐ７０ ５'ＵＴＲ）を含む１つ以上の調節エレメントも使用して、かつ／又はＷＰＲＥと組み合わせて使用して、導入遺伝子発現を増加させ得る。ＷＰＲＥｍｕｔ１及びＷＰＲＥｍｕｔ２は、Ｘタンパク質を発現しないが、依然として、導入遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を増強するように作用する。
レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスの細胞質尾部（ＴＲ）に融合したネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインを含むキメラ糖タンパク質である、ＲＤ１１４ＴＲ（例えば、配列番号９７）を用いて偽型化され得る。ＶＳＶ－Ｇ ｅｎｖ、ＭＬＶ４０７０Ａ ｅｎｖ、ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏ、バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ、若しくはＧＡＬＶ ｅｎｖ、又はそれらの誘導体などの他のウイルスエンベロープタンパク質も使用され得る。配列番号９７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を含むＲＤ１１４ＴＲバリアントもまた提供される。
例えば、図４は、２つの４－イン－１ベクター、例えば、ＴＣＲ（ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖）、ＣＤ８α、及びＣＤ８βを共発現する構築物番号１０及び番号２、ＴＣＲ及びＣＤ８αを発現する３つの３－イン－１ベクター、例えば、構築物番号１及び番号９、ＴＣＲ及びｍ１ＣＤ８α（配列番号７）を発現する２つの３－イン－１ベクター、例えば、構築物番号１１及び番号１２、並びにＴＣＲのみを発現する構築物番号８を含む例示的なベクターを示す。転写終結を改善するために、野生型ＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ）（配列番号２６４）が、構築物番号１、番号２、及び番号８に含まれ、ＷＰＲＥｍｕｔ（配列番号２５７）が、構築物番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２に含まれる。
更なる例示的な構築物（構築物番号１３～番号１９及び番号２１～番号２６）が、上記の表２に記載される。特に、構築物番号１３、番号１４、及び番号１６は、ＴＣＲ、ＣＤ８α、及びＣＤ８β３を、様々なシグナルペプチドの組み合わせ（配列番号６［ＷＴ ＣＤ８αシグナルペプチド］、配列番号２９３［ＷＴ ＣＤ８βシグナルペプチド］、及び配列番号２９４［Ｓ１９シグナルペプチド］）とともに共発現し、エレメント順序が異なる、４－イン－１構築物である。構築物番号１５及び番号１７は、ＴＣＲ、ＣＤ８α、及びＣＤ８β５を共発現する４－イン－１構築物である。構築物番号１５は、ＷＴ ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号６）及びＷＴ ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号２９３）を含み、一方、構築物番号１７は、ＣＤ８α及びＣＤ８β５の両方のＮ末端にＳ１９シグナルペプチド（配列番号２９４）を含む。構築物番号２１は、ＴＣＲと、ＣＤ８αと、ＷＴ ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号６）及びＷＴ ＣＤ８βシグナルペプチド（配列番号２９３）を含む、ＣＤ８β２と、を共発現する４－イン－１構築物である。構築物番号１８は、ＣＤ８α及びＣＤ８β１のＷＴシグナルペプチド（それぞれ、配列番号６及び２９３）がＳ１９シグナルペプチド（配列番号２９４）で置き換えられている、構築物番号１０のバリアントである。構築物番号１９は、ＷＴ ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号６）がＳ１９シグナルペプチド（配列番号２９４）で置き換えられている、構築物番号１１のバリアントである。構築物番号２２は、ＣＤ４膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが、ＣＤ８α膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの代わりにＣＤ８βストーク配列のＣ末端に融合されている、構築物番号１１のバリアントである。構築物番号２５は、ＣＤ８βストーク配列（配列番号２）がＣＤ８αストーク配列（配列番号２６０）で置き換えられている、構築物番号２２のバリアントである。
実施例４
ベクタースクリーニング（構築物番号１、番号２、番号８、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２）
ウイルス力価
図５Ａは、構築物番号１、番号２、番号８、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２のウイルス力価を示す。表５は、構築物番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２についてウイルス力価及びレンチウイルスＰ２４ ＥＬＩＳＡデータを示す。
構築物１２について、ＮＣＡＭｆｕは、改変ＣＤ８ａ細胞外ドメイン及び神経細胞接着分子１（ＣＤ５６）細胞内ドメインを発現するＮＣＡＭＦｕｓｉｏｎタンパク質を指す。
表５では、ＷＰＲＥｍｕｔ２部分は、配列番号２５７を指す。
Ｔ細胞製造
活性化
図６は、＋０日目に、２名のドナー（ドナー番号１及びドナー番号２）から得られたＰＢＭＣ（細胞約９×１０８個）を解凍して休ませたことを示す。細胞を、血清の存在中で抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたバッグ（ＡＣ２９０）中で活性化した。活性化マーカー、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びヒト低密度リポタンパク質受容体（Ｈ－ＬＤＬ－Ｒ）が、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞にあり、続いて測定した。図７Ａは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞％、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞％、及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｈ－ＬＤＬ－Ｒ＋細胞％が、活性化前（Ｐｒｅ－Ａ）と比較して、活性化後（Ｐｏｓｔ－Ａ）に増加することを示す。同様に図７Ｂは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞％、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞％、及びＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｈ－ＬＤＬ－Ｒ＋細胞％が、活性化前（Ｐｒｅ－Ａ）と比較して、活性化後（Ｐｏｓｔ－Ａ）に増加することを示す。これらの結果は、ＰＢＭＣの活性化を裏付ける。
形質導入
図６は、＋１日目に、活性化ＰＢＭＣを、ウイルスベクター、例えば、構築物番号１、番号２、番号８、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２を用いて、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）６ウェルプレートにおいて、血清の不存在下で、細胞約５×１０６個／ウェルで形質導入したことを示す。形質導入に使用されたウイルスの量が表６に示される。
増殖
図６は、＋２日目に、形質導入したＰＢＭＣが、血清の存在中で増殖したことを示す。＋６日目に、細胞をその後の分析、例えば、ＦＡＣＳ－Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ及びベクターコピー数（ＶＣＮ）のために細胞を採取し、凍結保存した。図８Ａ及び８Ｂは、それぞれ、ドナー番号１及びドナー番号２から得られた形質導入Ｔ細胞産物の、＋６日目の増殖倍率を示す。細胞の生存率は、＋６日目に９０％超である。
Ｔ細胞産物の特性評価
細胞数、ＦＡＣＳ－ｄｅｘｔｒａｍｅｒ、及びベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定した。四量体パネルは、生細胞／死細胞、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４、及びペプチド／ＭＨＣ四量体、例えば、ＰＲＡＭＥ－００４（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）（配列番号１４７）／ＭＨＣ四量体を含み得る。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋四量体（Ｔｅｔ）＋及びＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、及び９Ｄは、ドナー番号１から得られた細胞の代表的なフロープロットを示し、それぞれ、構築物番号９ｂ、番号１０、番号１１、又は番号１２で形質導入した細胞のＣＤ８、ＣＤ４、及びＰＲＡＭＥ－００４／ＭＨＣ四量体（Ｔｅｔ）％を示す。
図１０は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、又は番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞％を示す。これらの結果は、野生型ＷＰＲＥ（構築物番号１）及びＷＰＲＥｍｕｔ２（構築物番号９）でＣＤ８α及びＴＣＲを発現するベクターを用いた形質導入によって得られたＣＤ８＋ＣＤ４＋％が、細胞構築物番号１０、番号１１、又は番号１２で形質導入したものよりも高いことを示す。構築物番号８（ＴＣＲのみ）が陰性対照として機能する。図１１は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞のＴｅｔ％を示す。これらの結果は、ＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞のＴｅｔ％が、構築物番号９、番号１０、及び番号１１で形質導入した細胞間で同等に現れ、構築物番号１２で形質導入した細胞よりも高くみえることを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
図１２は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋細胞のＴｅｔ ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋での四量体ＭＦＩがドナー間で異なることを示す。図１３は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋細胞のＣＤ８α ＭＦＩを示す。これらの結果は、野生型ＷＰＲＥ（構築物番号１）及びＷＰＲＥｍｕｔ２（構築物番号９）を有するＣＤ８α及びＴＣＲを発現するベクターで形質導入した細胞におけるＣＤ８α ＭＦＩが、他の構築物で形質導入した細胞よりも高いことを示す。５μｌ／１０６個の形質導入体積は、１．２５μｌ／１０６個及び２．５μｌ／１０６個よりも優れた結果を生じるようである。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋、続いてＴｅｔ ＭＦＩ／ＣＤ８α ＭＦＩでゲーティングした。
図１４は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、又は番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からの細胞におけるＣＤ８頻度（ＣＤ３＋のうちのＣＤ８＋ＣＤ４－細胞の％）を示す。これらの結果は、構築物間のＣＤ８頻度に差がないことを示す。非形質導入（ＮＴ）が陰性対照として機能する。図１５は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、又は番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からの（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞％を示す。これらの結果は、構築物番号９、番号１１、及び番号１２で形質導入した細胞における（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋の頻度が、構築物番号１０で形質導入したものよりも高いことを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ８＋ＣＤ４－、続いてＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
図１６は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞のＴｅｔ ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ８＋ｔｅｔ＋細胞の四量体ＭＦＩがドナー間で異なることを示す。図１７は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、及び番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞のＣＤ８α ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋のＣＤ８α ＭＦＩが、異なる構築物で形質導入した細胞間で同等であることを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋、続いてＴｅｔ ＭＦＩ／ＣＤ８α ＭＦＩでゲーティングした。
図１８は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、又は番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１（上側パネル）及びドナー番号２（下側パネル）からのＣＤ３＋細胞のＴｅｔ＋％を示す。これらの結果は、構築物番号９又は番号１１で形質導入した細胞におけるＣＤ３＋Ｔｅｔ＋の頻度が、構築物番号１０又は番号１２で形質導入したものよりも高いことを示す。構築物番号１０（ＷＰＲＥｍｕｔ２）で形質導入した細胞中のＴｅｔ＋ＣＤ３＋細胞％は、構築物番号２（野生型ＷＰＲＥ）を用いて細胞１×１０６個当たり５μｌで形質導入した細胞よりも高いようにみえる。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ３＋、続いてＴｅｔ＋でゲーティングした。
図１９（上側パネル）は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、又は番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１からのベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す。これらの結果は、構築物番号１１又は番号１２で形質導入した細胞では、構築物番号９又は番号１０で形質導入した細胞よりも高いＶＣＮを示す（より高い力価に起因する可能性がある）。図１９（下側パネル）は、構築物番号１、番号２、番号８（ＴＣＲ）、番号９、番号１０、番号１１、又は番号１２を用いて、細胞１×１０６個当たり１．２５μｌ、２．５μｌ、又は５μｌで形質導入したドナー番号１からのＣＤ３＋Ｔｅｔ＋／ＶＣＮを示す。これらの結果は、構築物番号９で形質導入した細胞におけるＣＤ３＋Ｔｅｔ＋／ＶＣＮが、構築物番号１０、番号１１、又は番号１２で形質導入した細胞よりも高いこと示す。
要約すると、これらの結果は、（１）構築物番号１０、番号１１、又は番号１２で形質導入した細胞よりも野生型ＷＰＲＥ（構築物番号１）及びＷＰＲＥｍｕｔ２（構築物番号９）でＣＤ８α及びＴＣＲを発現するベクターを用いて形質導入した細胞によって得られた高いＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞％、（２）ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋細胞％が、異なる構築物を用いて形質導入した細胞間で同等であったこと、（３）四量体％における用量依存的増加、例えば、細胞１×１０６個当たり５μｌが、１．２５μｌ及び細胞１×１０６個当たり２．５μｌよりも良好な結果を示したこと、（４）異なる構築物で形質導入した細胞間での同等なＣＤ８＋細胞％、（５）構築物番号１０で形質導入した細胞よりも構築物番号９、番号１１、又は番号１２で形質導入した細胞における高いＣＤ８＋Ｔｅｔ＋頻度、（６）構築物番号１０又は番号１２で形質導入した細胞よりも構築物番号９又は番号１１で形質導入した細胞における高いＣＤ３＋Ｔｅｔ＋頻度、（７）構築物番号９又は番号１０で形質導入した細胞よりも、構築物番号１１又は番号１２で形質導入した細胞における高いＶＣＮ、及び（８）構築物番号１０、番号１１、又は番号１２で形質導入した細胞よりも構築物番号９で形質導入した細胞における高いＣＤ３＋ｔｅｔ＋／ＶＣＮ、を示す。
遺伝子導入ＴＣＲ及び改変ＣＤ８共受容体を発現するウイルスベクターで形質導入したＴ細胞産物は、標的陽性細胞株に対して優れた細胞傷害性及び増加したサイトカイン産生を示した。
実施例５
腫瘍死アッセイ
図２０Ａ～Ｃは、異なるレベルで抗原を発現する標的陽性細胞株（細胞当たり１０８１コピーのＵＡＣＣ２５７、細胞当たり５０コピーのＡ３７５）に対する細胞傷害性を媒介する際に、構築物（番号１０、番号１１、及び番号１２）がＴＣＲ単独に匹敵することを示すデータを示す。
構築物番号９は、低標的抗原発現性Ａ３７５細胞株に対して経時的に腫瘍制御を失う。
実施例６
ＩＦＮγ分泌アッセイ
ＩＦＮγ分泌は、ＵＡＣＣ２５７及びＡ３７５細胞株で測定した。ＵＡＣＣ２５７細胞株で応答するＩＦＮγ分泌は、構築物間で同等であった。しかしながら、Ａ３７５細胞株において、構築物番号１０は、他の構築物よりも高いＩＦＮγ分泌を示した。ＩＦＮγは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプレートからの上清中で定量した。図２１Ａ～Ｂ。
図２２は、標的陽性腫瘍細胞株ＵＡＣＣ２５７及びＡ３７５への暴露に応答して、ＰＢＭＣ由来のＴ細胞産物による樹状細胞（ＤＣ）成熟及びサイトカイン分泌を評価するための例示的な実験設計を示す。
Ａ３７５に応答するＩＦＮγ分泌は、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）の存在中で増加する。ｉＤＣを有する三共培養において、ＩＦＮγ分泌は、構築物番号１０で、他の構築物と比較して高い。しかしながら、番号９を、野生型及び改変ＣＤ８共受容体を発現する番号１１とそれぞれ比較すると、番号１１で形質導入されたＴ細胞は、ドナーＤ６００１１５を使用した三元共培養、Ｅ：Ｔ：ｉＤＣ：：１：１／１０：１／４の培養上清において定量化されたＩＦＮγとして測定された、より強いサイトカイン応答を誘導した。図２３Ａ～Ｂ
Ａ３７５に応答するＩＦＮγ分泌は、ｉＤＣの存在中で増加する。ｉＤＣを添加した三共培養において、ＩＦＮγ分泌は、構築物番号１０で、他の構築物と比較して高かった。ＤＣ共培養物Ｄ１５００８１、Ｅ：Ｔ：ｉＤＣ：：１：１／１０：１／４からの上清中で定量化したＩＦＮγ。図２４Ａ～Ｂ
ＵＡＣＣ２５７に応答するＩＦＮγ分泌は、ｉＤＣの存在中で増加する。ｉＤＣを添加した三共培養において、ＩＦＮγ分泌は、構築物番号１０で、他の構築物と比較して高い。しかしながら、番号９を、野生型及び改変ＣＤ８共受容体を発現する番号１１とそれぞれ比較すると、構築物番号１１で形質導入したＴ細胞は、ドナーＤ６００１１５を使用した三元共培養、Ｅ：Ｔ：ｉＤＣ：：１：１／１０：１／４の培養上清において定量化されたＩＦＮγとして測定された、より強いサイトカイン応答を誘導した。図２５Ａ～Ｂ。これらの結果は、導入遺伝子ＴＣＲ及びＣＤ８共受容体（αβヘテロ二量体又は改変ＣＤ８αホモ二量体）を共発現するＴ細胞産物が、抗原交差提示を通じて微小環境中のＤＣをライセンス化することができ、したがって、より強い抗腫瘍応答を開始し、腫瘍微小環境を調節する可能性を保持することを実証する。
実施例７
ベクタースクリーニング（構築物番号１３～番号２１）
ウイルス力価
図５Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ（新しいバッチ）、番号１１、番号１１ｎ（新しいバッチ）、番号１３～番号２１、及び対照としてのＴＣＲのみのウイルス力価を示す。
Ｔ細胞製造
活性化
図２６は、＋０日目に、２つのＨＬＡ－Ａ０２＋ドナー（ドナー番号１及びドナー番号２）から得られたＰＢＭＣを解凍し、休ませたことを示す。細胞を、血清の非存在下で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたバッグ（ＡＣ２９０）中で活性化した。活性化マーカー、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及びヒト低密度リポタンパク質受容体（Ｈ－ＬＤＬ－Ｒ）が、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞中にあり、続いて測定した。図２７Ａは、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞％、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞％、及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｈ－ＬＤＬ－Ｒ＋細胞％が、活性化前（Ｐｒｅ－Ａ）と比較して、活性化後（Ｐｏｓｔ－Ａ）に増加することを示す。同様に図２７Ｂは、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞％、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞％、及びＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｈ－ＬＤＬ－Ｒ＋細胞％が、活性化前（Ｐｒｅ－Ａ）と比較して、活性化後（Ｐｏｓｔ－Ａ）に増加することを示す。これらの結果は、ＰＢＭＣの活性化を裏付ける。
形質導入
図２６は、＋１日目に、活性化ＰＢＭＣを、ウイルスベクター、例えば、構築物番号８、番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１１ｎ、及び番号１３～番号２１を用いて、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）２４ウェルプレートにおいて、血清の不存在下で、細胞約２×１０６個／ウェルで形質導入したことを示す。形質導入に使用されたウイルスの量が表８に示される。
増殖
図２６は、＋２日目に、形質導入したＰＢＭＣが、血清の不在下で増殖したことを示す。＋６日目に、後続の分析、例えば、ＦＡＣＳ－ｄｅｘｔｒａｍｅｒ（四量体？）及びベクターコピー数（ＶＣＮ）のために細胞を採取し、凍結保存した。図２８は、形質導入したＴ細胞産物の＋６日目の増殖倍率を示す。細胞の生存率は、＋６日目に９０％超である。
Ｔ細胞産物の特性評価
細胞数、ＦＡＣＳ－ｄｅｘｔｒａｍｅｒ、及びベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定した。四量体パネルは、生細胞／死細胞、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４、及びペプチド／ＭＨＣ四量体、例えば、ＰＲＡＭＥ－００４（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）（配列番号１４７）／ＭＨＣ四量体を含み得る。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋四量体（Ｔｅｔ）＋及びＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
図２９Ａ及び図２９Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入したＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞％を示す。これらの結果は、試験した全てのベクターを用いた形質導入によって得られたＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞の同等の頻度を示す。構築物番号８（ＴＣＲのみ）が陰性対照として機能する。図３０Ａ及び図３０Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入したＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞のＴｅｔ％を示す。これらの結果は、ＣＤ８β３アイソフォーム（構築物番号１６）及びＣＤ８β５アイソフォーム（構築物番号１５及び番号１７）と比較して、ＣＤ８β１アイソフォーム（構築物番号１０及び番号１８）においてＣＤ４＋ＣＤ８＋ｔｅｔ＋の頻度が高い傾向にあったことを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
図３１Ａ及び図３１Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入したＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋細胞のＴｅｔ ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ８β３アイソフォーム（構築物番号１６）及びＣＤ８β５アイソフォーム（構築物番号１５及び番号１７）と比較して、ＣＤ８β１アイソフォーム（構築物番号１０及び番号１８）におけるＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋集団での高い四量体ＭＦＩの傾向を示す。
図３２Ａ及び図３２Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入した細胞におけるＣＤ８頻度（ＣＤ３＋のうちのＣＤ８＋ＣＤ４－％）を示す。これらの結果は、構築物間のＣＤ８頻度に差異を示さない。図３３Ａ及び図３３Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入した（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞％を示す。これらの結果は、構築物番号１０で形質導入した細胞における（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋の頻度が、他の構築物で形質導入したものよりもわずかに高いことを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３続いてＣＤ８＋ＣＤ４－、続いてＴｅｔ＋でゲーティングした。
図３４Ａ及び図３４Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入したＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞のＴｅｔ ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ８＋ｔｅｔ＋細胞の四量体ＭＦＩが、ＣＤ８β１（構築物番号１８及び番号１０）、ＣＤ８β５（構築物番号１５及び番号１７）、及びＣＤ８β３（構築物番号１６）アイソフォームの間で同等であり、一方、構築物番号２１は、より低い四量体ＭＦＩを表したことを示す。
図３５Ａ及び図３５Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入したＣＤ３細胞のＴｅｔ＋％を示す。これらの結果は、構築物番号１０（ＣＤ８β１）で形質導入した細胞におけるＣＤ３＋Ｔｅｔ＋の頻度が、ＣＤ８β３（構築物番号１６）及びＣＤ８β５（構築物番号１５及び番号１７）で形質導入したものと比較して高いことを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＴｅｔ＋でゲーティングした。
図３６Ａ及び図３６Ｂは、構築物番号１０、番号１０ｎ、番号１１、番号１３～番号２１を用いて、細胞１×１０６個当たり０．３μｌ、１．１μｌ、３．３μｌ、１０μｌ、又は３０μｌで形質導入した細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す。これらの結果は、ＣＤ８／ＴＣＲ遺伝子を組み込んで発現させる全ての構築物の同等の能力を示す。
要約すると、これらの結果は、（１）ＣＤ８β１、ＣＤ８β３、及びＣＤ８β５アイソフォームを有するウイルスベクターが良好な形質導入力価を有していたこと、（２）全ての構築物が製造を成功させることができたこと（例えば、高い生存率、６～１２の範囲の増殖倍率）、（３）ＣＤ８βアイソフォーム間のＣＤ３＋ｔｅｔ＋の頻度：ＣＤ８β１（構築物番号１０）が、ＣＤ８β３（構築物番号１６）及びＣＤ８β５（構築物番号１５及び番号１７）よりも高く、構築物番号２１が、最も低い値を示したこと、（４）構築物番号１１及び番号１９（ｍ１ＣＤ８α（配列番号７））におけるＣＤ３＋ｔｅｔ＋の頻度が、最も高い値を示したこと、並びに（５）１０μｌ／ｅ６個で観察されたＣＤ３＋ｔｅｔ＋％、ＣＤ８＋ｔｅｔ＋％、及びＣＤ４＋ＣＤ８＋ｔｅｔ＋％における飽和、を示した。最適なベクター用量は、全ての構築物について３．３～１０μｌ／ｅ６個の範囲である。
実施例７
中規模ベクタースクリーニング（構築物番号１３～番号１９）
Ｔ細胞製造
活性化／形質導入
図３７は、＋０日目に、４名のＨＬＡ－Ａ０２＋ドナーから得たＰＢＭＣを解凍し、休ませたことを示す。細胞を、血清の非存在下で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたバッグ（ＡＣ２９０）中で活性化した。＋１日目に、活性化ＰＢＭＣを、ウイルスベクター、例えば、構築物番号８、番号１０ｎ、番号１１ｎ、及び番号１３～番号１９を用いて、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）６ウェルプレートにおいて、血清の不存在下で、細胞約７×１０６個／ウェルで形質導入したことを示す。形質導入に使用されたウイルスの量が表９に示される。
増殖
図３７は、＋２日目に、形質導入したＰＢＭＣが、血清の不在下で増殖したことを示す。＋７日目に、後続の分析、例えば、ＦＡＣＳ－四量体及びベクターコピー数（ＶＣＮ）のために細胞を採取し、凍結保存した。＋７日目の増殖倍率は、全ての構築物で同等だった（約３０倍の増殖）。細胞の生存率は、＋７日目に９０％超である。
Ｔ細胞産物の特性評価
細胞数、ＦＡＣＳ－ｄｅｘｔｒａｍｅｒ、及びベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定した。四量体パネルは、生細胞／死細胞、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４、及びペプチド／ＭＨＣ四量体、例えば、ＰＲＡＭＥ－００４（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）（配列番号１４７）／ＭＨＣ四量体を含み得る。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋四量体（Ｔｅｔ）＋及びＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
実施例６に記載される結果と同様に、ＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞の同等の頻度が、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いた、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌでの形質導入によって得られた。構築物番号８（ＴＣＲのみ）が陰性対照として機能する。図３８は、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入したＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞のＴｅｔ％を示す。実施例６に記載される結果と同様に、これらの結果は、ＣＤ８β３アイソフォーム（構築物番号１３、番号１４、番号１６）及びＣＤ８β５アイソフォーム（構築物番号１５及び番号１７）と比較して、ＣＤ８β１アイソフォーム（構築物番号１０ｎ）におけるＣＤ４＋ＣＤ８＋ｔｅｔ＋の頻度が高い傾向にあったことを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＴｅｔ＋でゲーティングした。
図３９は、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入したＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔｅｔ＋細胞のＴｅｔ ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ８β３アイソフォーム（構築物番号１３）及びＣＤ８β５アイソフォーム（構築物番号１５及び番号１７）と比較して、ＣＤ８β１アイソフォーム（構築物番号１０ｎ）におけるＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋集団でのより高い四量体ＭＦＩを示す。
実施例６に記載される結果と同様に、結果は、構築物の間で、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて細胞１×１０６個当たり細胞２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入した細胞におけるＣＤ８頻度（ＣＤ３＋のうちのＣＤ８＋ＣＤ４－％）に差がないことを示す（データは示さず）。構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入した細胞における（ＣＤ３＋のうちの）ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋の同等の頻度（データ示さず）。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３続いてＣＤ８＋ＣＤ４－、続いてＴｅｔ＋でゲーティングした。
図４０は、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入したＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞のＴｅｔ ＭＦＩを示す。これらの結果は、ＣＤ８＋ｔｅｔ＋細胞の四量体ＭＦＩが、ＣＤ８β１（構築物番号１８及び番号１０）及びＣＤ８β５（構築物番号１５）アイソフォームの間で同等であり、一方、ＣＤ８β３（構築物番号１３、番号１４、及び番号１６）は、より低い四量体ＭＦＩを表したことを示す。
図４１は、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入したＣＤ３＋細胞のＴｅｔ％を示す。これらの結果は、構築物番号１０（ＣＤ８β１）で形質導入した細胞におけるＣＤ３＋Ｔｅｔ＋の頻度が、ＣＤ８β３（構築物番号１３、番号１４、及び番号１６）及びＣＤ８β５（構築物番号１５）で形質導入したものと比較してわずかに高いことを示す。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＴｅｔ＋でゲーティングした。構築物番号１０ＣＤ８β１で形質導入したＰＢＭＣにおいて、ＣＤ８β３（構築物番号１３、番号１４、及び番号１６）及びＣＤ８β５（構築物番号１５）で形質導入したものと比較して、わずかに高い総ＣＤ３＋ｔｅｔ＋細胞数が観察された（データは示さず）。
図４２は、構築物番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３～番号１９を用いて、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌで形質導入した細胞のベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す。これらの結果は、細胞１×１０６個当たり２．５μｌ又は５．０μｌのベクター用量で各個々の構築物を使用して誘導されたＰＢＭＣ産物において、細胞当たりのベクターコピーが５未満のままであったことを示す。
図４３は、各ドナーについて、構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５で形質導入した細胞におけるＴ細胞サブセット％を示す。構築物番号８（ＴＣＲのみ）及び非形質導入細胞を対照として使用した。これらの結果は、ＴＣＲのみの状態が、他の構築物と比較してわずかにナイーブ細胞を有し、より低い増殖倍率と一致することを示す。図４４Ａ及び図４４Ｂは、各ドナーについて、構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５で形質導入した細胞におけるＴ細胞サブセット％を示す。構築物番号８（ＴＣＲのみ）及び非形質導入細胞を対照として使用した。ＦＡＣＳ分析は、図４４ＡではＣＤ４＋ＣＤ８＋で、図４４ＢではＣＤ４－ＣＤ８＋ＴＣＲ＋でゲーティングした。これらの結果は、Ｔ細胞メモリサブセットの頻度間にドナーごとでの変動性を示すが、構築物間のＴナイーブ及びＴｃｍの頻度に差はほとんどないことを示す。
要約すると、これらの結果は、（１）生存率及び増殖倍率が７日目に全ての構築物間で同等であったこと、（２）ＣＤ８β３（構築物番号１３、番号１４、及び番号１６）及びＣＤ８β５（構築物番号１５及び番号１７）と比較して、ＣＤ８β１（構築物番号１０）で観察されたＣＤ３＋ｔｅｔ＋のわずかに高い頻度、（３）２．５～５ｕｌ／１０６個用量での構築物の大部分における細胞当たり５未満のベクターコピー、及び（４）Ｔ細胞メモリサブセットの頻度間のドナーごとの変動性、一般的に、構築物番号１０は、他のβアイソフォーム構築物よりもナイーブは少ないが、多くのＴｃｍ細胞を有すること、を示す。
実施例８
腫瘍死アッセイ－構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５
図４５Ａ及び４５Ｂは、高レベルの抗原（細胞当たり１０８１コピー）を発現するＵＡＣＣ２５７標的陽性細胞株に対する細胞傷害性を媒介する際に、構築物番号１３及び番号１０がＴＣＲのみに匹敵することを示すデータを示す。構築物番号１５も効果的であったが、構築物番号１３と番号１０と比較して殺傷が遅かった。これらの結果を生じるために使用したエフェクター：標的比は、４：１だった。同様の結果が、２：１のエフェクター：標的比で得られた（データは示さず）。
実施例９
ＩＦＮγ分泌アッセイ－構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５
ＩＦＮγ分泌は、ＵＡＣＣ２５７細胞株で測定した。ＦＩＧ．４６は、ＵＡＣＣ２５７細胞株で応答性したＩＦＮγ分泌が、構築物番号１０と比較して構築物番号１３で高かったことを示す。ＩＦＮγは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅプレートからの上清で定量した。これらの結果を生じるために使用したエフェクター：標的比は、４：１だった。同様の結果が、２：１のエフェクター：標的比で得られた（データは示さず）。
実施例１０
ＩＣＩマーカー発現－構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５
ＩＣＩマーカー頻度（２Ｂ４、４１ＢＢ、ＬＡＧ３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＣＤ３９＋ＣＤ６９＋、及びＣＤ３９－ＣＤ６９－）を測定した。図４７は、構築物番号１５が他の構築物と比較してＬＡＧ３、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴの高い発現を有し、構築物番号１０が続くことを示す。
実施例１１
サイトカイン発現－構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５
様々なサイトカインの発現を、構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５で形質導入したＰＢＭＣを用いて、４：１のＥ：Ｔ比で共培養したＵＡＣＣ２５７細胞で測定した。図４８Ａ～４８Ｇは、他の構築物と比較して、構築物番号１０（ＷＴシグナルペプチド、ＣＤ８β１）で形質導入したＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦαの増加した発現を示す。ＦＡＣＳ分析は、ＵＡＣＣ２５７に対してＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でゲーティングした、４：１のＥ：Ｔ。図４９Ａ～４９Ｇは、他の構築物と比較して、構築物番号１０（ＷＴシグナルペプチド、ＣＤ８β１）で形質導入したＣＤ４－ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＭＩＰ－１β、及びＴＮＦαの増加した発現を示す。ＦＡＣＳ分析は、ＵＡＣＣ２５７に対してＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋細胞でゲーティングした、４：１のＥ：Ｔ。図５０Ａ～５０Ｇは、他の構築物と比較して、構築物番号１０（ＷＴシグナルペプチド、ＣＤ８β１）で形質導入したＣＤ３＋ＴＣＲ＋細胞によるＩＬ－２及びＴＮＦαの増加した発現を示す。ＭＩＰ－１β発現は、構築物番号１１で最も高い（ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でゲーティングしたときと同様の結果）。ＦＡＣＳ分析を、ＵＡＣＣ２５７に対してＣＤ３＋ＴＣＲ＋細胞でゲーティングした、４：１のＥ：Ｔ。
様々なサイトカインの発現を、構築物番号１０、番号１１、番号１３、及び番号１５で形質導入したＰＢＭＣを用いて、４：１のＥ：Ｔ比で共培養したＡ３７５細胞で測定した。図５１Ａ～５１Ｃは、Ａ３７５に対してＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞でゲーティングしたＦＡＣＳ分析の結果を示す、４：１のＥ：Ｔ。図５２Ａ～５２Ｃは、Ａ３７５に対してＣＤ４－ＣＤ８＋細胞でゲーティングしたＦＡＣＳ分析の結果を示す、４：１のＥ：Ｔ。図５３Ａ～５３Ｃは、Ａ３７５に対してＣＤ３＋ＴＣＲ＋細胞でゲーティングしたＦＡＣＳ分析の結果を示す、４：１のＥ：Ｔ。全体として、細胞をＡ３７５＋ＲＦＰと共培養したときの結果はより変動的だったが、ＵＡＣＣ２５７＋ＲＦＰによる活性化と比較して同様の傾向が観察された。
実施例１２
大規模ベクタースクリーニング（構築物番号１０、番号１１、番号１３、番号１６、番号１８、番号１９）
Ｔ細胞製造
活性化／形質導入
図５４は、＋０日目に、３名のＨＬＡ－Ａ０２＋ドナーから得たＰＢＭＣを解凍し、休ませたことを示す。細胞を、血清の非存在下で、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたバッグ（ＡＣ２９０）中で活性化した。＋１日目に、活性化ＰＢＭＣを、ウイルスベクター、例えば、構築物番号８、番号１０ｎ、番号１１ｎ、番号１３、番号１６、番号１８、及び番号１９を用いて、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）１００細胞培養ベセルにおいて、血清の不存在下で、細胞約５×１０７個／ベセルで形質導入したことを示す。形質導入に使用されたウイルスの量が表１０に示される。
増殖
図５４は、＋２日目に、形質導入したＰＢＭＣが、血清の不在下で増殖したことを示す。＋７日目に、後続の分析、例えば、ＦＡＣＳ－四量体及びベクターコピー数（ＶＣＮ）のために細胞を採取し、凍結保存した。＋７日目の増殖倍率は、全ての構築物で同等だった（約３０倍の増殖）。細胞の生存率は、＋７日目に９０％超である。
Ｔ細胞産物の特性評価
細胞数、ＦＡＣＳ－ｄｅｘｔｒａｍｅｒ、及びベクターコピー数（ＶＣＮ）を決定した。四量体パネルは、生細胞／死細胞、ＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ４、及びペプチド／ＭＨＣ四量体、例えば、ＰＲＡＭＥ－００４（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）（配列番号１４７）／ＭＨＣ四量体を含み得る。ＦＡＣＳ分析を、生きているシングレット、続いてＣＤ３＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋、続いてＣＤ４＋ＣＤ８＋四量体（Ｔｅｔ）＋及びＣＤ８＋Ｔｅｔ＋でゲーティングした。
自己未成熟樹状細胞の存在中及び非存在下での腫瘍死アッセイ及びサイトカイン発現も測定した。
結果は、先の実施例と一致し、表１１に要約される。
実施例１３
本開示の構築物を発現するＣＤ４細胞によるＤＣライセンス化
図５９は、本開示の構築物で形質導入したＰＢＭＣの存在中、及び標的細胞、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞の存在中で、樹状細胞（ＤＣ）によるサイトカイン分泌のレベルを決定するスキームを示す。簡潔に述べると、０日目に、ＰＢＭＣ（ｎ＝３）を解凍して休ませ、続いて、ＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦの存在中で単球単離及び自己未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）生成を行い、２日目及び４～５日目に、ＤＣをＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦの存在中で供給し、６日目に、ｉＤＣ（＋ＤＣ）を、構築物番号１３、番号１６、番号１０ｎ、番号１８、番号１１ｎ、若しくは番号１９（エフェクター）及びＵＡＣＣ２５７細胞（標的）を用いてエフェクター：標的：ｉＤＣ＝１：１／１０：１／４の比率で、又はｉＤＣ無添加（－ＤＣ）で形質導入したＰＢＭＣ、ＴＣＲのみで形質導入したＰＢＭＣ、形質導入を伴わないＰＢＭＣ（ＮＴ）、ｉＤＣ及びＬＰＳで処置したＰＢＭＣ、並び対照として機能するｉＤＣのみとともに共培養し、７日目（２４時間共培養後）に、共培養物からの上清を収集し、続いて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを使用して、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αを含むサイトカインプロファイリングを行った。
自己未成熟樹状細胞、ＵＡＣＣ２５７腫瘍細胞株、並びにＣＤ８αβヘテロ二量体及びＴＣＲ（構築物番号１０）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞産物の三培養物中の炎症誘発性サイトカインの分泌が、ストーク領域がＣＤ８βストーク領域で置き換えられる発現ＣＤ８α＊ホモ二量体及びＴＣＲ（構築物番号１１）を発現するものと比較して増加した。
構築物番号１０又は番号１１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞がＤＣをライセンス化する能力を決定するために、バルクＰＢＭＣを構築物番号１０又は番号１１で形質導入し、続いて、産物からのＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の選択を行った。ＰＢＭＣ、ＣＤ８＋ＣＤ４－選択産物、又はＣＤ４＋ＣＤ８＋選択産物を、自己未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の存在中又は不存在下で２４時間、ＵＡＣＣ２５７腫瘍細胞株とともに三共培養し、続いて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを使用してＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６のサイトカイン定量化し、対照としてｉＤＣのみ又はＬＰＳ添加、Ｎ＝４～７、平均±ＳＤ、二元配置分散分析に基づいたＰ値を使用した。
未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）及びＵＡＣＣ２５７細胞の存在中で、構築物番号１０を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、構築物番号１１を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞よりも、樹状細胞（ＤＣ）によって分泌される高いレベルのＩＬ－１２（図５６）、ＴＮＦ－α（図５７）、及びＩＬ－６（図５８）を誘導することによって、良好に遂行した。一方、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６のレベルは、構築物番号１０及び番号１１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４－Ｔ細胞）間で同等だった。これらの結果は、ＣＤ８αβヘテロ二量体及びＴＣＲ（構築物番号１０）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＤＣライセンス化において、ＣＤ８α＊ホモ二量体及びＴＣＲ（構築物番号１１）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞よりも優れた産物であり得ることを示唆する。陰性対照には、（１）ｉＤＣ（－ｉＤＣ）の不存在下で、（２）非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）＋ＵＡＣＣ２５７細胞の存在中で、及び（３）ＴＣＲのみ（ＴＣＲ）＋ＵＡＣＣ２５７細胞で形質導入したＴ細胞の存在中で、得られたサイトカインレベルが含まれる。陽性対照には、ＤＣを活性化することができるリポ多糖（ＬＰＳ）で処理したｉＤＣから得られたサイトカインレベルが含まれる。
実施例１４
ＵＡＣＣ２５７標的に応答したＰＢＭＣ産物によるＤＣ成熟及びサイトカイン分泌の評価
図６０は、ｉＤＣ及び標的細胞、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞の存在中又は不存在下で、本開示の構築物で形質導入したＰＢＭＣを共培養することによって誘導されたＩＬ－１２分泌レベルを示す。例えば、ｉＤＣ（＋ＤＣ）及びＵＡＣＣ２５７の存在中で、構築物番号１０及び１３で形質導入したＰＢＭＣを共培養することによって、ＴＣＲのみで形質導入したＰＢＭＣを共培養することによるものと比較して、ＩＬ－１２分泌が増加した。ＩＬ－１２分泌の増加は、（１）ＴＮＦ－α産生含むＴｈ１細胞媒介性免疫に向けた分極化（図６１を参照）、（２）Ｔ細胞増殖、（３）ＩＦＮ－γ産生、及び（４）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞溶解活性を示唆する。
図６１は、ｉＤＣ及び標的細胞、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞の存在中又は非存在下で、本開示の構築物で形質導入したＰＢＭＣを共培養することによって誘導されたＴＮＦ－α分泌レベルを示す。例えば、ｉＤＣ（＋ＤＣ）及びＵＡＣＣ２５７の存在中で、構築物番号１０及び１３で形質導入したＰＢＭＣを共培養することによって、ＴＣＲのみで形質導入したＰＢＭＣを共培養することによるものと比較して、ＴＮＦ－α分泌が増加した。
増加したＩＬ－６分泌（ＩＬ－１２、ＴＮＦ－αに加えて）は、樹状細胞の成熟を意味し得、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＤＣとの間のＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用によって増大され得る。ＤＣの成熟及びその後のサイトカイン分泌は、炎症誘発環境の調節に役立ち得る。
図６２は、ｉＤＣ及び標的細胞、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞の存在中又は不存在下で、本開示の構築物で形質導入しＰＢＭＣを共培養することによって誘導されたＩＬ－６分泌レベルを示す。例えば、ｉＤＣ（＋ＤＣ）及びＵＡＣＣ２５７の存在中で、構築物番号１０及び１３で形質導入したＰＢＭＣを共培養することによって、ＴＣＲのみで形質導入したＰＢＭＣを共培養することによるものと比較して、ＩＬ－６分泌が増加した。
これらの結果は、遺伝子導入ＴＣＲ及びＣＤ８共受容体（ＣＤ８αβヘテロ二量体又はＣＤ８αホモ二量体）を共発現するＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣ産物が、抗原交差提示を介して微小環境中のＤＣをライセンス化し、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－α分泌を増加させることによって腫瘍微小環境を調節し得ることを示す。
表１２は、製造性及び機能性に基づく構築物間の比較を示す。
注：「＋＋＋」＝最も優れた応答、「＋＋」＝優れた応答、「＋」＝平均的な応答、「＋／－」＝乏しい応答。
表１３は、構築物の比較及びランキングを示す（数値が小さいほど優れている）。

＊期間遅延は、ここでは、例えば、ＧＭＰベクター製造からの任意の遅延、又は不完全なデータセットに起因する任意の遅延を指し、これは、臨床試験における構築物の実施における遅延が加わり得る。
要約すると、例えば、生存率、増殖倍率、導入遺伝子発現、及びベクターコピー数に関する製造性は、構築物番号１０、番号１１、番号１３、又は番号１９で形質導入した細胞の間でランク１として、同様に優れている可能性があり、構築物番号１０及び番号１３で形質導入された細胞の、例えば、細胞殺傷、サイトカイン分泌、ＤＣライセンス化、及び３Ｄスフェロイド形成能力に関する機能性はランク１として、ランク１～３としての構築物番号１１及び番号１９で形質導入したものよりも優れている可能性がある。
実施例１５
ＥＣ５０アッセイ
本開示の構築物、例えば、構築物番号１０及び番号１１で形質導入したＴ細胞の、標的細胞に対する有効性を判定するために、ＥＣ５０を、ＰＲＡＭＥペプチドパルス化Ｔ２細胞の存在中で形質導入した細胞によって産生されるＩＦＮγのレベルに基づいて判定した。
例えば、構築物番号１０（ＣＤ８αβ－ＴＣＲ）、構築物番号１１（ｍ１ＣＤ８α－ＴＣＲ）、又は構築物番号８（ＴＣＲのみ）で形質導入したＣＤ４＋選択Ｔ細胞のＥＣ５０を比較するために、ＣＤ４＋選択産物（ＴＣＲ＋正規化）を、ＰＲＡＭＥペプチドパルス化Ｔ２細胞とともに、定義された濃度で、Ｅ：Ｔ比１：１で２４時間共培養した。２４時間後に上清中のＩＦＮγレベルを定量した。図６３Ａ～６３Ｃは、それぞれドナー番号１、番号２、及び番号３から得られた形質導入ＣＤ４＋選択Ｔ細胞によって産生されたＩＦＮγレベルを示す。一般に、構築物番号１０で形質導入したＣＤ４＋選択Ｔ細胞のＥＣ５０値（ｎｇ／ｍｌ）が構築物番号１１で形質導入したものよりも低いことによって示されるように、構築物番号１０で形質導入したＣＤ４＋選択Ｔ細胞は、構築物番号１１（ｍ１ＣＤ８αＴＣＲ＋ＣＤ４Ｔ細胞）で形質導入したものよりも、ＰＲＡＭＥ抗原に対する感受性が高かった（図６３Ｄ）。ＴＣＲ＋ＣＤ４＋細胞の間で応答は観察されなかった（図６３Ａ～６３Ｄ）。これらの結果は、ＣＤ８αβヘテロ二量体が、ｍ１ＣＤ８ａホモ二量体と比較して、ＣＤ８αβＴＣＲ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する増加した結合活性を付与し、標的細胞に対するより優れた有効性をもたらし得ることを示唆する。
同様の実験を、ドナー番号１、番号３、及び番号４から得られたＰＢＭＣを使用して行った。簡潔に述べると、ＰＢＭＣ産物（ＴＣＲ＋非正規化）を、ＰＲＡＭＥペプチドパルス化Ｔ２細胞とともに、定義された濃度で、Ｅ：Ｔ比１：１で２４時間共培養した。２４時間後に上清中のＩＦＮγレベルを定量した。図６４Ａ～６４Ｃは、それぞれドナー番号４、番号１、及び番号３から得られた形質導入ＰＢＭＣによって産生されたＩＦＮγレベルを示す。ドナー間の変動が、ＥＣ５０値に観察された。例えば、ドナー番号３（図６４Ｃ及び６４Ｄ）は、構築物番号１０で形質導入したＰＢＭＣで、ＴＣＲのみで形質導入したものと比較して低いＥＣ５０を示すが、ドナー番号１（図６４Ｂ）及び番号４（図６４Ａ）は、構築物番号１０とＴＣＲのみ（図６４Ｄ）との間で、同等なＥＣ５０を示す。したがって、ＴＣＲ及びＣＤ８αβヘテロ二量体を発現するＣＤ４＋選択Ｔ細胞産物において、ＴＣＲのみを発現するものと比較して観察された増加した結合活性及び有効性が得られるが、ＰＢＭＣ産物を使用した場合よりも低い程度であり得る。
同一のドナーから得られた異なるＴ細胞産物のＥＣ５０を比較するために、単一のドナーから得られたＰＢＭＣ産物、ＣＤ８＋選択産物、及びＣＤ４＋選択産物を、ＰＲＡＭＥペプチドパルス化Ｔ２細胞（ＴＣＲ＋正規化）とともに、定義された濃度で、Ｅ：Ｔ比１：１で２４時間共培養した。２４時間後に上清中のＩＦＮγレベルを定量した。図６５Ａ～６５Ｃは、それぞれ、ＰＢＭＣ産物（図６５Ａ）、ＣＤ８＋選択産物（図６５Ｂ）、及びＣＤ４＋選択産物（図６５Ｃ）によって産生されたＩＦＮγレベルを示す。一貫して、構築物番号１０で形質導入したＣＤ４＋選択Ｔ細胞のＥＣ５０は、構築物番号１１又はＴＣＲのみ（図６５Ｃ）で形質導入したものよりも低かったが、形質導入したＰＢＭＣ及びＣＤ８＋選択Ｔ細胞のＥＣ５０は、構築物番号１０とＴＣＲのみの形質導入との間で、同等だった。したがって、ＴＣＲ及びＣＤ８αβヘテロ二量体を発現するＣＤ４＋選択Ｔ細胞産物において、ＴＣＲ及びｍ１ＣＤ８αホモ二量体を発現するもの、又はＴＣＲのみを発現するものと比較して観察された増加した結合活性及び有効性が得られるが、ＰＢＭＣ産物又はＣＤ８＋選択Ｔ細胞産物を使用した場合よりも低い程度であり得る。
本明細書で引用される全ての参照文献は、各参照文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。任意の参照文献の引用は、出願日の前のその開示のためのものであり、本開示が先行発明によってかかる参照文献に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。
上述した要素の各々、又は２つ以上を合わせても、上述したタイプとは異なる他のタイプの方法において有用な適用が見出され得ることが理解されるであろう。更なる分析なしに、前述のことは、他の人が、現在の知識を適用することによって、従来技術の観点から、添付の特許請求の範囲に示される本開示の一般的又は特定の実施形態の本質的特徴を公平に構成する特徴を省略することなく、様々な用途に容易に適応させることができるように、本開示の要点を十分に明らかにするであろう。前述の実施形態は、例としてのみ提示され、本開示の範囲は、以下の請求項の範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims (53)

  1. 単離された核酸であって、（ａ）α単離鎖及びβ鎖を含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、並びにα鎖及びβ鎖を含むＣＤ８ポリペプチド、又は（ｂ）α鎖及びβ鎖を含むＴＣＲ、並びにβ鎖を有しないα鎖を含むＣＤ８ポリペプチド、をコードする核酸配列を含み、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖が、配列番号１５及び１６、１７及び１８、１９及び２０、２１及び２２、２３及び２４、２５及び２６、２７及び２８、２９及び３０、３１及び３２、３３及び３４、３５及び３６、３７及び３８、３９及び４０、４１及び４２、４３及び４４、４５及び４６、４７及び４８、４９及び５０、５１及び５２、５３及び５４、５５及び５６、５７及び５８、５９及び６０、６１及び６２、６３及び６４、６５及び６６、６７及び６８、６９及び７０、７１及び３０３、３０４及び７４、７５及び７６、７７及び７８、７９及び８０、８１及び８２、８３及び８４、８５及び８６、８７及び８８、８９及び９０、並びに９１及び９２から選択され、ＣＤ８α鎖が、配列番号７、２５８、２５９、２６２、又はそのバリアントであり、ＣＤ８β鎖が、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４である、単離された核酸。
  2. 前記ＴＣＲα鎖及び前記ＴＣＲβ鎖が、配列番号１５及び１６、５７及び５８、５９及び６０、６１及び６２、６３及び６４、６５及び６６、６７及び６８、６９及び７０、並びに７１及び３０３から選択される、請求項１に記載の単離された核酸。
  3. 前記核酸配列が、配列番号２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９５、２９７、２９９、又は３０１の核酸配列と少なくとも８０％同一の核酸を含む、請求項１又は２に記載の単離された核酸。
  4. 前記核酸配列が、配列番号２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９５、２９７、２９９、又は３０１の前記核酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である、請求項３に記載の単離された核酸。
  5. 前記核酸が、配列番号２６７の前記核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  6. 前記核酸が、配列番号２７９の前記核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸によってコードされた、単離されたポリペプチド。
  8. 配列番号２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９６、２９８、３００、又は３０２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
  9. 前記アミノ酸配列が、配列番号２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９６、２９８、３００、又は３０２の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
  10. 前記アミノ酸が、配列番号２６８の前記アミノ酸配列を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  11. 前記アミノ酸が、配列番号２８０の前記アミノ酸配列を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  12. 請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
  13. 前記ベクターが、前記ＣＤ８α鎖をコードする前記核酸と前記ＣＤ８β鎖をコードする前記核酸との間に配置された、２Ａペプチドをコードする核酸又は内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を更に含む、請求項１２に記載のベクター。
  14. 前記ベクターが、前記ＴＣＲα鎖をコードする前記核酸と前記ＴＣＲβ鎖をコードする前記核酸との間に配置された、２Ａペプチドをコードする核酸又はＩＲＥＳを更に含む、請求項１２又は１３に記載のベクター。
  15. 前記２Ａペプチドが、Ｐ２Ａ（配列番号９３）、Ｔ２Ａ（配列番号９４）、Ｅ２Ａ（配列番号９５）、又はＦ２Ａ（配列番号９６）である、請求項１４に記載のベクター。
  16. 前記ベクターが、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）変異体１、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）変異体２、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）から選択される転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列を更に含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載のベクター。
  17. 前記転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列が、配列番号２５６のアミノ酸配列を含むウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）変異体１である、請求項１６に記載のベクター。
  18. 前記転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列が、配列番号２５７のアミノ酸配列を含むウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）変異体２である、請求項１６に記載のベクター。
  19. 前記ベクターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含む改変ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、Ｕｂｉｑｉｔｉｎ Ｃプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、又はマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターから選択されるプロモーターを更に含む、請求項１２～１８のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 前記ベクターが、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターである、請求項１２～１９のいずれか一項に記載のベクター。
  21. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
  22. 前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、フラウイルス（ｆｌａｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２１に記載のベクター。
  23. 前記ベクターが、天然のネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）、ＲＤ１１４の変形（ＲＤ１１４ＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ＧＡＬＶの変形（ＧＡＬＶ－ＴＲ）、両種指向性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ ４０７０Ａ）、バキュロウイルス（ＧＰ６４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、トリペストウイルス（ＦＰＶ）、エボラウイルス（ＥｂｏＶ）、又はヒヒレトロウイルス（エンベロープ糖タンパク質？）（ＢａＥＶ）、及びリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）から選択されるウイルスのエンベロープタンパク質で偽型化されている、請求項２１又は２２に記載のベクター。
  24. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１２～２３のいずれか一項に記載のベクター。
  25. 前記ベクターが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を更に含む、請求項１２～２４のいずれか一項に記載のベクター。
  26. 請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸で形質導入された、単離されたＴ細胞。
  27. 請求項６～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するように形質導入された、単離されたＴ細胞。
  28. 請求項１２～２５のいずれか一項に記載のベクターで形質導入された、単離されたＴ細胞。
  29. 前記細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、及び／又はナチュラルキラーＴ細胞である、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の細胞。
  30. 前記αβＴ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  31. 前記αβＴ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  32. 前記Ｔ細胞が、γδＴ細胞が、Ｖγ９Ｖδ２＋Ｔ細胞である、請求項２９に記載の細胞。
  33. 請求項６～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する、γδＴ細胞。
  34. 請求項６～１０のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する、αβＴ細胞。
  35. 請求項２６～３４のいずれか一項に記載のＴ細胞を含む、組成物。
  36. 前記組成物が、医薬組成物である、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記組成物が、アジュバント、賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、安定剤、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項３５又は３６に記載の組成物。
  38. 前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項３５又は３６に記載の組成物。
  39. 前記アジュバントが、抗ＣＤ４０抗体、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び誘導体、ポリ（Ｉ：Ｃ）及び誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、ポリ（ラクチドコ－グリコリド）（ＰＬＧ）を有する微粒子製剤、ビロソーム、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン－２３（ＩＬ－２３）、並びにそれらの組み合わせである、請求項３７又は３８に記載の組成物。
  40. 免疫療法のためのＴ細胞を調製する方法であって、
    ヒト対象の血液試料からＴ細胞を単離することと、
    前記単離したＴ細胞を活性化することと、
    前記活性化したＴ細胞を、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項１２～２５のいずれか一項に記載のベクターで形質導入することと、
    前記形質導入したＴ細胞を増殖することと、を含む、方法。
  41. 前記血液試料が、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記活性化することが、前記Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることを含む、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記Ｔ細胞が、γδＴ細胞又はαβＴ細胞である、請求項４０又は４１に記載の方法。
  46. 前記活性化及び／又は増殖するステップが、ＩＬ－２及びＩＬ－１５の組み合わせの存在中にあり、任意選択的に、ゾレドロネートを伴う、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. がんを有する患者を治療する方法であって、前記患者に、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、及び前立腺がんからなる群から選択される、方法。
  48. がんを有する患者における免疫応答を誘発する方法であって、前記患者に、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、及び前立腺がんからなる群から選択される、方法。
  49. 前記Ｔ細胞が、表面でＭＨＣ分子との複合体にペプチドを提示するがん細胞を殺傷し、前記ペプチドが、ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ（配列番号１４７）のアミノ酸配列からなる、請求項４７又は４８に記載の方法。
  50. 前記核酸が、配列番号２８５又は３０１の核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
  51. 前記アミノ酸が、配列番号２８６又は３０２のアミノ酸配列を含む、請求項７～９のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
  52. 前記ＩＲＥＳが、ピコルナウイルスからのＩＲＥＳ、フラビウイルスからのＩＲＥＳ、ペスチウイルスからのＩＲＥＳ、レトロウイルスからのＩＲＥＳ、レンチウイルスからのＩＲＥＳ、昆虫ＲＮＡウイルスからのＩＲＥＳ、及び細胞ｍＲＮＡからのＩＲＥＳからなる群から選択される、請求項１４に記載のベクター。
  53. 前記形質導入したＴ細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離することと、前記単離したＣＤ４＋ＣＤ８＋形質導入Ｔ細胞を増殖することと、を更に含む、請求項４０に記載の方法。
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