JP2021501589A - 新規操作ｔ細胞受容体およびそれを使用した免疫療法 - Google Patents

新規操作ｔ細胞受容体およびそれを使用した免疫療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＯＬ６Ａ３抗原に対する抗原認識コンストラクトに関する。本発明は、特に、抗原ＣＯＬ６Ａ３を発現する腫瘍に対して選択的かつ特異的な、新規操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベ-スの分子を提供する。本発明のＴＣＲ、およびそれに由来するＣＯＬ６Ａ３抗原結合断片は、ＣＯＬ６Ａ３を発現するがん性疾患の診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原認識コンストラクトをコ-ドする核酸、これらの核酸を含んでなるベクタ-、抗原認識コンストラクトを発現する組換え細胞、および本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。

Description

本発明は、ＣＯＬ６Ａ３抗原に対する抗原認識コンストラクトに関する。本発明は、特に、抗原ＣＯＬ６Ａ３を発現する腫瘍に対して選択的かつ特異的な、新規操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベ-スの分子を提供する。本発明のＴＣＲ、およびそれに由来するＣＯＬ６Ａ３抗原結合断片は、ＣＯＬ６Ａ３を発現するがん性疾患の診断、治療、および予防に有用である。さらに、本発明の抗原認識コンストラクトをコ-ドする核酸、これらの核酸を含んでなるベクタ-、抗原認識コンストラクトを発現する組換え細胞、および本発明の化合物を含んでなる医薬組成物が提供される。
コラ-ゲンは様々な組織の完全性を維持する上で役割を果たす、タンパク質のス-パ-ファミリ-である。コラ-ゲンは細胞外マトリックスタンパク質であり、それらの共通の構造要素として三重らせんドメインを有する。コラ-ゲンＶＩは、ミクロフィブリルの主要な構造成分である。コラ-ゲンＶＩの基本的な構造単位は、αｌ（ＶＩ）、α２（ＶＩ）、およびα３（ＶＩ）コラ-ゲン鎖のヘテロ三量体である。αｌ（ＶＩ）およびα２（ＶＩ）鎖は、それぞれＣＯＬ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２遺伝子によってコ-ドされる。ＣＯＬ６Ａ３遺伝子によってコ-ドされるタンパク質は、ＶＩ型コラ-ゲンのα３サブユニット（α３（ＶＩ）コラ-ゲン鎖）である（Ｂｅｒｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ ６：１９３-８）。ＣＯＬ６Ａ３の遺伝子発現は、乳がんの進行に関連し、大腸がんでは上昇する（Ｓｍｉｔｈ ＭＪ，ｅｔ ａｌ．”Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｓｔｒｏｍａ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ-ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．２００９；１００：１４５２-１４６４；Ｔｉｌｍａｎ Ｇ ｅｔ ａｌ”Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｔｕｍｏｒｓ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｂｏｔｈ ｓｔｒｏｍａｌ ａｎｄ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ”Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２００７；６：８０）ことが以前示されており、結腸直腸がんの予後マ-カ-であることが示されている（Ｑｉａｏ Ｊ ｅｔ ａｌ．”Ｓｔｒｏｍａ ｄｅｒｉｖｅｄ ＣＯＬ６Ａ３ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５ Ｏｃｔ ６；６（３０）：２９９２９-２９９４６）。ＣＯＬ６Ａ３遺伝子はヒトゲノムの２ｑ３７に位置し、４４個のエクソンを含む。ＣＯＬ６Ａ３タンパク質は、３１７７個のアミノ酸を有し、１２個のフォンヴィレブランド因子Ａ型（ｖＷＡ）ドメイン、１個のフィブロネクチン３型ドメイン、および１個のＢＰＴＩ／クニッツファミリ-のセリンプロテア-ゼ阻害剤（ＫＵ）ドメインを含む。
Ｔ細胞ベ-スの免疫療法の標的は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の分子によって提示される、腫瘍関連または腫瘍特異的タンパク質に由来する、ペプチドエピト-プに相当する。これらの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、酵素、受容体、転写因子などの全てのタンパク質クラスに由来するペプチドであり得て、それらは各腫瘍細胞内で発現され、同一起源の非改変細胞内と比較して、通常、上方制御される。
細胞性免疫応答の特定の要素は、腫瘍細胞を選択的に認識し破壊できる。腫瘍浸潤性細胞集団からの、または末梢血からの腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の単離は、がんに対する自然免疫防御において、このような細胞が重要な役割を果たすことを示唆する。特に、細胞質ゾル内に位置するタンパク質または欠陥リボソ-ム産物（ＤＲｉＰ）に由来する、通常は８〜１０アミノ酸残基の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）保有ペプチドのクラスＩ分子を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞が、この応答において重要な役割を果たす。ヒトのＭＨＣ分子はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称される。
ＴＣＲは、シグナル伝達媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質に関連する、免疫グロブリンス-パ-ファミリ-のヘテロ二量体細胞表面タンパク質である。ＴＣＲはαβおよびγδヘテロ二量体として存在し、それらは構造的に類似しているが、かなり異なる解剖学的位置とおそらくは機能とを有する。天然のヘテロ二量体αβＴＣＲの細胞外部分は２つのポリペプチド鎖からなり、そのそれぞれは膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを有する。定常ドメインおよび可変ドメインのそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似した、高度に多型性のル-プを含有する。ＴＣＲ遺伝子治療の使用は、いくつかの現在のハ-ドルを克服する。それは、患者自身のＴ細胞に所望の特異性を与えて、十分な数のＴ細胞を短期間で生成できるようにし、それらの枯渇を回避する。ＴＣＲは、中央記憶Ｔ細胞または幹細胞の特徴を有するＴ細胞に形質導入され、それは移入時におけるより良好な持続性および機能を確実にしてもよい。ＴＣＲ操作Ｔ細胞は、化学療法または照射によってリンパ球減少症になったがん患者に注入され、効率的な生着ができるようにするが、免疫抑制は阻害する。
がん治療のための分子標的薬の開発が進歩しているものの、当該技術分野において、がん細胞に高度に特異的な分子を特異的に標的化する、新たな抗がん剤を開発する必要性がなおもある。
本明細書は、開示されるようなＣＯＬ６Ａエピト-プに特異的に結合する、新規操作ＣＯＬ６Ａ３ ＴＣＲ、それぞれの組換えＴＣＲコンストラクト、核酸、ベクタ-、および宿主細胞と；がんの治療においてこのような分子を使用する方法とを提供することによって、この必要性に対処する。
第１の態様では、本発明の目的は、配列番号５（ＣＤＲａ１）、６（ＣＤＲａ２）、および７（ＣＤＲａ３）に記載の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる第１のドメインと、配列番号１３（ＣＤＲｂ１）、１４（ＣＤＲｂ２）、および１５（ＣＤＲｂ３）に記載の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる第２のドメインとを含んでなる抗原認識コンストラクトによって解決され、前記相補性決定領域の少なくとも１つは、ａ）配列番号２６（ＣＤＲａ１-ｍｕｔ１）、および配列番号３７〜４９（ＣＤＲｂ１-ｍｕｔ１〜ＣＤＲｂ１-ｍｕｔ１３）、好ましくは配列番号４０、およびｂ）保存的アミノ酸交換を含んでなる、配列番号２６、および配列番号３７〜４９、好ましくは配列番号４０の変異配列の群から選択される、少なくとも１つの配列で置換される。
別の態様では、抗原認識コンストラクトのＣＤＲａ１は、配列番号５に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。
別の態様では、抗原認識コンストラクトのＣＤＲａ２は、配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。
別の態様では、抗原認識コンストラクトの、ＣＤＲａ３は、配列番号７に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。
別の態様では、抗原認識コンストラクトの、ＣＤＲｂ１は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。
別の態様では、抗原認識コンストラクトの、ＣＤＲｂ２は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。
別の態様では、抗原認識コンストラクトの、ＣＤＲｂ３は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の同一性を有してもよい。
本発明の文脈において、本発明者らは、親Ｒ４Ｐ３Ｆ９の安定性、認識、および選択性が改善されたαおよびβ鎖中に変異ＣＤＲ１配列を含んでなる、ＣＯＬ６Ａ３ ＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９の改善された操作バ-ジョンを同定した。これらの成熟ＴＣＲ変異型は、第１段階が変異型の安定性を選択し、第２段階が変異型の親和性を選択する、二段法で選択される（実施例を参照されたい）。本発明のＴＣＲが変異ＣＤＲ１領域を含んでなる一方で、結合親和性／特異性および／または選択性を高めるために、ＣＤＲ２およびまたはＣＤＲ３もまた変異され得て、このような変異ＣＤＲは、理想的には既存のコンストラクトに含まれ得る。
親和性成熟は変異型を同定し、これは、特異性を保持しまたは改善さえもする一方で、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３ペプチドに対して大幅により強い結合活性を有した。親ＴＣＲ Ｃ-１（野生型ＣＤＲを含んでなるＲ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ、表５を参照されたい）と比較して、本発明の全ての変異型は、ＩＦＮ-γ放出を改善し、より低いペプチド負荷濃度において、既により高いレベルに達した。
可変ドメイン内で、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ポリペプチド鎖の可変（Ｖ）領域に見いだされ、ＣＤＲ３は、Ｖの一部と、多様性（Ｄ）および連結（Ｊ）領域の全てとを含む。ＣＤＲ３は、最も可変性が高く、抗原を特異的かつ選択的に認識することに関与する、主要ＣＤＲであると想定される。驚くことに、一部のＴＣＲ ＣＤＲ１は、ペプチドともまた接触するようであり、したがって選択的認識にも関与する。本件では、特定の理論に縛られることなく、変異ＣＤＲ１ｂは、ＣＯＬ６Ａ３ペプチドの８位と相互作用するようである。
天然α-βヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖を有する。各α鎖は可変領域、連結領域、および定常領域を含んでなり、β鎖は通常、可変領域と連結領域の間の短い多様性領域もまた含有するが、この多様性領域はしばしば連結領域の一部と見なされる。各可変領域はフレ-ムワ-ク配列に埋め込まれた３つのＣＤＲ（相補性決定領域）を含んでなり、そのうちの１つはＣＤＲ３と命名される超可変領域である。それらのフレ-ムワ-クによって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列によって、ならびに部分的に定義されたＣＤＲ３配列によって区別される、数種類のα鎖可変（Ｖα）領域および数種類のβ鎖可変（Ｖβ）領域がある。Ｖα型は固有のＴＲＡＶ番号によって、Ｖβ型は固有のＴＲＢＶ番号によって、ＩＭＧＴ命名法で示される。
好ましくは、本発明の抗原認識コンストラクトは、本明細書で開示される本発明の操作ＴＣＲ可変領域の一個体の各ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３を含んでなる。好ましいのは、少なくとも１つの、好ましくは２つの、成熟ＣＤＲ１配列を含んでなる、本発明の抗原認識コンストラクト（例えば、αβおよびγδＴＣＲ）である。
本明細書で開示されるＣＤＲ変異型、特にＣＤＲ１変異型は、特に明記されない場合は、ペプチド鎖内の異なる、場合により選択的な部位における、１つまたは複数の残基の置換によって修飾され得る。このような置換は、保存的性質であり、疎水性アミノ酸が別の疎水性アミノ酸によって置換されるなど、構造および特徴の類似したアミノ酸によってアミノ酸が置換される。さらにより保存的な置換は、ロイシンのイソロイシンによる置換などの、同一または類似サイズおよび化学的性質のアミノ酸の置換である。天然起源相同タンパク質ファミリ-の配列多様性の研究では、特定のアミノ酸置換は、他よりも耐容されることが多く、これらは、元のアミノ酸とその置換物との間のサイズ、電荷、極性、および疎水性の類似性との相関を示すことが多く、これが「保存的置換」の定義の基礎である。好ましい保存的置換は、本明細書では、以下の５つのグル-プの１つの中の交換として定義される：グル-プ１-小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；グル-プ２-極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；グル-プ３-極性の正に帯電した残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；グル-プ４-大型脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；およびグル-プ５-大型芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。
より保存的でない置換は、アラニンのイソロイシン残基による置換などの、類似した特徴を有するがサイズがいくらか異なる別のアミノ酸による置換を伴うかもしれない。
「特異性」または「抗原特異性」または所与の抗原「に特異的な」という用語は、本明細書の用法では、抗原がＨＬＡ、好ましくはＨＬＡ Ａ２によって提示される場合、抗原認識コンストラクトが、前記抗原に、好ましくはＣＯＬ６Ａ３抗原に、より好ましくは高い結合活性で、特異的に結合し得ることを意味する。例えば、抗原認識コンストラクトとしてのＴＣＲは、以下に提供されるＣＯＬ６Ａ３エピト-プおよび抗原などの低濃度のＣＯＬ６Ａ３抗原でパルスされたＨＬＡ Ａ２標的細胞との共培養に際して、ＣＯＬ６Ａ３に応答してＴＣＲを発現するＴ細胞が、少なくとも約２００ｐｇ／ｍｌ以上（例えば、２５０ｐｇ／ｍｌ以上、３００ｐｇ／ｍｌ以上、４００ｐｇ／ｍｌ以上、５００ｐｇ／ｍｌ以上、６００ｐｇ／ｍｌ以上、７００ｐｇ／ｍｌ以上、１０００ｐｇｍｌ以上、２，０００ｐｇ／ｍｌ以上、２，５００ｐｇ／ｍ以上、５，０００ｐｇ／ｍｌ以上）のインタ-フェロンγ（ＩＦＮ-γ）を分泌する場合に、ＣＯＬ６Ａ３抗原に対する「抗原性特異性」を有すると見なされてもよい（例えば、約１０-１１ｍｏｌ／ｌ、１０-１０ｍｏｌ／ｌ、１０-９ｍｏｌ／ｌ、１０-８ｍｏｌ／ｌ、１０-７ｍｏｌ／ｌ、１０-６ｍｏｌ／ｌ、１０-５ｍｏｌ／ｌ）。代案としては、またはそれに加えて、ＴＣＲを発現する細胞が、低濃度のＣＯＬ６Ａ３抗原でパルス処理された標的細胞との同時培養時に、ＩＦＮγの非形質導入バックグラウンドレベルの少なくとも２倍量のＩＦＮγを分泌する場合、ＴＣＲはＣＯＬ６Ａ３に対して「抗原特異性」を有すると見なされてもよい。上記のこのような「特異性」は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて分析され得る。
本発明の１つの代替または追加的な実施形態では、抗原認識コンストラクトは安定であり、ＣＯＬ６Ａ３抗原に特異的および／または選択的に結合でき；好ましくはＣＯＬ６Ａ３抗原は、配列番号１に示されるアミノ酸配列またはそれらの変異型を有するタンパク質エピト-プまたはペプチドである。変異型は、３つ以下、好ましくは２つ、最も好ましくは１つ以下のアミノ酸位置のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換である。
「選択性」または「選択的に認識／結合する」という用語は、好ましくは１つの特異的エピト-プのみを選択的に認識しまたはそれに結合し、好ましくは別のエピト-プに対する交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない、ＴＣＲまたは抗体などの抗原認識コンストラクトの特性を指すものと理解される。好ましくは「選択性」または「選択的に認識／結合する」は、好ましくは１つの特異的エピト-プのみを選択的に認識しまたはそれに結合し、好ましくは別のエピト-プに対する交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない、抗原認識コンストラクト（例えばＴＣＲ）を意味し、前記エピト-プは１つのタンパク質に固有であり、その結果、抗原認識コンストラクトは、その他のエピト-プおよびその他のタンパク質に対して交差反応性を示さないかまたは実質的に示さない。
本発明によるコンストラクトを認識する抗原は、好ましくは抗体、またはその誘導体もしくは断片、二重特異性分子、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはその誘導体もしくは断片から選択される。本発明の抗体またはＴＣＲの誘導体または断片は、好ましくは、親分子の抗原結合／認識能力、特に上で説明したようなその特異性および／または選択性を維持しなければならない。
本発明の一実施形態では、本発明の操作ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ依存性様式でＣＯＬ６Ａ３抗原を認識できる。「ＭＨＣクラスＩ依存性様式」は、本明細書の用法では、ＴＣＲが、ＭＨＣクラスＩ分子の文脈内で、ＣＯＬ６Ａ３ペプチド抗原への結合時に免疫応答を誘発することを意味する。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ-Ａ分子などの当該技術分野で公知の任意のＭＨＣクラスＩ分子であり得る。本発明の好ましい実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ-Ａ２分子である。
本発明は、コンストラクトを認識する一本鎖抗原と、コンストラクトを認識する二本鎖との双方、並びにその他の変異型分子を提供する。本発明は、特に抗原認識コンストラクトとしての操作ＴＣＲ、またはその断片もしくは誘導体を提供する。操作ＴＣＲは、好ましくはヒト起源であり、ヒトＴＣＲ遺伝子座から生成され、したがってヒトＴＣＲ配列を含んでなるものとして理解される。さらに、本発明のＴＣＲは、ＣＯＬ６Ａ３ペプチド抗原を特異的かつ選択的に認識できる、親和性成熟ＴＣＲとして特徴付けられる。
本発明の別の実施形態は、それに加えてまたは代案として、免疫応答を誘導する、上述の抗原認識コンストラクトを提供し、好ましくは免疫応答は、インタ-フェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。
本発明のＴＣＲは、一本鎖αまたはβ、またはγおよびδ、分子として、または代案としては、α鎖およびβ鎖双方、またはγ鎖およびδ鎖双方から構成される、二本鎖コンストラクトとして提供されてもよい。
最も好ましくは、いくらかの追加的な実施形態では、本開示は、本明細書で開示される操作ＴＣＲ鎖の任意の１つ、２つまたは全てのＣＤＲ１〜ＣＤＲ３領域を含んでなる、抗原認識コンストラクトに言及する（表１を参照されたい）。３つ、２つ、および好ましくは１つのみの修飾アミノ酸残基を有する、天然または操作ＣＤＲ配列を含んでなる抗原認識コンストラクトが好ましくあってもよい。修飾アミノ酸残基は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から選択されてもよい。最も好ましくは、３つ、２つ、好ましくは１つの修飾アミノ酸残基は、それぞれのＣＤＲ配列の最初または最後のアミノ酸残基である。修飾が置換である場合、いくつかの実施形態では、置換は保存的アミノ酸置換であることが好ましい。
本発明のＴＣＲは、例えば、ヒト、ラット、サル、ウサギ、ロバ、またはマウスなどの任意の哺乳類などの任意の適切な生物種に由来する、定常領域をさらに含んでなってもよい。本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは、ヒト定常領域をさらに含んでなる。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＴＣＲの定常領域は、例えば、ＴＣＲ発現および安定性を増加させてもよい、好ましくはマウス配列である異種配列の導入によって、わずかに修飾されてもよい。また、Ｖ領域の好ましくないアミノ酸の置換および／またはＴＣＲ Ｃドメイン間のジスルフィド架橋の導入、および不対システインの除去など、現状技術（例えば、独国特許第１０２０１６１２３８９３．７号明細書）から知られている、さらなる安定化変異が導入されてもよい。
本明細書の用法では、「マウス」または「ヒト」という用語は、抗原認識コンストラクト、またはＴＣＲ、または本明細書に記載のＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖、および／またはβ鎖）に言及する場合、それぞれ、マウスまたはヒト非再構成型ＴＣＲ遺伝子座に由来するＴＣＲ（またはその構成要素）を意味する。
本発明の一実施形態では、キメラＴＣＲが提供され、ＴＣＲ鎖は複数の生物種からの配列を含んでなる。好ましくは、本発明のＴＣＲは、α鎖のヒト可変領域と、例えばマウスＴＣＲα鎖のマウス定常領域とを含んでなる、α鎖を含んでなってもよい。
一実施形態では、本発明のＴＣＲは、上記の実施形態に従ったヒト可変領域と、ヒト定常領域とを含んでなる、ヒトＴＣＲである。
本発明のＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）として提供されてもよい。ｓｃＴＣＲは、第１のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖）の可変領域のポリペプチドと、全（完全長）第２のＴＣＲ鎖（例えば、β鎖）のポリペプチドとを含んでなり得て、または逆もまた然りである。さらに、ｓｃＴＣＲは、任意選択的に、２つ以上のポリペプチドを一緒に連結する、１つまたは複数のリンカ-を含んでなり得る。リンカ-は、例えば、本明細書に記載されるように、２つの一本鎖を一緒に結合するペプチドであり得る。また、ＩＬ-２、ＩＬ-７またはＩＬ-１５などのヒトサイトカインに融合された本発明のｓｃＴＣＲも提供される。
本発明による抗原認識コンストラクトはまた、少なくとも２つのｓｃＴＣＲ分子を含んでなる多量体複合体の形態で提供され得て、前記ｓｃＴＣＲ分子は、それぞれ、少なくとも１つのビオチン部分に融合され、前記ｓｃＴＣＲは、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用によって相互連結され、前記多量体複合体が形成できるようにする。多量体ＴＣＲを作製するための同様のアプロ-チもまた可能であり、本開示に含まれる。本発明のｓｃＴＣＲを２つを超えて含んでなる、より高次の多量体複合体もまた提供される。
本発明の目的で、ＴＣＲは、少なくとも１つのＴＣＲαまたはγおよび／またはＴＣＲβまたはδ可変ドメインを有する部分である。一般に、それらはＴＣＲα可変ドメインとＴＣＲβ可変ドメインとの双方を含んでなる。それらは、αβヘテロ二量体であってもよく、または一本鎖形態であってもよい。養子療法における使用のために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの双方を有する完全長鎖として形質移入されてもよい。所望ならば、導入されたジスルフィド結合は、それぞれの定常ドメインの残基間に存在してもよい。
好ましい実施形態では、抗原認識コンストラクトは、ヒトＴＣＲ、またはその断片もしくは誘導体である。ヒトＴＣＲまたはその断片もしくは誘導体は、対応するヒトＴＣＲ配列の５０％超を含んでなるＴＣＲである。好ましくは、ＴＣＲ配列のごく一部のみが人工起源であり、またはその他の生物種に由来する。しかし、例えば、ヒト起源に由来して定常ドメインにマウス配列を有するものなどのキメラＴＣＲが有利であることが知られている。したがって、それらの定常ドメインの細胞外部分にマウス配列を含有する、本発明によるＴＣＲが特に好ましい。
したがって、本発明の抗原認識コンストラクトが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）依存様式、好ましくはＨＬＡ-Ａ０２依存様式で、そのペプチド抗原を認識できることもまた好ましい。「ＨＬＡ依存様式」という用語は、本発明の文脈では、抗原ペプチドが前記ＨＬＡによって提示される場合にのみ、抗原認識コンストラクトが抗原に結合することを意味する。
本発明による抗原認識コンストラクトは、一実施形態では好ましくは免疫応答を誘導し、好ましくは免疫応答は、インタ-フェロン（ＩＦＮ）γレベルの増加によって特徴付けられる。
「ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、オリゴペプチドを含み、１つまたは複数のペプチド結合によって連結されたアミノ酸の一本鎖を指す。本発明のポリペプチドに関して、機能的部分は、機能的部分が、好ましくは本明細書の表１で開示されるようなＣＯＬ６Ａ３抗原に特異的に結合するという条件で、それがその一部であるＴＣＲ（またはその機能的変異型）の連続アミノ酸を含んでなる、任意の部分であり得る。「機能的部分」という用語は、ＴＣＲ（またはその機能的変異型）に関して使用される場合、本発明のＴＣＲ（またはその機能的変異型）の任意の部分または断片を指し、その部分または断片は、それがその一部である（親ＴＣＲまたはその親機能的変異型）ＴＣＲ（またはその機能的変異型）の生物学的活性を維持する。機能的部分は、例えば、ＴＣＲ（またはその機能的変異型）の部分を包含する親ＴＣＲ（またはその機能的変異型）と同様の程度に、同一程度に、またはより高い程度に、ＣＯＬ６Ａ３抗原に（ＨＬＡ-Ａ２依存様式で）特異的に結合する能力を保持し、またはがんを検出し、治療し、または予防する。
機能的部分は、部分のアミノまたはカルボキシ末端に、または双方の末端に、追加的なアミノ酸を含んでなり得て、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能的変異型のアミノ酸配列中に見いだされない。望ましくは、追加的なアミノ酸は、例えば、ＣＯＬ６Ａ３抗原に特異的に結合する；および／またはがん検出し、がんを治療または予防するなどの能力を有する、機能的部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加的なアミノ酸は、親ＴＣＲまたはその機能的変異型の生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。
既に上述したように、本発明のＴＣＲの結合機能性は、抗体のフレ-ムワ-クにおいて提供されてもよい。その様々な文法的形態における「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子を指すために、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原結合部位またはパラト-プを含有する分子を指すために、本明細書で使用される。このような分子は、免疫グロブリン分子の「抗原結合断片」とも称される。本発明は、本明細書に記載の抗原に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。抗体は、当該技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプであり得る。抗体は、モノクロ-ナルまたはポリクロ-ナルであり得る。抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスタ-、ヒトなどの哺乳類から単離されおよび／または精製された抗体などの天然抗体であり得る。代案としては、抗体は、例えば、ヒト化抗体またはキメラ抗体などの遺伝子改変抗体であり得る。抗体は、単量体または重合体形態であり得る。
本発明はまた、本明細書に記載の任意の抗体の抗原結合部分を提供する。抗原結合部分は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、および三特異性抗体などの少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。合成ペプチドを介して軽抗体鎖のＶドメインに連結される抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含んでなる切断型Ｆａｂ断片からなる、一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）抗体断片が、ル-チン組換えＤＮＡ技術技術を用いて生成され得る。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得るが、本発明の抗体断片は、これらの例示的なタイプの抗体断片に限定されない。また、抗体、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファタ-ゼ、西洋ワサビペルオキシダ-ゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識を含んでなるように修飾され得る。
抗体を作製する適切な方法は、当該技術分野で公知である。例えば、標準的なハイブリド-マ法は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，５，５１ １-５１９（１９７６），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、およびＣ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，８ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２０１１））に記載される。あるいは、ＥＢＶ-ハイブリド-マ法（Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１-６７（１９８４）、およびＲｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１，１４０-６７（１９８６））、バクテリオファ-ジベクタ-発現系（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５-８１（１９８９））を参照されたい）などのその他の方法が、当該技術分野で公知である。さらに、非ヒト動物において抗体を製造する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号明細書、米国特許第５，５６９，８２５号明細書、および米国特許第５，７１４，３５２号明細書、および米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号明細書に記載される。
本発明のいくつかの実施形態はまた、ＴＣＲまたはその機能的断片およびポリペプチドにも関し、それらは可溶性ＴＣＲである。本明細書の用法では、「可溶性Ｔ細胞受容体」という用語は、少なくともポリペプチド結合によって連結されたＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変ドメインを含んでなる、天然ＴＣＲの単鎖またはヘテロ二量体切断変異型を指す（配列番号２２、２４、２５、および２７）。ＴＣＲの可溶性変異型は、通常、少なくとも天然タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメインを欠いており；時に、好ましくはこのような可溶性コンストラクトは、いかなる定常ドメイン配列も含まない。本発明の可溶性Ｔ細胞受容体コンストラクトは、好ましい実施形態では、適切なリンカ-配列によって連結された、本明細書で提供されるα鎖およびβ鎖可変ドメイン配列からなるコンストラクトを含んでなる。可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変ドメイン配列（アミノ酸または核酸）は、天然ＴＣＲ中の対応する配列と同一であってもよく、または対応する天然ＴＣＲ配列と比較して、可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメイン配列の変異型を含んでなってもよい。「可溶性Ｔ細胞受容体」という用語は、本明細書の用法では、変異型または非変異型の可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメイン配列を有する、可溶性ＴＣＲを包含する。変異は、可溶性ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変ドメイン配列のフレ-ムワ-クおよび／またはＣＤＲ領域にあってもよく、アミノ酸の欠失、挿入、置換変異、ならびにアミノ酸配列を変化させない核酸配列変化を含み得るが、これに限定されるものではない。本発明の可溶性ＴＣＲは、いずれにしても、それらの親ＴＣＲ分子の結合機能を保持し、または優先的に改善する。
上記の問題は、本発明の抗原認識コンストラクトをコ-ドする核酸、または上記タンパク質もしくはポリペプチドコンストラクトのいずれかによってさらに解決される。核酸は、好ましくは、（ａ）本発明による抗原認識コンストラクトをコ-ドする鎖を有し；（ｂ）（ａ）の鎖に相補的な鎖を有し；または（ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）に記載の分子にハイブリダイズする鎖を有する。ストリンジェントな条件は、特にＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”から当業者に知られている。それに加えて、核酸は、タンパク質に対応する核酸配列を発現するために、特に哺乳類／ヒト細胞における発現に必要なさらなる配列を任意選択的に有する。使用される核酸は、細胞内のポリペプチドに対応する核酸配列の発現を可能にするのに適したベクタ-に含まれ得る。しかし、核酸は、それら自体がそれらの細胞表面に対応タンパク質を産生するように、樹状細胞などの古典的抗原提示細胞に限定されなくてもよい抗原提示細胞を形質転換するためにも使用され得る。
「核酸」は、本明細書の用法では、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡまたはＲＮＡのポリマ-を意味し、それは、合成されたまたは天然原料から得られた（例えば、単離および／または精製された）一本鎖または二本鎖であり得て、天然、非天然または改変ヌクオチドを含有し得て、未修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見いだされるリン酸ジエステルの代わりに、ホスホロアミデ-ト結合またはホスホロチオエ-ト結合などの天然、非天然または改変ヌクレオチド間結合を含有し得る。
好ましくは、本発明の核酸は組換え体である。本明細書の用法では、「組換え体」という用語は、（ｉ）生きている細胞内で自己複製し得る核酸分子に、天然または合成核酸セグメントを連結することによって、生きている細胞の外部に構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されるものの複製から生じる分子を指す。本明細書の目的のために、自己複製は、生体外複製または生体内複製であり得る。核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはそれらの機能的部分もしくは機能的変異型のいずれかをコ-ドする、任意のヌクレオチド配列を含んでなり得る。
さらに、本発明は、上記の本発明による核酸を含んでなるベクタ-を提供する。望ましくは、ベクタ-は、発現ベクタ-または組換え発現ベクタ-である。「組換え発現ベクタ-」という用語は、本発明の文脈では、適切な宿主細胞におけるｍＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドの発現を可能にする、核酸コンストラクトを指す。本発明の組換え発現ベクタ-は、任意の適切な組換え発現ベクタ-であり得て、任意の適切な宿主を形質転換または形質移入するために使用され得る。適切なベクタ-としては、例えば、プラスミドおよびウイルスなどの増殖および拡張のために、または発現のために、またはその双方のために、設計されたものが挙げられる。動物発現ベクタ-の例としては、ｐＥＵＫ-Ｃｌ、ｐＭＡＭ、およびｐＭＡＭｎｅｏが挙げられる。好ましくは、組換え発現ベクタ-は、例えば、レトロウイルスベクタ-などのウイルスベクタ-である。組換え発現ベクタ-は、その中にベクタ-が導入され、その中で本発明の核酸の発現が実施されてもよい宿主細胞のタイプ（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳開始および終止コドンなどの制御配列を含んでなる。さらに、本発明のベクタ-は、形質転換または形質移入された宿主の選択を可能にする、１つまたは複数のマ-カ-遺伝子を含んでもよい。組換え発現ベクタ-は、天然または規範的プロモ-タ-を含んでなり得て、それは本発明のコンストラクトをコ-ドするヌクレオチド配列に、または本発明のコンストラクトをコ-ドするヌクレオチド配列と相補的なまたはそれとハイブリダイズするヌクレオチド配列に、作動可能に連結される。プロモ-タ-の選択肢としては、例えば、強いプロモ-タ-、弱いプロモ-タ-、誘導性プロモ-タ-、組織特異的プロモ-タ-、および発達特異的プロモ-タ-が挙げられる。プロモ-タ-は、非ウイルスプロモ-タ-またはウイルスプロモ-タ-であり得る。本発明の組換え発現ベクタ-は、一過性発現、安定発現のどちらか、またはその双方のために設計され得る。また、組換え発現ベクタ-は、構成的発現または誘導的発現のために作製され得る。
本発明はまた、本発明による抗原認識コンストラクトを含んでなる宿主細胞にも関する。具体的には、本発明の宿主細胞は、本明細書中で上に記載されるような核酸またはベクタ-を含んでなる。宿主細胞は、例えば、植物、動物、真菌、または藻類などの真核細胞であり得て、または例えば、細菌または原虫など原核細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、例えばヒトなどの生物から直接単離された細胞であり得る。宿主細胞は、接着細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁状態で増殖する細胞であり得る。組換えＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質を生成するために、宿主細胞は、例えば、チャイニ-ズハムスタ-卵巣（ＣＨＯ）細胞など、好ましくは哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞は任意の細胞型であり得て、任意の組織型に由来し得て、任意の発達段階であり得るものの、宿主細胞は、好ましくは、末梢血白血球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば、初代Ｔ細胞などの培養Ｔ細胞などの任意のＴ細胞；または例えば、ジャ-カット、ＳｕｐＴ１などの培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞；または哺乳類から得られたＴ細胞、好ましくは、ヒト患者由来のＴ細胞またはＴ細胞前駆体であり得る。哺乳類から得られた場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、またはその他の組織または体液をはじめとするが、これに限定されるものではない、多数の起源から得られ得る。Ｔ細胞はまた、富化または精製され得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性のヘルパ-Ｔ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞（ＴＩＬ）、記憶Ｔ細胞、未感作Ｔ細胞などをはじめとするが、これに限定されるものではない、任意のＴ細胞型であり得て、任意の発達段階のものであり得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である。
好ましくは、本発明の宿主細胞は、リンパ球、好ましくはＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性Ｔ細胞などのＴリンパ球である。宿主細胞は、さらに好ましくは、ＣＯＬ６Ａ３発現腫瘍細胞に特異的な腫瘍反応性Ｔ細胞である。
本発明のさらなる一態様は、医療で使用するための本明細書で開示された抗原認識コンストラクト、核酸、ベクタ-、医薬組成物および／または宿主細胞に関する。医療における使用は、好ましい一実施形態では、悪性または良性腫瘍疾患などの腫瘍疾患の診断、予防および／または治療における使用を含む。腫瘍疾患は、例えば、前記腫瘍疾患のがんまたは腫瘍細胞における、ＣＯＬ６Ａ３の発現によって特徴付けられる腫瘍疾患である。
抗原認識コンストラクトおよびそれに由来するその他の物質の前述の医療用途に関して、治療および／または診断されるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管または直腸がん、眼のがん、肝内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、中耳がん、口腔がん、膣がん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、および膀胱がんなどの任意のがんであり得る。好ましいがんは、子宮頸部、口腔咽頭、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、外陰部、または陰茎のがんである。特に好ましいがんは、胃腸がんおよび胃がんなどのＣＯＬ６Ａ３陽性がんである。
本発明のコンストラクト、タンパク質、ＴＣＲ、抗体、ポリペプチド、および核酸は、特に免疫療法、好ましくは養子Ｔ細胞療法における使用のためのものである。本発明の化合物の投与は、例えば、前記患者への本発明のＴ細胞の注入を伴い得る。好ましくは、このようなＴ細胞は、患者の自己Ｔ細胞であり、本発明の核酸または抗原認識コンストラクトで生体外形質導入されたものである。
国際公開第２０１６／０１１２１０号パンフレットは、ＮＫ細胞およびＴ細胞をはじめとする養子療法のための操作された細胞、細胞を含有する組成物、およびそれらを対象に投与する方法を開示する。細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および共刺激受容体などの抗原に特異的に結合する、遺伝子操作された抗原受容体を含有し得る。
本発明の目的はまた、
ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
ｂ．請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコ-ドするコ-ド配列を含んでなる、遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップとを含んでなる、細胞株を発現するＣＯＬ６Ａ３特異的抗原認識コンストラクトを製造する方法によっても解決される。
方法はさらに、前記適切な宿主細胞上で、前記抗原認識コンストラクトを細胞表面提示させるステップをさらに含んでなってもよい。
その他の好ましい実施形態では、遺伝子コンストラクトは、前記コ-ド配列に作動可能に連結されたプロモ-タ-配列を含んでなる、発現コンストラクトである。
好ましくは、前記抗原認識コンストラクトは、哺乳類起源、好ましくはヒト起源である。本発明の方法で使用するための好ましい適切な宿主細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞、特にヒＴリンパ球である。本発明で使用するためのＴ細胞は、本明細書中で上に詳述される。
前記抗原認識コンストラクトが修飾ＴＣＲであり、前記修飾が標識または治療活性物質などの機能ドメインの付加である実施形態もまた、本発明に包含される。さらに、内在性膜貫通領域の代わりに代案の膜アンカ-ドメインなどの代案のドメインを有する、ＴＣＲが包含される。
望ましくは、遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するための形質移入システムは、レトロウイルスベクタ-システムである。このようなシステムは、当業者に周知である。
一実施形態における、細胞からの抗原認識コンストラクトの単離および精製の追加的方法段階、任意選択的に、Ｔ細胞中の翻訳された抗原認識コンストラクト断片の再構成もまた、本発明に含まれる。
本発明の代案の態様では、Ｔ細胞は、本明細書中で上に記載されるように、腫瘍細胞に特異的であり高い結合活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を製造する方法によって提供され、入手され、または入手可能である。このようなＴ細胞は、本発明の方法で使用される宿主細胞、例えば、ヒトまたは非ヒトＴ細胞、好ましくはヒトＴＣＲに依存する。
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（その機能的変異型を含む）、核酸、組換え発現ベクタ-、宿主細胞（その集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離および／または精製され得る。「単離された」という用語は、本明細書の用法では、その天然環境から取り出されていることを意味する。そして「精製された」という用語は、本明細書の用法では、純度が上昇していることを意味し、「純度」は相対的用語であり、必ずしも絶対的な純度として解釈されるべきではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得て、６０％、７０％ｏ、８０％、９０％、９５％を超え得て、または１００％であり得る。
本明細書で以後、集合的に「本発明のＴＣＲ材料」と称される、本発明の抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（それらの機能的変異型を含む）、核酸、組換え発現ベクタ-、宿主細胞（それらの集団を含む）、および抗体（その抗原結合部分を含む）は、医薬組成物などの組成物に調合され得る。この点において、本発明は、本明細書に記載の抗原認識コンストラクト、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、機能的部分、機能的変異型、核酸、発現ベクタ-、宿主細胞（それらの集団を含む）、および抗体（それらの抗原結合部分を含む）のいずれかと、薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または安定剤とを含んでなる、医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、例えば、１つのポリペプチドと１つの核酸などの２つ以上の本発明のＴＣＲ材料、または２つ以上の異なるＴＣＲ（それらの機能的部分および機能的変異型を含む）を含んでなり得る。代案としては、医薬組成物は、例えば、アスパラギナ-ゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサ-ト、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなどの化学療法剤のような別の薬学的に活性な薬剤または薬物と組み合わされた、発明のＴＣＲ材料を含んでなり得る。好ましくは、担体は、薬学的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の特定の本発明のＴＣＲ材料のために従来使用されているもののいずれかであり得る。このような薬学的に許容可能な担体は当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。
したがって、本明細書に記載される本発明の任意の生成物および本発明のＴＣＲ材料、具体的には任意のタンパク質、核酸または宿主細胞を含んでなる医薬組成物もまた提供される。好ましい実施形態では、医薬組成物は、免疫療法、好ましくは養子細胞療法のためのものである。
好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、例えば、静脈内注射などの注射によって投与される。本発明のＴＣＲ材料が本発明のＴＣＲ（またはその機能的変異型）を発現する宿主細胞である場合、注射用細胞のための薬学的に許容可能な担体は、例えば、生理食塩水（水中の約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中の約３００ｍ Ｏｓｍ／ＬのＮａＣｌ、または水１リットルあたり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ-ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中の約５％デキストロ-ス、または乳酸リンゲル液などの任意の等張性担体を含んでもよい。一実施形態では、薬学的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミンが添加されている。
本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ材料の量または用量（例えば、本発明のＴＣＲ材料が１つまたは複数の細胞である場合は細胞数）は、妥当な時間枠にわたり対象または動物において、例えば、治療的または予防的応答などの影響を及ぼすのに十分であってもよい。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、投与時から例えば１２〜２４時間以上などの約２時間以上の期間において、がん抗原に結合し、またはがんを検出、治療もしくは予防するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、期間はさらに長くなり得る。用量は、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性、および動物（例えば、ヒト）の病状、ならびに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。
本発明の医薬組成物、ＴＣＲ（それらの機能的変異型を含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクタ-、宿主細胞、または細胞集団は、がんまたはＣＯＬ６Ａ３陽性前がんを治療または予防する方法で使用され得ることが検討される。本発明のＴＣＲ（およびその機能的変異型）は、ＣＯＬ６Ａ３抗原と特異的に結合すると考えられ、その結果、ＴＣＲ（または関連する発明のポリペプチドまたはタンパク質およびその機能的変異型）は、細胞によって発現されると、本発明のＣＯＬ６Ａ３抗原を発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介できる。この点において、本発明は、哺乳類において病状を治療または予防するのに有効な量で、本明細書に記載の医薬組成物、特にＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）である抗原認識コンストラクト、ポリペプチド、またはタンパク質；本明細書に記載のＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）とポリペプチドとタンパク質とのいずれかをコ-ドするヌクレオチド配列を含んでなる、任意の核酸または組換え発現ベクタ-；または本明細書に記載の本発明のコンストラクト（およびそれらの機能的変異型）またはポリペプチドまたはタンパク質のいずれかをコ-ドする組換えベクタ-を含んでなる、任意の宿主細胞または細胞集団のいずれかを哺乳類に投与するステップを含んでなる、哺乳類における病状、特にがんを治療または予防する方法を提供し、病状は、がん、好ましくはＣＯＬ６Ａ３陽性がんである。
本発明で有用な薬学的に許容可能な担体または希釈剤の例としては、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビト-ル、マンニト-ル、デンプン、スクロ-ス、グルコ-ス、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有作用物質などの安定剤、および緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液）が挙げられる。
「治療する」および「予防する」という用語、ならびにそれから派生した用語は、本明細書の用法では、必ずしも１００％または完全な治療または予防を暗示しない。むしろ、当業者が潜在的利益または治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療または予防がある。この点において、本発明の方法は、哺乳類における病状の任意の量の任意のレベルの治療または予防を提供し得る。さらに、本発明の方法によって提供される治療または予防は、例えば、治療または予防されるがんなどの１つまたは複数の病状、または病状の症状の治療または予防を含み得る。例えば、治療または予防としては、腫瘍退縮の促進が挙げられる。また、本明細書の目的のために、「予防」は、病状または症状またはその病状の発生を遅延させることを包含し得る。
本発明はまた、少なくとも１つの化学療法剤および／または放射線療法を組み合わせて、本明細書のＴＣＲ、核酸、または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法にも関する。
ａ）細胞を前記対象から単離するステップと；
ｂ）細胞を本発明の抗原認識コンストラクトをコ-ドする少なくとも１つのベクタ-で形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
ａ）細胞を健常ドナ-から単離するステップと；
ｂ）細胞を本発明の抗原認識コンストラクトをコ-ドするベクタ-で形質転換して、形質転換細胞を生成するステップと；
ｃ）形質転換細胞を増殖させて、複数の形質転換細胞を生成するステップと；
ｄ）複数の形質転換細胞を前記対象に投与するステップと
を含んでなる、それを必要とする対象においてがんを治療する方法もまた提供される。
ａ）生物学的サンプルを本明細書の抗原認識コンストラクトに接触させるステップと；
ｂ）抗原認識コンストラクトの生物学的サンプルへの結合を検出するステップと
を含んでなる、生物学的サンプルにおいてがんを検出する方法もまた提供される。
いくつかの実施形態では、がんを検出する方法は、生体外、生体内または原位置で実施される。
哺乳類において、病状の存在を検出する方法もまた提供される。方法は、（ｉ）哺乳類由来の１つまたは複数の細胞を含んでなるサンプルを本発明のＴＣＲ（およびそれらの機能的変異型）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクタ-、宿主細胞、細胞集団、抗体、またはその抗原結合部分、または本明細書に記載される医薬組成物のいずれかに接触させ、それによって複合体を形成するステップと、（ｉｉ）複合体を検出するステップとを含んでなり、複合体の検出は、哺乳類における病状の存在の指標となり、病状は、ＣＯＬ６Ａ３陽性悪性腫瘍などのがんである。
哺乳類における病状を検出する本発明の方法に関して、細胞サンプルは、全細胞、その溶解産物、または例えば、核もしくは細胞質画分、全タンパク質画分、または核酸画分などのホ-ルセル溶解産物の画分を含んでなる、サンプルであり得る。
本発明の検出する目的のために、接触は哺乳類に関して生体外または生体内で行われ得る。好ましくは、接触は生体外である。
また、複合体の検出は、当該技術分野で公知の多数の様式を通じて行われ得る。例えば、本明細書に記載される、本発明の抗原認識コンストラクト（およびそれらの機能的変異型）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクタ-、宿主細胞、細胞集団、または抗体またはＴＣＲ、またはその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファタ-ゼ、西洋ワサビペルオキシダ-ゼ）、および元素粒子（例えば、金粒子）などの検出可能な標識で標識され得る。
宿主細胞または細胞集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は哺乳類にとって同種異系または自己由来の細胞であり得る。好ましくは、細胞は哺乳類にとって自己由来である。
本発明のＴＣＲ材料の前述の医療用途に関して、治療および／または診断されるがんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管または直腸がん、眼のがん、肝内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢または胸膜がん、鼻がん、鼻腔がん、中耳がん、口腔がん、膣がん、外陰部がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、口腔咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がん、および膀胱がんのいずれかなどの任意のがんであり得る。好ましいがんは、子宮頸部、口腔咽頭、肛門、肛門管、肛門直腸、膣、外陰部、または陰茎のがんである。特に好ましいがんは、胃腸がんまたは胃がんなどのＣＯＬ６Ａ３陽性がんである。
一般に、本発明は、本発明によって開示されるような抗原認識コンストラクト、核酸、ベクタ-、医薬組成物および／または宿主細胞を投与するステップを含んでなる、腫瘍または腫瘍疾患に罹患している対象を治療する方法を提供する。好ましくは、対象は、このような治療を必要とする対象である。好ましい実施形態では対象は、ＣＯＬ６Ａ３陽性の腫瘍または腫瘍疾患に罹患している哺乳類対象、好ましくはヒト患者である。
添付の図面および配列を参照しながら、本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、それでもなおそれらに限定されるものではない。本発明の目的で、本明細書で引用される全ての参考文献は、その内容全体が参照により援用される。図面および配列において：
酵母表面ディスプレイを介した、ＴＣＲの安定化Ｖα／Ｖβ単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）への変換を示す。形質転換されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００の表面に提示されたＳｃＴｖ分子は、ＦＩＴＣ標識抗Ｖｂｅｔａ１抗体およびＰＥ標識ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体で染色された。未改変ｓｃＴｖＲ４Ｐ３Ｆ９（左パネル、配列番号２２）は、ランダム変異ｓｃＴｖライブラリの選択から得られた、ｓｃＴｖ足場（右パネル）を安定化する単一点変異を有するｓｃＴｖクロ-ンと比較される。 酵母表面ディスプレイを介したｓｃＴｖ親和性成熟を示す。親和性成熟ＣＤＲ１βありおよびなしの安定化ｓｃＴｖ分子は、ＣＯＬ６Ａ３-００２（配列番号１）を含有するＨＬＡ-Ａ＊０２四量体で染色され、ＣＯＬ６Ａ３-００２と高い配列類似性を有する９つのペプチド（配列番号２８〜３６）を含有するＨＬＡ-Ａ＊０２四量体の混合物で対比染色された。非成熟β鎖ＣＤＲ１配列ＲＳＧＤＬＳ（配列番号１３）を有する安定化ｓｃＴｖ（配列番号２７）は、親和性成熟β鎖ＣＤＲ１配列ＡＭＤＨＰＹ（配列番号４０）およびＡＲＷＨＲＮ（配列番号３９）を有するｓｃＴｖクロ-ンと比較される。 抗ＣＤ３ Ｆａｂ-ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ融合変異型７５-１〜７５-２５のサイズ排除クロマトグラフィ-溶出プロファイルを示す。 同上 バイオレイヤ-干渉法によって測定された、抗ＣＤ３ Ｆａｂ-ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ融合変異型７５-１〜７５-２５のＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２結合動態を示す。ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２の分析濃度が示される。 同上 バイオレイヤ-干渉法（ＢＬＩ）を通じて測定された、抗ＣＤ３ Ｆａｂ-ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ融合変異型７５-１〜７５-２５の結合解析を示す。示された類似ペプチドとの複合体中の１μＭのＨＬＡ-Ａ＊０２が分析された。 同上 異なる抗ＣＤ３ Ｆａｂ-ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ融合変異型のＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２とＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ１-００１（配列番号３０）との結合動態の比較を示す。Ｆａｂ-ｓｃＴｖ分子の分析濃度が示される。 ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型のＰＥ標識ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体での染色を示す。対照の目的で、ＴＣＲなし（モック）またはＮＹＥＳＯ１-００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲが発現され、ＰＥ標識ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１-００１四量体で染色され、使用された。 ＣＯＬ６Ａ３-００２に応答してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する、成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型のＩＦＮ-γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲなし（モック）またはＮＹＥＳＯ１-００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲが発現された。ＩＦＮ-γ放出は、電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＣＯＬ６Ａ３-００２の連続希釈液が負荷されたＴ２細胞との共培養後に、ＥＬＩＳＡによって判定された。 ＣＯＬ６Ａ３-００２および異なる類似ペプチドに応答してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する、成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型のＩＦＮ-γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲなし（モック）またはＮＹＥＳＯ１-００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲが発現された。ＩＦＮ-γ放出は、電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、１０μＭのＣＯＬ６Ａ３-００２または同様のペプチドが負荷されたＴ２細胞との共培養後に、ＥＬＩＳＡによって判定された。 同上 同上 同上 ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型のＰＥ標識ペプチドＨＬＡ-Ａ＊０２四量体での染色を示す。対照の目的で、ＴＣＲなし（モック）またはＮＹＥＳＯ１-００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲが発現され、ＰＥ標識ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１-００１四量体で染色され、使用された。 ＣＯＬ６Ａ３-００２またはＣＯＬ６Ａ１-００１に応答してヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する、成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型のＩＦＮ-γ放出を示す。対照の目的で、ＴＣＲなし（モック）またはＮＹＥＳＯ１-００１に特異的な１Ｇ４ ＴＣＲが発現された。ＩＦＮ-γ放出は、電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＣＯＬ６Ａ３-００２またはＣＯＬ６Ａ１-００１の連続希釈液が負荷されたＴ２細胞との共培養後に、ＥＬＩＳＡによって判定された。 異なる腫瘍細胞株、ＳＦ５３９、ＳＷ９８２、およびＨｓ８４０との共培養時における、Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型を発現する初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ-γ放出を示す。Ｔ細胞は、異なるレベルで標的ペプチドを提示する。ＭＣＦ-７細胞は、標的ペプチドを提示しない。対照として、外因性ＴＣＲを含まないエフェクタ-細胞が、目的のＴＣＲの細胞と共に分析された。ＩＦＮ-γ放出は、ＥＬＩＳＡによって判定された。＊スケ-ル外のデ-タ点をマ-クする。
表1: 本発明のペプチド配列（位置はIMGT番号付けによる：
(Francois Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; タンパク質提示: ヒト (Homo sapiens) TRAV; IMGT Repertoire. IMGT登録商標, the international ImMunoGenetics information system登録商標 http://www.imgt.org.; 作成日: 16/03/2011. バ-ジョン: 03/06/2016; Francois Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; タンパク質提示: ヒト (Homo sapiens) TRBV; IMGT Repertoire. IMGT登録商標, the international ImMunoGenetics information system登録商標 http://www.imgt.org.; 作成日: 16/03/2011. バ-ジョン: 03/06/2016）。）
がん抗原に対する天然細胞受容体（ＴＣＲ）は、ウイルス抗原を標的化するＴＣＲと比較した場合に、親和性がより低いことが多く、これは腫瘍の免疫逃避の１つの可能な説明であってもよい（Ａｌｅｋｓｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１２）。したがって、養子細胞療法における抗原認識コンストラクトとしての使用、または可溶性アプロ-チの認識モジュ-ルとしての使用、すなわち二重特異性分子を使用するために設計された、より親和性の高いＴＣＲ変異型を有することが望ましい（Ｈｉｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）。したがって、本発明は、約６０μＭの親和性で腫瘍関連ペプチドＣＯＬ６Ａ３-００２（配列番号１）を標的化する、天然に存在するＴ細胞受容体Ｒ４Ｐ３Ｆ９（配列番号２および１０）の修飾および最適化に関する（独国特許第１０２０１６１１５２４６号明細書）。
実施例１：安定したｓｃＴｖの生成
本発明では、酵母表面ディスプレイを介した成熟のために、可変α（配列番号４）およびβ（配列番号１２）ドメインと、それぞれの定常ドメイン（配列番号９および１７）および適切なグリシン-セリンリンカ-配列の付属肢との組み合わせによって、以前に調査されたＴＣＲ Ｒ４Ｐ３Ｆ９（配列番号２および１０）を単鎖ＴＣＲコンストラクト（ｓｃＴｖ、配列番号２２）に変換した。ｐＣＴ３０２に基づくリ-ダ-配列とＡｇａ２ｐ酵母接合タンパク質（配列番号２０）とを含有する酵母ディスプレイベクタ-と共に、対応する配列のＤＮＡを合成し、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＢＹ１００（ＭＡＴａ ＡＧＡ１：：ＧＡＬ１-ＡＧＡ１：：ＵＲＡ３ ｕｒａ３-５２ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２-ｄｅｌｔａ２００ ｈｉｓ３-ｄｅｌｔａ２００ ｐｅｐ４：：ＨＩＳ３ ｐｒｂｄ１．６Ｒ ｃａｎ１ ＧＡＬ）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＭＹＡ-４９４１（商標））に形質転換した（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００）。酵母における相同組換え後に得られた融合タンパク質（配列番号１９）は、目的のタンパク質の提示に関与する、Ａｇａ２ｐタンパク質のＮ末端のリ-ダ-ペプチド（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９７）と、発現制御のためのリンカ-配列（配列番号２１および２３）と、目的のタンパク質、すなわちｓｃＴｖＲ４Ｐ３Ｆ９（配列番号２２）またはその変異型を含む短いペプチドタグとを含有する独国特許第１０２０１６１２１８９９号明細書に記載されるように形質転換を実施し、ライブラリ-あたり最大１０９の酵母クロ-ンを得た。ライブラリは、ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９の全遺伝子配列に広がるランダム変異ＰＣＲアプロ-チを通じて生成した。
ＨＬＡ-Ａ＊０２の文脈でＣＯＬ６Ａ３-００２に選択的に結合するｓｃＴｖを最も良く発現する酵母クロ-ンの選択過程は、本質的にＳｍｉｔｈｅｔ ａｌ ２０１５に記載されるように実施した。酵母表面に提示されるｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９変異型の高い発現と正しい立体構造を確認するために、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体と共に、抗Ｖβ１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クロ-ンＢＬ３７．２）抗体を使用した（図１）。酵母表面ディスプレイによるｓｃＴｖ変換によって、細胞表面でのｓｃＴｖの適切な提示のための元のＣＤＲ配列、すなわちどちらもβ鎖上に位置するｂＱ４３Ｋ（配列番号２４）およびｂＬ７２Ｓ（配列番号２５）と共に、フレ-ムワ-ク領域内の２つの重要な安定化変異を明らかにした。さらに、安定成熟中に、α鎖のＣＤＲ１の位置２９（配列番号５）がグリシンからアルギニンに変換され（ＣＤＲａ１変異体１、配列番号２６）、それは四量体結合の改善をもたらした。
実施例２：安定化ｓｃＴｖの親和性成熟
ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２への結合親和性がより高いｓｃＴｖ分子を生成するために、安定化変異ａＧ２９Ｒ、ｂＱ４３Ｋ、およびｂＬ７２Ｓを発現する、以前に同定された安定化ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓスキャフォ-ルド（配列番号２７）を使用して、ＣＤＲｂ１（配列番号１３）を変性させた。ＣＤＲｂ１残基は、本質的に以前記載されたように（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）、縮重ＤＮＡオリゴプライマ-を使用することによってランダム化した。得られたＤＮＡライブラリ-は、実施例１に記載されるように形質転換した。ｓｃＴｖ結合選択性を保持するために、ＣＯＬ６Ａ３-００２ペプチドとの高い配列類似性を示す正常組織由来のペプチド（配列番号２８〜３６）を含んでなるＨＬＡ-Ａ＊０２四量体に対して、ネガティブ選択を採用した。
親和性が強化された選択的ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ変異型を選択するために、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体の漸減濃度を各選別ラウンドのために使用した。３回の選択ラウンドの後、単一のｓｃＴｖクロ-ンを単離して配列決定し、様々な親和性成熟ＣＤＲｂ１配列（配列番号３７〜４９）をもたらした。成熟ＣＤＲｂ１配列を有するｓｃＴｖでは、ＣＯＬ６Ａ３-００２結合の強い改善が示され得た一方で、９つの類似ペプチドの結合が観察されなかったことから、ＣＯＬ６Ａ３-００２結合の選択性は保持された（図２）。
実施例３：二重特異性抗体-ｓｃＴｖ融合タンパク質の生成
ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２に対する安定化および親和性成熟ｓｃＴｖは、ＣＤ３に対する抗体部分と融合して発現され得て、それらの天然特異性とは無関係に、腫瘍特異的再標的化およびＴ細胞活性化を可能にする。本発明者らは、ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ変異型（配列番号５０、６４、６５、および６６）および抗ＣＤ３Ｆａｂ（ＵＣＨＴ１）軽鎖（配列番号５２）に融合した、抗ＣＤ３Ｆａｂ（ＵＣＨＴ１）重鎖（配列番号５１）を含んでなる、二重特異性抗体-ＴＣＲ融合タンパク質を作製した。得られたＦａｂ-ｓｃＴｖ融合タンパク質は、およそ７５ｋＤａの分子量を有する。ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓα鎖（配列番号５および２６）およびβ鎖（配列番号１３および３７〜４９）の異なるＣＤＲ１配列に基づいて、製造業者によって推奨されるように、異なるＦａｂ-ｓｃＴｖ融合変異型（７５-１〜７５-２５、表２）を一過性に形質移入されたＥｘｐｉＣＨＯ細胞において発現させた。タンパク質は、プロテインＬおよびサイズ排除クロマトグラフィ-によって精製した。全ての融合変異型は、８０μｇから１ｍｇに至る収量（表２）で、サイズ排除クロマトグラフィ-によって分析された予想サイズの均一に形成されたヘテロ二量体（図３）で生成し得た。
実施例４：ＣＯＬ６Ａ３-００２および類似ペプチドに結合するＦａｂ-ｓｃＴｖ融合タンパク質
ＣＯＬ６Ａ３-００２または異なる類似ペプチドを有するＨＬＡ-Ａ＊０２モノマ-に対する抗ＣＤ３-ｓｃＴｖ Ｒ４Ｐ３Ｆ９Ｓ融合タンパク質の結合親和性をバイオレイヤ-干渉法によって測定した。製造業者によって推奨される設定を使用して、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４システムで測定を行った。簡潔に述べると、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２の連続希釈液を分析する前に、精製されたＦａｂ-ｓｃＴｖ分子をバイオセンサ-（ＦＡＢ２Ｇ）に負荷した。野生型ＣＤＲａ１および野生型ＣＤＲｂ１を含んでなる変異型７５-１および７５-２４と比較して、成熟ＣＤＲａ１および／またはＣＤＲｂ１配列を有するＦａｂ-ｓｃＴｖ変異型では、最大４０倍の結合親和性の増加が観察された（表３、図４）。ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２への結合の選択性を評価するために、それぞれがＨＬＡ-Ａ＊０２と複合体形成した１μＭ類似ペプチド（配列番号２８〜３６）への結合について、ＦＡＢ２Ｇバイオセンサ-上に負荷された精製Ｆａｂ-ｓｃＴｖ分子をスクリ-ニングした。成熟ＣＤＲａ１（配列番号２６）を含有するＦａｂ-ｓｃＴｖ変異型のほとんどによって結合されたＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ１-００１（配列番号３０）を除き、Ｆａｂ-ｓｃＴｖ変異型は、高い結合選択性を主張する類似ペプチドへの結合（図５）を示さなかった。一部のＦａｂ-ｓｃＴｖ変異型では、ビオチン化ペプチド-ＨＬＡ複合体をバイオセンサ-（ＳＡ）上に負荷し、Ｆａｂ-ｓｃＴｖ変異型の希釈系列を分析することによって、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２とＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ１-００１の結合の間の治療濃度域を調査した。成熟ＣＤＲａ１（配列番号２６）および野生型ＣＤＲｂ１（配列番号１３）配列を含んでなる変異型７５-１０が、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ１-００１よりもＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２に対する結合親和性が８倍増加したことを示した一方で、成熟ＣＤＲｂ１（配列番号３９）を含んでなるＦａｂ-ｓｃＴｖ変異型７５-１３について、治療濃度域の改善を主張する、結合親和性の最大５７倍の増加が検出された（表４、図６）。
実施例５：細胞発現のための親和性成熟ＴＣＲの使用
腫瘍特異的ペプチドＨＬＡを認識するＴＣＲを発現するためのＴ細胞の修飾は、Ｔ細胞をがん細胞にリダイレクトする有望な代替法である。成熟ＣＤＲ１配列の使用によって、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２に対する細胞結合ＴＣＲを改善できることから、同定されたＣＤＲａ１およびＣＤＲｂ１変異体配列を親ＴＣＲＲ４Ｐ３Ｆ９（配列番号２および１０）上にグラフトした。得られた変異体ＴＣＲ変異型（Ｃ-１からＣ-１８、表５）は、ＰＣＲ増幅ＤＮＡコンストラクトの生体外転写によって生成されたそれぞれのｍＲＮＡの電気穿孔後に、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞中で発現させた。対照の目的で、ＮＹＥＳＯ１-００１ペプチド（配列番号６１）に対する１Ｇ４ ＴＣＲ（配列番号５３および５７）を発現させた。ＲＮＡ電気穿孔されたＣＤ８＋Ｔ細胞を一晩インキュベ-トした後に、ＰＥ標識ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体またはＨＬＡ-Ａ＊０２／ＮＹＥＳＯ１-００１四量体で染色することによって、導入されたＴＣＲ変異型の発現を分析した。親ＴＣＲＲ４Ｐ３Ｆ９変異型Ｃ-１は、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体で最小限の染色のみを示したが、成熟ＣＤＲａ１および／またはＣＤＲｂ１を有するＲ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型Ｃ-２〜Ｃ-１８は、四量体染色の増加を示した（図７）。ＣＯＬ６Ａ３-００２の希釈系列（配列番号１）または１０μＭのＣＯＬ６Ａ３-００２および類似ペプチド（配列番号２８〜３６）のいずれかが負荷された、Ｔ２細胞との共培養（２０，０００細胞／ウェル）に際して放出されたＩＦＮ-γのレベルを判定することによって、異なる成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ＴＣＲ変異型を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞（２０，０００細胞／ウェル）の機能的活性化を調査した。親Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型Ｃ-１と比較して、成熟ＴＣＲ変異型Ｃ-２〜Ｃ-１８はＩＦＮ-γ放出の増加を示し、より低いペプチド濃度で、既に最大濃度に達した（図８）。予測されたように、ＴＣＲを発現しないＴ細胞またはＮＹＥＳＯ１-００１に特異的な１Ｇ４対照ＴＣＲでは、ＩＦＮ-γ放出は観察されなかった。成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型のＣＯＬ６Ａ３-００２認識の選択性を分析するために、異なる類似ペプチド（配列番号２８〜３６）が負荷されたＴ２細胞に応答したＩＦＮ-γ放出を分析し、成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型に対する異なる選択性プロファイルを明らかにした。最も興味深いことに、同一成熟ＣＤＲｂ１（配列番号４０）を含んでなるＴＣＲ変異型Ｃ-５（配列番号６２および２）およびＣ-１４（配列番号６２および６３）は、ＣＯＬ６Ａ１-００１またはその他の類似ペプチド（図９）に対するいかなる交差反応性も示さず、親和性成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９ＴＣＲ変異型Ｃ-５およびＣ１４を細胞ＴＣＲベ-スの腫瘍標的化の最も有望な候補にする。
実施例６：細胞ＴＣＲ変異型のＣＯＬ６Ａ３-００２およびＣＯＬ６Ａ１-００１認識のウィンドウ
Ｒ４Ｐ３Ｆ９変異型の細胞発現および分析は、上述したように実施した。先の実験（図７）に従って、Ｒ４Ｐ３Ｆ９ ＴＣＲ変異型Ｃ-２〜Ｃ-１８を発現するＴ細胞のＰＥ標識ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２四量体での染色は、親ＴＣＲ Ｃ-１と比較して増加した。さらに、ＴＣＲ変異型Ｃ-１２およびＣ-１７は、ＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ１-００１への結合を示した（図１０）。成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９変異型の発現によって、ＣＯＬ６Ａ３-００２（配列番号１）の希釈系列が負荷されたＴ２細胞に応答した、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的活性化が改善し、親ＴＣＲＣ-１と比較して５〜９０倍低いＥＣ５０値に達した（図１１、表６）。最も低いＥＣ５０値は、変異型Ｃ-１４で認められた。この場合も、同一成熟ＣＤＲｂ１（配列番号４０）を含んでなるＴＣＲ変異型Ｃ-５（配列番号６２および２）およびＣ-１４（配列番号６２および６３）は、ＣＯＬ６Ａ１-００１に対して交差反応性を示さなかった一方で、その他の変異型は、ＥＣ５０ウィンドウ（ＣＯＬ６Ａ３-００２対ＣＯＬ６Ａ１-００１）で５倍の強力な認識を示した。
実施例７：腫瘍細胞株に対する成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９変異型Ｃ-５およびＣ-１４の有効性
Ｒ４Ｐ３Ｆ９変異型の細胞発現および分析は、上述したように実施した。
成熟Ｒ４Ｐ３Ｆ９変異型Ｃ-５（配列番号６２および２）およびＣ-１４（配列番号６２および６３）の発現は、親ＴＣＲ Ｃ-１（図１２）と比較して、ＣＯＬ６Ａ３-００２（配列番号１）提示腫瘍細胞株に応答した、ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的活性化を改善した。この試験中に使用された腫瘍細胞株は、異なる量の標的ペプチドを提示する。ＳＦ５３９細胞は１細胞当たり約４０００コピ-のＨＬＡ-Ａ＊０２／ＣＯＬ６Ａ３-００２を保有し、ＳＷ９８２細胞は１細胞当たり約４６０コピ-を保有する。親ＴＣＲ Ｃ-１が、標的陽性細胞株との共培養時に強力なＴ細胞活性化を媒介しなかった一方で、ＴＣＲ変異型Ｃ-１４は、ＴＣＲ変異型Ｃ-５よりもさらに強力な機能的活性化の改善を示した。これらのデ-タは、ＴＣＲ Ｃ-１からＣ-５への、そしてＣ-１４へのＥＣ５０改善と一致する（表６）。標的陰性腫瘍細胞株ＭＣＦ-７は、これらのＴＣＲのいずれによっても認識されななかった。
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Claims (18)

  1. 配列番号５（ＣＤＲａ１）、６（ＣＤＲａ２）、および７（ＣＤＲａ３）に記載のアミノ酸配列を含んでなる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる第１のドメインと、配列番号１３（ＣＤＲｂ１）、１４（ＣＤＲｂ２）、および１５（ＣＤＲｂ３）に記載のアミノ酸配列を含んでなる、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる第２のドメインとを含んでなる、抗原認識コンストラクトであって、前記相補性決定領域の少なくとも１つが、
    ａ）配列番号２６（ＣＤＲａ１変異体１）および配列番号３７〜４９（ＣＤＲｂ１-ｍｕｔ１〜ＣＤＲｂ１-ｍｕｔ１３）、および
    ｂ）配列番号２６および配列番号３７〜４９の少なくとも１つを含んでなる変異配列からなる群から選択されるアミノ酸配列
    の群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つで置換され、前記少なくとも１つのアミノ酸配列が、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含有する、抗原認識コンストラクト。
  2. 前記抗原認識コンストラクトが安定であり、特にＭＨＣに関する文脈で、特に配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなるＣＯＬ６Ａ３抗原ペプチドに、特異的および／または選択的に結合できる、請求項１に記載の抗原認コンストラクト。
  3. 前記抗原認識コンストラクトが、抗体、または二重特異性分子または断片などのその誘導体であり、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、または二重特異性分子または断片などのその誘導体である、請求項１または２に記載の抗原認識コンストラクト。
  4. 前記第１のドメインがＴＣＲαまたはγ鎖の一部であり、および／または前記第２のドメインがＴＣＲβまたはδ鎖の一部である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコ-ドする核酸、または前記核酸を含んでなる核酸ベクタ-。
  6. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項５に記載の核酸またはベクタ-を含んでなる組換え宿主細胞であって、好ましくは、ａ）Ｔリンパ球などのリンパ球、または例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴリンパ球始原細胞、またはｂ）チャイニ-ズハムスタ-卵巣（ＣＨＯ）細胞などの非リンパ球である、組換え宿主細胞。
  7. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、または請求項５に記載の核酸もしくはベクタ-、または請求項６に記載の宿主細胞、および薬学的に許容可能な担体、希釈剤、安定剤および／または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
  8. ａ．適切な宿主細胞を提供するステップと、
    ｂ．請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクトをコ-ドするコ-ド配列を含んでなる、遺伝子コンストラクトを提供するステップと、
    ｃ．前記遺伝子コンストラクトを前記適切な宿主細胞に導入するステップと、
    ｄ．前記適切な宿主細胞によって前記遺伝子コンストラクトを発現させるステップと
    を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＣＯＬ６Ａ３特異的抗原認識コンストラクトを生成する方法。
  9. 前記抗原認識コンストラクトを前記適切な宿主細胞から単離し精製するステップと、任意選択的に、前記抗原認識コンストラクトをＴ細胞中で再構成するステップとをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
  10. 医療で使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、請求項５に記載の核酸またはベクタ-、請求項６に記載の宿主細胞、または請求項７に記載の医薬品組成物。
  11. がんなどの増殖性疾患の診断、予防、および／または治療で使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、請求項５に記載の核酸またはベクタ-、請求項６に記載の宿主細胞、または請求項７に記載の医薬品組成物。
  12. 前記がんが、例えば、結腸直腸がん、結腸がん、肝臓がん、卵巣がん、および胃がんなど、ＣＯＬ６Ａ３が過剰発現され、変異し、および／またはＣＯＬ６Ａ３由来の腫瘍関連抗原が提示されるがんから選択される、請求項１１に記載の使用のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト、請求項５に記載の核酸またはベクタ-、請求項６に記載の宿主細胞、または請求項７に記載の医薬品組成物。
  13. 前記変異配列が、前記第１の配列中の１つ、２つまたは３つのアミノ酸を前記第２の配列中の対応する１つ、２つまたは３つのアミノ酸で置換することによって提供されるような、第１および第２のアミノ酸配列の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
  14. 前記変異配列が、前記第１３の配列中の１つ、２つまたは３つの連続的アミノ酸を前記第２の配列中の対応する１つ、２つまたは３つの連続的アミノ酸で置換することによって提供されるような、第１および第２のアミノ酸配列の組み合わせである、請求項１３に記載の抗原認識コンストラクト。
  15. （ｂ）の変異配列が、少なくとも１つの（ａ）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含有する、請求項１〜４および１３〜１４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
  16. 前記相補性決定領域の前記少なくとも１つが、配列番号４０で置換され、配列番号４０が、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換を含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
  17. 前記相補性決定領域の前記少なくとも１つが、配列番号４０で置換される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
  18. 表２の７５-１〜７５-２５および表５のＣ-１〜Ｃ-１８からなる群から選択される変異型を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原認識コンストラクト。
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