EA043746B1 - Новые полученные методами генной инженерии t-клеточные рецепторы и иммунная терапия с их использованием - Google Patents

Новые полученные методами генной инженерии t-клеточные рецепторы и иммунная терапия с их использованием Download PDF

Info

Publication number
EA043746B1
EA043746B1 EA202090712 EA043746B1 EA 043746 B1 EA043746 B1 EA 043746B1 EA 202090712 EA202090712 EA 202090712 EA 043746 B1 EA043746 B1 EA 043746B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ser
leu
gly
val
thr
Prior art date
Application number
EA202090712
Other languages
English (en)
Inventor
Феликс Ундердорбен
Себастиан Бунк
Мартин ХОФМАНН
Майке Хутт
Доминик Маурер
Леони Алтен
Клаудиа Вагнер
Original Assignee
Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх filed Critical Имматикс Байотекнолоджиз Гмбх
Publication of EA043746B1 publication Critical patent/EA043746B1/ru

Links

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антигенраспознающим структурам к антигенам COL6A3. В частности, в изобретении предложены новые полученные методами генной инженерии молекулы на основе T-клеточного рецептора (ТКР), являющиеся селективными и специфическими для экспрессируемого опухолями антигена COL6A3. ТКР по изобретению и фрагменты, связывающиеся с антигеном COL6A3, образованные из этого ТКР, полезны для диагностики, лечения и профилактики раковых заболеваний, при которых экспрессируется COL6A3. Предложены также нуклеиновые кислоты, кодирующие антигенраспознающие структуры по изобретению, векторы, включающие данные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные клетки, экспрессирующие эти антигенраспознающие структуры, и фармацевтические композиции, включающие соединения по изобретению.
Описание изобретения
Коллагены являются надсемейством белков, которые играют роль в сохранении целостности различных тканей. Коллагены являются белками внеклеточного матрикса и имеют домен с тройными спиралями в качестве их общего структурного элемента. Коллаген VI является основным структурным компонентом микрофибрилл. Основной структурной единицей коллагена VI является гетеротример альфа 1(VI), альфа 2(VI) и альфа 3(VI) цепей коллагена. Альфа 1(VI)- и альфа 2(VI)-цепи кодируют гены COL6A1 и COL6A2 соответственно. Белок, кодируемый геном COL6A3, - это субъединица альфа-3 коллагена VI типа (альфа-цепь коллагена 3(VI)) (Bertini et al., 2002, Eur. J. Paediatr. Neurol., 6:193-8). Как было продемонстрировано ранее, экспрессия гена COL6A3 ассоциируется с прогрессированием рака молочной железы, и ее уровень был повышен при раке толстой кишки (Smith M.J., et al. Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification, British journal of cancer. 2009; 100:1452-1464; Tilman G. et al Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells, Mol. Cancer. 2007; 6:80), а также выступает в роли прогностического маркера колоректальной карциномы (Qiao J. et al. Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics, Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30):29929-29946). COL6A3 локализован на хромосоме 2q37 человеческого генома и содержит 44 экзона. Белок COL6A3 состоит из 3177 аминокислот и содержит 12 доменов типа A фактора фон Виллебранда (vWA), один домен фибронектина 3 типа и один домен ингибиторов сериновых протеаз (KU) семейства BPTI/Кунитца.
Мишени иммунотерапии, основанной на T-клетках, представлены пептидными эпитопами, полученными из опухолеассоциированных или опухолеспецифических белков, которые презентируются молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). Данные опухолеассоциированные антигены (TAA) могут быть пептидами, образованными из любого класса белков, таких как ферменты, рецепторы, факторы транскрипции и т.д., которые экспрессируются и обычно имеют по сравнению с неизмененными клетками того же происхождения повышенный уровень в клетках соответствующей опухоли.
Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к селективному распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Выделение T-клеток, специфических к опухолевым антигенам, из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака. В частности, CD8-положительные T-клетки, которые распознают пептиды, связанные с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса, играют важную роль в этом ответе. Эти пептиды обычно состоят из 8-10 аминокислотных остатков, полученных из белков или дефектных рибосомных продуктов (DRiP), находящихся в цитозоле. Молекулы MHC человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (HLA).
ТКР - это гетеродимерный белок клеточной поверхности надсемейства иммуноглобулинов, которое ассоциируется с инвариантными белками комплекса CD3, участвующими в опосредовании передачи сигналов. ТКР существуют в виде αβ- и γδ-гетеродимеров, которые сходны по структуре, однако имеют весьма различное анатомическое расположение и, вероятно, функции. Внеклеточная часть встречающегося в природе гетеродимерного авТКР состоит из двух полипептидных цепей, каждая из которых имеет расположенный ближе к мембране константный домен и расположенный дальше от мембраны вариабельный домен. Каждый из константных и вариабельных доменов включает дисульфидную связь внутри цепи. Вариабельные домены содержат высокополиморфные петли, аналогичные участкам, определяющим комплементарность (CDR) антител. Применение генной терапии на основе ТКР позволяет преодолеть многие из имеющихся преград. Она позволяет снабдить собственные T-клетки пациента желаемой специфичностью и вырабатывать достаточное число T-клеток в короткий период времени без их истощения. ТКР трансдуцируют в центральные T-клетки памяти или T-клетки с характеристиками стволовых клеток, что может обеспечить лучшую устойчивость и сохранение функциональности при переносе. Пациентам, больным раком, с лимфопенией, вызванной химиотерапией или лучевой терапией, с помощью инфузии вводят T-клетки с встроенными ТКР, что позволяет провести успешное приживление, но при этом ингибирует иммуносупрессию.
Несмотря на достижения в разработке молекулярно-таргетных препаратов для противораковой те
- 1 043746 рапии, в этой области остается потребность в развитии новых противораковых препаратов, мишенями которых были бы молекулы, высокоспецифические для раковых клеток. Настоящее описание направлено на удовлетворение этой потребности, предлагая новые модифицированные COL6A3-специфичные ТКР, соответствующие рекомбинантные ТКР-структуры, нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева, которые специфически связываются с предложенными в изобретении эпитопами COL6A3; и способы применения таких молекул в лечении рака.
В первом аспекте задача изобретения решена с помощью антигенраспознающей структуры, включающей первый домен, включающий три комплементарных детерминантных участка (CDR) в соответствии с SEQ ID NO: 5 (CDRa1), 6 (CDRa2) и 7 (CDRa3), и второй домен, включающий три комплементарных детерминантных участка (CDR) в соответствии с SEQ ID NO: 13 (CDRb1), 14 (CDRb2) и 15 (CDRb3), где по меньшей мере один из указанных комплементарных детерминантных участков заменен по меньшей мере на одну последовательность, выбранную из группы: a) SEQ ID NO: 26 (CDRa1-mut1) и SEQ ID NO: 37-49 (CDRb1-mut1 по CDRb1-mut13), предпочтительно SEQ ID NO: 40; и б) последовательности с мутациями SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 37-49, предпочтительно SEQ ID NO: 40, включающую консервативные аминокислотные замены.
В другом аспекте CDRa1 антигенраспознающей структуры может быть по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% идентичен аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 5.
В другом аспекте CDRa2 антигенраспознающей структуры может быть по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% идентичен аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6.
В другом аспекте CDRa3 антигенраспознающей структуры может быть по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% идентичен аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 7.
В другом аспекте CDRb1 антигенраспознающей структуры может быть по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% идентичен аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 13.
В другом аспекте CDRb2 антигенраспознающей структуры может быть по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% идентичен аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 14.
В другом аспекте CDRb3 антигенраспознающей структуры может быть по меньшей мере на около 25%, по меньшей мере на около 30%, по меньшей мере на около 35%, по меньшей мере на около 40%, по меньшей мере на около 45%, по меньшей мере на около 50%, по меньшей мере на около 55%, по меньшей мере на около 60%, по меньшей мере на около 65%, по меньшей мере на около 70%, по меньшей мере на около 75%, по меньшей мере на около 80%, по меньшей мере на около 85%, по меньшей мере на около 90%, по меньшей мере на около 95%, по меньшей мере на около 96%, по меньшей мере на около 97%, по меньшей мере на около 98%, по меньшей мере на около 99% иденти
- 2 043746 чен аминокислотной последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 15.
В контексте настоящего изобретения авторы изобретения идентифицировали усовершенствованные генетически сконструированные варианты ТКР R4P3F9 к COL6A3, включающие последовательности CDR1 с мутациями в альфа- и бета-цепи(ях), которые улучшают стабильность, способность к распознаванию и селективность исходного R4P3F9. Выбор этих зрелых вариантов ТКР проводили с помощью двухэтапного способа, в котором на первом этапе происходит выбор вариантов по стабильности, а на втором - по аффинности (см. примеры). Поскольку ТКР по изобретению включают участки CDR1 с мутациями, скорее всего, CDR2 и/или CDR3 может также иметь мутацию в целях увеличения аффинности специфичности и/или селективности связывания, и такие мутированные CDR могли бы быть в идеальном случае включены в существующие структуры.
За счет аффинной зрелости были идентифицированы варианты со значительно более сильной активностью связывания по отношению к HLA-A*02/COL6A3-пептид при сохранении или даже улучшении специфичности. По сравнению с исходным ТКР C-1 (ТКР R4P3F9, включающий CDR дикого типа, см. табл. 5) у всех вариантов по изобретению улучшилось высвобождение IFN-гамма с достижением более высоких уровней уже при более низких концентрациях нагружаемого пептида.
Внутри вариабельного домена CDR1 и CDR2 расположены в вариабельном домене (V) полипептидной цепи, и CDR3 включает некоторые из V-доменов, все сегменты разнообразия (D) и соединительные сегменты (J). Предполагается, что CDR3 является наиболее вариабельным и основным CDR, отвечающим за специфическое и селективное распознавание антигена. Как ни удивительно, в случае некоторых CDR1 рецепторов ТКР, по-видимому, также контактирует пептид и, таким образом, также отвечает за селективное распознавание. В данном случае, без привязки к какой-либо конкретной теории, мутированный CDR1b, по-видимому, взаимодействует с позицией 8 комплекса COL6A3-пептид.
Встречающиеся в природе альфа-бета гетеродимерные TCR имеют альфа-цепь и бета-цепь. Каждая альфа-цепь включает вариабельные, соединительные и константные сегменты, а бета-цепь обычно также включает между вариабельными и соединительными сегментами короткий сегмент разнообразия, однако этот сегмент разнообразия часто рассматривается как часть соединительного сегмента. Каждая вариабельная область включает три участка CDR (Complementarity Determining Regions, участки, определяющие комплементарность), внедренных в каркасную последовательность, один из них является гипервариабельным участком, называемым CDR3. Имеется несколько видов вариабельных областей (Va) альфацепи и несколько видов вариабельных областей (νβ) бета-цепи, различаемых по их каркасным областям, последовательностям CDR1 и CDR2, и по - отчасти определенной - последовательности CDR3. В номенклатуре IMGT (международная иммуногенетическая информационная система) виды Va обладают уникальным номером TRAV, виды νβ - уникальным номером TRBV.
Предпочтительно, если антигенраспознающая структура согласно изобретению включает соответствующие последовательности с CDR1 по CDR3 одной отдельной раскрытой в данном документе модифицированной вариабельной области ТКР согласно изобретению. Предпочтительными являются антигенраспознающие структуры (например, αβ и γδ ТКР) по изобретению, которые включают по меньшей мере одну, предпочтительно две последовательности CDR1 с созревшей аффинностью.
Варианты CDR, раскрываемые в данном описании, в частности варианты CDR1, могут быть модифицированы путем замены одного или нескольких остатков в различных, возможно селективных, участках пептидной цепи, если не заявлено иное. Такие замены носят консервативный характер, когда одна аминокислота заменяется аминокислотой с похожей структурой и характеристиками, как это происходит при замене гидрофобной аминокислоты на другую гидрофобную аминокислоту. Еще более консервативной будет замена аминокислот одинакового или похожего размера и химического характера, как, например, при замене лейцина на изолейцин. В исследованиях вариаций последовательностей внутри семейств встречающихся в природе гомологичных белков определенные замены аминокислот допускаются чаще, чем другие, и они часто связаны со сходствами по размеру, заряду, полярности и гидрофобности между исходной аминокислотой и ее заменой; и это является основой определения консервативных замен. Предпочтительные консервативные замены определены в контексте настоящего описания как обмены внутри одной из последующих пяти групп:
группа 1 - малые, алифатические, неполярные или слабополярные остатки (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly);
группа 2 - полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды (Asp, Asn, Glu, Gln);
группа 3 - полярные, положительно заряженные остатки (His, Arg, Lys);
группа 4 - крупные, алифатические, неполярные остатки (Met, Leu, Ile, Val, Cys);
группа 5 - крупные, ароматические остатки (Phe, Tyr, Trp).
Менее консервативные замены могут охватывать замену одной аминокислоты другой, имеющей похожие характеристики, но отличающейся в какой-то степени по размеру, как в случае замены аланина остатком изолейцина.
Понятия специфичность, или специфичность к антигену, или специфичный к данному антигену, используемые в настоящем контексте, означают, что антигенраспознающая структура может специфически связываться с указанным антигеном, предпочтительно антигеном COL6A3, более предпочти
- 3 043746 тельно с высокой авидностью, когда указанный антиген представляется в комплексе с HLA, предпочтительно с HLA A2. Например, можно считать, что ТКР, представленный в качестве антигенраспознающей структуры, имеет антигенную специфичность к антигенам COL6A3, если T-клетки, экспрессирующие ТКР в ответ на HLA, презентирующий COL6A3, секретируют по меньшей мере 200 пг/мл или более (например, 250 пг/мл или более, 300 пг/мл или более, 400 пг/мл или более, 500 пг/мл или более, 600 пг/мл или более, 700 пг/мл или более, 1000 пг/мл или более, 2000 пг/мл или более, 2500 пг/мл или более, 5000 пг/мл или более) интерферона γ (IFN-γ) при совместном культивировании с клетками-мишенями HLA A2, нагруженными низкой концентрацией антигена COL6A3, такого как эпитопы COL6A3 и антигены, предложенной в настоящем контексте (например, около 10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 моль/л). Альтернативно или дополнительно, можно считать, что ТКР имеет антигенную специфичность к COL6A3, если T-клетки, экспрессирующие ТКР, секретируют по меньшей мере в два раза больше IFN-γ по сравнению с фоновым уровнем IFN-γ в нетрансдуцированных клетках при совместном культивировании с клетками-мишенями, нагруженными низкой концентрацией антигена COL6A3. Анализ такой специфичности, описанной выше, можно провести, например, с помощью метода ELISA.
В одном альтернативном или дополнительном варианте осуществления изобретения антигенраспознающая структура является стабильной и способной специфически и/или селективно связывается с антигеном COL6A3; предпочтительно, если антиген COL6A3 является эпитопом или пептидом белка с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1, или ее вариантом, где вариант содержит делецию, добавление, вставку или замену аминокислоты не более чем в трех, предпочтительно двух и наиболее предпочтительно не более чем в одной аминокислотной позиции.
Под термином селективность или селективное распознавание/связывание понимается свойство антигенраспознающей структуры, такой как ТКР или антитело, селективно распознавать или связываться предпочтительно только с одним специфическим эпитопом и предпочтительно не проявлять или по существу не проявлять перекрестного взаимодействия с другим эпитопом. Предпочтительно селективность или селективное распознавание/связывание означает, что антигенраспознающая структура (например, ТКР) селективно распознает или связывается предпочтительно только с одним специфическим эпитопом и предпочтительно не проявляет или по существу не проявляет перекрестного взаимодействия с другим эпитопом, где указанный эпитоп является уникальным для одного белка, так что антигенраспознающая структура не проявляет или по существу,не проявляет перекрестного взаимодействия с другим эпитопом и другим белком.
Антигенраспознающая структура в соответствии с изобретением предпочтительно выбрана из антитела, или его производного, или его фрагмента, биспецифической молекулы или T-клеточного рецептора (ТКР), или его производного, или его фрагмента. Производное или его фрагмент антитела или ТКР по изобретению предпочтительно сохраняет способность связываться/распознавать антиген, свойственную родительской молекуле, в частности ее специфичность и/или селективность, как поясняется выше.
В одном из вариантов осуществления изобретения полученные методом генной инженерии ТКР по изобретению способны распознавать антигены COL6A3 за счет главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса. Понятие за счет главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса в контексте настоящего изобретения обозначает, что ТКР вызывает иммунный ответ при связывании с пептидными антигенами COL6A3 в контексте молекулы MHC I класса. Молекула MHC I класса может быть любой молекулой MHC I класса, известной в этой области техники, например молекулами HLA-A. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекула MHC I класса является молекулой HLA-A2.
В изобретении предложены как одноцепочечная антигенраспознающая структура, так и двухцепочечные распознающие структуры, а также другие варианты молекул. В изобретении, в частности, в качестве антигенраспознающей структуры предложен сконструированный ТКР, или его фрагмент, или его производное. Предпочтительно, если это сконструированный ТКР человеческого происхождения, что подразумевает, что он получен из локуса человеческого ТКР и, таким образом, включает последовательности человеческого ТКР. Кроме того, ТКР по изобретению характеризуется как ТКР, обладающий зрелой аффинностью, который способен специфически и селективно распознавать пептидный антиген COL6A3.
В другом варианте осуществления изобретения дополнительно или в качестве альтернативы предложена антигенраспознающая структура, описанная выше, которая вызывает иммунный ответ, предпочтительно, где иммунный ответ характеризуется увеличением уровней интерферона (ИФН)-гамма.
ТКР по изобретению могут быть предложены в виде одноцепочечных α или β или γ или δ, молекул или в качестве альтернативы в виде двухцепочечной структуры, состоящей из обеих цепей, α- и β-цепи, или γ- и δ-цепи.
Наиболее предпочтительно в некоторых дополнительных вариантах осуществления, в которых изобретение относится к антигенраспознающим структурам, включающим любую одну, две или все области CDR1 по CDR3 раскрытых в настоящем описании сконструированных цепей ТКР (см. табл. 1). Предпочтительными антигенраспознающими структурами могут быть такие, что включают природную или сконструированную последовательность CDR, имеющую три, два и предпочтительно только один модифици
- 4 043746 рованный аминокислотный остаток. Модифицированный аминокислотный остаток может быть выбран из вставки, делеции или замены аминокислоты. Наиболее предпочтительно, когда все три, два, предпочтительно один модифицированный аминокислотный остаток являются первым или последним аминокислотным остатком соответствующей последовательности CDR. Если модификация является заменой, тогда в некоторых вариантах осуществления предпочтительно, чтобы замена была консервативной заменой аминокислоты.
ТКР согласно изобретению могут дополнительно включать константную область, полученную от любых подходящих видов, таких как любое млекопитающее, например человек, крыса, обезьяна, кролик, осел или мышь. В одном варианте осуществления изобретения ТКР согласно изобретению дополнительно включают константную область человека. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления константная область ТКР по изобретению может быть незначительно модифицирована, например, за счет введения гетерологичных последовательностей, предпочтительно, последовательностей мыши, что может повышать экспрессию и стабильность ТКР.
Также могут быть внедрены и другие стабилизирующие мутации, известные из уровня техники (например, DE 102016123893.7), например замена неблагоприятных аминокислот в V-сегментах и/или введение дисульфидного мостика между C-доменами ТКР и удаление неспаренных цистеинов.
В контексте настоящего описания понятия мышиный или человеческий, когда они относятся к антигенраспознающей структуре, или к ТКР, или к любому из компонентов ТКР, описанных в настоящем контексте (например, участок, определяющий комплементарность (CDR), вариабельная область, константная область, α-цепь и/или β-цепь), обозначают ТКР (или его компонент), который получен из локуса мышиного или человеческого ТКР без перегруппировок соответственно.
В одном варианте осуществления изобретения предложены химерные ТКР, где цепи ТКР включают последовательности нескольких биологических видов. Предпочтительно, когда ТКР согласно изобретению может включать α-цепь, включающую человеческую вариабельную область α-цепи и, например, мышиную константную область α-цепи ТКР мыши.
В одном варианте осуществления ТКР по изобретению является человеческим ТКР, включающим человеческие вариабельные области в соответствии с представленными выше вариантами осуществления и человеческие константные области.
ТКР по изобретению может быть предложен в виде одноцепочечного ТКР. Одноцепочечный ТКР может включать полипептид вариабельной области первой цепи ТКР (например, альфа-цепи) и полипептид всей (полной длины) второй цепи ТКР целиком (например, бета-цепи), или наоборот. Более того, одноцепочечный ТКР может, необязательно, включать один или несколько линкеров, которые соединяют два или более полипептидов друг с другом. Линкер может быть, например, пептидом, который соединяет вместе две одиночные цепи согласно описанию в данном документе. Также предложен такой одноцепочечный ТКР по изобретению, который слит с человеческим цитокином, таким как ИЛ-2, ИЛ-7 или ИЛ-15.
Антигенраспознающая структура в соответствии с изобретением может быть также предложена в форме мультимерного комплекса, включающего по меньшей мере две молекулы одноцепочечных ТКР, где каждая из указанных молекул одноцепочечных ТКР слита по меньшей мере с одним биотиновым компонентом и где указанные одноцепочечные ТКР соединены между собой за счет взаимодействия биотин-стрептавидин, позволяя образовываться указанному мультимерному комплексу. Возможными являются также похожие подходы для получения мультимерных ТКР, и они включены в настоящее изобретение. Также предложены мультимерные комплексы более высокого порядка, включающие более чем два двухцепочечных ТКР по изобретению.
В целях настоящего изобретения ТКР является компонентом, имеющим по меньшей мере один вариабельный домен альфа- или гамма-цепи ТКР и/или вариабельный домен бета- или дельта-цепи ТКР. В основном они включают как альфа-вариабельный домен ТКР, так и бета-вариабельный домен ТКР. Они могут быть гетеродимерами αβ или могут быть в форме отдельной цепи. Для применения в рамках адоптивной терапии αβ-гетеродимерные ТКР могут быть, например, трансфицированы как цепи полной длины, имеющие как цитоплазматические, так и трансмембранные домены. По желанию может присутствовать введенная дисульфидная связь между остатками соответствующих константных доменов.
В предпочтительном варианте осуществления антигенраспознающая структура является ТКР человека, или его фрагментом, или его производным. ТКР человека, или его фрагмент, или его производное является ТКР, который включает свыше 50% соответствующей последовательности ТКР человека. Предпочтительно, если только малая часть последовательности ТКР искусственного происхождения или получена от других видов. Тем не менее известно, что преимущества имеют химерные ТКР, например, человеческого происхождения с мышиными последовательностями в константных доменах. Поэтому особенно предпочтительным является ТКР в соответствии с настоящим изобретением, который содержит мышиные последовательности во внеклеточной части их константных доменов.
Таким образом, также предпочтительным является то, что антигенраспознающая структура по изобретению способна распознавать свой пептидный антиген по зависимому от человеческого лейкоцитар- 5 043746 ного антигена (HLA) механизму, предпочтительно по HLA-A02-3aeucuMOMy механизму. Понятие по
HLA-зависимому механизму в контексте настоящего описания означает, что антигенраспознающая структура связывается с антигеном только в том случае, если антигенный пептид презентируется указанным HLA.
Антигенраспознающая структура в соответствии с изобретением в одном варианте осуществления предпочтительно индуцирует иммунный ответ, предпочтительно где иммунный ответ характеризуется повышением уровней интерферона (ИФН)-гамма.
Понятие полипептид в контексте настоящего описания включает олигопептиды и относится к одиночной цепи аминокислот, связанных одной или несколькими пептидными связями. В отношении полипептидов по изобретению функциональный участок может быть любым участком, включающим смежные аминокислоты ТКР (или его функционального варианта), частью которого он является, при условии, что функциональный участок специфически связывается с антигеном COL6A3, предпочтительно, как раскрыто в настоящем описании в табл. 1. Понятие функциональный участок, когда оно используется в отношении ТКР (или его функционального варианта), относится к любой части или фрагменту ТКР (или его функционального варианта) по изобретению, часть или фрагмент которого сохраняет биологическую активность ТКР (или его функционального варианта), частью которого он является (исходный ТКР или его исходный функциональный вариант). Функциональные участки охватывают, например, те части ТКР (или его функционального варианта), которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном COL6A3 (по HLA-A2-зависимомy механизму) или выявлять, лечить или предотвращать рак в подобной степени, в равной степени или в большей степени, чем исходный ТКР (или его функциональный вариант).
Функциональный участок может включать дополнительные аминокислоты на аминном или карбоксильном конце участка или на обоих концах, на которых дополнительные аминокислоты не обнаруживаются в аминокислотной последовательности исходного ТКР или его функционального варианта. Желательно, чтобы дополнительные аминокислоты не мешали осуществлению биологической функции функционального участка, например специфическому связыванию с антигенами COL6A3; и/или имеющейся способности выявлять рак, лечить или предотвращать рак и т.д. Более желательно, чтобы дополнительные аминокислоты усиливали биологическую активность по сравнению с биологической активностью исходного ТКР или его функционального варианта.
Как уже упоминалось выше, функциональность по связыванию ТКР по изобретению может быть обеспечена за счет каркаса антитела. Понятие антитело в своих различных грамматических формах используется в настоящем контексте для обозначения молекул иммуноглобулина и иммунологически активных участков молекул иммуноглобулина, т.е. молекул, которые содержат антигенсвязывающий центр или паратоп. Такие молекулы называются также антигенсвязывающие фрагменты молекул иммуноглобулина. В изобретении далее предложено антитело или его антигенсвязывающий участок, который специфически связывается с антигенами, описанными в настоящем документе. Антитело может быть иммуноглобулином любого вида, известного из уровня техники. Например, антитело может быть любого изотипа, например IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и т.д. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть встречавшимся в природе антителом, например антителом, выделенным и/или очищенным из клеток млекопитающего, например мыши, кролика, козы, лошади, курицы, хомяка, человека и т.д. В качестве альтернативы антитело может быть получено методами генной инженерии, например, гуманизированным антителом или химерным антителом. Антитело может быть в форме мономера или полимера.
В изобретении также предложены антигенсвязывающие участки любого из антител, описанных в данном контексте. Антигенсвязывающий участок может быть любым участком, который имеет по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, такой как Fab, F(ab')2, dsFv, scFv, диатела и триатела. Одноцепочечный фрагмент вариабельной области (scFv) антитела, который состоит из усеченного фрагмента Fab, включающего вариабельный домен (V) тяжелой цепи антитела, связанного с V-доменом легкой цепи антитела с помощью синтетического пептида, может быть получен с помощью стандартных методик рекомбинантных ДНК. Подобным образом стабилизированные дисульфидной связью фрагменты вариабельной области (dsFv) могут быть получены по технологии рекомбинантных ДНК, фрагменты антител по изобретению тем не менее не ограничены этими отдельными типами фрагментов антител. Также антитело или его антигенсвязывающий участок могут быть модифицированы таким образом, чтобы включать поддающуюся обнаружению метку, такую как, например, радиоизотоп, флуорофор (например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE)), фермент (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена) и частицы элементов (например, частицы золота).
Подходящие способы получения антител известны из уровня техники. Например, стандартные гибридомные технологии описаны, например, в работе Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51:1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) и C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)). В качестве альтернативы другие способы, такие как технологии гибридомы EBV (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984) и Roder et al., Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)) и векторные системы экспрессии на основе
- 6 043746 бактериофагов (см., например, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)), известны из уровня техники.
Кроме того, способы получения антител у животных нечеловеческого происхождения описаны, например, в патентах США № 5545806, 5569825 и 5714352 и патентной заявке США № 2002/0197266.
Некоторые варианты осуществления изобретения также относятся к ТКР или их функциональным фрагментам и их полипептидам, которые являются растворимыми ТКР. В контексте настоящего описания понятие растворимый T-клеточный рецептор относится к одноцепочечным или гетеродимерным усеченным вариантам природных ТКР, которые включают по меньшей мере вариабельные домены α-цепи и β-цепи ТКР, связанные полипептидным линкером (SEQ ID NO: 22, 24, 25 и 27). У растворимых вариантов ТКР, как правило, отсутствуют по меньшей мере трансмембранные и цитозольные домены природного белка; иногда такие растворимые структуры предпочтительно не содержат никакие последовательности константных доменов. Структуры растворимого T-клеточного рецептора по изобретению в предпочтительных вариантах осуществления включают структуры, состоящие из последовательностей вариабельных доменов α- и β-цепи, предложенных в настоящем контексте, соединенных с помощью подходящей линкерной последовательности. Последовательность вариабельного домена (аминокислот или нуклеиновых кислот) α-цепи и β-цепи растворимого ТКР может быть идентичной соответствующим последовательностям природного ТКР или может включать варианты последовательностей α-цепи и β-цепи вариабельного домена растворимого ТКР по сравнению с соответствующими последовательностями природного ТКР. Понятие растворимый T-клеточный рецептор, используемое в настоящем контексте, включает растворимые ТКР с вариантными или невариантными последовательностями α-цепи и β-цепи вариабельного домена растворимого ТКР. Вариации могут быть в каркасных и/или CDR-областях последовательностей вариабельных доменов α-цепи и β-цепи растворимого ТКР и могут включать, но без ограничения, мутации аминокислотной делеции, вставки, замены, а также изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, которые не изменяют аминокислотную последовательность. Растворимый ТКР по изобретению в любом случае сохраняет или преимущественно улучшает функциональность своих исходных молекул ТКР по связыванию.
Обозначенная выше проблема решена также с помощью нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенраспознающую структуру по изобретению или любую из упомянутых ранее белковых или полипептидных структур. Нуклеиновая кислота предпочтительно может (а) имеет нить, кодирующую антигенраспознающую структуру в соответствии с изобретением; (б) имеет нить, комплементарную по отношению к нити из (а); или (в) имеет нить, которая при жестких условиях гибридизируется с молекулой, описанной в (а) или (б). Жесткие условия известны специалисту в данной области, в частности, из работы Sambrook и соавт., Molecular Cloning. Кроме того, нуклеиновая кислота необязательно имеет дополнительные последовательности, которые необходимы для экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей белку, в особенности для экспрессии в клетке млекопитающего/человека. Используемая нуклеиновая кислота может быть включена в вектор, пригодный для осуществления экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующей полипептиду, в клетке. Тем не менее нуклеиновые кислоты могут также использоваться для трансформации антигенпрезентирующей клетки, которые не ограничиваются классическими антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, таким образом, что они сами образуют соответствующие белки на их клеточной поверхности.
Понятие нуклеиновая кислота в настоящем контексте включает полинуклеотид, олигонуклеотид и молекулу нуклеиновой кислоты и в общем обозначает полимер ДНК или РНК, который может быть одноцепочечным или двухцепочечным, синтезированным или полученным (например, выделенным и/или очищенным) из природных источников, который может содержать встречающиеся в природе, не встречающиеся в природе или измененные нуклеотиды и может содержать встречающуюся в природе, не встречающуюся в природе или измененную межнуклеотидную связь, такую как фосфороамидатную связь или фосфоротиоатную связь вместо фосфодиэфирной, существующей между нуклеотидами немодифицированного олигонуклеотида.
Предпочтительно, если нуклеиновые кислоты по изобретению являются рекомбинантными. В настоящем контексте понятие рекомбинантный означает (i) молекулы, конструкции которых получены вне живых клеток за счет соединения фрагментов встречающихся в природе или синтетических нуклеиновых кислот с молекулами нуклеиновых кислот, которые могут реплицироваться в живой клетке; или (ii) молекул, полученных в результате репликации тех, что описаны выше в (i). В целях настоящего изобретения репликация может быть репликацией in vitro или репликацией in vivo. Нуклеиновая кислота может включать любую нуклеотидную последовательность, которая кодирует любой из ТКР, полипептидов или белков или их функциональных фрагментов или функциональных вариантов, описанных в настоящем контексте.
Кроме того, в изобретении предложен вектор, включающий нуклеиновую кислоту в соответствии с изобретением, как описано выше. Желательно, чтобы вектор являлся вектором экспрессии или рекомбинантным вектором экспрессии. Понятие рекомбинантный вектор экспрессии в контексте настоящего изобретения относится к нуклеиново-кислотной конструкции, которая делает возможной экспрессию
- 7 043746 мРНК, белка или полипептида в подходящей клетке-хозяине. Рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению может быть любым подходящим рекомбинантным вектором экспрессии и может быть использован для трансформации или трансфекции любого подходящего хозяина. Подходящие векторы включают такие векторы, которые сконструированы для распространения и размножения или для экспрессии или того и другого, такие как плазмиды и вирусы. Примеры векторов экспрессии животных включают pEUK-Cl, pMAM и pMAMneo. Предпочтительно, когда рекомбинантный вектор экспрессии является вирусным вектором, например, ретровирусным вектором. Рекомбинантный вектор экспрессии включает регуляторные последовательности, такие как инициации транскрипции и трансляции и терминирующие кодоны, которые являются специфическими для вида клетки-хозяина (например, бактериальная, грибная, растительная или животная), в которую необходимо ввести вектор и в которой может быть осуществлена экспрессия нуклеиновой кислоты по изобретению. Кроме того, вектор согласно изобретению может включать один или более маркерный ген, который позволяет производить выбор трансформированных или трансфицированных хозяев. Рекомбинантный вектор экспрессии может включать нативный или нормальный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей структуры по изобретению или с нуклеотидной последовательностью, которая является комплементарной по отношению к или которая гибридизируется с нуклеотидной последовательностью, кодирующей структуры по изобретению. Выбор промоторов включает, например, сильные, слабые, индуцируемые, специфические для тканей и органов промоторы. Промотор может быть вирусного или невирусного происхождения. Рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут быть сконструированы для кратковременной или устойчивой экспрессии или обоих видов. Также рекомбинантные векторы экспрессии могут быть сконструированы для конститутивной экспрессии или для индуцируемой экспрессии.
Изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей антигенраспознающую структуру в соответствии с изобретением. В частности, клетка-хозяин по изобретению содержит нуклеиновую кислоту или вектор, как описано в данном контексте выше. Клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, например клеткой растения, животного, грибов или водорослей, или может быть прокариотической клеткой, например клеткой бактерий или простейших. Клетка-хозяин может быть клеткой из культуры или первичной клеткой, т.е. выделенной непосредственно из организма, например, человека. Клеткахозяин может быть прилипающей клеткой или суспендированной клеткой, т.е. клеткой, выращиваемой в суспензии. В целях получения рекомбинантного ТКР, полипептида или белка клетка-хозяин предпочтительно является клеткой млекопитающего, например клеткой яичника китайского хомяка (CHO). Наиболее предпочтительно, чтобы клетка-хозяин являлась клеткой человека. Хотя клетка-хозяин может быть клеткой любого вида, может быть получена из любого вида ткани и может находиться на любой стадии развития, предпочтительно, чтобы клетка-хозяин являлась лейкоцитом периферической крови (ЛПК) или мононуклеарной клеткой периферической крови (МКПК). Более предпочтительно, если клетка-хозяин является T-клеткой. T-клетка может быть любой T-клеткой, такой как T-клетка из культуры клеток, например первичной T-клеткой, или T-клеткой из культуры линии T-клеток, например Jurkat, SupT1 и т.д., или T-клеткой, полученной из организма млекопитающего, предпочтительно T-клеткой или предшественником T-клетки организма пациента-человека. Если T-клетка получена из организма млекопитающего, то она может быть получена из многочисленных источников, включая кровь, костный мозг, лимфатический узел, вилочковую железу или другие ткани или жидкости, но без ограничения перечисленным. Tклетки также могут быть обогащены или очищены. Предпочтительно, если T-клетка является T-клеткой человеческого происхождения. Более предпочтительно, если T-клетка является T-клеткой, выделенной из человеческого организма. T-клетка может быть T-клеткой любого вида и любой стадии развития, включая CD4-положительные и/или CD8-положительные, CD4-положительные хелперные T-клетки, например клетки Th1 и Th2, CD8-положительные T-клетки, например цитотоксические T-клетки), инфильтрующие опухоль клетки (TIL), T-клетки памяти, наивные T-клетки и т.п., но без ограничения перечисленным. Предпочтительно, если T-клетка является CD8-положительной T-клеткой или CD4-положительной T-клеткой.
Предпочтительно, если клетка-хозяин по изобретению является лимфоцитом, предпочтительно T-лимфоцитом, таким как CD4-положительнαя или CD8-положительная T-клетка. Клетка-хозяин, кроме того, предпочтительно является опухолереактивной T-клеткой, специфической для опухолевых клеток, экспрессирующих COL6A3.
В еще одном другом аспекте настоящее изобретение относится к предложенным в настоящем контексте антигенраспознающим структурам, нуклеиновым кислотам, векторам, фармацевтическим композициям и/или клетке-хозяину для применения в медицине. Применение в медицине в одном предпочтительном варианте осуществления включает применение в диагностике, предупреждении и/или лечении опухолевого заболевания, такого как злокачественное или доброкачественное опухолевое заболевание. Опухолевое заболевание является, например, опухолевым заболеванием, характеризующимся экспрессией COL6A3 в раковой или опухолевой клетке указанного опухолевого заболевания.
В отношении у помянутого медицинского применения антигенраспознающих структур и других материалов, полученных из них, подлежащее лечению и/или диагностике раковое заболевание может
- 8 043746 быть любым видом рака, включая любое из заболеваний: острый лимфоцитарный рак, острый миелолейкоз, альвеолярная рабдомиосаркома, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, рак анального отверстия, анального канала или аноректальной области, рак глаза, рак внутрипеченочных желчных протоков, рак суставов, рак шеи, желчного пузыря или плевры, рак носа, полости носа или среднего уха, рак полости рта, рак влагалища, рак вульвы, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоидный рак, рак толстой кишки, рак пищевода, рак шейки матки, гастроинтестинальная карциноидная опухоль, глиома, ходжкинская лимфома, рак гортаноглотки, рак почки, рак гортани, рак печени, рак легких, злокачественная мезотелиома, меланома, множественная миелома, рак носоглотки, неходжкинская лимфома, рак ротоглотки, рак яичника, рак пениса, рак поджелудочной железы, брюшины, сальника и рак брыжейки, рак глотки, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечный рак, рак кожи, рак тонкой кишкирак мягких тканей, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак матки, рак мочеточника и рак мочевого пузыря. Предпочтительным видом рака является рак шейки матки, ротоглотки, анального отверстия, анального канала, аноректальной области, влагалища, вульвы или пениса. Особенно предпочтительным видом рака является COL6A3-положительный рак, включая гастроинтестинальный рак и рак желудка.
Структуры, белки, антитела к ТКР, полипептиды и нуклеиновые кислоты по изобретению предназначены, в частности, для применения в иммунной терапии, предпочтительно в адоптивной T-клеточной терапии. Введение соединений по изобретению может, например, включать инфузию T-клеток по изобретению указанному пациенту. Предпочтительно, если такие T-клетки являются аутологичными клетками пациента, трансдуцированными in vitro нуклеиновой кислотой или антигенраспознающей структурой согласно настоящему изобретению.
В заявке WO 2016/011210 предложены клетки, сконструированные для адоптивной терапии, в том числе NK-клетки и T-клетки, и композиции, содержащие эти клетки, а также способы их введения субъектам. Эти клетки могут содержать полученные методами генной инженерии антигенные рецепторы, которые специфически связываются с антигенами, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR) и костимулирующие рецепторы.
Задача изобретения также решена за счет предложения способа получения линии клеток, экспрессирующей COL6A3-специфичную антигенраспознающую структуру, включающего:
а) обеспечение подходящей клетки-хозяина;
б) обеспечение генетической конструкции, включающей кодирующую последовательность, кодирующую антигенраспознающую структуру в соответствии с любым из пп.1-4;
в) внесение указанной генетической конструкции в указанную подходящую клетку-хозяина и
г) экспрессию указанной генетической конструкции указанной подходящей клеткой-хозяином.
Способ может далее включать этап презентации указанной антигенраспознающей структуры на поверхности указанной подходящей клетки-хозяина.
В других предпочтительных вариантах осуществления генетическая конструкция является экспрессионной конструкцией, включающей промоторную последовательность, функционально связанную с указанной кодирующей последовательностью.
Предпочтительно, если указанная антигенраспознающая структура происходит от млекопитающего, предпочтительно от человека. Предпочтительная подходящая клетка-хозяин для применения в способе по изобретению является клеткой млекопитающего, такой как клетка человека, в частности T-лимфоцит человека. T-клетки для применения в изобретении описаны в настоящем контексте выше.
Изобретение включает также варианты осуществления, где указанная антигенраспознающая структура является модифицированным ТКР, где указанная модификация представляет собой добавление функциональных доменов, таких как метка или терапевтически активная субстанция. Кроме того, предложены ТКР с альтернативными доменами, такими как альтернативный мембранный якорный домен вместо эндогенной трансмембранной области.
Желательно, если система трансфекции для введения генетической конструкции в указанную подходящую клетку-хозяина является ретровирусной векторной системой. Такие системы хорошо известны для опытного специалиста.
В настоящее изобретение также включен в одном варианте осуществления дополнительный этап способа - выделения и очистки антигенраспознающей структуры из клетки и, необязательно, восстановления транслированных фрагментов антигенраспознающей структуры в T-клетке.
В альтернативном аспекте изобретения предложена T-клетка, полученная или которую можно получить способом получения T-клеточного рецептора (ТКР), который специфичен для опухолевых клеток и обладает высокой авидностью, как это описывалось ранее в настоящем контексте. Такая T-клетка зависит от клетки-хозяина, используемой в способе по изобретению, например, T-клетка человеческого или нечеловеческого происхождения, предпочтительно, ТКР человеческого происхождения.
ТКР, полипептиды, белки, (в том числе их функциональные варианты), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные векторы экспрессии, клетки-хозяева (в том числе их популяции) и антитела (в том числе их антигенсвязывающие фрагменты) по изобретению могут быть выделены и/или очищены. Понятие выделенный, используемое в настоящем контексте, означает удаление из естественного окружения.
- 9 043746
Понятие очищенный, используемое в настоящем контексте, означает увеличение степени чистоты, причем чистота является относительным понятием и не должно обязательно истолковываться как абсолютная чистота. Например, чистота может быть по меньшей мере около 50, может быть более 60, 70,
80, 90, 95 или может быть 10о%.
Антигенраспознающие структуры, ТКР, полипептиды, белки (в том числе их функциональные варианты), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные векторы экспрессии, клетки-хозяева (в том числе их популяции) и антитела (в том числе их антигенсвязывающие фрагменты) по изобретению, все из которых далее именуются совместно ТКР-материалы по изобретению, могут быть в составе композиции, такой как фармацевтическая композиция. В этом отношении в изобретении также предложена фармацевтическая композиция, включающая любые из антигенраспознающих структур, ТКР, полипептидов, белков, функциональных фрагментов, функциональных вариантов, нуклеиновых кислот, векторов экспрессии, клеток-хозяев (в том числе их популяции) и антител (в том числе их антигенсвязывающие фрагменты), описанных в настоящем контексте, и фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество и/или стабилизатор. Фармацевтические композиции по изобретению, содержащие любой из ТКРматериалов по изобретению, могут включать более чем один ТКР-материал по изобретению, например полипептид и нуклеиновую кислоту или два или более различных ТКР (в том числе их функциональные фрагменты и функциональные варианты). Альтернативно, фармацевтические композиции могут включать ТКР-материал по изобретению в комбинации с другим(и) фармацевтически активным(и) веществом(ами) или лекарственным(и) средством(ами), таким как химиотерапевтические средства, например аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фтороурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.д. Предпочтительно, если носитель является фармацевтически приемлемым носителем. В отношении фармацевтических композиций носитель может быть любым из обычно используемых для конкретного рассматриваемого ТКР-материала по изобретению. Такие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны специалистам данной области и являются общедоступными. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемый носитель был таким, который в условиях применения не имеет негативных побочных эффектов или токсичности.
Таким образом, также предложена фармацевтическая композиция, включающая любой из описанных в контексте продуктов по изобретению и ТКР-материалов по изобретению, в особенности любые белки, нуклеиновые кислоты или клетки-хозяева. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция предназначена для иммунной терапии, предпочтительно для адоптивной клеточной терапии.
Предпочтительно, чтобы ТКР-материал по изобретению вводился с помощью инъекции, например, внутривенно. Если ТКР-материал по изобретению является клеткой-хозяином, экспрессирующей ТКР по изобретению (или его функциональный вариант), фармацевтически приемлемый носитель для клеток для инъекции может включать любой изотонный носитель, такой как, например, нормальный физиологический раствор (около 0,90% мас./об. NaCl в воде, около 300 мОсм/л NaCl в воде или около 9,0 г NaCl на 1 л воды), электролитный раствор NORMOSOL R (Abbott, Чикаго, Иллинойс, США), PLASMA-LYTE A (Baxter, Дирфилд, Иллинойс, США), около 5% декстрозы в воде или Рингера лактат. В одном варианте осуществления в фармацевтически приемлемый носитель добавлен сывороточный альбумин человека.
В целях настоящего изобретения количество или доза (например, количество клеток, когда ТКРматериал по изобретению является одной или несколькими клетками) вводящегося ТКР-материала по изобретению могут быть достаточными для оказания влияния, например вызвать терапевтический или профилактический ответ, у субъекта или животного в течение приемлемого промежутка времени. Например, доза ТКР-материала по изобретению должна быть достаточной для связывания с раковым антигеном или для выявления, лечения или предупреждения рака в течение периода времени от около 2 ч или дольше, например 12-24 ч или более, начиная с момента введения. В определенных вариантах осуществления период времени может быть даже длиннее. Дозу определяют по эффективности конкретного ТКРматериала по изобретению и состоянию животного (например, человека), а также по весу тела животного (например, человека), подлежащего лечению.
Во внимание принимается тот факт, что фармацевтические композиции по изобретению, ТКР (в том числе их функциональные варианты), полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные векторы экспрессии, клетки-хозяева или популяции клеток могут применяться в способах лечения или предупреждения рака или COL6A3-положительного предопухолевого состояния. ТКР по изобретению (и их функциональные варианты), как считается, специфически связываются с антигеном COL6A3, так что ТКР (или родственный полипептид или белок по изобретению и их функциональные варианты), когда он экспрессируется клеткой, способен опосредовать иммунный ответ по отношению к клетке-мишени, экспрессирующей антигены COL6A3 по изобретению. В этом отношении в изобретении предложен способ лечения или предупреждения состояния, в частности рака, у млекопитающего, включающий введение млекопитающему любых из фармацевтических композиций, антигенраспознающих структур, в частности ТКР (и их функциональных вариантов), полипептидов или белков, описанных в настоящем контексте, любой нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора экспрессии, включающего нуклеотид- 10 043746 ную последовательность, кодирующую любой из ТКР (и их функциональных вариантов), полипептидов, белков, описанных в настоящем контексте, или любой клетки-хозяина или популяции клеток, включающей рекомбинантный вектор, который кодирует любую из структур по изобретению (и их функциональные варианты), полипептиды или белки, описанные в настоящем контексте, в количестве, эффективном для лечения или предупреждения состояния у млекопитающего, где состояние является раком, предпочтительно COL6A3-положительным раком.
Примеры фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, применимых в рамках настоящего изобретения, включают стабилизаторы, такие как СФГА, углеводы (например, сорбит, маннит, крахмал, сахароза, глюкоза, декстран), белки, такие как альбумин или казеин, содержащие белок продукты, такие как бычья сыворотка или обезжиренное молоко, и буферы (например, фосфатный буфер).
Понятия лечить и предупреждать, а также образованные от них слова в контексте настоящего описания необязательно подразумевают 100%-ное или полное излечение или предупреждение. Скорее, это разные степени излечения или предупреждения, которые средний специалист данной области определяет как имеющие потенциальную пользу или терапевтический эффект. В этом отношении способы по изобретению могут обеспечить любую степень любого уровня излечения или предупреждения патологического состояния у млекопитающего. Кроме того, лечение или предупреждение, обеспечиваемые способом по изобретению, могут включать лечение или предупреждение одного или нескольких патологических состояний или симптомов этих состояний, например, рака, подвергающихся лечению или предупреждению. Например, лечение или предупреждение может включать стимуляцию регрессии опухоли. Также в целях настоящего изобретения предупреждение может охватывать замедление развития патологического состояния или его симптома или состояния.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, включающему введение ТКР, нуклеиновой кислоты или клетки-хозяина согласно настоящему описанию в комбинации с по меньшей мере одним химиотерапевтическим препаратом и/или лучевой терапией.
Также предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в нем, включающий:
а) выделение клетки из организма указанного субъекта;
б) трансформацию клетки по меньшей мере одним вектором, кодирующим антигенраспознающую структуру согласно настоящему изобретению, для получения трансформированной клетки;
в) культивирование трансформированной клетки для получения множества трансформированных клеток;
г) введение множества трансформированных клеток указанному субъекту.
Также предложен способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в нем, включающий:
а) выделение клетки из организма здорового донора;
б) трансформацию клетки вектором, кодирующим антигенраспознающую структуру согласно настоящему изобретению, для получения трансформированной клетки;
в) культивирование трансформированной клетки для получения множества трансформированных клеток; и
г) введение множества трансформированных клеток указанному субъекту.
Также предложен способ выявления рака в биологическом образце, включающий:
а) контактирование биологического образца с антигенраспознающей структурой согласно настоящему описанию;
б) выявление связывания антигенраспознающей структуры с биологическим образцом.
В некоторых вариантах осуществления способ выявления рака осуществляется in vitro, in vivo или in situ.
Также предложен способ выявления патологического состояния у млекопитающего. Способ включает (i) контактирование образца, включающего одну или более клеток млекопитающего, с любыми из ТКР (и их функциональными вариантами), полипептидов, белков, нуклеиновых кислот, рекомбинантных векторов экспрессии, клеток-хозяев, популяций клеток, антител или их антигенсвязывающих фрагментов по изобретению или фармацевтическими композициями, описываемыми в настоящем контексте, что ведет к образованию комплекса; и (ii) выявление этого комплекса, причем выявление этого комплекса является индикатором наличия патологического состояния у млекопитающего, где состояние является раковым заболеванием, таким как COL6A3-положительное злокачественное заболевание.
В отношении способа выявления патологического состояния у млекопитающего, образцом клеток может быть образец, содержащий цельные клетки, их лизаты или фракцию лизата цельных клеток, например ядерную или цитоплазматическую фракцию, фракцию цельных белков или фракцию нуклеиновых кислот.
В целях способа выявления по изобретению контактирование по отношению к млекопитающему может проходить in vitro или in vivo. Предпочтительно, если контактирование проходит in vitro.
Выявление комплекса может также осуществляться с помощью любого количества способов, известных из уровня техники. Например, антигенраспознающие структуры (и их функциональные варианты), полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные векторы экспрессии, клетки-хозяева, популяции клеток или антитела или ТКР или их антигенсвязывающие фрагменты, описываемые в на- 11 043746 стоящем контексте, могут быть помечены поддающейся обнаружению меткой, такой как, например, радиоизотоп, флуорофор (например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE)), фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена) и частицы элементов (например, частицы золота).
В целях способов по изобретению, когда вводятся клетки-хозяева или популяции клеток, клетки могут быть клетками, которые являются аллогенными или аутологичными по отношению к млекопитающему. Предпочтительно, если клетки являются аутологичными по отношению к млекопитающему.
В отношении упомянутых ранее видов медицинского применения ТКР-материала согласно изобретению, требующее лечения и/или диагностики раковое заболевание может быть любым раковым заболеванием, включая острый лимфоцитарный рак, острый миелолейкоз, альвеолярная рабдомиосаркома, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, рак анального отверстия, анального канала или аноректальной области, рак глаза, рак внутрипеченочных желчных протоков, рак суставов, рак шеи, желчного пузыря или плевры, рак носа, полости носа или среднего уха, рак полости рта, рак влагалища, рак вульвы, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоидный рак, рак толстой кишки, рак пищевода, рак шейки матки, гастроинтестинальная карциноидная опухоль, глиома, ходжкинская лимфома, рак гортаноглотки, рак почки, рак гортани, рак печени, рак легких, злокачественная мезотелиома, меланома, множественная миелома, рак носоглотки, неходжкинская лимфома, рак ротоглотки, рак яичника, рак пениса, рак поджелудочной железы, брюшины, сальника и рак брыжейки, рак глотки, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечный рак, рак кожи, рак тонкой кишки, рак мягких тканей, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак матки, рак мочеточника и рак мочевого пузыря. Предпочтительным видом рака является рак шейки матки, ротоглотки, анального отверстия, анального канала, аноректальной области, влагалища, вульвы или пениса. Особенно предпочтительным видом рака является COL6A3-положительный рак, такой как гастроинтестинальный рак и рак желудка.
В целом, в изобретении предложен способ лечения субъекта, страдающего от опухоли или опухолевого заболевания, который включает введение антигенраспознающих структур, нуклеиновых кислот, векторов, фармацевтических композиций и/или клетки-хозяина, как раскрыто в настоящем изобретении. Предпочтительно, если субъект является субъектом, которому необходимо такое лечение. Субъект в предпочтительных вариантах осуществления является млекопитающим субъектом, предпочтительно пациентом человеческого происхождения, страдающим от опухоли или опухолевого заболевания, являющегося COL6A3-положительным.
Настоящее изобретение будет далее описано с помощью последующих примеров со ссылкой на сопровождающие фигуры и последовательности, тем не менее, не ограничивая ими изобретение. В соответствии с целями настоящего изобретения все цитируемые источники включены в данное описание во всей полноте путем ссылки. На фигурах и в последовательностях:
На фиг. 1 представлено превращение ТКР в стабилизированный Va/Ve одноцепочечный ТКР (scTv) за счет поверхностного дисплея на основе дрожжей. Молекулы ScTv, представленные на поверхности трансформированных клеток Saccharomyces cerevisiae EBY100, окрашивали антителом к Vbeta1, меченным FITC, и тетрамером HLA-A*02/COL6A3-002, меченным PE. Немодифицированный scTv R4P3F9 (левая секция, SEQ ID NO: 22) сравнивается с клоном scTv с одноточечными мутациями в целях стабилизации каркаса scTv (правая секция), который был получен с помощью отбора из библиотеки случайных мутаций scTv.
На фиг. 2 представлено созревание аффинности scTv с помощью поверхностного дисплея на основе дрожжей. Для стабилизированных молекул scTv, содержащих или не содержащих бета-цепь CDR1 с несозревшей аффинностью, производили окрашивание тетрамерами HLA-A*02, содержащими COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1), и доокрашивание смесью тетрамеров HLA-A*02, содержащей 9 пептидов (SEQ ID NO: 28-36) с высоким сходством последовательностей с COL6A3-002. Стабилизированный scTv (SEQ ID NO 27) с последовательностью бета-цепи CDR1, с не созревшей аффинностью, RSGDLS (SEQ ID NO: 13) сравнивается с клонами scTv, имеющими последовательности бета-цепи CDR1 с созревшей аффинностью, AMDHPY (SEQ ID NO: 40) и ARWHRN (SEQ ID NO: 39).
На фиг. 3 представлены профили элюции, полученные методом эксклюзионной хроматографии для гибридных вариантов анти-CD3 Fab-scTv R4P3F9S с 75-1 по 75-25.
На фиг. 4 представлена кинетика связывания HLA-A*02/COL6A3-002 с анти-CD3 Fab-scTv R4P3F9S в гибридных вариантах с 75-1 по 75-25, измеренная с помощью биослойной интерферометрии. Указаны проанализированные концентрации HLA-A*02/COL6A3-002.
На фиг. 5 показан анализ связывания анти-CD3 Fab-scTv R4P3F9S в гибридных вариантах с 75-1 по 75-25 по измерениям с помощью биослойной интерферометрии (BLI). Анализировали 1 мкМ HLA-A*02 в комплексе с указанными сходными пептидами.
На фиг. 6 представлено сравнение кинетики связывания HLA-A*02/COL6A3-002 и HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID NO: 30) с анти-CD3 Fab-scTv R4P3F9S в различных гибридных вариантах. Указаны проанализированные концентрации молекул Fab-scTv.
На фиг. 7 показано окрашивание меченными ФЭ тетрамерами HLA-A*02/COL6A3-002 T-клеток человека, экспрессирующих вариант ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью. Отсутствие ТКР (имитация) или экспрессию ТКР 1G4, специфичного к NYESO1-001, и окрашивание меченными ФЭ тетрамерами
- 12 043746
HLA-A*02/NYESO1-001 использовали в целях контроля.
На фиг. 8 показано высвобождение IFN-гамма у варианта ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью, экспрессируемого CD8+ T-клетками человека в ответ на COL6A3-002. В целях контроля ТКР не экспрессировали (имитация) или экспрессировали ТКР 1G4, специфичный к NYESO1-001. Высвобождение IFN-гамма определяли методом ELISA после совместного культивирования электропорированных CD8+ T-клеток с клетками T2, нагруженными серийными разведениями COL6A3-002.
На фиг. 9 показано высвобождение IFN-гамма у варианта ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью, экспрессируемого CD8+ T-клетками человека в ответ на COL6A3-002 и различные сходные пептиды. В целях контроля ТКР не экспрессировали (имитация) или экспрессировали ТКР 1G4, специфичный к NYESO1-001. Высвобождение IFN-гамма определяли методом ELISA после совместного культивирования электропорированных CD8+ T-клеток с клетками T2, нагруженными 10 мкМ COL6A3-002 или сходных пептидов.
На фиг. 10 показано окрашивание меченными ФЭ тетрамерами пептид-HLA-A*02 T-клеток человека, экспрессирующих вариант ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью. В целях контроля ТКР не экспрессировали (имитация) или экспрессировали ТКР 1G4, специфичный к NYESO1-001, и проводили окрашивание меченными ФЭ тетрамерами HLA-A*02/NYESO1-001.
На фиг. 11 показано высвобождение IFN-гамма у варианта ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью, экспрессируемого CD8+ T-клетками человека в ответ на COL6A3-002 или COL6A1-001. В целях контроля ТКР не экспрессировали (имитация) или экспрессировали ТКР 1G4, специфичный к NYESO1-001. Высвобождение IFN-гамма определяли методом ELISA после совместного культивирования электропорированных CD8+ T-клеток с клетками T2, нагруженными серийными разведениями COL6A3-002 или COL6A1-001.
На фиг. 12 показано высвобождение IFN-гамма первичными CD8+ T-клетками человека, экспрессирующими варианты ТКР R4P3F9, после совместного культивирования с различными линиями опухолевых клеток. T-клетки линий SF539, SW982 и Hs840 презентируют пептид-мишень на различных уровнях. Клетки MCF-7 не презентируют пептид-мишень. В качестве контролей анализировали эффекторные клетки без экзогенного ТКР вместе с клетками с исследуемым ТКР. Высвобождение IFN-гамма определяли методом ELISA. * Отмечена точка вне масштаба.
Таблица 1 Последовательности пептида по изобретению (положения согласно нумерации IMGT (Frangois Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: human (Homo sapiens) TRAV; IMGT Repertoire. IMGT®, the international ImMunoGenetics information system® http://www.imgt.org.; Создан: 16/03/2011. Версия: 03/06/2016; Frangois Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: human (Homo sapiens) TRBV; IMGT Repertoire. IMGT®, the international ImMunoGenetics information system® http://www.imgt.org.; Создан: 16/03/2011. Версия: 03/06/2016.
SEQ ID NO Название Описание Последовательность
1 COL6A3002 FLLDGSANV
2 R4P3F9 ТКР R4P3F9, MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIAS
альфа альфа-цепь - полной длины LNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRF TAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTF GKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQ TNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQ NLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
3 R4P3F9, альфа, лидерный ТКР R4P3F9, альфа-цепь - лидерный пептид MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ
4 R4P3F9, ТКР R4P3F9, QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSG
альфа, альфа-цепь KSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPS
вариабель ный вариабельны й домен DSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP
5 R4P3F9, CDRal ТКР R4P3F9, альфа-цепь - CDR1 DRGSQS
6 R4P3F9, CDRa2 ТКР R4P3F9, альфа-цепь - CDR2 IYSNGD
7 R4P3F9, CDRa3 ТКР R4P3F9, альфа-цепь - CDR3 CAAYSGAGSYQLT
8 R4P3F9 - ТКР R4P3F9, NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD
альфа, альфа-цепь VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSII
константн - PEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRIL
ый константный домен LLKVAGFNLLMTLRLWSS
9 R4P3F9 альфа, константн ый, начало ТКР R4P3F9, альфа-цепь константный NIQN
- 13 043746
домен, начало
10 R4P3F9, бета ТКР R4P3F9, бета-цепь полной длины MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLR CSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILER FSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFG SGTRLTWEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLA TGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRY CLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAK PVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKA Т LYAVLVSALVLMAMVKRKD F
11 R4P3F9, бета, лидерный ТКР R4P3F9, бета-цепь лидерный пептид MGFRLLCCVAFCLLGAGPV
12 R4P3F9, бета, вариабель ный ТКР R4P3F9, бета-цепь вариабельны й домен DSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQ GLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLE LGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTW
13 R4P3F9, CDRbl ТКР R4P3F9, бета-цепь CDR1 RSGDLS
14 R4P3F9, CDRb2 ТКР R4P3F9, бета-цепь CDR2 YYNGEE
15 R4P3F9, CDRb3 ТКР R4P3F9, бета-цепь CDR3 CASSVESSYGYT
16 R4P3F9, бета, константы ый ТКР R4P3F9, бета-цепь константный домен EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHV ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSA EAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVS ALVLMAMVKRKDF
17 R4P3F9, бета, константы ый, начало 1 ТКР R4P3F9, бета-цепь константный домен, начало 1 EDLNK
18 R4P3F9, бета, константн ый, начало 2 ТКР R4P3F9, бета-цепь константный домен, начало 2 EDLKN
19 Ада2р R4P3F9 Слитый белок Ада2р с scTv R4P3F9 и метками MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLS TTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPIN TQYVFGGGGSDYKDDDDKGGGASQKEVEQNSGPLSVPEGAI ASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDG RFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQL TFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQT PKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQ YYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALY FCASSVESSYGYTFGSGTRLTWEDLNKAAAGGSGGEQKLI SEEDL
20 Ада2р Лидерная последовате льность и Ада2р MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLS TTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPIN TQYVF
21 Метка FLAG Метка FLAG плюс линкеры GGGGSDYKDDDDKGGGAS
22 scTv R4P3F9 Одноцепочеч ные вариабель- QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSG KSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPS DSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGG
- 14 043746
ные домены R4P3F9 с линкером; aF55S в вариабельно м домене альфа-цепи GGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDL SVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPD LHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTW EDLNK
23 Метка Мус Линкер и метка Мус AAAGGSGGEQKLISEEDL
24 scTv R4P3F9 bQ43K scTv R4P3F9 со стабилизиру ющей мутацией bQ43K в вариабельном домене бета-цепи QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSG KSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPS DSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDL SVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPD LHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTW EDLNK
25 scTv R4P3F9 bL72S scTv R4P3F9 со стабилизиру ющей мутацией bL72S в вариабельном домене бета-цепи QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSG KSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPS DSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDL SVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPD LHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTW EDLNK
26 CDRal мутант! Мутация aG29R DRRSQS
27 scTv R4P3F9S Стабилизиро ванная версия scTv R4P3F9 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSG KSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPS DSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGD LSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFP DLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTV V
28 AGRN-001 Сходные пептиды ALLDGRVQL
29 CLAS Pl001 Сходные пептиды RLLDGAFKL
30 COL6A1001 Сходные пептиды ILLDGSASV
31 COL6A2001 Сходные пептиды FLLDGSERL
32 COL6A3006 Сходные пептиды FLFDGSANLV
33 COL6A3008 Сходные пептиды FLFDGSANL
34 COL6A3014 Сходные пептиды FLLDGSEGV
35 VWA2-001 Сходные пептиды FLLDGSNSV
36 VWF-001 Сходные пептиды FLLDGSSRL
37 CDRbl, мутант 1 Бета-цепь CDR1, вариант 1 ARWHNN
38 CDRbl, мутант 2 Бета-цепь CDR1 вариант 2 AKDHLN
- 15 043746
39 CDRbl, мутант 3 Бета-цепь CDR1, вариант 3 ARWHRN
40 CDRbl, мутант 4 Бета-цепь CDR1 вариант 4 AMDHPY
41 CDRbl, мутант 5 Бета-цепь CDR1 вариант 5 ATDHYN
42 CDRbl, мутант 6 Бета-цепь CDR1 вариант 6 ARYHTN
43 CDRbl, мутант 7 Бета-цепь CDR1 вариант 7 APYHLN
44 CDRbl, мутант 8 Бета-цепь CDR1 вариант 8 AKDHTN
45 CDRbl, мутант 9 Бета-цепь CDR1 вариант 9 ARYHRN
46 CDRbl, мутант 10 Бета-цепь CDR1 вариант 10 ARWHSN
47 CDRbl, мутант 11 Бета-цепь CDR1 вариант 11 ATDHYN
48 CDRbl, мутант 12 Бета-цепь CDR1 вариант 12 RWGDLN
49 CDRbl, мутант 13 Бета-цепь CDR1 вариант 13 ARDHLN
50 75-1 Тяжелая цепь Fab со стабилизиро ванным scTv R4P3F9S MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKF KDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDS DWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDR GSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKAS QYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSV IPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLI TATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGE ERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASS VESSYGYTFGSGTRLTWEDLKN
51 75- Fab тяжелая цепь Тяжелая цепь Fab MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKF KDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDS DWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTSPPSPAPPVAG
52 75- Fab легкая цепь Легкая цепь Fab MKWVTFISLLFLFSSAYSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVE IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLS SPVTKS FNRGEC
53 1G4, альфа ТКР 1G4, альфа-цепь METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLN CSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLN ASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTF
- 16 043746
- полной длины GRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQ TNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQ NLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
54 1G4, альфа, лидерный ТКР 1G4, альфа-цепь - лидерный пептид METLLGLLILWLQLQWVSSK
55 1G4, альфа, вариабель ный ТКР 1G4, альфа-цепь вариабельный домен QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGK GLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPG DSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHP
56 1G4, альфа, константы ый ТКР 1G4, альфа-цепь константный домен YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSD VYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSII PEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRIL LLKVAGFNLLMTLRLWSS
57 1G4, бета ТКР 1G4, бета-цепь полной длины MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQ CAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNG YNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFF GEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCL ATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSR YCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRA KPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
58 1G4, бета, лидерный ТКР 1G4, бета-цепь лидерный пептид MSIGLLCCAALS LLWAGPVNA
59 1G4, бета, вариабель ный ТКР 1G4, бета-цепь вариабельный домен GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGL RLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPS QTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL
60 1G4, бета, константн ый Бета-цепь константный домен EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHV ELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSA EAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVS ALVLMAMVKRKD S RG
61 NYESO1001 Контрольный пептид SLLMWITQV
62 С-14, бета; С5, бета Бета-цепь полной длины ТКР С-14; С-5 с CDRbl, мутант 4 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLR CSPAMDHPYVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILER FSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFG SGTRLTWEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLA TGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRY CLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAK PVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKA TLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
63 С-14, альфа С-14; ТКР бета-цепь полной длины с CDRal мутант 1 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIAS LNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRF TAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTF GKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQ TNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQ NLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
64 75-5 Тяжелая цепь Fab со стабилизиро ванным scTv R4P3F9S и MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKF KDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDS DWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
- 17 043746
CDRbl мутант 4 HTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDR GSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKAS QYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSV IPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLI TATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGE ERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASS VESSYGYTFGSGTRLTWEDLKN
65 75-14 Тяжелая цепь Fab со стабилизиро ванным scTv R4P3F9S, CDRal, мутант 1, и CDRbl, мутант 4 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKF KDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDS DWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDR RSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKAS QYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSV IPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLI TATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGE ERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASS VESSYGYTFGSGTRLTWEDLKN
66 75-25 Тяжелая цепь Fab со стабилизиро ванным scTv R4P3F9S в бета/альфаориентации, CDRal, мутант 1 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKF KDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDS DWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTSPPSPAPPVAGGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDL SVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPD LHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTW EDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPL SVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYS NGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYS GAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQN
Примеры
Встречающиеся в природе T-клеточные рецепторы (ТКР) к раковым антигенам зачастую обладают более низкой аффинностью по сравнению с ТКР, направленными на вирусные антигены, и это может быть одним из возможных объяснений ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора (Aleksic et al., 2012). Таким образом, желательно иметь варианты ТКР с более высокой аффинностью, разработанные для использования в качестве антигенраспознающих структур в адоптивной клеточной терапии, или же в качестве модуля распознавания в подходе на основе растворимых схем, например, с использованием биспецифических молекул (Hickman et al., 2016). Настоящее изобретение, таким образом, относится к модификации и оптимизации встречающегося в природе T-клеточного рецептора R4P3F9 (SEQ ID NO: 2 и 10), мишенью которого является опухолеассоциированный пептид COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1) с аффинностью около 60 мкМ (DE102016115246).
Пример 1. Получение стабильных scTv.
Для целей настоящего изобретения ранее исследованный ТКР R4P3F9 (SEQ ID NO: 2 и 10) был преобразован в одноцепочечную ТКР-структуру (scTv, SEQ ID NO: 22) для созревания по технологии поверхностного дисплея на основе дрожжей при помощи комбинации вариабельного альфа(SEQ ID NO: 4) и бета- (SEQ ID NO: 12) домена с дополнениями в виде соответствующих константных доменов (SEQ ID NO: 9 и 17) и подходящей глицин-сериновой линкерной последовательности. ДНК соответствующей последовательности была синтезирована и трансформирована в Saccharomyces cerevisiae EBY100 (MATa AGA1::GAL1AGA1::URA3 ura352 trp1 leu2delta200 his3delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL) (ATCC® MYA 4941™) вместе с вектором дрожжевого дисплея, содержащим лидерную последовательность и белок Aga2p, определяющий тип спаривания у дрожжей (SEQ ID NO: 20), на основе pCT302 (Boder et al., 2000). Полученный в результате слитый белок после гомологичной рекомбинации в дрожжевых клетках (SEQ ID NO: 19) содержит лидерный пептид на N-конце белка Aga2p, отвечающего за экспонирование исследуемого белка (Boder et al., 1997), короткие пептидные метки, включающие линкерные последовательности (SEQ ID NO: 21 и 23) в целях экспрессии контролей и исследуемого белка, а именно scTv R4P3F9 (SEQ ID NO: 22) или его варианты. Трансформацию производили согласно описанию в заявке DE 102016121899 с получением в результате вплоть до 109 дрожжевых клонов на библиотеку. Библиотеки были получены за счет случайного мутагенеза при ПЦР, охватывая целиком последовательность генов scTv R4P3F9.
Процесс отбора дрожжевых клонов с лучшим экспрессирующимся scTv, который селективно связывается с COL6A3-002 при участии HLA-A*02, производили в сущности согласно описанию в работе Smith et al., 2015. В целях подтверждения высокого уровня экспрессии и правильной конформации варианта scTv R4P3F9, экспонированного на поверхности дрожжей, использовали антитело к Vbeta1 (Beckman Coulter, клон BL37.2) вместе с тетрамером HLA-A*02/COL6A3-002 (фиг. 1). Преобразование scTv с помощью поверхностного дисплея на основе дрожжей обнаружило две ключевые стабилизирующие мутации в каркасном участке, необходимом вместе с исходными последовательностями CDR для надлежащей презентации scTv на клеточной поверхности, а именно bQ43K (SEQ ID NO: 24) и bL72S (SEQ ID NO: 25), обе из которых расположены на бета-цепи. Кроме того, во время созревания стабиль- 18 043746 ности в положении 29 в CDR1 альфа-цепи (SEQ ID NO: 5) было сделано преобразование: глицин в аргинин (мутант 1 CDRa1, SEQ ID NO: 26), что привело к улучшенному связыванию с тетрамером.
Пример 2. Созревание аффинности стабилизированных scTv.
В целях получения молекул scTv с более высокой аффинностью связывания по отношению к HLA-A*02/COL6A3-002 производили вырождение CDRb1 (SEQ ID NO: 13) с использованием предварительно идентифицированного стабилизированного каркаса scTv R4P3F9S (SEQ ID NO: 27), экспрессирующего стабилизирующие мутации aG29R, bQ43K и bL72S. Остатки CDRb1 рандомизировали с помощью вырожденных олигонуклеотидных праймеров ДНК, по существу, как было описано ранее (Smith et al., 2015). Полученную в результате ДНК-библиотеку трансформировали согласно описанию примера 1. Чтобы сохранить селективность связывания scTv, негативный отбор использовали против тетрамеров HLA-A*02, включающих пептиды, полученные из нормальных тканей (SEQ ID NO: 28-36), которые обладают высоким сходством последовательности с пептидом COL6A3-002.
Чтобы произвести отбор вариантов scTv R4P3F9S с увеличенной аффинностью и селективностью, использовали тетрамер HLA-A*02/COL6A3-002 со снижением концентраций для каждого этапа сортировки. После трех этапов отбора выделяли и секвенировали отдельные клоны scTv, получая в результате ряд последовательностей CDRb1 с созревшей аффинностью (SEQ ID NO: 37 по 49). Для scTv с последовательностями CDRb1 с созревшей аффинностью, могло быть продемонстрировано сильное улучшение способности связывания с COL6A3-002, тогда как селективность связывания с COL6A3-002 сохранялась, поскольку связывания для 9 сходных пептидов не наблюдалось (фиг. 2).
Пример 3. Производство слитых белков биспецифическое антитело-scTv.
Стабилизированный scTv с созревшей аффинностью к HLA-A*02/COL6A3-002 может быть экспрессирован в слитой форме с фрагментом антитела к CD3, делая возможным опухолеспецифическое перенаправление на мишень и активацию T-клеток вне зависимости от их природной специфичности. Авторы изобретения получили слитые белки биспецифическое антитело-ТКР, включающие тяжелую цепь антитела с анти-CD3 Fab-фрагментом (UCHT1) (SEQ ID NO: 51), слитую с вариантами scTv R4P3F9S (SEQ ID NO: 50, 64, 65 и 66) и легкую цепь антитела с анти-CD3 Fab-фрагментом (UCHT1) (SEQ ID NO: 52). Полученные в результате слитые белки Fab-scTv обладают молекулярной массой приблизительно 75 кДа. На основании различных CDR1-последовательностей scTv R4P3F9S альфа(SEQ ID NO: 5 и 26) и бета-цепи (SEQ ID NO: 13 и 37-49) различные варианты слияния Fab-scTv (75-1 по 75-25, табл. 2) были экспрессированы в транзиторно трансфицированные клетки ExpiCHO согласно рекомендациям производителя. Белки были очищены с помощью хроматографии с белком L и эксклюзионной хроматографии. Все варианты слияния могли быть получены с выходом в диапазоне от 80 мкг вплоть до 1 мг (табл. 2) и гетеродимерами однородной формы ожидаемого размера согласно результатам анализа с помощью эксклюзионной хроматографии (фиг. 3).
Таблица 2
Номенклатура и выход слитых белков биспецифический Fab-scTv. В основе молекулы лежат последовательности SEQ ID NO 50 и 52 и указанные варианты CDRa1 и CDRb1
Вариант CDRal/SEQ CDRbl/SEQ Выход [мк
75-1 DRGSQS (SEQ Ш NO. 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267,9
75-2 DRGSQS (SEQ Ш NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) 78,4
75-3 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 646,7
75-4 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) 704,3
75-5 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 397,2
75-6 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 268,1
75-7 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 83,2
75-8 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 765,7
75-9 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 1067,2
75-10 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 389,6
75-11 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) 270,4
75-12 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 943,6
75-13 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) 560,3
75-14 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 360,7
75-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 541,5
75-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 403,6
75-17 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 195,5
75-18 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 731,3
75-19 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHRN (SEQ ID NO. 45) 794
75-20 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHSN (SEQ ID NO. 46) 85,5
75-21 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 47) 276
75-22 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RWGDLN (SEQ ID NO. 48) 255
75-23 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARDHLN (SEQ ID NO. 49) 217
75-24а DRGSQS (SEQ ID NO: 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 166,6
75-25а DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267
а Бета-альфа-ориентация scTv.
- 19 043746
Пример 4. Связывание слитых белков Fab-scTv с COL6A3-002 и сходными пептидами.
Аффинность связывания слитых белков анти-CD3-scTv R4P3F9S по отношению к мономерам HLA-A*02 с пептидом COL6A3-002 или различными сходными пептидами измеряли с помощью биослойной интерферометрии. Измерения проводили на системе Octet RED384 с использованием настроек, рекомендованных производителем. Вкратце, очищенные молекулы Fab-scTv загружали на биосенсоры (FAB2G) до проведения анализа серийных разведений HLA-A*02/COL6A3-002. В сравнении с вариантами 75-1 и 75-24, включающими CDRa1 дикого типа и CDRb1 дикого типа, для вариантов Fab-scTv с последовательностями CDRa1 и/или CDRb1 с созревшей аффинностью наблюдалось повышение уровня аффинности связывания вплоть до 40 раз (табл. 3, фиг. 4). В целях оценки селективности связывания с HLA-A*02/COL6A3-002 проводили скрининг очищенных молекул Fab-scTv, нагруженных на биосенсоры FAB2G, относительно связывания с 1 мкМ сходных пептидов (SEQ ID NO: 28-36), каждый их которых был в комплексе с HLA-A*02. За исключением HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID NO: 30), с которым связывалось большинство вариантов Fab-scTv, содержащих зрелый CDRa1 с созревшей аффинностью (SEQ ID NO: 26), варианты Fab-scTv не продемонстрировали связывания со сходными пептидами (фиг. 5), что свидетельствует о высокой селективности связывания. Для некоторых вариантов Fab-scTv проводили исследование терапевтического окна между связыванием с HLA-A*02/COL6A3-002 и HLA-A*02/COL6A1-001, нагружая биотинилированные комплексы пептид-HLA на биосенсоры (SA) и анализируя серийные разведения вариантов Fab-scTv. Тогда как аффинность связывания варианта 75-10, включающего последовательность CDRa1 (SEQ ID NO: 26) с созревшей аффинностью и последовательность дикого типа CDRb1 (SEQ ID NO: 13), была в 8 раз выше с HLA-A*02/COL6A3-002, чем с HLA-A*02/COL6A1-001, аффинность связывания, выявленная для варианта 75-13 Fab-scTv, включающего CDRb1 (SEQ ID NO: 39), обладающий зрелостью, была вплоть до 57 раз выше, что подтверждает улучшение терапевтического окна (табл. 4, фиг. 6).
Таблица 3
Аффинность связывания слитых белков Fab-scTv с HLA-A*02/COL6A3-002
Вариант KD (М) коп (1/Мс) koff (1/с)
75-1 8,06Е-06 1,01Е+05 8Д7Е-01
75-2 3,69Е-06 1,59Е+05 5,86Е-01
75-3 4,92Е-06 9,71Е+04 4,78Е-01
75-4 5,76Е-06 9,78Е+04 5,63Е-01
75-5 4,32Е-04 2,21Е+03 9,55Е-01
75-6 1,1 ЗЕ-06 2,06Е+05 2,32Е-01
75-7 1,79Е-06 1,93Е+05 3,44Е-01
75-8 3,45Е-06 1,36Е+05 4,69Е-01
75-9 1,41Е-05 6,02Е+04 8,51Е-01
75-10 1,78Е-06 1,69Е+05 3,01Е-01
75-11 2,82Е-07 4Д6Е+05 1Д8Е-01
75-12 3,74Е-07 2,67Е+05 1,00Е-01
75-13 4,05Е-07 3,28Е+05 1,ЗЗЕ-01
75-14 3,10Е-06 8,41Е+04 2,61Е-01
75-15 7,78Е-07 2,ЗЗЕ+05 1,81Е-01
75-16 5,87Е-07 3,37Е+05 1,98Е-01
75-17 2,27Е-07 3,62Е+05 8,20Е-02
75-18 1,93Е-06 1,51Е+05 2,91Е-01
75-19 6,00Е-07 2,96Е+05 1,78Е-01
75-20 5,31Е-07 6,08Е+05 3,23Е-01
75-21 5,52Е-07 2,72Е+05 1,50Е-01
75-22 8,22Е-07 2,48Е+05 2,04Е-01
75-23 3,24Е-07 3,18Е+05 1,03Е-01
75-24 5,20Е-06 1,08Е+05 5,62Е-01
75-25 8,ЗЗЕ-06 6,23Е+04 5Д9Е-01
- 20 043746
Таблица 4
Сравнительные аффинности связывания слитых белков Fab-scTv с HLA-A*02/COL6A3-002 и HLA-A*02/COL6A1-001
Вариант pHLA-A*02 KD (М) KDcOL6A1-001/KDcOL6A3-002
75-10 COL6A3-002 1,37Е-05 8
COL6A1-001 1,08Е-04
75-11 COL6A3-002 8,50Е-07 8
COL6A1-001 6,46Е-06
75-12 COL6A3-002 7,24Е-07 12
COL6A1-001 8,98Е-06
75-13 COL6A3-002 7,39Е-07 57
COL6A1-001 4,23Е-05
75-17 COL6A3-002 8,25Е-07 9
COL6A1-001 7,10Е-06
75-23 COL6A3-002 1Д5Е-06 22
COL6A1-001 2,55Е-05
Пример 5. Применение ТКР, обладающих созревшей аффинностью, для клеточной экспрессии.
Модификация T-клеток в целях экспрессии ТКР, распознающих комплекс опухолеспецифический пептид-HLA, является многообещающей альтернативой для перенаправления T-клеток на раковые клетки. Поскольку использование последовательностей CDR1 с созревшей аффинностью могло улучшить связанные с клетками ТКР к HLA-A*02/COL6A3-002, идентифицированные последовательности CDRa1 и CDRb1 с мутациями вводили в исходный ТКР R4P3F9 (SEQ ID NO: 2 и 10). Полученные варианты ТКР с мутациями (с C-1 по C-18, табл. 5) экспрессировали в CD8+ T-клетках человека после электропорации соответствующей мРНК, полученной за счет транскрипции in vitro амплифицированных путем ПЦР конструкций ДНК. В целях контроля производили экспрессию ТКР 1G4 (SEQ ID NO: 53 и 57) к пептиду NYESO1-001 (SEQ ID NO: 61). После инкубации в течение ночи РНК-электропорированных CD8+ T-клеток экспрессию введенных вариантов ТКР анализировали с помощью окрашивания ФЭ-меченными тетрамерами HLA-A*02/COL6A3-002 или тетрамерами HLA-A*02/NYESO1-001. Тогда как исходный ТКР R4P3F9, вариант C-1 демонстрировал только минимальное окрашивание тетрамерами HLA-A*02/COL6A3-002, варианты ТКР R4P3F9 с C-2 по C-18 с CDRa1 и/или CDRb1 с созревшей аффинностью демонстрировали повышенное тетрамерное окрашивание (фиг. 7). Функциональную активацию CD8+ T-клеток (20000 клеток/лунка), экспрессирующих различные варианты ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью исследовали путем определения уровней высвобождаемого IFN-гамма после совместной культивации с T2 клетками (20 000 клеток/лунка), нагруженных либо серийными разведениями COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1), либо 10 мкМ COL6A3-002 и сходных пептидов (SEQ ID NO: 28-36). По сравнению с исходным ТКР R4P3F9, вариантом C-1, ТКР-варианты с C-2 по C-18 с созревшей аффинностью демонстрировали повышенное высвобождение IFN-гамма с достижением максимальных уровней уже при более низких концентрациях пептида (фиг. 8). Как и ожидалось, высвобождения IFN-гамма не наблюдалось в случае T-клеток, не экспрессирующих ТКР, или экспрессирующих контрольный ТКР 1G4, специфичный к NYESO1-001. Чтобы проанализировать селективность распознавания COL6A3-002 вариантами ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью, проводили анализ высвобождения IFN-гамма в ответ на T2-клетки, нагруженные различными сходными пептидами (SEQ ID NO: 28-36), выявив различные профили селективности для вариантов ТКР R4P3F9 с созревшей аффинностью. Наиболее интересно отметить, что ТКР-варианты C-5 (SEQ ID NO: 62 и 2) и C-14 (SEQ ID NO: 62 и 63), включающие одинаковые CDRb1 (SEQ ID NO: 40) с созревшей аффинностью, не продемонстрировали никакого перекрестного взаимодействия с COL6A1-001 или другими сходными пептидами (фиг. 9), делая ТКР R4P3F9 варианты с созревшей аффинностью C-5 и С14 наиболее многообещающими кандидатами для адресного внутриклеточного нацеливания на опухоли на основе ТКР.
- 21 043746
Таблица 5
Номенклатура клеточных вариантов ТКР. В основе молекулы лежат последовательности SEQ ID NO: 2 и 10 и указанные варианты CDRa1 и CDRb1
Вариант CDRal CDRbl
С-1 DRGSQS (SEQ Ш NO. 5) RSGDLS (SEQ Ш NO. 13)
С-2 DRGSQS (SEQ Ш NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37)
С-3 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38)
С-4 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39)
С-5 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40)
С-6 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41)
С-7 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42)
С-8 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43)
С-9 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44)
С-10 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ Ш NO. 13)
С-11 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHNN (SEQ ID NO. 37)
С-12 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHLN (SEQ ID NO. 38)
С-13 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHRN (SEQ ID NO. 39)
С-14 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AMDHPY (SEQ ID NO. 40)
С-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 41)
С-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHTN (SEQ ID NO. 42)
С-17 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) APYHLN (SEQ ID NO. 43)
С-18 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHTN (SEQ ID NO. 44)
Пример 6. Окно распознавания COL6A3-002 и COL6A1-001 вариантами клеточных ТКР.
Клеточную экспрессию и анализ вариантов R4P3F9 производили, как описано выше. В соответствии с предшествовавшими экспериментами (фиг. 7) уровень окрашивания T-клеток, экспрессирующих ТКР R4P3F9 варианты с C-2 по C-18, меченными ФЭ тетрамерами HLA-A*02/COL6A3-002, был выше в сравнении с исходным ТКР C-1. Кроме того, ТКР-варианты C-12 и C-17 демонстрировали связывание с HLA-A*02/COL6A1-001 (фиг. 10). Экспрессия всех вариантов R4P3F9 с созревшей аффинностью улучшила функциональную активацию CD8+ T-клеток в ответ на T2-клетки, нагруженные серийными разведениями COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1), с достижением значений EC50 в 5-90 раз ниже, чем в случае исходного ТКР C-1 (фиг. 11, табл. 6). Наиболее низкий уровень EC50 был зафиксирован для варианта C-14. Опять же, ТКР-варианты C-5 (SEQ ID NO: 62 и 2) и C-14 (SEQ ID NO: 62 и 63), включающие тот же самый CDRb1 (SEQ ID NO: 40) с созревшей аффинностью, не продемонстрировали никакого перекрестного взаимодействия по отношению к COL6A1-001, тогда как другие варианты демонстрировали сильное распознавание с окнами EC50 (COL6A3-002 в сравнении с COL6A1-001) на таком низком уровне, который соответствует множителю 5.
Таблица 6
Значения EC50 [нМ] высвобождения IFN-γ T-клетками, экспрессирующими варианты R4P3F9, после совместного культивирования с T2-клетками, нагруженными COL6A3-002 или COL6A1-001
Вариант ECso для COL6A3-002 |нТ ECso для COL6A1-001 [нТ
C-1 2,51 -
C-2 0,16 -
C-3 0,14 87 la
C-4 0,13 -
C-5 0,15 -
C-6 0,48 -
C-7 0,29 -
C-8 0,20 350
C-9 0,55 -
C-10 0,32 1.5
C-ll 0,32 8.2
C-12 0,20 1.9
C-13 0,23 9.7
C-14 0,03 -
C-15 0,31 69
C-16 0,34 78
C-17 0,33 4.1
C-18 0,14 280089a
a Уровень плато не достигнут.
Пример 7. Эффективность вариантов R4P3F9 C-5 и C-14 с созревшей аффинностью на линиях опухолевых клеток.
Клеточную экспрессию и анализ вариантов R4P3F9 производили, как описано выше. Экспрессия вариантов R4P3F9C-5 (SEQ ID NO: 62 и 2) и C-14 (SEQ ID NO: 62 и 63) с созревшей аффинностью улучшала функциональную активацию CD8+ T-клеток в ответ на линии опухолевых клеток, презентирующие COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1), в сравнении с исходным ТКР C-1 (фиг. 12). Линии опухолевых клеток, ис- 22 043746 пользованных во время этого исследования, презентируют различные количества пептида-мишени. Клетки SF539 имеют ~4000 копий HLA-A*02/COL6A3-002 на клетку и клетки SW982 имеют ~460 копий на клетку. Тогда как исходный ТКР C-1 не опосредовал сильной активации T-клеток после совместного культивирования с мишень-положительными клеточными линиями, вариант ТКР C-14 демонстрировал еще более сильное улучшение функциональной активации, чем вариант ТКР C-5. Эти данные сопоставимы с улучшением EC50, от ТКР C-1 к C-5 и к C-14 (табл. 6). Мишень-отрицательная клеточная линия MCF-7 не распознавалась ни одним из данных ТКР.
Литература:
Aleksic et al. 2012: Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors implications for therapeutic strategies, Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9;
Hickman et al. 2016: Antigen Selection for Enhanced Affinity T-Cell Receptor-Based Cancer
Therapies, JBiomol Screen. 2016 Sep;21(8):769-85;
Boder and Wittrup 2000: Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol. 2000;328:430-44;
Boder and Wittrup 1997: Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7;
Smith et al. 2015: T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display
Platform, Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141;
DE102016121899.5
DE102016115246
Перечень последовательностей < 110> Immatics Biotechnologies GmbH < 120> НОВЫЕ ПОЛУЧЕННЫЕ МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ИММУННАЯ ТЕРАПИЯ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ < 130> I33054WO < 150> DE 102017125888.4 < 151> 2017-11-06 < 150> US 62/582,202 < 151> 2017-11-06 < 160>66 < 170> PatentIn version 3.5 < 210>1 < 211>9 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>1
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val 15 <210> 2 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens < 400>2
- 23 043746
Met Lys Ser Leu Arg 1 5
Val Leu Leu Val Ile
Leu Trp Leu Gln Leu
Trp Val Trp Ser Gln
Gln Lys Glu Val Glu
Gln Asn Ser Gly Pro 30
Ser Val Pro Glu Gly 35
Ala Ile Ala Ser Leu 40
Asn Cys Thr Tyr Ser 45
Arg Gly Ser Gln Ser 50
Phe Phe Trp Tyr Arg 55
Gln Tyr Ser Gly Lys 60
Pro Glu Leu Ile Met 65
Phe Ile Tyr Ser Asn 70
Gly Asp Lys Glu Asp 75
Arg Phe Thr Ala Gln 85
Leu Asn Lys Ala Ser 90
Gln Tyr Val Ser Leu 95
Ile Arg Asp Ser Gln
100
Pro Ser Asp Ser Ala
105
Thr Tyr Leu Cys Ala
110
Tyr Ser Gly Ala Gly 115
Ser Tyr Gln Leu Thr 120
Phe Gly Lys Gly Thr 125
Leu Ser Val Ile Pro
130
Asn Ile Gln Asn Pro
135
Asp Pro Ala Val Tyr 140
Leu Arg Asp Ser Lys 145
Ser Ser Asp Lys Ser 150
Val Cys Leu Phe Thr 155
Phe Asp Ser Gln Thr
165
Asn Val Ser Gln Ser
170
Lys Asp Ser Asp Val
175
Ile Thr Asp Lys Thr
180
Val Leu Asp Met Arg
185
Ser Met Asp Phe Lys
190
Asn Ser Ala Val Ala
195
Trp Ser Asn Lys Ser 200
Asp Phe Ala Cys Ala 205
Ala Phe Asn Asn Ser
210
Ile Ile Pro Glu Asp
215
Thr Phe Phe Pro Ser
220
Glu Ser Ser Cys Asp 225
Val Lys Leu Val Glu 230
Lys Ser Phe Glu Thr 235
Thr Asn Leu Asn Phe
245
Gln Asn Leu Ser Val
250
Ile Gly Phe Arg Ile
255
Ser
Leu
Asp
Ser
Gly 80
Leu
Ala
Lys
Gln
Asp 160
Tyr
Ser
Asn
Pro
Asp 240
Leu
- 24 043746
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
260 265
Ser Ser <210>3 <211>21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>3
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val 15
Trp Val Trp Ser Gln 20 <210>4 <211>112 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>4
Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly 15
Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr 20 25
Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly
40
Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu
55
Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser 65 70
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys 85
Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly
100 105
Met Thr Leu Arg Leu Trp
270
Leu Trp Leu Gln Leu Ser
Leu Ser Val Pro Glu Gly
Asp Arg Gly Ser Gln Ser 30
Ser Pro Glu Leu Ile Met
Gly Arg Phe Thr Ala Gln 60
Leu Ile Arg Asp Ser Gln 75 80
Ala Tyr Ser Gly Ala Gly 95
Lys Leu Ser Val Ile Pro
110 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens
- 25 043746 <400> 5
Asp Arg Gly Ser Gln Ser
5 <210>6 <211>5 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>6
Tyr Ser Asn Gly Asp 15 <210>7 <211>13 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>7
Cys Ala Ala Tyr Ser Gly Ala Gly Ser 15 <210>8 <211>141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>8
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe 20 25
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
40
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
55
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys 65 70
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro 85
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
100 105
Gln Leu Thr
Gln Leu Arg Asp Ser Lys
Asp Phe Asp Ser Gln Thr 30
Tyr Ile Thr Asp Lys Thr 45
Ser Asn Ser Ala Val Ala
Asn Ala Phe Asn Asn Ser 75 80
Pro Glu Ser Ser Cys Asp 95
Asp Thr Asn Leu Asn Phe
110
- 26 043746
Gln Asn Leu
115
Gly Phe Asn
130
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 120
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 135
Leu Leu Lys Val
125
Ser Ser 140
Ala <210>9 <211>4 <212> PRT <213> Homo <400>9
Asn Ile Gln 1 sapiens
Asn <210>10 <211>308 <212> PRT <213> Homo <400>10
Met Gly Phe 1 sapiens
Gly Pro Val
Ala Thr Gly
Leu Ser Val
Leu Ile Gln 65
Glu Arg Phe
Leu Ser Ser
Ser Val Glu
115
Thr Val Val
130
Arg Leu 5
Asp Ser 20
Gln Arg
Tyr Trp
Tyr Tyr
Ser Ala 85
Leu Glu 100
Ser Ser
Glu Asp
Leu Cys
Gly Val
Val Thr
Tyr Gln 55
Asn Gly 70
Gln Gln
Leu Gly
Tyr Gly
Leu Asn
135
Cys Val
Thr Gln
Leu Arg 40
Gln Ser
Glu Glu
Phe Pro
Asp Ser
105
Tyr Thr 120
Lys Val
Ala Phe 10
Thr Pro
Cys Ser
Leu Asp
Arg Ala 75
Asp Leu 90
Ala Leu
Phe Gly
Phe Pro
Cys Leu
Leu Gly 15
Lys His
Leu Ile 30
Pro Arg 45
Gln Gly 60
Lys Gly
His Ser
Tyr Phe
Ser Gly
125
Pro Glu 140
Ser Gly
Leu Gln
Asn Ile
Glu Leu
Cys Ala 110
Thr Arg
Val Ala
Ala
Thr
Asp
Phe
Leu 80
Asn
Ser
Leu
Val
- 27 043746
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser
145 150
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro
165
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser
180 185
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn
195 200
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe
210 215
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly
225 230
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr
245
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr
260 265
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu
275 280
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu
290 295
Arg Lys Asp Phe 305 <210>11 <211>19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>11
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val 15
Thr Gln Lys Ala Thr Leu
155 160
His Val Glu Leu Ser Trp 175
Val Ser Thr Asp Pro Gln
190
Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
205
Gln Asn Pro Arg Asn His
220
Ser Glu Asn Asp Glu Trp
235 240
Ile Val Ser Ala Glu Ala
255
Val Ser Tyr Gln Gln Gly
270
Leu Leu Gly Lys Ala Thr
285
Leu Met Ala Met Val Lys 300
Phe Cys Leu Leu Gly Ala
Gly Pro Val <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens
- 28 043746 <400> 12
Asp Ser Gly 1 Val Thr 5 Gln Thr Pro Lys His 10 Leu Ile Thr Ala Thr 15
Gln Arg Val Thr 20 Leu Arg Cys Ser Pro 25 Arg Ser Gly Asp Leu 30 Ser
Tyr Trp Tyr 35 Gln Gln Ser Leu Asp 40 Gln Gly Leu Gln Phe 45 Leu Ile
Tyr Tyr Asn 50 Gly Glu Glu Arg 55 Ala Lys Gly Asn Ile 60 Leu Glu Arg
Ser Ala Gln 65 Gln Phe Pro 70 Asp Leu His Ser Glu 75 Leu Asn Leu Ser
Leu Glu Leu Gly Asp 85 Ser Ala Leu Tyr Phe 90 Cys Ala Ser Ser Val 95
Ser Ser Tyr Gly 100 Tyr Thr Phe Gly Ser 105 Gly Thr Arg Leu Thr 110 Val
<210> <211> <212> <213> 13 6 PRT Homo sapiens
<400> 13
Arg Ser Gly 1 Asp Leu 5 Ser
<210> <211> <212> <213> 14 5 PRT Homo sapiens
<400> 14
Tyr Asn Gly 1 Glu Glu 5
<210> <211> <212> <213> 15 12 PRT Homo sapiens
<400> 15
Cys Ala Ser 1 Ser Val 5 Glu Ser Ser Tyr Gly 10 Tyr Thr
Gly
Val
Gln
Phe
Ser 80
Glu
Val
- 29 043746
Val Ala Val Phe Glu <210>16 <211>177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>16
Glu Asp Leu Asn Lys 1 5
Val Phe Pro Pro Glu
Ser Glu Ala Glu Ile
Ser His Thr Gln Lys
Ala Thr Leu Val Cys 30
Ala Thr Gly Phe Phe 35
Pro Asp His Val Glu 40
Leu Ser Trp Trp Val 45
Gly Lys Glu Val His 50
Ser Gly Val Ser Thr 55
Asp Pro Gln Pro Leu 60
Glu Gln Pro Ala Leu 65
Asn Asp Ser Arg Tyr 70
Cys Leu Ser Ser Arg 75
Arg Val Ser Ala Thr 85
Phe Trp Gln Asn Pro 90
Arg Asn His Phe Arg 95
Gln Val Gln Phe Tyr
100
Gly Leu Ser Glu Asn
105
Asp Glu Trp Thr Gln
110
Arg Ala Lys Pro Val 115
Thr Gln Ile Val Ser
120
Ala Glu Ala Trp Gly 125
Ala Asp Cys Gly Phe 130
Thr Ser Val Ser Tyr
135
Gln Gln Gly Val Leu 140
Ala Thr Ile Leu Tyr 145
Glu Ile Leu Leu Gly 150
Lys Ala Thr Leu Tyr 155
Val Leu Val Ser Ala
165
Leu Val Leu Met Ala
170
Met Val Lys Arg Lys
175
Pro
Leu
Asn
Lys
Leu 80
Cys
Asp
Arg
Ser
Ala 160
Asp
Phe <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17
- 30 043746
Glu Asp Leu Asn Lys 1 5 <210>18 <211>5 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>18
Glu Asp Leu Lys Asn 15 <210>19 <211>374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>19
Met Gln Leu Leu Arg 1 5
Cys Phe Ser Ile Phe
Ser Val Ile Ala Ser
Leu Ala Gln Glu Leu
Thr Thr Ile Cys Glu 25
Gln Ile Pro Ser Pro
Leu Glu Ser Thr Pro
Tyr Ser Leu Ser Thr 40
Thr Thr Ile Leu Ala
Gly Lys Ala Met Gln 50
Gly Val Phe Glu Tyr 55
Tyr Lys Ser Val Thr 60
Val Ser Asn Cys Gly 65
Ser His Pro Ser Thr 70
Thr Ser Lys Gly Ser 75
Ile Asn Thr Gln Tyr 85
Val Phe Gly Gly Gly 90
Gly Ser Asp Tyr Lys 95
Asp Asp Asp Lys Gly
100
Gly Gly Ala Ser Gln
105
Lys Glu Val Glu Gln
110
Ser Gly Pro Leu Ser 115
Val Pro Glu Gly Ala
120
Ile Ala Ser Leu Asn
125
Thr Tyr Ser Asp Arg
130
Gly Ser Gln Ser Phe
135
Phe Trp Tyr Arg Gln
140
Ser Gly Lys Ser Pro 145
Glu Leu Ile Met Ser 150
Ile Tyr Ser Asn Gly 155
Val
Thr
Asn
Phe
Pro 80
Asp
Asn
Cys
Tyr
Asp 160
Tyr
Lys Glu Asp Gly Arg
Phe Thr Ala Gln Leu
Asn Lys Ala Ser Gln
- 31 043746
165
175
Ala Thr
190
Val Ser Leu
Leu Ile 180
Arg Asp
Ser Gln
185
Leu Cys Ala
195
Ala Tyr
Ser Gly
Ala Gly 200
Lys Gly Thr
210
Lys Leu
Ser Val
215
Ile Pro
170
Pro Ser
Ser Tyr
Asn Ile
Asp Ser
Gln Leu
205
Gln Asn
220
Thr Phe
Gly Gly
Gly Ser Gly 225
Gly Gly
Gly Ser 230
Gly Gly
Gly Gly
235
Ser Gly
Gly Gly
Ser Gly Val
Thr Gln
245
Thr Pro
Lys His
Leu Ile
250
Thr Ala
Thr Gly
255
Arg Val Thr
Leu Arg 260
Cys Ser
Pro Arg
265
Ser Gly
Asp Leu
Ser Val
270
Trp Tyr Gln
275
Gln Ser
Leu Asp
Gln Gly 280
Leu Gln
Phe Leu
285
Ile Gln
Tyr Asn Gly
290
Glu Glu
Arg Ala
295
Lys Gly
Asn Ile
Leu Glu 300
Arg Phe
Ala Gln Gln 305
Phe Pro
Asp Leu 310
His Ser
Glu Leu
315
Asn Leu
Ser Ser
Glu Leu Gly
Asp Ser
325
Ala Leu
Tyr Phe
Cys Ala 330
Ser Ser
Val Glu
335
Ser Tyr Gly
Tyr Thr 340
Phe Gly
Ser Gly
345
Thr Arg
Leu Thr
Val Val 350
Asp Leu Asn
355
Lys Ala
Ala Ala
Gly Gly 360
Ser Gly
Gly Glu
365
Gln Lys
Tyr
Gly
Gly
Gly 240
Gln
Tyr
Tyr
Ser
Leu 320
Ser
Glu
Leu
Ile Ser Glu
370
Glu Asp
Leu <210>20 <211>87 <212> PRT <213> Homo <400>20
Met Gln Leu sapiens
Leu Arg
Cys Phe
Ser Ile
Phe Ser
Val Ile
Ala Ser
Val
- 32 043746
Leu Ala Gln
Leu Glu Ser
Gly Lys Ala 50
Val Ser Asn 65
Ile Asn Thr <210>21 <211>18 <212> PRT <213> Homo <400>21
Gly Gly Gly 1
Glu Leu Thr 20
Thr Pro Tyr
Met Gln Gly
Cys Gly Ser 70
Gln Tyr Val 85 sapiens
Gly Ser Asp 5
Thr Ile Cys 25
Ser Leu Ser
Val Phe Glu 55
His Pro Ser
Phe
Tyr Lys Asp
Ala Ser <210>22 <211>251 <212> PRT <213> Homo <400>22
Gln Lys Glu 1 sapiens
Val Glu Gln
Asn Ser Gly
Ala Ile Ala
Ser Leu Asn 20
Cys Thr Tyr
Phe Phe Trp
Tyr Arg Gln
Tyr Ser Gly 40
Ser Ile Tyr 50
Ser Asn Gly
Asp Lys Glu 55
Leu Asn Lys 65
Ala Ser Gln
Tyr Val Ser
Glu Gln Ile
Thr Thr Thr
Tyr Tyr Lys 60
Thr Thr Ser 75
Asp Asp Asp 10
Pro Leu Ser 10
Ser Asp Arg
Lys Ser Pro
Asp Gly Arg
Leu Leu Ile
Pro Ser Pro 30
Ile Leu Ala 45
Ser Val Thr
Lys Gly Ser
Lys Gly Gly 15
Val Pro Glu
Gly Ser Gln 30
Glu Leu Ile 45
Phe Thr Ala
Arg Asp Ser
Thr
Asn
Phe
Pro 80
Gly
Gly
Ser
Met
Gln
Gln 80
- 33 043746
Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys 85
Ser Tyr Gln Leu Thr Phe Gly Lys Gly
100 105
Asn Ile Gln Asn Gly Gly Gly Gly Ser
115 120
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135
Leu Ile Thr Ala Thr Gly Gln Arg Val 145 150
Ser Gly Asp Leu Ser Val Tyr Trp Tyr
165
Leu Gln Phe Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn
180 185
Asn Ile Leu Glu Arg Phe Ser Ala Gln
195 200
Glu Leu Asn Leu Ser Ser Leu Glu Leu
210 215
Cys Ala Ser Ser Val Glu Ser Ser Tyr
225 230
Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu
245 < 210>23 < 211>18 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>23
Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Glu
Asp Leu <210> 24 <211> 251
Ala Tyr Ser Gly Ala Gly 95
Lys Leu Ser Val Ile Pro 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly
125
Thr Gln Thr Pro Lys His
140
Leu Arg Cys Ser Pro Arg
155 160
Gln Ser Leu Asp Gln Gly
175
Glu Glu Arg Ala Lys Gly
190
Phe Pro Asp Leu His Ser
205
Asp Ser Ala Leu Tyr Phe
220
Tyr Thr Phe Gly Ser Gly
235 240
Lys
Lys Leu Ile Ser Glu Glu
Ser Val
Pro Glu <212> PRT <213> Homo <400> 24
Gln Lys Glu 1 sapiens
Ala Ile Ala
Phe Phe Trp
Ser Ile Tyr 50
Leu Asn Lys 65
Val Glu 5
Ser Leu 20
Tyr Arg
Ser Asn
Ala Ser
Gln Asn
Ser Gly
Asn Cys
Thr Tyr
Gln Tyr
Gly Asp 55
Gln Tyr 70
Pro Ser Asp
Ser Ala
Thr Tyr
Ser Tyr Gln
Leu Thr 100
Phe Gly
Ser Gly 40
Lys Glu
Val Ser
Leu Cys
Lys Gly
105
Asn Ile Gln
115
Asn Gly
Gly Gly
Gly Ser 120
Gly Gly Ser
130
Gly Gly
Gly Gly
135
Ser Gly
Leu Ile Thr 145
Ala Thr
Gly Gln 150
Arg Val
Ser Gly Asp
Leu Ser
165
Val Tyr
Trp Tyr
Leu Gln Phe
Leu Ile 180
Gln Tyr
Tyr Asn
185
Asn Ile Leu
195
Glu Arg
Phe Ser
Ala Gln 200
Glu Leu Asn
210
Leu Ser
Ser Leu
215
Glu Leu
Cys Ala Ser 225
Ser Val
Glu Ser
230
Ser Tyr
Pro Leu 10
Ser Asp
Lys Ser
Asp Gly
Arg Gly
Pro Glu
Arg Phe 60
Ser Gln 30
Leu Ile
Thr Ala
Leu Leu
Ile Arg
Asp Ser
Ala Ala 90
Tyr Ser
Gly Ala 95
Thr Lys
Leu Ser
Val Ile
110
Gly Gly
Gly Gly
125
Ser Gly
Val Thr
Thr Leu
155
Lys Gln 170
Gly Glu
Gln Phe
Gly Asp
Gly Tyr
235
Gln Thr 140
Pro Lys
Arg Cys
Ser Pro
Ser Leu
Glu Arg
Pro Asp
205
Ser Ala
220
Thr Phe
Asp Gln
175
Ala Lys 190
Leu His
Leu Tyr
Gly Ser
Gly
Ser
Met
Gln
Gln 80
Gly
Pro
Gly
His
Arg 160
Gly
Gly
Ser
Phe
Gly 240
- 35 043746
Thr Arg Leu
Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys
245 250 <210>25 <211>251 <212> PRT <213> Homo <400>25
Gln Lys Glu 1 sapiens
Val Glu Gln
Asn Ser Gly
Pro Leu Ser 10
Val Pro Glu
Ala Ile Ala
Ser Leu Asn 20
Cys Thr Tyr 25
Ser Asp Arg
Gly Ser Gln 30
Phe Phe Trp
Tyr Arg Gln
Tyr Ser Gly 40
Lys Ser Pro
Glu Leu Ile 45
Ser Ile Tyr 50
Ser Asn Gly
Asp Lys Glu 55
Asp Gly Arg
Phe Thr Ala
Leu Asn Lys 65
Ala Ser Gln
Tyr Val Ser
Leu Leu Ile
Arg Asp Ser
Pro Ser Asp
Ser Ala Thr
Tyr Leu Cys
Ala Ala Tyr 90
Ser Gly Ala
Ser Tyr Gln
Leu Thr Phe 100
Gly Lys Gly
105
Thr Lys Leu
Ser Val Ile
110
Asn Ile Gln
115
Asn Gly Gly
Gly Gly Ser
120
Gly Gly Gly
Gly Ser Gly 125
Gly Gly Ser
130
Gly Gly Gly
Gly Ser Gly 135
Val Thr Gln
140
Thr Pro Lys
Leu Ile Thr 145
Ala Thr Gly
150
Gln Arg Val
Thr Leu Arg
155
Cys Ser Pro
Ser Gly Asp
Leu Ser Val
165
Tyr Trp Tyr
Gln Gln Ser 170
Leu Asp Gln
175
Leu Gln Phe
Leu Ile Gln 180
Tyr Tyr Asn
185
Gly Glu Glu
Arg Ala Lys
190
Asn Ile Ser
195
Glu Arg Phe
Ser Ala Gln
200
Gln Phe Pro
Asp Leu His 205
Gly
Ser
Met
Gln
Gln 80
Gly
Pro
Gly
His
Arg 160
Gly
Gly
Ser
- 36 043746
Glu Leu Asn
210
Leu
Ser
Ser
Leu
215
Glu
Leu
Gly
Asp
Ser 220
Ala
Leu
Tyr
Phe
Cys Ala Ser 225
Ser
Val
Glu
230
Ser
Ser
Tyr
Gly
Tyr 235
Thr
Phe
Gly
Ser
Gly 240
Thr Arg Leu
Thr
Val
245
Val
Glu
Asp
Leu
Asn
250
Lys <210>26 <211>6 <212> PRT <213> Homo <400>26
Asp Arg Arg 1 sapiens
Ser Gln
Ser <210>27 <211>247 <212> PRT <213> Homo <400>27
Gln Lys Glu 1 sapiens
Val
Glu 5
Gln
Asn
Ser
Gly
Pro 10
Leu
Ser
Val
Pro
Glu 15
Gly
Ala Ile Ala
Ser 20
Leu
Asn
Cys
Thr
Tyr 25
Ser
Asp
Arg
Arg
Ser 30
Gln
Ser
Phe Phe Trp
Tyr
Arg
Gln
Tyr
Ser 40
Gly
Lys
Ser
Pro
Glu 45
Leu
Ile
Met
Ser Ile Tyr 50
Ser
Asn
Gly
Asp 55
Lys
Glu
Asp
Gly
Arg 60
Phe
Thr
Ala
Gln
Leu Asn Lys 65
Ala
Ser
Gln 70
Tyr
Val
Ser
Leu
Leu 75
Ile
Arg
Asp
Ser
Gln 80
Pro Ser Asp
Ser
Ala 85
Thr
Tyr
Leu
Cys
Ala 90
Ala
Tyr
Ser
Gly
Ala 95
Gly
Ser Tyr Gln
Leu
100
Thr
Phe
Gly
Lys
Gly 105
Thr
Lys
Leu
Ser
Val
110
Ile
Pro
Gly Gly Gly
115
Gly
Ser
Gly
Gly
Gly 120
Gly 125
Gly
Ser
Gly
Gly
Gly
Ser
Gly
- 37 043746
Gly Gly Gly Ser Gly 130
Gly Gly Gly Ser Gly
135
Val Thr Gln Thr Pro
140
His Leu Ile Thr Ala 145
Thr Gly Gln Arg Val 150
Thr Leu Arg Cys Ser 155
Arg Ser Gly Asp Leu
165
Ser Val Tyr Trp Tyr
170
Lys Gln Ser Leu Asp
175
Gly Leu Gln Phe Leu
180
Ile Gln Tyr Tyr Asn
185
Gly Glu Glu Arg Ala
190
Gly Asn Ile Ser Glu 195
Arg Phe Ser Ala Gln 200
Gln Phe Pro Asp Leu
205
Ser Glu Leu Asn Leu
210
Ser Ser Leu Glu Leu
215
Gly Asp Ser Ala Leu
220
Phe Cys Ala Ser Ser 225
Val Glu Ser Ser Tyr 230
Gly Tyr Thr Phe Gly 235
Lys
Pro 160
Gln
Lys
His
Tyr
Ser 240
Gly Thr Arg Leu Thr
245
Val Val <210>28 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>28
Ala Leu Leu Asp Gly Arg Val Gln Leu <210>29 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>29
Arg Leu Leu Asp Gly Ala Phe Lys Leu <210>30 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>30
Ile Leu Leu Asp Gly Ser Ala Ser Val
- 38 043746 <210>31 <211>9 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>31
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Glu Arg Leu 15 < 210>32 < 211>10 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>32
Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu 15
Val 10 < 210>33 < 211>9 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>33
Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu 15 < 210>34 < 211>9 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>34
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Glu Gly Val 15 < 210>35 < 211>9 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>35
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Asn Ser Val <210>36 <211>9 <212> PRT <213> Homo sapiens
- 39 043746 <400>36
Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu 15 <210>37 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>37
Ala Arg Trp His Asn Asn <210>38 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>38
Ala Lys Asp His Leu Asn <210>39 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>39
Ala Arg Trp His Arg Asn <210>40 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>40
Ala Met Asp His Pro Tyr <210>41 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>41
Ala Thr Asp His Tyr Asn <210>42 <211>6
- 40 043746 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>42
Ala Arg Tyr His Thr Asn <210>43 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>43
Ala Pro Tyr His Leu Asn <210>44 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>44
Ala Lys Asp His Thr Asn <210>45 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>45
Ala Arg Tyr His Arg Asn <210>46 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>46
Ala Arg Trp His Ser Asn <210>47 <211>6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>47
Ala Thr Asp His Tyr Asn
- 41 043746 <210>48 < 211>6 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>48
Arg Trp Gly Asp Leu Asn 15 < 210>49 < 211>6 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>49
Ala Arg Asp His Leu Asn <210>50 <211>514 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>50
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser 1 5
Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
15
Tyr Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 20
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 25 30
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
40
Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly 45
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln
55
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 60
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys 65 70
Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
80
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser 85
Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
95
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
100
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
105 110
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly
115 120
Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
- 42 043746
Lys Ser Thr
155
Ser Gly Gly
160
130
135
140
Pro 145
Thr
Thr
Pro
Thr
Asn 225
Ser
Ala
Glu
Gln
Ile 305
Ala
Ser
Ala
Ile
Ser Val Phe
Pro Leu Ala
150
Pro Ser Ser
Ala Ala Leu
Val Ser Trp
180
Ala Val Leu
195
Val Pro Ser 210
His Lys Pro
Cys Asp Lys
Gly Gln Lys
260
Gly Ala Ile
275
Ser Phe Phe 290
Met Ser Ile
Gln Leu Asn
Gln Pro Ser
340
Gly Ser Tyr
355
Pro Asn Ile 370
Gly Cys Leu 165
Val Lys Asp
170
Tyr Phe Pro
Glu Pro Val
175
Asn Ser Gly
Ala Leu Thr
185
Ser Gly Val
His Thr Phe 190
Gln Ser Ser
Gly Leu Tyr 200
Ser Leu Ser
205
Ser Val Val
Ser Ser Leu
215
Ser Asn Thr
230
Thr His Thr 245
Glu Val Glu
Ala Ser Leu
Trp Tyr Arg
295
Tyr Ser Asn
310
Lys Ala Ser 325
Asp Ser Ala
Gln Leu Thr
Gln Asn Gly
375
Gly Thr Gln
Thr Tyr Ile
220
Cys Asn Val
Lys Val Asp
Lys Lys Val 235
Glu Pro Lys
240
Ser Pro Pro
250
Ser Pro Ala
Pro Pro Val
255
Gln Asn Ser
265
Gly Pro Leu
Ser Val Pro 270
Asn Cys Thr 280
Tyr Ser Asp
285
Arg Gly Ser
Gln Tyr Ser
Gly Lys Ser
300
Pro Glu Leu
Gly Asp Lys
Gln Tyr Val
330
Thr Tyr Leu
345
Phe Gly Lys 360
Gly Gly Gly
Glu Asp Gly 315
Ser Leu Leu
Cys Ala Ala
Gly Thr Lys
365
Ser Gly Gly
380
Arg Phe Thr
320
Ile Arg Asp
335
Tyr Ser Gly 350
Leu Ser Val
Gly Gly Ser
- 43 043746
Gly 385
Gly
Gly
Gly
Ser
Gly 390
Gly
Gly
Gly
Ser
Gly 395
Gly
Gly
Gly
Ser
Val
Thr
Gln
Thr
Pro
405
Lys
His
Leu
Ile
Thr
410
Ala
Thr
Gly
Gln
Arg 415
Thr
Leu
Arg
Cys 420
Ser
Pro
Arg
Ser
Gly 425
Asp
Leu
Ser
Val
Tyr 430
Trp
Lys
Gln
Ser
435
Leu
Asp
Gln
Gly
Leu
440
Gln
Phe
Leu
Ile
Gln
445
Tyr
Tyr
Gly Glu
450
Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Ser
455
Glu Arg Phe Ser Ala 460
Gln Phe 465
Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn 470
Leu Ser Ser Leu Glu 475
Gly Asp
Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
485 490
Ser Val Glu Ser Ser
495
Gly Tyr
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu
500 505
Thr Val Val Glu Asp
510
Gly 400
Val
Tyr
Asn
Gln
Leu 480
Tyr
Leu
Lys Asn <210>51 <211>258 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>51
Met Lys Trp Val Thr 15
Phe Ile Ser Leu Leu
Phe Leu Phe Ser Ser
Tyr Glu Val Gln Leu
Val Glu Ser Gly Gly
Gly Leu Val Gln Pro 30
Gly Ser Leu Arg Leu 35
Ser Cys Ala Ala Ser 40
Gly Tyr Ser Phe Thr 45
Tyr Thr Met Asn Trp 50
Val Arg Gln Ala Pro 55
Gly Lys Gly Leu Glu 60
Val Ala Leu Ile Asn 65
Pro Tyr Lys Gly Val 70
Ser Thr Tyr Asn Gln 75
Ala
Gly
Gly
Trp
Lys 80
- 44 043746
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val 85
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
100 105
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp
115 120
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
145 150
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
165
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
180 185
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
195 200
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
210 215
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 225 230
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro
245
Ala Gly <210>52 <211>232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>52
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu 15
Tyr Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 20 25
Lys Ser Lys Asn Thr Ala 95
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
110
Asp Trp Tyr Phe Asp Val
125
Ser Ala Ser Thr Lys Gly
140
Lys Ser Thr Ser Gly Gly
155 160
Tyr Phe Pro Glu Pro Val
175
Ser Gly Val His Thr Phe
190
Ser Leu Ser Ser Val Val
205
Thr Tyr Ile Cys Asn Val
220
Lys Lys Val Glu Pro Lys
235 240
Ser Pro Ala Pro Pro Val
255
Phe Leu Phe Ser Ser Ala
Ser Ser Leu Ser Ala Ser
- 45 043746
Val Gly Asp Arg Val 35
Thr Ile Thr Cys Arg 40
Ala Ser Gln Asp Ile 45
Asn Tyr Leu Asn Trp 50
Tyr Gln Gln Lys Pro 55
Gly Lys Ala Pro Lys 60
Leu Ile Tyr Tyr Thr 65
Ser Arg Leu Glu Ser 70
Gly Val Pro Ser Arg 75
Ser Gly Ser Gly Ser 85
Gly Thr Asp Tyr Thr 90
Leu Thr Ile Ser Ser
Gln Pro Glu Asp Phe
100
Ala Thr Tyr Tyr Cys
105
Gln Gln Gly Asn Thr
110
Pro Trp Thr Phe Gly 115
Gln Gly Thr Lys Val 120
Glu Ile Lys Arg Thr
125
Ala Ala Pro Ser Val
130
Phe Ile Phe Pro Pro
135
Ser Asp Glu Gln Leu
140
Ser Gly Thr Ala Ser 145
Val Val Cys Leu Leu 150
Asn Asn Phe Tyr Pro 155
Glu Ala Lys Val Gln
165
Trp Lys Val Asp Asn
170
Ala Leu Gln Ser Gly
175
Ser Gln Glu Ser Val
180
Thr Glu Gln Asp Ser
185
Lys Asp Ser Thr Tyr
190
Leu Ser Ser Thr Leu
195
Thr Leu Ser Lys Ala 200
Asp Tyr Glu Lys His 205
Val Tyr Ala Cys Glu
210
Val Thr His Gln Gly
215
Leu Ser Ser Pro Val
220
Arg
Leu
Phe 80
Leu
Leu
Val
Lys
Arg 160
Asn
Ser
Lys
Thr
Lys Ser Phe Asn Arg 225
Gly Glu Cys 230 <210>53 <211>274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>53
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu 1 5
Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln
15
Trp
- 46 043746
Val Ser Ser Lys Gln
Glu Val Thr Gln Ile
Pro Ala Ala Leu Ser
Pro Glu Gly Glu Asn 35
Leu Val Leu Asn Cys 40
Ser Phe Thr Asp Ser 45
Ile Tyr Asn Leu Gln 50
Trp Phe Arg Gln Asp 55
Pro Gly Lys Gly Leu 60
Ser Leu Leu Leu Ile 65
Gln Ser Ser Gln Arg 70
Glu Gln Thr Ser Gly 75
Leu Asn Ala Ser Leu
Asp Lys Ser Ser Gly 90
Arg Ser Thr Leu Tyr 95
Ala Ala Ser Gln Pro
100
Gly Asp Ser Ala Thr
105
Tyr Leu Cys Ala Val
110
Pro Thr Ser Gly Gly 115
Ser Tyr Ile Pro Thr 120
Phe Gly Arg Gly Thr 125
Leu Ile Val His Pro
130
Tyr Ile Gln Asn Pro
135
Asp Pro Ala Val Tyr 140
Leu Arg Asp Ser Lys 145
Ser Ser Asp Lys Ser 150
Val Cys Leu Phe Thr 155
Phe Asp Ser Gln Thr
165
Asn Val Ser Gln Ser
170
Lys Asp Ser Asp Val
175
Ile Thr Asp Lys Thr
180
Val Leu Asp Met Arg
185
Ser Met Asp Phe Lys
190
Asn Ser Ala Val Ala
195
Trp Ser Asn Lys Ser 200
Asp Phe Ala Cys Ala 205
Ala Phe Asn Asn Ser
210
Ile Ile Pro Glu Asp
215
Thr Phe Phe Pro Ser
220
Glu Ser Ser Cys Asp 225
Val Lys Leu Val Glu 230
Lys Ser Phe Glu Thr 235
Thr Asn Leu Asn Phe
245
Gln Asn Leu Ser Val
250
Ile Gly Phe Arg Ile
255
Leu Leu Lys Val Ala
260
Gly Phe Asn Leu Leu
265
Met Thr Leu Arg Leu
270
Val
Ala
Thr
Arg 80
Ile
Arg
Ser
Gln
Asp 160
Tyr
Ser
Asn
Pro
Asp 240
Leu
Trp
- 47 043746
Ser Ser <210>54 <211>20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>54
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile 15
Val Ser Ser Lys 20 <210>55 < 211>113 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>55
Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala
Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr 20 25
Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys
40
Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr
55
Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr 65 70
Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys 85
Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg
100 105
Trp Leu Gln Leu Gln Trp
Ser Val Pro Glu Gly Glu
Ser Ala Ile Tyr Asn Leu 30
Leu Thr Ser Leu Leu Leu
Gly Arg Leu Asn Ala Ser 60
Tyr Ile Ala Ala Ser Gln 75 80
Val Arg Pro Thr Ser Gly 95
Thr Ser Leu Ile Val His
110
Pro <210> 56 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens
- 48 043746 <400> 56
Tyr Ile Gln Asn Pro 1 5
Asp Pro Ala Val Tyr
Gln Leu Arg Asp Ser
Ser Ser Asp Lys Ser 20
Val Cys Leu Phe Thr
Asp Phe Asp Ser Gln 30
Asn Val Ser Gln Ser 35
Lys Asp Ser Asp Val 40
Tyr Ile Thr Asp Lys 45
Val Leu Asp Met Arg 50
Ser Met Asp Phe Lys 55
Ser Asn Ser Ala Val
Trp Ser Asn Lys Ser 65
Asp Phe Ala Cys Ala 70
Asn Ala Phe Asn Asn 75
Ile Ile Pro Glu Asp 85
Thr Phe Phe Pro Ser
Pro Glu Ser Ser Cys 95
Val Lys Leu Val Glu
100
Lys Ser Phe Glu Thr
105
Asp Thr Asn Leu Asn
110
Gln Asn Leu Ser Val
115
Ile Gly Phe Arg Ile 120
Leu Leu Leu Lys Val 125
Lys
Thr
Thr
Ala
Ser 80
Asp
Phe
Ala
Gly Phe Asn Leu Leu 130
Met Thr Leu Arg Leu
135
Trp Ser Ser
140 <210>57 <211>311 <212> PRT <213> Homo <400>57
Met Ser Ile 1
Gly Pro Val
Lys Thr Gly
Glu Tyr Met 50
Ile His Tyr sapiens
Gly Leu Leu 5
Asn Ala Gly 20
Gln Ser Met
Ser Trp Tyr
Ser Val Gly
Cys Cys Ala
Val Thr Gln
Thr Leu Gln
Arg Gln Asp 55
Ala Gly Ile
Ala Leu Ser 10
Thr Pro Lys
Cys Ala Gln
Pro Gly Met 60
Thr Asp Gln
Leu Leu Trp 15
Phe Gln Val
Asp Met Asn 45
Gly Leu Arg
Gly Glu Val
Ala
Leu
His
Leu
Pro
- 49 043746
Glu Asp Phe Pro Leu
Asn Gly Tyr Asn Val 85
Ser Arg Ser Thr Thr 90
Leu Leu Ser Ala Ala
100
Pro Ser Gln Thr Ser
105
Val Tyr Phe Cys Ala
110
Ser Tyr Val Gly Asn
115
Thr Gly Glu Leu Phe
120
Phe Gly Glu Gly Ser 125
Leu Thr Val Leu Glu
130
Asp Leu Lys Asn Val
135
Phe Pro Pro Glu Val
140
Val Phe Glu Pro Ser 145
Glu Ala Glu Ile Ser 150
His Thr Gln Lys Ala 155
Leu Val Cys Leu Ala
165
Thr Gly Phe Tyr Pro
170
Asp His Val Glu Leu
175
Trp Trp Val Asn Gly
180
Lys Glu Val His Ser
185
Gly Val Ser Thr Asp
190
Gln Pro Leu Lys Glu 195
Gln Pro Ala Leu Asn
200
Asp Ser Arg Tyr Cys 205
Ser Ser Arg Leu Arg
210
Val Ser Ala Thr Phe
215
Trp Gln Asn Pro Arg
220
His Phe Arg Cys Gln 225
Val Gln Phe Tyr Gly 230
Leu Ser Glu Asn Asp 235
Trp Thr Gln Asp Arg
245
Ala Lys Pro Val Thr
250
Gln Ile Val Ser Ala
255
Ala Trp Gly Arg Ala
260
Asp Cys Gly Phe Thr
265
Ser Glu Ser Tyr Gln
270
Gly Val Leu Ser Ala
275
Thr Ile Leu Tyr Glu 280
Ile Leu Leu Gly Lys
285
Thr Leu Tyr Ala Val
290
Leu Val Ser Ala Leu
295
Val Leu Met Ala Met
300
Arg
Ser
Arg
Ala
Thr 160
Ser
Pro
Leu
Asn
Glu 240
Glu
Gln
Ala
Val
Lys Arg Lys Asp Ser 305
Arg Gly 310
- 50 043746
Leu Ser Leu Leu Trp Ala <210>58 <211>21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>58
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala 15
Gly Pro Val Asn Ala 20 <210>59 <211>111 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>59
Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln
Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met 20 25
Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu
40
Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu
55
Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro 65 70
Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys 85
Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly
100 105 <210>60 < 211>179 < 212> PRT < 213> Homo sapiens < 400>60
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
25
Leu Lys Thr Gly Gln Ser
His Glu Tyr Met Ser Trp 30
Leu Ile His Tyr Ser Val 45
Pro Asn Gly Tyr Asn Val 60
Arg Leu Leu Ser Ala Ala 75 80
Ser Ser Tyr Val Gly Asn 95
Arg Leu Thr Val Leu
110
Val Ala Val Phe Glu Pro
Ala Thr Leu Val Cys Leu 30
- 51 043746
Leu Ser Trp Trp Val Asn
Ala Thr Gly 35 Phe Tyr Pro Asp His 40 Val
Gly Lys 50 Glu Val His Ser Gly 55 Val Ser
Glu 65 Gln Pro Ala Leu Asn 70 Asp Ser Arg
Arg Val Ser Ala Thr 85 Phe Trp Gln Asn
Gln Val Gln Phe 100 Tyr Gly Leu Ser Glu 105
Arg Ala Lys 115 Pro Val Thr Gln Ile 120 Val
Ala Asp 130 Cys Gly Phe Thr Ser 135 Glu Ser
Ala 145 Thr Ile Leu Tyr Glu 150 Ile Leu Leu
Val Leu Val Ser Ala 165 Leu Val Leu Met
Ser Arg Gly
<210> <211> <212> <213> 61 9 PRT Homo sapiens
<400> 61
Ser 1 Leu Leu Met Trp 5 Ile Thr Gln Val
<210> <211> <212> <213> 62 308 PRT Homo sapiens
<400> 62
Met 1 Gly Phe Arg Leu 5 Leu Cys Cys Val
Asp Pro Gln Pro Leu Lys 60
Cys Leu Ser Ser Arg Leu 75 80
Arg Asn His Phe Arg Cys 95
Asp Glu Trp Thr Gln Asp
110
Ala Glu Ala Trp Gly Arg
125
Gln Gln Gly Val Leu Ser
140
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
155 160
Met Val Lys Arg Lys Asp
175
Phe Cys Leu Leu Gly Ala
- 52 043746
Gly
Ala
Pro
Leu 65
Glu
Leu
Ser
Thr
Phe 145
Val
Trp
Pro
Ser
Phe 225
Thr
Trp
Pro Val Asp Ser Gly 20
Thr Gly Gln Arg Val 35
Tyr Val Tyr Trp Tyr 50
Ile Gln Tyr Tyr Asn 70
Arg Phe Ser Ala Gln 85
Ser Ser Leu Glu Leu
100
Val Glu Ser Ser Tyr 115
Val Val Glu Asp Leu 130
Glu Pro Ser Glu Ala
150
Cys Leu Ala Thr Gly
165
Val Asn Gly Lys Glu
180
Leu Lys Glu Gln Pro
195
Arg Leu Arg Val Ser 210
Arg Cys Gln Val Gln
230
Gln Asp Arg Ala Lys
245
Gly Arg Ala Asp Cys 260
Val Thr Gln Thr Pro
Thr Leu Arg Cys Ser 40
Gln Gln Ser Leu Asp 55
Gly Glu Glu Arg Ala
Gln Phe Pro Asp Leu
Gly Asp Ser Ala Leu 105
Gly Tyr Thr Phe Gly 120
Asn Lys Val Phe Pro 135
Glu Ile Ser His Thr
155
Phe Phe Pro Asp His
170
Val His Ser Gly Val
185
Ala Leu Asn Asp Ser 200
Ala Thr Phe Trp Gln 215
Phe Tyr Gly Leu Ser
235
Pro Val Thr Gln Ile
250
Gly Phe Thr Ser Val
265
Lys His Leu Ile Thr 30
Pro Ala Met Asp His 45
Gln Gly Leu Gln Phe 60
Lys Gly Asn Ile Leu 80
His Ser Glu Leu Asn
Tyr Phe Cys Ala Ser
110
Ser Gly Thr Arg Leu
125
Pro Glu Val Ala Val 140
Gln Lys Ala Thr Leu
160
Val Glu Leu Ser Trp
175
Ser Thr Asp Pro Gln 190
Arg Tyr Cys Leu Ser 205
Asn Pro Arg Asn His 220
Glu Asn Asp Glu Trp
240
Val Ser Ala Glu Ala
255
Ser Tyr Gln Gln Gly
270
- 53 043746
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu
275 280
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu
290 295
Arg Lys Asp Phe 305 <210>63 <211>274 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>63
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val 20 25
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser
40
Arg Arg Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr
55
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser 65 70
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala 85
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser
100 105
Tyr Ser Gly Ala Gly Ser Tyr Gln Leu
115 120
Leu Ser Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn
130 135
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys 145 150
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln
165
Leu Leu Gly Lys Ala Thr
285
Leu Met Ala Met Val Lys 300
Leu Trp Leu Gln Leu Ser
Gln Asn Ser Gly Pro Leu 30
Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 45
Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 60
Gly Asp Lys Glu Asp Gly 75 80
Gln Tyr Val Ser Leu Leu 95
Thr Tyr Leu Cys Ala Ala
110
Phe Gly Lys Gly Thr Lys
125
Asp Pro Ala Val Tyr Gln
140
Val Cys Leu Phe Thr Asp
155 160
Lys Asp Ser Asp Val Tyr
175
- 54 043746
Ile Thr Asp
Asn Ser Ala
195
Ala Phe Asn
210
Glu Ser Ser 225
Thr Asn Leu
Leu Leu Lys
Lys 180
Val
Asn
Cys
Asn
Val 260
Thr
Ala
Ser
Asp
Phe 245
Ala
Val
Trp
Ile
Val 230
Gln
Gly
Leu
Ser
Ile 215
Lys
Asn
Phe
Asp
Asn 200
Pro
Leu
Leu
Asn
Met 185
Lys
Glu
Val
Ser
Leu 265
Arg
Ser
Asp
Glu
Val 250
Leu
Ser
Asp
Thr
Lys 235
Ile
Met
Met Asp Phe Lys
190
Phe Ala Cys Ala
205
Phe Phe Pro Ser 220
Ser Phe Glu Thr
Gly Phe Arg Ile
255
Thr Leu
Arg Leu 270
Ser
Asn
Pro
Asp 240
Leu
Trp
Ser Ser <210>64 <211>515 <212> PRT <213> Homo <400>64
Met Lys Trp 1 sapiens
Val Thr Phe
Ile Ser Leu
Leu Phe Leu 10
Phe Ser Ser
Tyr Ser Glu
Val Gln Leu 20
Val Glu Ser
Gly Gly Gly
Leu Val Gln
Gly Gly Ser
Leu Arg Leu
Ser Cys Ala 40
Ala Ser Gly
Tyr Ser Phe 45
Gly Tyr Thr 50
Met Asn Trp
Val Arg Gln 55
Ala Pro Gly 60
Lys Gly Leu
Trp Val Ala 65
Leu Ile Asn
Pro Tyr Lys
Gly Val Ser
Thr Tyr Asn
Lys Phe Lys
Asp Arg Phe 85
Thr Ile Ser
Val Asp Lys 90
Ser Lys Asn
Ala Tyr Leu
Gln Met Asn 100
Ser Leu Arg
105
Ala Glu Asp
Thr Ala Val
110
Ala
Pro
Thr
Glu
Gln 80
Thr
Tyr
- 55 043746
Tyr Cys Ala Arg Ser 115
Gly Tyr Tyr Gly Asp
120
Ser Asp Trp Tyr Phe
125
Val Trp Gly Gln Gly
130
Thr Leu Val Thr Val
135
Ser Ser Ala Ser Thr
140
Gly Pro Ser Val Phe 145
Pro Leu Ala Pro Ser 150
Ser Lys Ser Thr Ser 155
Gly Thr Ala Ala Leu
165
Gly Cys Leu Val Lys
170
Asp Tyr Phe Pro Glu
175
Val Thr Val Ser Trp
180
Asn Ser Gly Ala Leu
185
Thr Ser Gly Val His
190
Phe Pro Ala Val Leu
195
Gln Ser Ser Gly Leu 200
Tyr Ser Leu Ser Ser 205
Val Thr Val Pro Ser
210
Ser Ser Leu Gly Thr
215
Gln Thr Tyr Ile Cys 220
Val Asn His Lys Pro 225
Ser Asn Thr Lys Val 230
Asp Lys Lys Val Glu 235
Lys Ser Cys Asp Lys
245
Thr His Thr Ser Pro
250
Pro Ser Pro Ala Pro
255
Val Ala Gly Gln Lys
260
Glu Val Glu Gln Asn
265
Ser Gly Pro Leu Ser
270
Pro Glu Gly Ala Ile
275
Ala Ser Leu Asn Cys 280
Thr Tyr Ser Asp Arg
285
Ser Gln Ser Phe Phe
290
Trp Tyr Arg Gln Tyr
295
Ser Gly Lys Ser Pro
300
Leu Ile Met Ser Ile 305
Tyr Ser Asn Gly Asp 310
Lys Glu Asp Gly Arg 315
Thr Ala Gln Leu Asn
325
Lys Ala Ser Gln Tyr
330
Val Ser Leu Leu Ile
335
Asp Ser Gln Pro Ser
340
Asp Ser Ala Thr Tyr
345
Leu Cys Ala Ala Tyr
350
Gly Ala Gly Ser Tyr
Gln Leu Thr Phe Gly
Lys Gly Thr Lys Leu
Asp
Lys
Gly 160
Pro
Thr
Val
Asn
Pro 240
Pro
Val
Gly
Glu
Phe 320
Arg
Ser
Ser
- 56 043746
Ser Gly
380
Gly Gly
355
Val Ile Pro
370
Asn Ile
Gln Asn
375
Ser Gly Gly 385
Gly Gly
Ser Gly 390
Gly Val Thr
Gln Thr
405
Pro Lys
Val Thr Leu
Arg Cys 420
Ser Pro
Tyr Lys Gln
435
Ser Leu
Asp Gln
Asn Gly Glu
450
Glu Arg
Ala Lys
455
Gln Gln Phe 465
Pro Asp
Leu His 470
Leu Gly Asp
Ser Ala
485
Leu Tyr
Tyr Gly Tyr
Thr Phe 500
Gly Ser
360
Gly Gly
Gly Gly
His Leu
Ala Met 425
Gly Leu 440
Gly Asn
Ser Glu
Phe Cys
Gly Thr 505
Gly Gly
Gly Ser
395
Ile Thr 410
Asp His
Gln Phe
Ile Ser
Leu Asn
475
Ala Ser 490
Arg Leu
365
Gly Gly
Ala Thr
Pro Tyr
Leu Ile
445
Glu Arg 460
Leu Ser
Ser Val
Thr Val
Gly Gly
Gly Gln
415
Val Tyr 430
Gln Tyr
Phe Ser
Ser Leu
Glu Ser
495
Val Glu 510
Gly
Ser 400
Arg
Trp
Tyr
Ala
Glu 480
Ser
Asp
Leu Lys Asn
515 <210>65 <211>515 <212> PRT <213> Homo <400>65
Met Lys Trp 1
Tyr Ser Glu
Gly Gly Ser
Gly Tyr Thr sapiens
Val Thr Phe 5
Val Gln Leu 20
Leu Arg Leu
Met Asn Trp
Ile Ser Leu
Val Glu Ser 25
Ser Cys Ala 40
Val Arg Gln
Leu Phe Leu 10
Gly Gly Gly
Ala Ser Gly
Ala Pro Gly
Phe Ser Ser
Leu Val Gln
Tyr Ser Phe 45
Lys Gly Leu
Ala
Pro
Thr
Glu
- 57 043746
Val Ser Thr Tyr Asn
Trp Val Ala Leu Ile 65
Asn Pro Tyr Lys Gly 70
Lys Phe Lys Asp Arg 85
Phe Thr Ile Ser Val
Asp Lys Ser Lys Asn 95
Ala Tyr Leu Gln Met
100
Asn Ser Leu Arg Ala
105
Glu Asp Thr Ala Val
110
Tyr Cys Ala Arg Ser 115
Gly Tyr Tyr Gly Asp
120
Ser Asp Trp Tyr Phe
125
Val Trp Gly Gln Gly
130
Thr Leu Val Thr Val
135
Ser Ser Ala Ser Thr
140
Gly Pro Ser Val Phe 145
Pro Leu Ala Pro Ser 150
Ser Lys Ser Thr Ser 155
Gly Thr Ala Ala Leu
165
Gly Cys Leu Val Lys
170
Asp Tyr Phe Pro Glu
175
Val Thr Val Ser Trp
180
Asn Ser Gly Ala Leu
185
Thr Ser Gly Val His
190
Phe Pro Ala Val Leu
195
Gln Ser Ser Gly Leu 200
Tyr Ser Leu Ser Ser 205
Val Thr Val Pro Ser
210
Ser Ser Leu Gly Thr
215
Gln Thr Tyr Ile Cys
220
Val Asn His Lys Pro 225
Ser Asn Thr Lys Val 230
Asp Lys Lys Val Glu 235
Lys Ser Cys Asp Lys
245
Thr His Thr Ser Pro
250
Pro Ser Pro Ala Pro
255
Val Ala Gly Gln Lys
260
Glu Val Glu Gln Asn
265
Ser Gly Pro Leu Ser
270
Pro Glu Gly Ala Ile
275
Ala Ser Leu Asn Cys 280
Thr Tyr Ser Asp Arg
285
Ser Gln Ser Phe Phe
290
Trp Tyr Arg Gln Tyr
295
Ser Gly Lys Ser Pro
300
Gln 80
Thr
Tyr
Asp
Lys
Gly 160
Pro
Thr
Val
Asn
Pro 240
Pro
Val
Arg
Glu
- 58 043746
Leu
305
Ile
Met
Ser
Ile
Tyr 310
Ser
Asn
Gly
Asp
Lys 315
Glu
Asp
Gly
Arg
Phe
320
Thr
Ala
Gln
Leu
Asn
325
Lys
Ala
Ser
Gln
Tyr 330
Val
Ser
Leu
Leu
Ile
335
Arg
Asp
Ser
Gln
Pro
340
Ser
Asp
Ser
Ala
Thr
345
Tyr
Leu
Cys
Ala
Ala
350
Tyr
Ser
Gly Ala Gly Ser
355
Tyr Gln Leu
Thr Phe Gly 360
Lys Gly Thr
365
Lys Leu Ser
Val Ile Pro Asn
370
Ile Gln Asn
375
Gly Gly Gly
Gly Ser Gly
380
Gly Gly Gly
Ser Gly Gly Gly 385
Gly Ser Gly
390
Gly Gly Gly
Ser Gly Gly 395
Gly Gly Ser
400
Gly Val Thr Gln
Thr Pro Lys 405
His Leu Ile
410
Thr Ala Thr
Gly Gln Arg
415
Val Thr Leu Arg
420
Cys Ser Pro
Ala Met Asp
425
His Pro Tyr
Val Tyr Trp 430
Tyr Lys
Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe Leu 435 440
Ile Gln Tyr Tyr 445
Asn
Gln 465
Leu
Tyr
Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Ser 450 455
Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
470 475
Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
485 490
Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu
500 505
Leu Lys Asn
515 <210> 66 <211> 515 <212> PRT <213> Homo sapiens
Glu Arg Phe Ser Ala 460
Leu Ser Ser Leu Glu
480
Ser Val Glu Ser Ser
495
Thr Val Val Glu Asp 510 <400> 66
- 59 043746
Met
Tyr
Gly
Gly
Trp 65
Lys
Ala
Tyr
Val
Gly 145
Gly
Val
Phe
Val
Val 225
Lys
Lys Trp Val Thr Phe 5
Ser Glu Val Gln Leu
Gly Ser Leu Arg Leu 35
Tyr Thr Met Asn Trp 50
Val Ala Leu Ile Asn
Phe Lys Asp Arg Phe 85
Tyr Leu Gln Met Asn
100
Cys Ala Arg Ser Gly 115
Trp Gly Gln Gly Thr 130
Pro Ser Val Phe Pro
150
Thr Ala Ala Leu Gly
165
Thr Val Ser Trp Asn
180
Pro Ala Val Leu Gln
195
Thr Val Pro Ser Ser 210
Asn His Lys Pro Ser
230
Ser Cys Asp Lys Thr
245
Ile Ser Leu Leu Phe
Leu Phe Ser Ser Ala
Val Glu Ser Gly Gly 25
Gly Leu Val Gln Pro 30
Ser Cys Ala Ala Ser 40
Gly Tyr Ser Phe Thr 45
Val Arg Gln Ala Pro 55
Pro Tyr Lys Gly Val
Thr Ile Ser Val Asp 90
Ser Leu Arg Ala Glu
105
Tyr Tyr Gly Asp Ser 120
Leu Val Thr Val Ser 135
Leu Ala Pro Ser Ser
155
Cys Leu Val Lys Asp
170
Ser Gly Ala Leu Thr
185
Ser Ser Gly Leu Tyr
200
Ser Leu Gly Thr Gln 215
Asn Thr Lys Val Asp
235
His Thr Ser Pro Pro
250
Gly Lys Gly Leu Glu 60
Ser Thr Tyr Asn Gln 80
Lys Ser Lys Asn Thr 95
Asp Thr Ala Val Tyr 110
Asp Trp Tyr Phe Asp 125
Ser Ala Ser Thr Lys 140
Lys Ser Thr Ser Gly
160
Tyr Phe Pro Glu Pro
175
Ser Gly Val His Thr 190
Ser Leu Ser Ser Val
205
Thr Tyr Ile Cys Asn 220
Lys Lys Val Glu Pro
240
Ser Pro Ala Pro Pro
255
- 60 043746
Val
Gly
Val
Gln 305
Phe
Ser
Glu
Val
Gly 385
Lys
Ile
Phe
Ile
Asn 465
Ser
Tyr
Ala Gly
Gln Arg
275
Tyr Trp 290
Tyr Tyr
Ser Ala
Leu Glu
Ser Ser
355
Glu Asp 370
Gly Gly
Glu Val
Ala Ser
Trp Tyr
435
Tyr Ser 450
Lys Ala
Asp Ser
Gln Leu
Gly Val 260
Val Thr
Tyr Lys
Asn Gly
Gln Gln
325
Leu Gly 340
Tyr Gly
Leu Lys
Gly Ser
Glu Gln
405
Leu Asn 420
Arg Gln
Asn Gly
Ser Gln
Ala Thr
485
Thr Phe 500
Thr Gln
Leu Arg
Gln Ser
295
Glu Glu 310
Phe Pro
Asp Ser
Tyr Thr
Asn Gly
375
Gly Gly 390
Asn Ser
Cys Thr
Tyr Ser
Asp Lys
455
Tyr Val 470
Tyr Leu
Gly Lys
Thr Pro
265
Cys Ser 280
Leu Asp
Arg Ala
Asp Leu
Ala Leu
345
Phe Gly 360
Gly Gly
Gly Gly
Gly Pro
Tyr Ser
425
Gly Lys 440
Glu Asp
Ser Leu
Cys Ala
Gly Thr
505
Lys His
Leu Ile
Pro Arg
Gln Gly
Lys Gly
315
His Ser 330
Tyr Phe
Ser Gly
Gly Ser
Ser Gly
395
Leu Ser 410
Asp Arg
Ser Pro
Gly Arg
Leu Ile
475
Ala Tyr 490
Lys Leu
Ser Gly
285
Leu Gln 300
Asn Ile
Glu Leu
Cys Ala
Thr Arg
365
Gly Gly 380
Gly Gly
Val Pro
Arg Ser
Glu Leu
445
Phe Thr 460
Arg Asp
Ser Gly
Ser Val
Thr Ala 270
Asp Leu
Phe Leu
Ser Glu
Asn Leu
335
Ser Ser
350
Leu Thr
Gly Gly
Gly Ser
Glu Gly
415
Gln Ser 430
Ile Met
Ala Gln
Ser Gln
Ala Gly
495
Ile Pro
510
Thr
Ser
Ile
Arg 320
Ser
Val
Val
Ser
Gln 400
Ala
Phe
Ser
Leu
Pro 480
Ser
Asn
-

Claims (33)

  1. Ile Gln Asn
    515
    ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антигенраспознающая структура, которая является стабильной и способной специфически и/или селективно связываться с антигенным пептидом COL6A3, включающая первый домен и второй домен, каждый включающий три комплементарных детерминантных участка (CDR), где первый домен содержит аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6 (CDRa2) и 7 (CDRa3) и второй домен содержит аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 14 (CDRb2) и 15 (CDRb3), причем:
    а) CDRa1 первого домена изложен в SEQ ID NO: 5 и CDRb1 второго домена выбран из одной из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 37-44 или
    б) CDRa1 первого домена изложен в SEQ ID NO: 26 и CDRb1 второго домена выбран из одной из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 13 и 37-49;
    где антигенраспознающая структура является T-клеточным рецептором (ТКР), или его производным, или его фрагментом, где производное или фрагмент сохраня.т антигенсвязывающую и/или распознающую способность молекулы специфически и/или селективно связываться с антигенным полипептидом COL6A3.
  2. 2. Антигенраспознающая структура по п.1, в которой:
    (i) первый домен содержит SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 и второй домен содержит SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 40 или (ii) первый домен содержит SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 и второй домен содержит SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 40.
  3. 3. Антигенраспознающая структура по п.2, в которой структура в соответствии с (i) содержит SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 62 или в которой структура в соответствии с (ii) содержит SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 63.
  4. 4. Антигенраспознающая структура по любому из пп.1-3, где указанная антигенраспознающая структура является стабильной и способна специфически и/или селективно связываться с антигенным пептидом COL6A3, включающим аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1, в частности, при участии MHC.
  5. 5. Антигенраспознающая структура в соответствии с любым из пп.1, 2 или 4, где указанный первый домен является частью α- или γ-цепи ТКР и/или где указанный второй домен является частью β- или δ-цепи ТКР.
  6. 6. Антигенраспознающая структура по любому из пп.1-5, причем антигенраспознающая структура представляет собой одноцепочечную антигенраспознающую структуру.
  7. 7. Антигенраспознающая структура по п.6, причем одноцепочечная антигенраспознающая структура представляет собой одноцепочечный ТКР.
  8. 8. Антигенраспознающая структура по любому из пп.1-7, причем антигенраспознающая структура представляет собой растворимый ТКР.
  9. 9. Полипептидная цепь, которая является стабильной и способной специфически и/или селективно связываться с антигенным пептидом COL6A3, содержащая первый домен и второй домен, каждый включающий три комплементарных детерминантных участка (CDR), где первый домен содержит аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 6 (CDRa2) и 7 (CDRa3) и второй домен содержит аминокислотные последовательности в соответствии с SEQ ID NO: 14 (CDRb2) и 15 (CDRb3), причем:
    a) CDRa1 первого домена изложен в SEQ ID NO: 5 и CDRb1 второго домена выбран из одной из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 37-44 или
    b) CDRa1 первого домена изложен в SEQ ID NO: 26 и CDRb1 второго домена выбран из одной из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 13 и 37-49.
  10. 10. Нуклеиновая кислота, кодирующая антигенраспознающую структуру в соответствии с любым из пп.1-8 или полипептидную цепь по п.9.
  11. 11. Вектор нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеиновую кислоту по п.10.
  12. 12. Рекомбинантная клетка-хозяин, включающая антигенраспознающую структуру в соответствии с любым из пп.1-8, полипептидную цепь по п.9, нуклеиновую кислоту по п.10 или вектор по п.11.
  13. 13. Клетка-хозяин по п.12, где указанная клетка-хозяин является клеткой млекопитающего.
  14. 14. Клетка-хозяин по п.13, где указанная клетка-хозяин представляет собой человеческую клетку.
    - 62 043746
  15. 15. Клетка-хозяин по любому из пп.12-14, где указанная клетка-хозяин представляет собой:
    а) лимфоцит, предпочтительно T-лимфоцит или клетка-предшественник T-лимфоцита, более предпочтительно CD4- или CD8-положительная T-клетка или
    б) не лимфоцит.
  16. 16. Антигенраспознающая структура по любому из пп.1-8, полипептидная цепь по п.9, нуклеиновая кислота по п.10, вектор по п.11 или клетка-хозяин по любому из пп.12-15, где антигенраспознающая структура, полипептидная цепь, нуклеиновая кислота, вектор или клетка-хозяин помечены поддающейся обнаружению меткой.
  17. 17. Антигенраспознающая структура, полипептидная цепь, нуклеиновая кислота, вектор или клетка-хозяин по п.16, где поддающаяся обнаружению метка выбрана из группы, состоящей из радиоизотопа, флуорофора, фикоэритрина, фермента и частиц элемента.
  18. 18. Фармацевтическая композиция, включающая антигенраспознающую структуру в соответствии с любым из пп.1-8, полипептидную цепь по п.9, нуклеиновую кислоту по п.10, вектор по п.11 или клеткухозяина по п.15а) и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель стабилизатор и/или вспомогательное вещество.
  19. 19. Фармацевтическая композиция по п.18, дополнительно содержащая другое фармацевтически активное вещество или лекарственное средство.
  20. 20. Фармацевтическая композиция по п.19, где дополнительное фармацевтически активное вещество или лекарственное средство выбрано из группы, состоящей из аспарагиназы, бусульфана, карбоплатина, цисплатина, даунорубицина, доксорубицина, фтороурацила, гемцитабина, гидроксимочевины, метотрексата, паклитаксела, ритуксимаба, винбластина и винкристина.
  21. 21. Способ получения COL6A3-специфической антигенраспознающей структуры в соответствии с любым из пп.1-8, включающий:
    а) обеспечение подходящей клетки-хозяина;
    б) обеспечение генетической конструкции, включающей кодирующую последовательность, кодирующую антигенраспознающую структуру в соответствии с любым из пп.1-8;
    в) внесение указанной генетической конструкции в указанную подходящую клетку-хозяина;
    г) экспрессию указанной генетической конструкции указанной подходящей клеткой-хозяином.
  22. 22. Способ в соответствии с п.21, дополнительно включающий выделение и очистку антигенраспознающей структуры из подходящей клетки-хозяина и, необязательно, восстановление антигенраспознающей структуры в T-клетке.
  23. 23. Применение антигенраспознающей структуры по любому из пп.1-8 в предупреждении и/или лечении пролиферативного заболевания.
  24. 24. Применение полипептидной цепи по п.9 в предупреждении и/или лечении пролиферативного заболевания.
  25. 25. Применение нуклеиновой кислоты по п.10 в предупреждении и/или лечении пролиферативного заболевания.
  26. 26. Применение вектора по п.11 в предупреждении и/или лечении пролиферативного заболевания.
  27. 27. Применение клетки-хозяина по п.15а) в предупреждении и/или лечении пролиферативного заболевания.
  28. 28. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.18-20 в предупреждении и/или лечении пролиферативного заболевания.
  29. 29. Применение по пп.23-28, где пролиферативное заболевание представляет собой COL6A3положительное предопухолевое состояние или рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака толстой кишки и колоректальной карциномы.
  30. 30. Применение по п.29, где указанный рак выбран из рака, в котором имеется избыточная экспрессия или мутации COL6A3 и/или презентируется полученный из COL6A3 опухолеассоциированный антиген.
  31. 31. Применение клетки-хозяина по п.15а) для изготовления лекарственного средства для лечения рака или COL6A3-положительного предопухолевого состояния у субъекта, нуждающегося в этом, где клетка-хозяин является аутологичной клеткой пациента.
  32. 32. Применение клетки-хозяина по п.15а) для изготовления лекарственного средства для лечения рака или COL6A3-положительного предопухолевого состояния у субъекта, нуждающегося в этом, где клетка-хозяин является аллогенной клеткой.
  33. 33. Способ лечения рака или COL6A3-положительного предопухолевого состояния у субъекта, нуждающегося в этом, включающий:
    а) получение клетки от указанного субъекта;
    б) трансформирование клетки по меньшей мере одним вектором по п.11 для получения трансформированной клетки;
    в) культивирование трансформированной клетки для получения множества трансформированных клеток и
    г) введение множества трансформированных клеток указанному субъекту.
    -
EA202090712 2017-11-06 2018-11-05 Новые полученные методами генной инженерии t-клеточные рецепторы и иммунная терапия с их использованием EA043746B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102017125888.4 2017-11-06
US62/582,202 2017-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EA043746B1 true EA043746B1 (ru) 2023-06-19

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11932689B2 (en) Engineered T cell receptors and immune therapy using the same
AU2017312361B2 (en) T cell receptors and immune therapy using the same
EP3645573B1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same
KR20190132655A (ko) T 세포 수용체, 및 이를 사용하는 흑색종의 우선적 발현 항원(prame) 양성 암에 대한 면역 요법
US20190359677A1 (en) Novel t cell receptors and immune therapy using the same for the treatment of cancer and infectious diseases
EP3707159B1 (en) Novel engineered t cell receptors and immune therapy using the same
EA043746B1 (ru) Новые полученные методами генной инженерии t-клеточные рецепторы и иммунная терапия с их использованием
KR102381854B1 (ko) T 세포 수용체 및 이를 사용하는 면역 요법
KR20240151870A (ko) T 세포 수용체, 및 이를 사용하는 흑색종의 우선적 발현 항원(prame) 양성 암에 대한 면역 요법