CN111448209B - 新型改造t细胞受体及其免疫治疗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对COL6A3抗原的抗原识别构建体。本发明特别提出了对肿瘤表达抗原COL6A3具有选择性和特异性的新型改造T细胞受体(TCR)分子。本发明的TCR及其衍生的COL6A3抗原结合片段可用于诊断、治疗和预防表达COL6A3的癌性疾病。还提出了编码本发明抗原识别构建体的核酸、包含这些核酸的载体、表达抗原识别构建体的重组细胞以及包含本发明化合物的药物组合物。

Description

新型改造T细胞受体及其免疫治疗的应用
发明领域
本发明涉及针对COL6A3抗原的抗原识别构建体。本发明特别提出了对肿瘤表达抗原COL6A3具有选择性和特异性的新型改造T细胞受体(TCR)分子。本发明的TCR及其衍生的COL6A3抗原结合片段可用于诊断、治疗和预防表达COL6A3的癌性疾病。还提出了编码本发明抗原识别构建体的核酸、包含这些核酸的载体、表达抗原识别构建体的重组细胞以及包含本发明化合物的药物组合物。
说明
胶原蛋白是一种蛋白质超家族，在维持各种组织完整性方面发挥作用。胶原蛋白为细胞外基质蛋白，并具有三螺旋结构域作为其共同的结构元素。胶原蛋白VI是微纤维的主要结构成分。胶原蛋白VI的基本结构单元为α1(VI)、α2(VI)和α3(VI)胶原链的异源三聚体。α1(VI)和α2(VI)链分别由COL6A1和COL6A2基因编码。由COL6A3基因编码的蛋白质为VI型胶原蛋白(α3(VI)胶原链)的α3亚基(Bertini et al.,2002Eur.J.Paediatr.Neurol 6:193-8)。COL6A3基因表达之前被证明与乳腺癌进展相关，并在结肠癌中升高(Smith MJ,etal.“Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stromausing fluorescence-activated cell sorting purification”British journal ofcancer.2009；100:1452–1464；Tilman G et al“Human periostin gene expression innormal tissues,tumors and melanoma:evidences for periostin production by bothstromal and melanoma cells”Mol Cancer.2007；6:80)并作为结直肠癌的预后指标(QiaoJ et al.“Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectalcarcinoma revealed by quantitative proteomics”Oncotarget.2015Oct 6；6(30):29929–29946)。COL6A3基因位于人基因组中2q37的位置，包含44个外显子。COL6A3蛋白有3177个氨基酸，包含12个血管性假血友病因子A型(vWA)结构域，一个纤连蛋白3型结构域和一个BPTI/Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(KU)结构域。
基于T细胞的免疫治疗的靶标表示主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递的来源于肿瘤相关蛋白或肿瘤特异性蛋白的肽表位。这些肿瘤相关抗原(TAA)可以是源自所有蛋白类型的肽，如酶、受体、转录因子等，它们在相应肿瘤的细胞中被表达，并且与同源未变的细胞相比，其表达通常上调。
细胞免疫反应的特定元素能选择性地识别和破坏肿瘤细胞。从肿瘤浸润细胞群或外周血中分离出的肿瘤抗原特异性T细胞表明，这些细胞在癌症的天然免疫防御中发挥了重要作用。特别是CD8阳性T细胞在这种反应中发挥重要作用，TCD8+能识别通常8至10个源自蛋白或位于细胞质的缺损核糖体产物(DRiP)的氨基酸残基的主要组织相容性复合体(MHC)所载的肽中所含的I类分子。人MHC分子也称为人白细胞-抗原(HLA)。
TCR是免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，其与参与介导信号转导的CD3复合体的不变蛋白质相关。TCR以αβ和γδ异源二聚体形式存在，其结构相似，但解剖位置非常不同，也可能功能也非常不同。天然异二聚体αβTCR的细胞外部分由两个多肽链组成，每个多肽都有一个膜近端恒定结构域和一个膜远端可变结构域。每个恒定和可变结构域都包括一个链内二硫键。可变结构域包含与抗体互补决定区(CDR)类似的高度多态性环。使用TCR基因疗法可克服目前的一些障碍。它可让患者自己的T细胞在短时间内具有所需的特异性并产生足够数量的T细胞，从而避免其耗尽。TCR将被转导至中央记忆T细胞或具有干细胞特征的T细胞中，这可确保转移时产生更好的持久性和功能。TCR工程化T细胞将透过化学疗法或照射被注入淋巴细胞减少的癌症患者，从而获得有效的植入，但抑制免疫抑制。
虽然在开发用于癌症治疗的分子靶向药物方面取得了进展，但是，本领域仍然需要开发专门靶向作用于癌细胞高度特异性分子的抗癌新药。本发明说明书透过提出新型改造COL6A3 TCR、各自的重组TCR构建体、核酸、载体和与COL6A3表位特异性结合的公开宿主细胞来满足此需求；以及使用这些分子治疗癌症的方法。
第一方面，本发明的目的透过抗原识别构建体来解决，所述抗原识别构建体包含由根据SEQ ID NO:5(CDRa1)、6(CDRa2)和7(CDRa3)的三个互补决定区(CDR)组成的第一结构域和由根据SEQ ID NO:13(CDRb1)、14(CDRb2)和15(CDRb3)的三个互补决定区(CDR)组成的第二结构域，其中至少一个所述互补决定区被选自以下组的至少一个序列取代：a)SEQID NO:26(CDRa1-mut1)和SEQ ID NO:37至49(CDRb1-mut1至CDRb1-mut13)，优选为SEQ IDNO:40，和b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:37至49，优选为SEQ ID NO:40的突变序列，其包含保守氨基酸交换。
另一方面，抗原识别构建体的CDRa1可能与根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
另一方面，抗原识别构建体的CDRa2可能与根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
另一方面，抗原识别构建体的CDRa3可能与根据SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
另一方面，抗原识别构建体的CDRb1可能与根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
另一方面，抗原识别构建体的CDRb2可能与根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
另一方面，抗原识别构建体的CDRb3可能与根据SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。
在本发明的背景下，发明人已发现改良的COL6A3 TCR R4P3F9的改造形式，其包含改善亲本R4P3F9稳定性、识别和选择性的α和β链中的突变CDR1序列。在两步法中选择这些成熟的TCR变体，其中一步选择变体的稳定性、第二步选择变体的亲和力(参见实施例)。虽然本发明的TCR包含突变的CDR1区域，但CDR2和/或CDR3也可能发生突变，以增加结合亲和力/特异性和/或选择性，在理想情况下，现有构建体中可能包括此类突变的CDR。
亲和力成熟鉴定了对HLA-A*02/COL6A3-肽具有显著更强结合活性的变体，同时保留或甚至改善特异性。与亲本TCR C-1(包含野生型CDR的R4P3F9TCR，参见表5)相比，本发明的所有变体改善了IFN-γ释放，针对较低肽负载浓度已经达到了较高水平。
在可变结构域内，CDR1和CDR2位于多肽链的可变(V)区域，CDR3包括一部分V区域、全部多样性(D)区域和连接(J)区域。假设CDR3是最可变的，是负责特异性和选择性识别抗原的主要CDR。令人惊讶的是，对于一些TCR，CDR1似乎也与肽接触，因此也负责选择性识别。在本发明的情况下，若不受特定理论约束，突变的CDR1b似乎与COL6A3-肽的第8位相互作用。
天然α-β异二聚体TCR具有α链和β链。每个α链都包括可变、连接和恒定区域，β链通常还包括可变区和连接区之间的短多样性区域，但是该多样性区域常被视为连接区域的一部分。每个可变区都包括嵌入在框架序列中的三个CDR(互补决定区)，其中一个是称为CDR3的高度可变区。存在几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区，由其框架、CDR1和CDR2序列及部分定义的CDR3序列区分。Vα类型透过唯一的TRAV号在IMGT命名中提及，Vβ类型透过唯一的TRBV号被提及。
优选情况是，本发明的抗原识别构建体包含本文公开的本发明的单个改造TCR可变区的各CDR1至CDR3。优选的是本发明的抗原识别构建体(例如αβ和γδTCR)，其包含至少一个，优选两个成熟的CDR1序列。
如果没有其他说明，文中公开的CDR变体，特别是CDR1变体，可以透过在肽链内部的不同位点(可能是选择性位点)替换一个或多个残基来进行修饰。此取代是保守性的，其中一个氨基酸被具有类似结构和特征的另一个氨基酸所取代，替代其中一个疏水性氨基酸被另一个疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或类似的大小和化学性质的氨基酸间的取代，例如，亮氨酸被异亮氨酸取代。在天然同源蛋白质家族序列变异的研究中，某些氨基酸的取代经常比其他氨基酸更具有耐受性，这些氨基酸经常表现出与原氨基酸的大小，分子量，极性和疏水性之间的相似性相关，这是确定“保守取代”的基础。在这里中，优选保守取代定义为在以下五种基团之一的内部进行交换：基团1—小脂肪族，非极性或略具极性的残基(Ala，Ser，Thr，Pro，Gly)；基团2—极性、带负电荷的残基及其醯胺(Asp，Asn，Glu，Gln)；基团3—极性、带正电荷的残基(His，Arg，Lys)；基团4—大脂肪族非极性残基(Met，Leu，Ile，Val，Cys)以及基团5—大芳香残基(Phe，Tyr，Trp)。
较不保守的取代可能涉及一个氨基酸被另一个具有类似特点但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被异亮氨酸残基取代。
本文所用术语“特异性”或“抗原特异性”或“特异性针对”给定抗原系指当所述抗原为HLA，优选为HLA A2呈递时，抗原识别构建体可与所述抗原特异性结合，优选为COL6A3抗原，更优选为具有高亲合力的抗原。例如，作为抗原识别构建体的TCR可视为对COL6A3抗原具有“抗原特异性”，条件是在与使用低浓度COL6A3抗原，例如下文提出的COL6A3表位(例如，约10-11mol/l、10-10mol/l、10-9mol/l、10-8mol/l、10-7mol/l、10-6mol/l、10-5mol/l)脉冲处理的HLA A2靶细胞共培养时，表达TCR对呈递HLA的COL6A3作出反应的T细胞分泌至少约200pg/ml或以上(例如，250pg/ml或以上、300pg/ml或以上、400pg/ml或以上、500pg/ml或以上、600pg/ml或以上、700pg/ml或以上、1000pg/ml或以上、2,000pg/ml或以上、2,500pg/ml或以上、5,000pg/ml或以上)的干扰素γ(IFN-γ)。替代或附加情况是，如果表达TCR的T细胞在与低浓度COL6A3抗原脉冲的靶细胞共培养时分泌至少两倍于IFN-γ未转染背景水平的IFN-γ，则认为TCR对COL6A3具有“抗原特异性”。如上所述的这种“特异性”可用ELISA进行分析。
在本发明的一个替代或附加实施方案中，抗原识别构建体稳定并可特异性地和/或选择性地与COL6A3抗原结合；优选其中COL6A3抗原为具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质表位或肽或其变体，其中所述变体氨基酸缺失、添加、插入或取代不超过三个、优选为两个、最优选为不超过一个氨基酸位置。
术语“选择性”或“选择性识别/结合”被理解为是指抗原识别构建体(如TCR或抗体)的性质，选择性地识别或结合至优选仅一个特异性表位，优选为与另一个表位没有或基本上没有交叉反应。优选情况为，术语“选择性”或“选择性识别/结合”是指抗原识别构建体(例如TCR)选择性地识别或结合优选仅一个特异性表位，且优选为与另一个表位没有或基本上没有交叉反应，其中所述表位对于一种蛋白质是独特的，使得抗原识别构建体对另一种表位和另一种蛋白质没有或基本上没有交叉反应性。
根据本发明的抗原识别构建体优选为选自抗体或其衍生物或片段、双特异性分子或T细胞受体(TCR)或其衍生物或片段。本发明的抗体或TCR的衍生物或片段应优选为可保留母体分子的抗原结合/识别能力，特别是其如上所述的特异性和/或选择性。
在本发明的一实施方案中，本发明改造的TCR能够以主要组织相容性复合体(MHC)I类依赖性方式识别COL6A3抗原。本文使用的“MHC I类依赖性方式”系指在MHC I类分子的背景中在结合COL6A3肽抗原时TCR引起免疫应答。MHC I类分子可以是本领域已知的任何MHC I类分子，例如HLA-A分子。在本发明的一项优先实施方案中，MHC I类分子为HLA-A2分子。
本发明提供单链抗原识别构建体和双链识别构建体以及其他变异分子。本发明特别提出一种作为抗原识别构建体或其片段或衍生物的改造TCR。改造TCR优选为来源于人，其被理解为由人TCR基因座产生，因此包含人TCR序列。此外，本发明TCR的特征在于亲和力成熟的TCR，其能够特异性地和选择性地识别COL6A3肽抗原。
本发明的另一项实施方案另外提供上述抗原识别构建体，其诱导免疫应答，优选为其中免疫应答的特征在于干扰素(IFN)γ水平增加。
本发明的TCR可以为单链α或β，或γ和δ分子，或为由α和β链或γ和δ链两者组成的双链构建体。
最优选地，在一些附加的实施方案中，其中本披露是指包含本文公开的改造TCR链的任何一个、两个或全部CDR1至CDR3区的抗原识别构建体(参见表1)。抗原识别构建体可能为优选，其包含天然或改造的CDR序列，其具有三个、两个、优选为仅一个修饰的氨基酸残基。修饰的氨基酸残基可能选自氨基酸插入、缺失或取代基。最为优先的情况是三个、两个、优选为一个修饰的氨基酸残基为相应CDR序列的第一个或最后一个氨基酸残基。如果修饰是取代，则在一些实施方案中优选取代为保守的氨基酸取代。
本发明的TCR可以进一步包含源自任何合适物种的恒定区，如任何哺乳动物，例如：人、大鼠、猴、兔、驴或小鼠。在本发明的一项实施方案中，本发明的TCR进一步包含人恒定区。在一些优选实施方案中，本发明TCR的恒定区可例如透过引入异源序列、优选为小鼠序列来稍加修饰，这可能增加TCR的表达和稳定性。此外，可以引入现有技术中已知的进一步稳定化突变(例如DE 102016 123 893.7)，例如，替换V区中的不利氨基酸和/或在TCR C结构域之间引入二硫键以及去除不配对的半胱氨酸。
本文所用的术语“鼠”或“人”在提及抗原识别构建体或TCR时，或本文所述的TCR的任何组分(例如，互补性决定区(CDR)、可变区、恒定区，α链和/或β链)是指分别源自小鼠或人未经排列的TCR基因座的TCR(或其组分)。
在本发明的一项实施方案中，提供了嵌合TCR，其中所述TCR链包含来自多物种的序列。优选情况为，本发明的TCR可包含α链，其包含α链的人可变区和例如鼠TCRα链的鼠恒定区。
在一项实施方案中，本发明的TCR是由根据上述实施方案的人可变区和人恒定区组成的人TCR。
本发明的TCR可能为单链TCR(scTCR)。scTCR可包含第一TCR链(例如，α链)的可变区的多肽和整个(全长)第二TCR链(例如，β链)的多肽，反之亦然。此外，scTCR可以任选地包含一个或多个将两个或多个多肽连接在一起的接头。例如，接头可以是肽，其将两个单链连接在一起，如本文所述。还提供了本发明的scTCR，其与人细胞因子如IL-2、IL-7或IL-15融合。
本发明的抗原识别构建体还可能以包含至少两个scTCR分子的多聚复合体形式提供，其中所述scTCR分子各自与至少一种生物素部分融合，并且其中所述scTCR透过生物素-链霉亲和素相互作用相互连接，以形成所述多聚体复合体。用于产生多聚体TCR的类似方法也是可能的并且包括在本披露资料中。还提出了更高级的多聚体复合体，其包含本发明两种以上的scTCR。
为了本发明的目的，TCR是具有至少一个TCRα或γ和/或TCRβ或δ可变结构域的部分。通常他们包括TCRα可变结构域和TCRβ可变结构域。他们可能为αβ异源二聚体，也可能为单链形式。为了用于过继疗法，αβ异二聚体TCR可能例如被转染为具有细胞质和跨膜结构域的全长链。如果需要，相应恒定结构域残基之间可能存在引入的二硫键。
在一项优选的实施方案中，抗原识别构建体为人TCR或其片段或衍生物。人TCR或其片段或衍生物是一种TCR，其包含超过50％的相应人TCR序列。优选情况为，只有少部分TCR序列为人工来源或源自其他物种。然而，众所周知，例如，人源的嵌合TCR在恒定结构域含有鼠源序列是有利的。因此，特别优选的是根据本发明的TCR，其在其恒定结构域的细胞外部分含有鼠序列。
因此，又为优选的是本发明的抗原识别构建体能够以人白细胞抗原(HLA)依赖性方式、优选以HLA-A02依赖性方式识别其肽抗原。在本发明的上下文中，术语“HLA依赖性方式”系指抗原识别构建体仅在抗原肽由所述HLA呈递的情况下才与抗原结合。
在一项实施方案中，根据本发明的抗原识别构建体优选为诱导免疫应答，优选为其中免疫应答的特征在于干扰素(IFN)γ水平增加。
如本文所用的术语“多肽”包括寡肽，系指透过一个或多个肽键连接的单链氨基酸。关于本发明的多肽，功能部分可以是包含TCR(或其功能变体)连续氨基酸的任何部分，其中部分条件是功能部分与COL6A3抗原特异性结合，优选为如表1中所公开的。当使用与TCR(或其功能变体)相关时，术语“功能部分”系指本发明TCR(或其功能变体)的任何部分或片段，其中该部分或片段保留TCR(或其功能变体)的生物活性，其为母体TCR或其亲代功能变体的一部分。功能部分包括，例如，保留与COL6A3抗原特异性结合的能力(以HLA依赖性方式)或以与母体TCR(或其功能变体)相似程度、相同程度或更高程度检测、治疗或预防癌症的TCR(或其功能变体)的那些部分。
功能部分可以在该部分的氨基或羧基末端或两个末端包含额外的氨基酸，其中在母体TCR或其功能变体的氨基酸序列中未发现额外的氨基酸。理想的情况是，额外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，特异性结合COL6A3抗原；和/或具有检测癌症、治疗或预防癌症等能力。更理想的是，与母体TCR或其功能变体的生物学活性相比，额外的氨基酸增强了生物学活性。
如上所述，本发明TCR的结合功能可能在抗体框架中提供。本文中使用了各种语法形式的术语“抗体”，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点或互补位的分子。此类分子也被称为免疫球蛋白分子的“抗原结合片段”。本发明还提出了与本文所述的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合部分。抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是任何同种型免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。抗体可以是天然存在的抗体，例如从哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)中分离和/或纯化的抗体。或者，抗体可以是基因工程化抗体，例如人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是单体或聚合体形式。
本发明还提出了本文所述任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位元点的任何部分，例如Fab、F(ab')2、dsFv、scFv、双抗体和三抗体。由包含透过合成肽连接到轻链抗体的可变(V)结构域的抗体重链的V结构域的截短Fab片段所组成的单链可变区片段(scFv)抗体片段可使用常规重组DNA技术方法产生。类似地，二硫键稳定的可变区片段(dsFv)可以透过重组DNA技术制备，但本发明的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。此外，抗体或其抗原结合部分可以被修饰为包括可检测的标记，例如放射性同位素、萤光团(例如，异硫氰酸萤光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)。
制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于例如，Kohlerand Milstein,Eur.J.Immunol,5,51 1-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988),and CA Janeway et al.(eds.),Immunobiology,8Ed.,Garland Publishing,New York,NY(201 1)一文中。或者，其他方法，例如EBV杂交瘤方法(Haskard and Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984),和Roder et al,Methods Enzymol,121,140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见例如，Huse et al.,Science,246,1275-81(1989))都是本领域已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法描述于例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利申请公开号2002/0197266中。
本发明的一些实施方案也涉及作为可溶性TCR的TCR或其功能片段和多肽。用于本文时，术语可溶性“T细胞受体”系指天然TCR的单链或异二聚体截短变体，其至少包含由多肽接头连接的TCRα链和β链的可变结构域(SEQ ID NO:22、24、25和27)。TCR的可溶性变体通常至少缺乏天然蛋白质的跨膜和胞质结构域；有时优选地，此类可溶性构建体不包含任何恒定的结构域序列。在优选的实施方案中，本发明的可溶性T细胞受体构建体包含由本文提供的α和β链可变结构域序列组成的构建体，其透过合适的接头序列连接。可溶性TCRα链和β链的可变结构域序列(氨基酸或核酸)可以与天然TCR中的相应序列相同，或者与相应的天然TCR序列相比，可以包含可溶性TCRα链和β链可变结构域序列的变体。本文所用的术语可溶性「T细胞受体」包括具有变体或非变体可溶性TCRα链和β链可变结构域序列的可溶性TCR。这些变异可以在可溶性TCRα链和β链可变结构域序列的框架和/或CDR区中，并且可以包括但不限于氨基酸缺失、插入、取代突变以及不改变氨基酸序列的核酸序列改变。在任何情况下，本发明的可溶性TCR都保留或优先改善其亲本TCR分子的结合功能。
上述问题透过编码本发明抗原识别构建体的核酸或任何上述蛋白质或多肽构建体得以进一步解决。核酸优选为(a)具有编码根据本发明的抗原识别构建体的链；(b)具有与(a)中的链互补的链；或(c)具有在严格条件下与如(a)或(b)所述的分子杂交的链。严格条件是本领域技术人员已知的，具体来自Sambrook等人的《Molecular Cloning》一文。除此之外，核酸任选具有进一步的序列，其是表达对应于蛋白质的核酸序列所必需的，特别是用于在哺乳动物/人细胞中表达。使用的核酸可包含于适于允许在细胞中表达对应于该多肽的核酸序列的载体中。然而，核酸也可用于转化抗原呈递细胞，其可能不限于经典的抗原呈递细胞，例如树突状细胞，这样，使得他们本身在其细胞表面上产生相应的蛋白质。
本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，通常是指可以为单链或双链、合成或从自然资源中获得(例如，分离和/或纯化)的DNA或RNA聚合物，其可含有天然、非天然的或改变的核苷酸，并且可含有天然、非天然的或改变的核苷酸间连接子，例如氨基磷酸酯连接子或磷硫代磷酸酯连接子，而非未修饰寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。
优选地，本发明的核酸为重组核酸。本文所用的术语“重组”系指(i)透过将天然或合成核酸区段连接到可在活细胞中复制的核酸分子而构建在活细胞外部的分子，或(ii)从复制上述(i)中所述内容而产生的分子。为了本文的目的，复制可以是体外复制，也可以是体内复制。核酸可包含编码本文所述的任何TCR、多肽或蛋白质或功能部分或其功能变体的任何核苷酸序列。
此外，本发明提出了包含如上所述的本发明核酸的载体。理想情况是，载体为表达载体或重组表达载体。术语“重组表达载体”在本发明背景下系指允许在合适宿主细胞中表达mRNA、蛋白质或多肽的核酸构建体。本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并可用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者兼有的载体，例如质粒和病毒。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo。优选地，重组表达载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体。重组表达载体包括调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其特异于宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)的类型，其中载体将被引入其中并且在其中可以进行本发明核酸的表达。此外，本发明的载体可能包括一个或多个标志物基因，其允许选择转化或转染的宿主。重组表达载体可包含与编码本发明构建体的核苷酸序列或者与编码本发明构建体的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列在操作上可连接的天然或规范性启动子。启动子的选择包括例如强、弱、诱导型、组织特异性和开发特异性启动子。启动子可以是非病毒启动子，也可以是病毒启动子。本发明的重组表达载体可以被设计用于暂态表达、稳定表达或两者的表达。此外，重组表达载体可以用于组成型表达或诱导型表达。
本发明还涉及包含根据本发明的抗原识别构建体的宿主细胞。具体地，本发明的宿主细胞包含如上所述的核酸或载体。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，也可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养细胞或原代细胞，即直接从生物体(例如人)分离。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞(即，在悬浮液中生长的细胞)。为了产生重组TCR、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选为哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。最优选地，宿主细胞为人细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来自任何类型的组织，可以是任何发育阶段的细胞，但是宿主细胞优选为外周血白细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞为T细胞。T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，例如，原代T细胞或来自培养T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获得自哺乳动物的T细胞，优选为来自人类患者的T细胞或T细胞前体。如果获得自哺乳动物，T细胞可从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或液体。T细胞还可以是富集或纯化的。优选地，T细胞为人T细胞。更优选地，T细胞是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以是任何发育阶段的，包括但不限于CD4阳性和/或CD8阳性、CD4阳性辅助T细胞，例如，Th1和Th2细胞、CD8-阳性T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚T细胞等。优选地，T细胞为CD8阳性T细胞或CD4阳性T细胞。
优选地，本发明的宿主细胞为淋巴细胞，优选为T淋巴细胞，例如CD4阳性或CD8阳性T细胞。宿主细胞更优选为对表达COL6A3的肿瘤细胞特异性的肿瘤反应性T细胞。
本发明的另一方面涉及本文公开的用于药物中的抗原识别构建体、核酸、载体、药物组合物和/或宿主细胞。在一项优选实施方案中在药物中的用途包括在诊断、预防和/或治疗诸如恶性或良性肿瘤疾病等肿瘤疾病中的用途。肿瘤疾病为，例如，在所述肿瘤疾病的癌细胞或肿瘤细胞中以表达COL6A3为特征的肿瘤疾病。关于抗原识别构建体及其衍生其他材料的上述医疗用途，待治疗和/或诊断的癌症可以为任何癌症，包括以下癌症中任一种：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠类癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌。优选的癌症为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。特别优选的癌症为COL6A3阳性癌症，包括胃肠癌和胃癌。
本发明的构建体、蛋白质、TCR、抗体、多肽和核酸特别用于免疫治疗，优选用于过继性T细胞治疗。本发明化合物的给药可以，例如，涉及将本发明的T细胞输注入所述患者体内。优选地，此类T细胞为患者的自体T细胞，并且用本发明的核酸或抗原识别构建体在体外转导。
WO 2016/011210公开了用于过继疗法的工程细胞，包括NK细胞和T细胞以及含有所述细胞的组合物及其受试者给药方法。所述细胞可以含有特异性结合抗原的基因工程化抗原受体，例如，嵌合抗原受体(CAR)和共刺激受体。
本发明的目的还透过制备表达细胞系的COL6A3特异性抗原识别构建体的方法来解决，包括
a.提出合适的宿主细胞，
b.提出一种基因构建体，其包含编码根据权利要求1至4中任一项所述的抗原识别构建体的编码序列，
c.将所述基因构建体引入所述合适的宿主细胞，和
d.由所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。
所述方法可能进一步包括在所述合适宿主细胞上进行细胞表面呈递所述抗原识别构建体的步骤。
在其他优选的实施方案中，所述基因构建体是包含与所述编码序列可操作地连接的启动子序列的表达构建体。
优选地，所述抗原识别构建体来源于哺乳动物，优选来源于人。用于本发明方法的优选合适宿主细胞为哺乳动物细胞，诸如人细胞，特别是人T淋巴细胞。用于本发明的T细胞在上文中进行了详细描述。
本发明还包括实施方案，其中所述抗原识别构建体为修饰的TCR，其中所述修饰是加入功能结构域，诸如标记物或治疗活性物质。此外，包括具有可选结构域的TCR，诸如可选膜锚定结构域而不是内源性跨膜区。
理想情况是，用于将基因构建体引入所述合适宿主细胞的转染系统为逆转录病毒载体系统。此类系统是本领域技术人员所熟知的。
本发明还包括在一项实施方案中，从细胞中分离和纯化抗原识别构建体的另外的方法步骤，以及任选地在T细胞中重构经翻译的抗原识别构建体片段。
本发明的另一方面提出了透过产生T细胞受体(TCR)的方法获得的或可获得的T细胞，其中T细胞受体(TCR)对于肿瘤细胞具有特异性并且具有如上所述的高亲合力。此类T细胞取决于本发明方法中使用的宿主细胞，例如人或非人T细胞，优选为人TCR。
本发明的TCR、多肽、蛋白质(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)可以进行分离和/或纯化。本文所用的术语“分离”系指已经从其自然环境中去除。本文所用的术语“纯化”系指纯度增加，其中“纯度”为一个相对术语，并不一定要解释为绝对纯度。例如，纯度可以为至少约50％，可以大于60％、70％、80％、90％、95％，也可以为100％。
本发明的抗原识别构建体、TCR、多肽、蛋白质(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)以下统称为“本发明的TCR材料”，可以配制成组合物，诸如药物组合物。就此而言，本发明提出了一种药物组合物，其包含本文所述的任意抗原识别构建体、TCR、多肽、蛋白质、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)以及药用载体、赋形剂和/或稳定剂。含有任何本发明TCR材料的本发明药物组合物可包含多于一种本发明的TCR材料，例如，多肽和核酸，或两种或更多种不同的TCR(包括功能部分及其功能变体)。或者，药物组合物可包含与另一种药物活性剂或药物组合的本发明TCR材料，诸如，化学治疗剂，例如，天冬醯胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花堿、长春新堿等。优选地，载体为药用载体。关于药物组合物，载体可以是常规用于所考虑的本发明的特定TCR材料的任意载体。这些药用载体是本领域技术人员所熟知的，并且是公众容易获得的。优选情况是，药用载体是在使用条件下无有害副作用或毒性的一种载体。
因此，本还提出了一种药物组合物，其包含本文所述的本发明的任何产品和本发明的任何TCR材料，特别是任何蛋白质、核酸或宿主细胞。在一项优选的实施方案中，药物组合物用于免疫治疗，优选为继代细胞治疗。
优选地，本发明的TCR材料透过注射施用，如，静脉内施用。当本发明的TCR材料为表达本发明TCR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射的细胞药用载体可能包括任何等渗载体，例如，生理盐水(水中含有约0.90％w/v的NaCl、水中含有约300mOsm/L NaCl、或每升水中含有约9.0g NaCl)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)、水中含约5％葡萄糖或林格氏乳酸盐。在一项实施方案中，药用载体用人血清白蛋白补充。
为了本发明的目的，施用本发明TCR材料的数量或剂量(例如，当本发明TCR材料为一个或多个细胞时的细胞数量)可能在合理时间框架内在受试者或动物中足以影响治疗或预防反应。例如，本发明TCR材料的剂量应该自施用起约2个小时或更长时间(例如，12至24小时)或更多小时的期间内与癌症抗原结合或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间可能更长。剂量将由本发明特定TCR材料的疗效和动物(例如，人)的状况以及待治疗动物(例如，人)的体重决定。
预期本发明的药物组合物、TCR(包括其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群可用于癌症或COL6A3阳性癌前病变的治疗或预防方法。本发明的TCR(及其功能变体)被认为可与COL6A3抗原特异性结合，使得TCR(或本发明相关多肽或蛋白质及其功能变体)由细胞表达时能够介导针对表达本发明COL6A3抗原的靶细胞。就此而言，本发明提出了哺乳动物中病症(特别是癌症)的治疗或预防方法，包括向哺乳动物施用任何药物组合物、抗原识别构建体，特别是TCR(及其功能变体)、多肽或本文所述的蛋白质、任何核酸或重组表达载体，其包含编码本文所述的任何TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质的核苷酸序列或包含重组载体的任何宿主细胞或细胞群，该重组载体编码本文所述的本发明的任何构建体(及其功能变体)、多肽或蛋白质，用量为有效治疗或预防哺乳动物中病症的量，其中所述病症为癌症，优选为COL6A3阳性癌症。
可用于本发明的药用载体或稀释剂的实例包括诸如SPGA、碳水化合物(例如，山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖)等稳定剂，诸如白蛋白或酪蛋白等蛋白质，诸如牛血清或脱脂牛奶和缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)等含蛋白制剂。
本文中所用的术语“治疗”和“预防”以及源自这些术语的词语并不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，而本领域普通技术人员认识到具有潜在的益处或治疗效果。就此而言，本发明的方法可为哺乳动物的病症提供任何治疗或预防水平的任意量。此外，本发明方法提出的治疗或预防可包括待治疗或预防病症(例如，癌症)的一种或多种病症或症状的治疗或预防。例如，治疗或预防可以包括促进肿瘤消退。此外，为了本文之目的，“预防”可以包括推迟疾病或其症状或病症的发作。
本发明还涉及一种治疗癌症的方法，其包括与至少一种化学治疗剂和/或放射治疗组合施用本说明书的TCR、核酸或宿主细胞。
还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：
a)从所述受试者中分离细胞；
b)用编码本发明的抗原识别构建体的至少一种载体转化细胞以产生转化的细胞；c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；和
d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。
还提出了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括：
a)从健康供体中分离细胞；
b)用编码本发明的抗原识别构建体的一种载体转化细胞以产生转化的细胞；
c)扩增转化细胞以产生多个转化细胞；和
d)将所述多个转化细胞施用于所述受试者。
还提出了一种检测生物样本中癌症的方法，包括：
a)使生物样本与本说明书的抗原识别构建体接触；
b)检测抗原识别构建体与生物样本的结合情况。
在一些实施方案中，检测癌症的方法在体外、体内或原位进行。
还提出了检测哺乳动物中有无病症的方法。该方法包括(i)将包含哺乳动物一种或多种细胞的样本接触本发明的任何TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分或本文所述的药物组合物，从而形成复合体，并(ii)包括检测复合体，其中所述复合体的检测提示哺乳动物中是否存在病症，其中所述病症为癌症，诸如COL6A3阳性恶性疾病。
关于检测哺乳动物疾病的本发明方法，细胞样本可以是包含全细胞、其裂解物或全部细胞裂解物的一部分的样本，例如核或细胞质级分、全蛋白质级分或核酸级分。
为了本发明的检测方法之目的，所述接触可以在哺乳动物体外或体内进行。优选情况是，接触在体外进行。
此外，复合体的检测可以透过本领域已知的任何方式进行。例如，本文所述的本发明抗原识别构建体(及其功能变体)、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或TCR或其抗原结合部分可以用检测到的标记(诸如，放射性同位素、萤光团(例如，异硫氰酸萤光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)进行标记。
为了本发明方法之目的，其中施用宿主细胞或细胞群，所述细胞可以是与哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选情况是，细胞为哺乳动物自体细胞。
关于本发明TCR材料的上述医疗用途，待治疗和/或诊断的癌症可以为任何癌症，包括以下癌症中任一种：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞癌、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠类癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌。优选的癌症为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、肛门直肠癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。特别优选的癌症为COL6A3阳性癌症，例如，胃肠癌或胃癌。
总体上，本发明提出了患有肿瘤或肿瘤疾病的受试者的治疗方法，其包括施用本发明公开的抗原识别构建体、核酸、载体、药物组合物和/或宿主细胞。优选地，所述受试者为需要这种治疗的受试者。优选实施方案中的受试者为患有COL6A3阳性的肿瘤或肿瘤疾病的哺乳动物受试者，优选为人类患者。
在以下实施例中将对本发明进一步进行说明，参照随附图表和序列，但是不仅限于此。为了本发明之目的，所有参考文献均以完整引用的形式并入本文。在图和序列中：
图1显示了透过酵母表面展示技术将TCR转化为稳定的Vα/Vβ单链TCR(scTv)。显示于转化酿酒酵母EBY100表面上的ScTv分子用FITC标记的抗Vbeta1抗体和PE标记的HLA-A*02/COL6A3 002四聚体染色。将未修饰的scTv R4P3F9(左图，SEQ ID NO:22)与带有单点突变的scTv克隆进行比较，以稳定scTv支架(右图)，其源自随机突变scTv文库的选择。
图2显示了透过酵母表面展示的scTv亲和力成熟。将具有和不具有亲和力成熟CDR1β的稳定scTv分子用含有COL6A3-002(SEQ ID NO:1)的HLA-A*02四聚体进行染色，并用含有与COL6A3-002具有高度序列相似性的9种肽(SEQ ID NO:28至36)的HLA-A*02四聚体混合物进行复染。将具有非成熟β链CDR1序列RSGDLS(SEQ ID NO:13)的稳定scTv(SEQ ID NO:27)与携带亲和力成熟β链CDR1序列(SEQ ID NO:40)和ARWHRN(SEQ ID NO:39)的scTv克隆进行比较。
图3显示了抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合变体75-1至75-25的尺寸排阻色谱洗脱曲线。
图4显示了透过生物层干涉测量法测量的抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合变体75-1至75-25的HLA-A*02/COL6A3-002结合动力学。显示了HLA-A*02/COL6A3-002的分析浓度。
图5显示了透过生物层干涉测量法(BLI)测量的抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合变体75-1至75-25的结合分析。分析了与指定的相似肽复合的1μM HLA-A*02。
图6显示了不同抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合变体的HLA-A*02/COL6A3-002和HLA-A*02/COL6A1-001(SEQ ID NO:30)结合动力学的比较。显示了Fab-scTv分子的分析浓度。
图7显示了用PE标记的HLA-A*02/COL6A3-002四聚体染色表达人CD8+T细胞的成熟R4P3F9 TCR变体。出于对照目的，没有表达对NYESO1-001特异的TCR(空白对照)或1G4 TCR，并且使用PE标记的HLA-A*02/NYESO1-001四聚体进行染色。
图8显示了应答COL6A3-002的表达人CD8+T细胞的成熟R4P3F9 TCR变体的IFN-γ释放。出于对照目的，没有表达对NYESO1-001特异的TCR(空白对照)或1G4 TCR。在电穿孔的CD8+T细胞与载有连续稀释的COL6A3-002的T2细胞共培养后，透过ELISA法测定IFN-γ释放。
图9显示了应答COL6A3-002和不同相似肽的表达人CD8+T细胞的成熟R4P3F9TCR变体的IFN-γ释放。出于对照目的，没有表达对NYESO1-001特异的TCR(空白对照)或1G4 TCR。在电穿孔的CD8+T细胞与载有10μM COL6A3-002或相似肽的T2细胞共培养后，透过ELISA法测定IFN-γ释放。
图10显示了用PE标记的肽-HLA-A*02四聚体染色表达人CD8+T细胞的成熟R4P3F9TCR变体。出于对照目的，没有表达对NYESO1-001特异的TCR(空白对照)或1G4 TCR，并且使用PE标记的HLA-A*02/NYESO1-001四聚体进行染色。
图11显示了应答COL6A3-002或COL6A1-001的表达人CD8+T细胞的成熟R4P3F9 TCR变体的IFN-γ释放。出于对照目的，没有表达对NYESO1-001特异的TCR(空白对照)或1G4TCR。在电穿孔的CD8+T细胞与载有连续稀释的COL6A3-002或COL6A1-001的T2细胞共培养后，透过ELISA法测定IFN-γ释放。
图12显示了与不同肿瘤细胞系共培养后表达R4P3F9 TCR变体的原代人CD8+T细胞的IFN-γ释放。SF539、SW982和Hs840.T细胞以不同水平呈递靶肽。MCF-7细胞不呈递靶肽。作为对照，无外源性TCR的效应细胞与具有目标TCR的细胞一起分析。透过ELISA法测定IFN-γ释放。*标记超出范围的资料点。
表1：本发明的肽序列(位置根据IMGT编号：
( Ehrenmann、Patrice Duroux、Chantal Ginestoux；蛋白展示：人(智人)TRAV；IMGT库。国际ImMunoGeneticshttp://www.imgt.org.；创建时间：2011年3月16日。版本：2016年6月3日；Ehrenmann、Patrice Duroux、Chantal Ginestoux；蛋白展示：人(智人)TRBV；IMGT库。国际ImMunoGeneticshttp://www.imgt.org.；创建时间：2011年3月16日。版本：2016年6月3日。)
实施例
与靶向作用于病毒抗原的TCR相比，抗癌抗原的天然T细胞受体(TCR)通常亲和力较低，这可能是肿瘤免疫逃逸的一种可能解释(Aleksic et al.2012)。因此，希望具有更高亲和力的TCR变体，其设计用作过继细胞疗法中的抗原识别构建体，或者作为可溶性方法的识别模组，即，使用双特异性分子(Hickman et al.2016)。因此，本发明涉及天然存在的T细胞受体R4P3F9(SEQ ID NO:2和10)的修饰和优化，其靶向作用于亲和力为约60μM的肿瘤相关肽COL6A3-002(SEQ ID NO:1)(DE102016115246)。
实施例1：稳定scTv的产生
对于本发明，先前研究的TCR R4P3F9(SEQ ID NO:2和10)被转化为单链TCR构建体(scTv，SEQ ID NO:22)，透过酵母表面展示以含有各自恒定结构域(SEQ ID NO:9和17)的附加物和适当的甘氨酸-丝氨酸接头序列的可变α(SEQ ID NO:4)和β(SEQ ID NO:12)结构域的组合进行成熟。合成相应序列的DNA并转化为酿酒酵母EBY100(MATa AGA1::GAL1AGA1::URA3 ura352 trp1leu2delta200 his3delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL)(MYA 4941TM)与基于pCT302的含有前导序列和Aga2p酵母交配蛋白(SEQ ID NO:20)的酵母展示载体(Boder et al.2000)。在酵母中同源重组后得到的融合蛋白(SEQ ID NO:19)在Aga2p蛋白的N末端含有前导肽(负责显示目的蛋白)(Boder et al.1997)、短肽标签，包括用于表达对照和目的蛋白质的接头序列(SEQ ID NO:21和23)，即scTv R4P3F9(SEQ IDNO:22)或其变体。如DE102016121899中所述进行转化，每个文库产生多达109个酵母克隆。透过跨越scTv R4P3F9的完整基因序列的随机突变PCR方法产生文库。
具有在HLA-A*02背景下选择性结合COL6A3-002的最佳表达scTv的酵母克隆的选择过程基本上如Smith et al 2015中所述进行。为了确定在酵母表面上显示的scTvR4P3F9变体的高表达和正确构象，抗-Vβ1(Beckman Coulter，克隆BL37.2)抗体与HLA-A*02/COL6A3 002四聚体一起使用(图1)。透过酵母表面展示的scTv转化揭示了框架区中两个关键稳定突变以及用于在细胞表面上正确呈递scTv的原始CDR序列，即bQ43K(SEQ ID NO:24)和bL72S(SEQ ID NO:25)，均位于β链上。此外，在稳定性成熟期间，α链的CDR1中的第29位置(SEQ ID NO:5)从甘氨酸转化为精氨酸(CDRa1突变体1，SEQ ID NO:26)，这导致四聚体结合改善。
实施例2：稳定scTv的亲和力成熟
为了产生对HLA-A*02/COL6A3 002具有更高结合亲和力的scTv分子，使用先前鉴定的表达稳定突变aG29R、bQ43K和bL72S的稳定化scTv R4P3F9S支架(SEQ ID NO:27)对CDRb1(SEQ ID NO:13)进行简并。透过使用基本上如前所述的简并DNA寡聚引物随机化处理CDRb1残基(Smith et al.2015)。如实施例1中所述转化所得到的DNA文库。为了保持scTv结合选择性，对包含衍生自正常组织的肽(SEQ ID NO:28至36)的HLA A*02四聚体进行阴性选择，其显示出与COL6A3-002肽的高度序列相似性。
为了选择亲和力增强的和选择性的scTv R4P3F9S变体，每个分选回合使用降低浓度的HLA A*02/COL6A3 002四聚体。在三轮选择后，分离单个scTv克隆并测序，产生多种亲和力成熟的CDRb1序列(SEQ ID NO:37至49)。对于具有成熟CDRb1序列的scTv，可以证明COL6A3-002结合的强烈改善，同时保留COL6A3-002结合的选择性，因为未观察到9种类似肽的结合(图2)。
实施例3：双特异性抗体-scTv融合蛋白的产生
针对HLA A*02/COL6A3 002的稳定和亲和力成熟的scTv可以与针对CD3的抗体部分融合表达，从而允许肿瘤特异性重新靶向作用于和活化T细胞，而与其天然特异性无关。本发明人产生了双特异性抗体-TCR融合蛋白，其包含与scTv R4P3F9S变体(SEQ ID NO:50、64、65和66)融合的抗CD3 Fab(UCHT1)重链(SEQ ID NO:51)和抗CD3 Fab(UCHT1)轻链(SEQID NO:52)。得到的Fab-scTv融合蛋白的分子量约为75kDa。基于scTvR4P3F9Sα(SEQ ID NO:5和26)和β链(SEQ ID NO:13和37至49)的不同CDR1序列，不同的Fab-scTv融合变体(75-1至75-25，表2)按照制造商的建议在暂态转染的ExpiCHO细胞中表达。透过蛋白L和尺寸排阻色谱法纯化蛋白质。所有融合变体均可产生，产量范围为80μg至1mg(表2)并且均匀形成的异二聚体预期大小如透过尺寸排阻色谱法分析的大小(图3)。
表2：双特异性Fab-scTv融合蛋白的命名和产量。分子基于SEQ ID NO 50和52以及指示的CDRa1和CDRb1变体。
变体 CDRa1/SEQ CDRb1/SEQ 产量[μg]
75-1 DRGSQS(SEQ ID NO.5) RSGDLS(SEQ ID NO.13) 267.9
75-2 DRGSQS(SEQ ID NO.5) ARWHNN(SEQ ID NO.37) 78.4
75-3 DRGSQS(SEQ ID NO.5) AKDHLN(SEQ ID NO.38) 646.7
75-4 DRGSQS(SEQ ID NO.5) ARWHRN(SEQ ID NO.39) 704.3
75-5 DRGSQS(SEQ ID NO.5) AMDHPY(SEQ ID NO.40) 397.2
75-6 DRGSQS(SEQ ID NO.5) ATDHYN(SEQ ID NO.41) 268.1
75-7 DRGSQS(SEQ ID NO.5) ARYHTN(SEQ ID NO.42) 83.2
75-8 DRGSQS(SEQ ID NO.5) APYHLN(SEQ ID NO.43) 765.7
75-9 DRGSQS(SEQ ID NO.5) AKDHTN(SEQ ID NO.44) 1067.2
75-10 DRRSQS(SEQ ID NO.26) RSGDLS(SEQ ID NO.13) 389.6
75-11 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ARWHNN(SEQ ID NO.37) 270.4
75-12 DRRSQS(SEQ ID NO.26) AKDHLN(SEQ ID NO.38) 943.6
75-13 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ARWHRN(SEQ ID NO.39) 560.3
75-14 DRRSQS(SEQ ID NO.26) AMDHPY(SEQ ID NO.40) 360.7
75-15 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ATDHYN(SEQ ID NO.41) 541.5
75-16 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ARYHTN(SEQ ID NO.42) 403.6
75-17 DRRSQS(SEQ ID NO.26) APYHLN(SEQ ID NO.43) 195.5
75-18 DRRSQS(SEQ ID NO.26) AKDHTN(SEQ ID NO.44) 731.3
75-19 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ARYHRN(SEQ ID NO.45) 794
75-20 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ARWHSN(SEQ ID NO.46) 85.5
75-21 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ATDHYN(SEQ ID NO.47) 276
75-22 DRRSQS(SEQ ID NO.26) RWGDLN(SEQ ID NO.48) 255
75-23 DRRSQS(SEQ ID NO.26) ARDHLN(SEQ ID NO.49) 217
75-24a DRGSQS(SEQ ID NO:5) RSGDLS(SEQ ID NO.13) 166.6
75-25a DRRSQS(SEQ ID NO.26) RSGDLS(SEQ ID NO.13) 267
a scTv的β-α方向
实施例4：Fab-scTv融合蛋白与COL6A3-002和类似肽的结合透过生物层干涉测量法测量抗CD3-scTv R4P3F9S融合蛋白对具有COL6A3-002或不同类似肽的HLA-A*02单体的结合亲和力。使用制造商推荐的设置在Octet RED384系统上进行测量。简而言之，在分析HLA-A*02/COL6A3-002的系列稀释液之前，将纯化的Fab-scTv分子上样到生物感测器(FAB2G)上。与包含野生型CDRa1和野生型CDRb1的变体75-1和75-24相比，具有成熟CDRa1和/或CDRb1序列的Fab-scTv变体观察到结合亲和力增加高达40倍(表3、图4)。为了评估与HLA-A*02/COL6A3-002结合的选择性，筛选载入到FAB2G生物感测器上的纯化Fab-scTv分子与1μM相似肽(SEQ ID NO:28至36)结合，每个都与HLA-A*02复合。除了与大多数含有成熟CDRa1(SEQ ID NO:26)的Fab-scTv变体结合的HLA-A*02/COL6A1-001(SEQ ID NO:30)外，Fab-scTv变体显示不与相似肽结合(图5)，支持高结合选择性。对于一些Fab-scTv变体，透过将生物素化肽-HLA复合体载入到生物感测器(SA)上并分析Fab-scTv变体的稀释系列来研究HLA-A*02/COL6A3-002与HLA-A*02/COL6A1-001结合之间的治疗视窗。虽然包含成熟CDRa1(SEQ ID NO:26)和野生型CDRb1(SEQ ID NO:13)序列的变体75-10显示出对HLA-A*02/COL6A3-002的结合亲和力比对HLA-A*02/COL6A1-001增加8倍，但是对于包含成熟CDRb1(SEQ ID NO:39)的Fab-scTv变体75-13的结合亲和力检测到增加高达57倍，从而支援治疗视窗有所改善(表4、图6)。
表3：Fab-scTv融合蛋白与HLA-A*02/COL6A3-002的结合亲和力。
表4：Fab-scTv融合蛋白与HLA-A*02/COL6A3-002和HLA-A*02/COL6A1-001的结合亲和力比较。
变体 pHLA-A*02 KD(M) KDCOL6A1-001/KDCOL6A3-002
75-10 COL6A3-002 1.37E-05 8
COL6A1-001 1.08E-04
75-11 COL6A3-002 8.50E-07 8
COL6A1-001 6.46E-06
75-12 COL6A3-002 7.24E-07 12
COL6A1-001 8.98E-06
75-13 COL6A3-002 7.39E-07 57
COL6A1-001 4.23E-05
75-17 COL6A3-002 8.25E-07 9
COL6A1-001 7.10E-06
75-23 COL6A3-002 1.15E-06 22
COL6A1-001 2.55E-05
实施例5：亲和力成熟TCR对于细胞表达的用途
修饰T细胞以表达识别肿瘤特异性肽-HLA的TCR是将T细胞重定向至癌细胞的有前景的替代方案。由于使用成熟的CDR1序列可以改善针对HLA-A*02/COL6A3-002的细胞结合TCR，因此将鉴定的CDRa1和CDRb1突变体序列移植到亲本TCR R4P3F9(SEQ ID NO:2和10)上。在电穿孔透过PCR扩增DNA构建体的体外转录产生的相应mRNA后，在人CD8+T细胞中表达所得的突变TCR变体(C-1至C-18、表5)。出于对照目的，表达针对NYESO1-001肽(SEQ ID NO:61)的1G4 TCR(SEQ ID NO:53和57)。在RNA电穿孔的CD8+T细胞过夜孵育后，透过用PE标记的HLA-A*02/COL6A3-002四聚体或HLA-A*02/NYESO1-001四聚体染色来分析引入TCR变体的表达。虽然亲本TCR R4P3F9变体C-1仅显示出对HLA-A*02/COL6A3-002四聚体的最少染色，但具有成熟CDRa1和/或CDRb1的R4P3F9 TCR变体C-2至C-18显示四聚体染色增加(图7)。表达不同成熟R4P3F9 TCR变体的CD8+T细胞(20,000个细胞/孔)的功能性活化透过测定与T2细胞(20,000个细胞/孔)共同培养后释放的IFN-γ水平来研究，所述T2细胞载入有稀释系列的COL6A3-002(SEQ ID NO:1)或10μM COL6A3-002和类似肽(SEQ ID NO:28至36)。与亲本R4P3F9 TCR变体C-1相比，成熟的TCR变体C-2至C-18显示出IFN-γ释放增加，在较低的肽浓度下已达到最高水平(图8)。如所预期的，对于不表达TCR的T细胞或对NYESO1-001特异的1G4对照TCR未观察到IFN-γ释放。为了分析COL6A3-002对成熟R4P3F9 TCR变体的识别选择性，分析了负载不同相似肽(SEQ ID NO:28至36)的T2细胞的IFN-γ释放，并显示了成熟R4P3F9 TCR变体的不同选择性特征。最有趣的是，包含相同成熟CDRb1(SEQ ID NO:40)的TCR变体C-5(SEQ ID No 62和2)和C-14(SEQ ID NO:62和63)未对COL6A1-001或其他类似肽(图9)显示出任何交叉反应性，这使亲和力成熟R4P3F9 TCR变体C-5和C14成为最有希望用于基于细胞TCR肿瘤靶向作用的候选变体。
表5：细胞TCR变体的命名。分子基于SEQ ID NO 2和10以及指示的CDRa1和CDRb1变体。
实施例6：COL6A3-002和COL6A1-001识别细胞TCR变体的视窗如上所述进行R4P3F9变体的细胞表达和分析。根据先前的实验(图7)，与亲本TCR C-1相比，用PE标记的HLA-A*02/COL6A3-002四聚体对表达R4P3F9 TCR变体C-2至C-18的T细胞染色增加。另外，TCR变体C-12和C-17显示与HLA-A*02/COL6A1-001结合(图10)。所有成熟R4P3F9变体的表达改善了CD8+T细胞的功能性活化，以应答载入有COL6A3-002稀释系列(SEQ ID NO:1)的T2细胞，与亲本TCR C-1相比，EC50值降低5至90倍(图11、表6)。发现了变体C-14的最低EC50值。同样，包含相同成熟CDRb1(SEQ ID NO:40)的TCR变体C-5(SEQ ID No 62和2)和C-14(SEQ ID NO:62和63)未对COL6A1-001显示出任何交叉反应性，但是，其他变体显示出强识别能力，EC50视窗(COL6A3-002与COL6A1-001)低至因子5。
表6：与载有COL6A3-002或COL6A1-001的T2细胞共培养后表达R4P3F9变体的T细胞的IFN-γ释放EC50值[nM]。
a未达到稳定状态
实施例7：成熟R4P3F9变体C-5和C-14对肿瘤细胞系的疗效如上所述进行R4P3F9变体的细胞表达和分析。
与亲本TCR C-1相比，成熟R4P3F9变体C-5(SEQ ID NO 62和2)和C-14(SEQ ID NO:62和63)的表达改善了CD8+T细胞的功能性活化，以应答呈递COL6A3-002(SEQ ID NO:1)的肿瘤细胞系(图12)。该研究期间使用的肿瘤细胞系呈递不同量的靶肽。SF539细胞每个细胞携带～4000个拷贝的HLA-A*02/COL6A3-002，SW982细胞每个细胞携带～460个拷贝。尽管亲本TCR C-1在与靶阳性细胞系共培养后不介导强的T细胞活化，但TCR变体C-14显示出比TCR变体C-5更强的功能性活化改善。这些资料符合从TCR C-1到C-5和至C-14的EC50改善(表6)。靶阴性肿瘤细胞系MCF-7未被任何这些TCR识别。
参考文献：
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val
1 5
<210> 2
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala
100 105 110
Tyr Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
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<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln
20
<210> 4
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
1 5 10 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
20 25 30
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met
35 40 45
Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln
50 55 60
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln
65 70 75 80
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala Tyr Ser Gly Ala Gly
85 90 95
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<213> Homo sapiens
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Asp Arg Gly Ser Gln Ser
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<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
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Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
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Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
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1
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
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Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
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Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
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1 5 10 15
Gly Pro Val
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln
35 40 45
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser
65 70 75 80
Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu
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Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val
100 105 110
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Arg Ser Gly Asp Leu Ser
1 5
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1 5
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Cys Ala Ser Ser Val Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr
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1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
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Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
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Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
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Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
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Phe
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Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr
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Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp
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Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly Gln
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Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val Tyr
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Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu Glu Arg Phe Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Gln Leu Leu Arg Cys Phe Ser Ile Phe Ser Val Ile Ala Ser Val
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Gly Lys Ala Met Gln Gly Val Phe Glu Tyr Tyr Lys Ser Val Thr Phe
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<213> Homo sapiens
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly
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Ala Ser
<210> 22
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly
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<400> 24
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His
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Glu Leu Asn Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe
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<213> Homo sapiens
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Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln Ser
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Cys Ala Ser Ser Val Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 9
<212> PRT
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<210> 34
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 9
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
<400> 45
Ala Arg Tyr His Arg Asn
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ala Arg Trp His Ser Asn
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Ala Thr Asp His Tyr Asn
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Arg Trp Gly Asp Leu Asn
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Ala Arg Asp His Leu Asn
1 5
<210> 50
<211> 514
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
35 40 45
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
85 90 95
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val
245 250 255
Ala Gly Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro
260 265 270
Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser
275 280 285
Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu
290 295 300
Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp
325 330 335
Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala Tyr Ser Gly
340 345 350
Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val
355 360 365
Ile Pro Asn Ile Gln Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly Gln Arg Val
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Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser Val Tyr Trp Tyr
420 425 430
Lys Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn
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Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Ser Glu Arg Phe Ser Ala Gln
450 455 460
Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser Leu Glu Leu
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Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu Ser Ser Tyr
485 490 495
Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu
500 505 510
Lys Asn
<210> 51
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
20 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
35 40 45
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
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Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Val
245 250 255
Ala Gly
<210> 52
<211> 232
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
20 25 30
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg
35 40 45
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
65 70 75 80
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
85 90 95
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu
100 105 110
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
130 135 140
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
165 170 175
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
180 185 190
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
195 200 205
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
210 215 220
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
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<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
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Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
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100 105 110
Pro Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser
115 120 125
Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
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Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
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210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
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Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 54
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
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Val Ser Ser Lys
20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly Glu
1 5 10 15
Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu Leu
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Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala Ser
50 55 60
Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser Gln
65 70 75 80
Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His
100 105 110
Pro
<210> 56
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
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<211> 311
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 58
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala
20
<210> 59
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly Gln Ser
1 5 10 15
Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met Ser Trp
20 25 30
Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr Ser Val
35 40 45
Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr Asn Val
50 55 60
Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser Ala Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn
85 90 95
Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 60
<211> 179
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Arg Gly
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
1 5
<210> 62
<211> 308
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ala Met Asp His
35 40 45
Pro Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Val Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Phe
305
<210> 63
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Arg Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala
100 105 110
Tyr Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
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210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 64
<211> 515
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
35 40 45
Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val
260 265 270
Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly
275 280 285
Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu
290 295 300
Leu Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe
305 310 315 320
Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg
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Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser
355 360 365
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly Gln Arg
405 410 415
Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ala Met Asp His Pro Tyr Val Tyr Trp
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Tyr Lys Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr
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Leu Lys Asn
515
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<211> 515
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
35 40 45
Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
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65 70 75 80
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Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val
260 265 270
Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Arg
275 280 285
Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu
290 295 300
Leu Ile Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe
305 310 315 320
Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg
325 330 335
Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala Tyr Ser
340 345 350
Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser
355 360 365
Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
385 390 395 400
Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr Gly Gln Arg
405 410 415
Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Ala Met Asp His Pro Tyr Val Tyr Trp
420 425 430
Tyr Lys Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr
435 440 445
Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Ser Glu Arg Phe Ser Ala
450 455 460
Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser Ser Leu Glu
465 470 475 480
Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val Glu Ser Ser
485 490 495
Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp
500 505 510
Leu Lys Asn
515
<210> 66
<211> 515
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
35 40 45
Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln
65 70 75 80
Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr
85 90 95
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro
245 250 255
Val Ala Gly Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr Ala Thr
260 265 270
Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp Leu Ser
275 280 285
Val Tyr Trp Tyr Lys Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu Ile
290 295 300
Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Ser Glu Arg
305 310 315 320
Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn Leu Ser
325 330 335
Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Val
340 345 350
Glu Ser Ser Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val
355 360 365
Val Glu Asp Leu Lys Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
385 390 395 400
Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu Gly Ala
405 410 415
Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Arg Ser Gln Ser Phe
420 425 430
Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile Met Ser
435 440 445
Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala Gln Leu
450 455 460
Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser Gln Pro
465 470 475 480
Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Ala Tyr Ser Gly Ala Gly Ser
485 490 495
Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Ile Pro Asn
500 505 510
Ile Gln Asn
515

Claims (37)

1.一种抗原识别构建体，其包含第一结构域和第二结构域，每个结构域包含三个互补决定区(CDR)，其中所述第一结构域包含根据SEQ ID NO:6(CDRa2)和SEQ ID NO:7(CDRa3)的氨基酸序列，并且所述第二结构域包含根据SEQ ID NO:14(CDRb2)和SEQ ID NO:15(CDRb3)的氨基酸序列，其中
a)所述第一结构域的CDRa1如SEQ ID NO:5所示，并且所述第二结构域的CDRb1选自根据SEQ ID NO:37至44的氨基酸序列之一，或
b)所述第一结构域的CDRa1如SEQ ID NO:26所示，并且所述第二结构域的CDRb1选自根据SEQ ID NO:13、37至49的氨基酸序列之一；
且其中所述抗原识别构建体与COL6A3抗原多肽特异性和/或选择性结合且是T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段保留所述分子与COL6A3抗原多肽特异性和/或选择性结合的抗原结合和/或识别能力。
2.根据权利要求1所述的抗原识别构建体，其中
(i)所述第一结构域包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，并且所述第二结构域包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:40；或
(ii)所述第一结构域包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7，并且所述第二结构域包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:40。
3.根据权利要求2所述的抗原识别构建体，
其中所述根据(i)的构建体包含如SEQ ID NO:2中包含的TCRα可变结构域和恒定结构域和如SEQ ID NO:62中包含的TCRβ可变结构域和恒定结构域，或
其中所述根据(ii)的构建体包含如SEQ ID NO:62中包含的TCRβ可变结构域和恒定结构域和如SEQ ID NO:63中包含的TCRα可变结构域和恒定结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体是稳定的，并且能够特异性地和/或选择性地与包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的COL6A3抗原肽结合，特别是在MHC的背景下。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述第一结构域是TCRα或γ链的一部分；和/或其中所述第二结构域是TCRβ或δ链的一部分。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体是单链抗原识别构建体。
7.根据权利要求6所述的抗原识别构建体，其中所述单链抗原识别构建体是单链TCR。
8.根据权利要求7所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体是包含至少两个单链TCR分子的多聚复合体，所述单链TCR分子各自与至少一种生物素部分融合，其中所述单链TCR分子透过生物素-链霉亲和素相互作用相互连接。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原识别构建体，其中所述抗原识别构建体是可溶性TCR。
10.一种多肽链，其包含第一结构域和第二结构域，每个结构域包含三个互补决定区(CDR)，其中所述第一结构域包含根据SEQ ID NO:6(CDRa2)和SEQ ID NO:7(CDRa3)的氨基酸序列，并且所述第二结构域包含根据SEQ ID NO:14(CDRb2)和SEQ ID NO:15(CDRb3)的氨基酸序列，其中
a)所述第一结构域的CDRa1如SEQ ID NO:5所示，并且所述第二结构域的CDRb1选自根据SEQ ID NO:37至44的氨基酸序列之一，或
b)所述第一结构域的CDRa1如SEQ ID NO:26所示，并且所述第二结构域的CDRb1选自根据SEQ ID NO:13、37至49的氨基酸序列之一；
且其中所述多肽链与COL6A3抗原多肽特异性和/或选择性结合且是T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段保留所述分子与COL6A3抗原多肽特异性和/或选择性结合的抗原结合和/或识别能力。
11.一种核酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体或根据权利要求10所述的多肽链。
12.一种核酸载体，其包含根据权利要求11所述的核酸。
13.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体、根据权利要求10所述的多肽、根据权利要求11所述的核酸或根据权利要求12所述的载体。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为
a)淋巴细胞，或
b)非淋巴细胞。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是T淋巴细胞或T淋巴细胞祖细胞。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CD4或CD8阳性T细胞。
19.根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体、根据权利要求10所述的多肽链、根据权利要求11所述的核酸、根据权利要求12所述的载体或根据权利要求13-18中任一项所述的宿主细胞，其中所述抗原识别构建体、所述多肽链、所述核酸、所述载体或所述宿主细胞用可检测的标记标记。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体、根据权利要求10所述的多肽链、根据权利要求11所述的核酸、根据权利要求12所述的载体、或根据权利要求13-18中任一项所述的宿主细胞，以及药用载体、稀释稳定剂和/或赋形剂。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其还包含另一种药物活性剂或药物。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述另外的药物活性剂或药物选自天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱和长春新碱。
23.一种制造根据权利要求1至9中任一项所述的COL6A3特异性抗原识别构建体的方法，包括：
a.提供合适的宿主细胞，
b.提供一种基因构建体，其包含编码根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体的编码序列，
c.将所述基因构建体引入所述合适的宿主细胞，和
d.由所述合适的宿主细胞表达所述基因构建体。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括从合适的宿主细胞分离和纯化所述抗原识别构建体，以及任选地在T细胞中重构所述抗原识别构建体。
25.根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体、根据权利要求10所述的多肽链、根据权利要求11所述的核酸、根据权利要求12所述的载体、根据权利要求13至18中任一项所述的宿主细胞、或根据权利要求20-22所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防COL6A3阳性增殖性疾病的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述增殖性疾病是选自以下的COL6A3阳性癌前病变或癌症：急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌或中耳癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞癌、食管癌、胃肠类癌瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌、肠系膜癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌、宫颈癌和胃肠癌。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述增殖性疾病是选自以下的COL6A3阳性癌前病变或癌症：鼻腔癌、口腔癌、黑色素瘤、咽癌、直肠癌、胃癌、小肠癌或结肠癌。
28.根据权利要求26或27所述的用途，其中所述癌症选自COL6A3过度表达、突变和/或呈递COL6A3衍生肿瘤相关抗原的癌症。
29.根据权利要求13至18中任一项所述的宿主细胞在制备用于在有此需要的患者中治疗COL6A3阳性癌症或COL6A3阳性癌前病变的药物中的用途，其中所述宿主细胞是所述患者的自体细胞。
30.根据权利要求13至18中任一项所述的宿主细胞在制备用于治疗在有此需要的人中治疗COL6A3阳性癌症或COL6A3阳性癌前病变的药物中的用途，其中所述宿主细胞是同种异体的细胞。
31.一种用于产生多个转化细胞的体外方法，所述方法包括：
a)从受试者获得细胞；
b)用至少一种根据权利要求12所述的载体转化所述细胞，以产生转化细胞；和
c)扩增所述转化细胞以产生大量转化细胞。
32.根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体在制备供在用于检测生物样品中的癌症的体外方法中使用的试剂中的用途，所述方法包括：
a)使所述生物样品与根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体接触；
b)检测所述抗原识别构建体与所述生物样品的结合。
33.根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体在制备供在用于检测生物样品中的癌症的体外方法中使用的试剂中的用途，所述方法包括以下步骤：
(i)使来自哺乳动物的包含一种或多种细胞的样品与根据权利要求1至9中任一项所述的抗原识别构建体、根据权利要求10所述的多肽链、根据权利要求11所述的核酸、根据权利要求12所述的载体、根据权利要求13至18中任一项所述的宿主细胞或权利要求20至22中任一项所述的药物组合物接触，由此形成复合体，以及
(ii)检测所述复合体，
其中检测到所述复合体表明所述哺乳动物中存在所述病症，其中所述病症是癌症。
34.根据权利要求33所述的用途，其中所述细胞样品是包含全细胞、其裂解物、或所述全细胞裂解物的一部分的样品。
35.根据权利要求33或34所述的用途，其中所述抗原识别构建体、所述多肽链、所述核酸、所述载体或所述宿主细胞用可检测的标记标记，并且检测所述复合体的步骤包括检测所述可检测的标记。
36.大量转化细胞在制备用于治疗有此需要的受试者中的COL6A3阳性癌症或COL6A3阳性癌前病变的药物中的用途，其中所述大量细胞通过以下步骤获得：
a)从所述受试者获得细胞；
b)用至少一种根据权利要求12所述的载体转化所述细胞，以产生转化细胞；
c)扩增所述转化细胞以产生所述大量转化细胞。
37.大量转化细胞在制备用于治疗有此需要的受试者中的COL6A3阳性癌症或COL6A3阳性癌前病变的药物中的用途，其中所述大量细胞通过以下步骤获得：
a)从健康供体中获得细胞；
b)用至少一种根据权利要求12所述的载体转化所述细胞，以产生转化细胞；
c)扩增所述转化细胞以产生所述大量转化细胞。
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