BR112020008943A2 - estrutura reconhecedora de antígenos, ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, composição farmacêutica e método de produção de estruturas reconhecedoras de antígenos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção se refere a estruturas reconhecedoras de antígenos contra antígenos COL6A3. Mais particularmente, a invenção fornece novas moléculas seletivas específicas para o antígeno COL6A3 expresso em tumores baseadas em modificações dos receptores de células T (TCR, T-cell receptor). O TCR da presente invenção e os fragmentos ligantes de COL6A3 derivados dos mesmos são empregados para diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças oncológicas que expressam COL6A3. Também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam as estruturas reconhecedoras de antígenos da invenção, vetores que compreendem esses ácidos nucleicos, células recombinantes que expressam as estruturas reconhecedoras de antígeno e composições farmacêuticas que compreendem os compostos da invenção.

Description

“ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ESTRUTURAS RECONHECEDORAS DE ANTÍGENOS” RESUMO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a estruturas reconhecedoras de antígenos específicas contra antígenos derivados de COL6A3. Mais particularmente, a invenção fornece novas moléculas seletivas específicas para o antígeno COL6A3 expresso em tumores baseadas em modificações dos receptores de células T (TCR, “T-cell receptor”). O TCR da presente invenção e os fragmentos ligantes de COL6A3 derivados do mesmo são empregados para diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças oncológicas que expressam COL6A3. Também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam as estruturas reconhecedoras de antígenos da invenção, vetores que compreendem esses ácidos nucleicos e células recombinantes que expressam as estruturas reconhecedoras de antígeno e composições farmacêuticas que compreendem os compostos da invenção.
DESCRIÇÃO
[002] Os colágenos são uma superfamília de proteínas que contribuem para manter a integridade de vários tecidos. Os colágenos são proteína da matriz extracelular e possuem um domínio em formato de tripla hélice como elemento estrutural em comum entre eles. O colágeno tipo VI é um importante componente estrutural das microfibrilas, e sua unidade estrutural básica é um heterotrímero formado pelas cadeias colágenas alfa 1(VI), alfa 2(VI) e alfa 3(VI). Os genes COL6A1 e COL6A?2 codificam as cadeias alfa 1(VI) e alfa 2(VI), respectivamente, e o gene COL6A3 codifica a proteína da subunidade alfa 3 do colágeno tipo VI (cadeia alfa 3(VI) do colágeno) (Bertini et al., 2002 Eur. J. Paediatr. Neuro! 6:193-8). Demonstrou-se que a expressão do gene COL6A3 está associada com a progressão do câncer de mama, apresenta níveis mais elevados no câncer de cólon (Smith MJ, et al. Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification. British Journal of Cancer. 2009;100:1452—1464; Tilman G et al. Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma: evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells. Mol Cancer. 2007;6:80) e serve como marcador prognóstico no carcinoma colorretal (Qiao J et al. Stroma derived COL6A3 is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics. Oncotarget. 2015 Oct 6; 6(30): 29929-29946). O gene COL6AS3 está localizado no segmento 2937 do genoma humano e contém 44 éxons. A proteína COL6A3 possui 3177 aminoácidos e contém 12 domínios tipo A do fator de von Willebrand (vWA), um domínio de fibronectina tipo 3 e um domínio da família BPTI/Kunitz de inibidores de serina protease (KU).
[003] A imunoterapia baseada em células T age contra epítopos peptídicos derivados de proteínas associadas a ou específicas para tumores, que são apresentadas por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Tais antígenos associados a tumores (AAT) podem ser peptídeos derivados de qualquer classe de proteínas, tais como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc., que são expressas e normalmente apresentam regulação positiva em células do tumor em comparação com células inalteradas da mesma origem.
[004] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir células tumorais de modo seletivo. O isolamento de células T específicas contra antígenos tumorais a partir de populações de células infiltrantes de tumores ou do sangue periférico sugere que tais células podem ter participação relevante na imunidade natural anticâncer. Em particular, desempenham importante papel nessa resposta as células T
CD8-positivas capazes de reconhecer moléculas de classe!| do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) acopladas a peptídeos com 8 a 10 aminoácidos de comprimento derivados de proteínas ou de produtos ribossômicos defeituosos (DRiPs, “defective ribosomal products”). As moléculas de MHC humanas também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA, “human leucocyte antigen”).
[005] O TCR é uma proteína heterodimérica da superfamília das imunoglobulinas, que se localiza na superfície celular e está associada com proteínas invariantes do complexo CD3 que participam da mediação da transdução de sinais. Os TORs podem ser heterodímeros aB ou yó. Embora estruturalmente semelhantes, essas entidades são encontradas em sítios anatômicos diferentes e provavelmente apresentam diferenças funcionais entre si, A porção extracelular do abBTCR heterodimérico nativo é formada por duas cadeias polipeptídicas, cada uma das quais possui um domínio constante próximo à membrana e um domínio variável distal à membrana. Cada um dos domínios constante e variável possui uma ponte dissulfeto em sua cadeia. Os domínios variáveis contêm alças altamente polimórficas, que são análogas às regiões determinantes de complementaridade (CDR, “complementarity determining regions”) dos anticorpos. O uso da terapia gênica com TCRs permite sobrepujar diversos obstáculos encontrados atualmente, pois é capaz de dotar as células T do paciente das especificidades desejadas e de gerar células T rapidamente e em número suficiente, evitando assim que elas se esgotem. O TCR sofre transdução em células T de memória centrais ou em células T com características de células-tronco, o que pode torná-las mais persistentes e funcionais após a transferência. Em seguida, as células T modificadas por engenharia genética são infundidas em pacientes com câncer após indução de linfopenia por quimioterapia ou radioterapia, de modo a proporcionar enxertia eficaz e inibir a imunossupressão.
[006] Embora tenha havido avanços no desenvolvimento de drogas direcionadas a moléculas específicas para tratamento do câncer, persiste na técnica uma necessidade de desenvolver novos agentes anticâncer que atuem especificamente sobre moléculas altamente específicas para células cancerosas. A presente descrição aborda tal necessidade fornecendo novos TCRs modificados específicos para COL6A3, as respectivas estruturas de TOR recombinante, ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras que se ligam especificamente aos epítopos de COL6A3, conforme será revelado, e métodos para uso dessas moléculas no tratamento de câncer.
[007] Em um primeiro aspecto, o objeto da invenção é solucionado por uma estrutura reconhecedora de antígenos que compreende um primeiro domínio que compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR) de acordo com SEQ Nº 5 (CDRa1), SEQ Nº 6 (CDRa2) e SEQ Nº 7 (CDRa3); um segundo domínio que compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDR) de acordo com SEQ Nº 13 (CDRb1), SEQ Nº 14 (CDRb2) e SEQ Nº 15 (CDRb3), caracterizados pelo fato de que pelo menos uma das referidas regiões determinantes de complementaridade é substituída por pelo menos uma sequência do grupo formado por: a) SEQ Nº 26 (CDRa1- mut1) e SEQ Nº 37 a 49 (CDRb1-mut1 a CDRb1-mut13), sendo preferida a SEQ Nº 40; e b) sequências mutantes de SEQ Nº 26 e SEQ Nº 37 a 49, sendo preferida a SEQ Nº 40, compreendo substituições de aminoácidos de natureza conservadora.
[008] Em outro aspecto, o CDRal de uma estrutura reconhecedora de antígenos pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntico à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 5.
[009] Em outro aspecto, o CDRa2 de uma estrutura reconhecedora de antígenos pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntico à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 6.
[010] Em outro aspecto, o CDRa3 de uma estrutura reconhecedora de antígenos pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntico à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 7.
[011] Em outro aspecto, o CDRb1 de uma estrutura reconhecedora de antígenos pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntico à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 13.
[012] Em outro aspecto, o CDRb2 de uma estrutura reconhecedora de antígenos pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntico à sequência de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 14.
[013] Em outro aspecto, o CDRb3 de uma estrutura reconhecedora de antígenos pode ser pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% idêntico à sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ Nº 15.
[014] No contexto da presente invenção, os inventores identificaram versões modificadas e melhoradas do TCR anti-COL6A3 R4P3F9, que compreendem mutações nas sequências nas cadeias alfa e beta de CDR1, que podem conferir ao R4P3F9 original mais estabilidade, capacidade de reconhecimento e seletividade. Tais variantes maturadas de TCR foram selecionadas por meio de uma abordagem que compreende duas etapas, a primeira das quais seleciona em função da estabilidade e a segunda em função da afinidade por variantes. (Ver exemplos.) Embora os TCRs da invenção compreendam regiões CDR1 mutantes, o CDR2 ou o CDR3 também podem apresentar mutações a fim de aumentar a afinidade e/ou a especificidade e/ou a seletividade. Idealmente, podem-se incluir tais CDRs mutantes nas estruturas existentes.
[015] A maturação por afinidade identificou variantes cuja atividade ligante em relação ao HLA A*02 em complexo com o peptídeo COLGA3 era bem mais forte, com especificidade mantida ou até melhorada. Comparadas com o TCR C-1 original (TCR R4P3F9 compreendendo CDRs do tipo selvagem; ver Tabela 5), todas as variantes da invenção aumentaram a liberação de IFN- gama, proporcionando os níveis mais elevados já atingidos, mesmo quando o carregamento de peptídeos foi realizado com concentrações mais baixas.
[016] No domínio variável, o CDR1 e o CDR2 são encontrados na região variável (V) de uma cadeia polipeptídica, e o CDR3 inclui parte da região V e a totalidade das regiões diversificadora (D) e juncional (J). Supõe-se que o domínio mais variável é o CDR3, que é também o CDR mais importante para reconhecimento antigênico de forma específica e seletiva. Surpreendentemente, o CDR1 de alguns TCRs também parece ser capaz de fazer contatos com o peptídeo e, portanto, é também responsável pelo reconhecimento seletivo. No caso atual, sem se ater a nenhuma teoria específica, o CDR1Ib mutante parece interagir com a posição 8 do peptídeo COL6A3.
[017] Os TCRs alfa-beta heterodiméricos nativos possuem uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Cada uma dessas cadeias alfa possui regiões variável, juncional e constante, e a cadeia beta normalmente também possui uma pequena região diversificadora localizada entre a região variável e a região juncional, mas essa região diversificadora normalmente é considerada parte da região juncional. Cada região variável compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs, “complementarity determining regions”) estruturadas em uma sequência, sendo uma delas a região hipervariável denominada CDR3. Existem diversos tipos de regiões da cadeia alfa variável (Va) e diversos tipos de cadeia beta variável (VB) que se diferenciam em função de sua estrutura, de suas sequências CDR1 e CDR2, e de uma sequência de CDR3 definida parcialmente. Na nomenclatura IMGT, cada tipo de Va é definido por um único número TRAV e cada tipo de VB por um único número TRBV.
[018] Preferivelmente, a estrutura reconhecedora de antígenos da invenção compreende os respectivos CDR1 a CDR3 de uma das regiões de TOR variável modificado da invenção aqui reveladas. São preferidas as estruturas reconhecedoras de antígenos da invenção que compreendem pelo menos uma, e preferivelmente duas, sequências CDR1 obtidas por maturação.
[019] As CDR variantes aqui reveladas — em especial as CDR1 variantes — podem ser modificadas por substituição de um ou mais resíduos em sítios diferentes e possivelmente seletivos da cadeia peptídica, salvo indicação em contrário. Tais substituições são de natureza conservadora, ou seja, consistem em substituir um aminoácido por outro de estrutura e características semelhantes, como, por exemplo, substituição de um aminoácido hidrofóbico por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria substituir um aminoácido por outro de tamanho e natureza química semelhantes ou idênticos (p.ex. substituir leucina por isoleucina). Em estudos de variações de sequências em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, determinadas substituições de aminoácidos são toleradas com muito mais frequência que outras, e estas frequentemente mostram correlação com semelhanças entre o aminoácido original e seu substituto quanto ao tamanho, carga elétrica, polaridade e hidrofobicidade, sendo esta a base para definição de “substituição conservadora”. As substituições conservadoras preferidas são aqui definidas como trocas onde ambos os aminoácidos pertencem a um dos cinco grupos a seguir: Grupo 1: Resíduos pequenos alifáticos, apolares ou ligeiramente polares (Ala, Ser, Tre, Pro, Gli); Grupo 2: Resíduos polares com carga negativa e as respectivas amidas (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupo 3: Resíduos polares com carga positiva (His, Arg, Lis); Grupo 4: Resíduos alifáticos grandes e apolares (Met, Leu, Ile, Val, Cis); e Grupo 5: resíduos aromáticos grandes (Fen, Tir, Trp).
[020] Algumas substituições menos conservadoras podem consistir em substituição de um aminoácido por outro com características semelhantes mas algo diferente em tamanho, como substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina.
[021] Conforme aqui utilizados, os termos “especificidade”, “especificidade antigênica” e “específico para" um determinado antígeno podem indicar que a estrutura reconhecedora de antígenos se liga de forma específica ao referido antígeno, sendo este preferivelmente um antígeno COL6A3 e sendo a ligação preferivelmente com avidez elevada, com aprsesentação do antígeno por HLA, e preferivelmente por HLA A2. Por exemplo, pode-se considerar que um TCR usado como estrutura reconhecedora de antígenos possui “especificidade antigênica” para antígenos COL6A3 se as células T que expressam o referido TOR secretarem pelo menos cerca de 200 pg/ml ou mais (p.ex. 250 pg/ml ou mais, 300 pg/ml ou mais, 400 pg/ml ou mais, 500 pg/ml ou mais, 600 pg/ml ou mais, 700 pg/ml ou mais, 1000 pg ml ou mais, 2000 pg/ml ou mais, 2500 pg/ml ou mais, 5000 pg/ml ou mais) de interferon y (IFN-y) ao entrarem em contato com células-alvo HLA A2 pulsadas com baixas concentrações de COL6A3 (p.ex. cerca de 10 ** mol/l, 10º mol/l, 10º mol/l, 10º 3 mol/1,10-7 mol/I,10-º mol/Il ou 10º mol/l), tais como epítopos de COL6A3 e os antígenos aqui apresentados a seguir. Alternativa ou adicionalmente, pode-se considerar que um TCR apresenta “especificidade antigênica” para COL6A3 se as células T que expressam o referido TOR secretarem IFN-y em níveis pelo menos duas vezes superiores aos níveis basais serem cultivadas simultaneamente com células-alvo pulsadas com baixas concentrações de antígenos COL6A3. A “especificidade” descrita anteriormente pode ser ensaiada, por exemplo, pelo método ELISA.
[022] Em uma configuração alternativa ou adicional da invenção, a estrutura reconhecedora de antígenos é estável e capaz de se ligar de forma específica e/ou seletiva a um antígeno COL6A3, preferivelmente quando o antígeno COL6A3 é um epítopo proteico ou peptídeo que possui a sequência de aminoácidos exibida em SEQ Nº 1 ou uma variante da mesma, sendo que a variante é uma deleção, adição, inserção ou substituição de aminoácidos em não mais que três, preferivelmente duas e, o mais preferido, não mais que uma posição.
[023] O termo “seletividade” ou “ligação/reconhecimento seletivo” é entendido como a propriedade de uma estrutura reconhecedora de antígenos (p.ex. um TCR ou um anticorpo) de reconhecer seletivamente ou se ligar preferivelmente a apenas um epítopo específico e, preferivelmente, apresentar pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros epítopos. Preferivelmente, “seletividade” ou “ligação/reconhecimento seletivo” significa que a estrutura reconhecedora de antígenos (p.ex. um TCR) reconhece seletivamente ou se liga preferivelmente a um único epítopo específico e, preferivelmente, apresenta pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros epítopos, sendo que o referido epítopo específico é exclusivo de uma proteína, de modo que a estrutura reconhecedora de antígenos possui pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outros epítopos e proteínas.
[024] A estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com a invenção é selecionada preferivelmente entre um anticorpo ou um derivado ou fragmento de anticorpo, uma molécula biespecífica, um receptor de célula T (TCR) ou um derivado ou fragmento de TCR. Um derivado ou fragmento de um dos anticorpos ou TCRs da invenção deve preferivelmente ter preservada a capacidade de ligação e reconhecimento antigênico da molécula parental, em especial sua especificidade e/ou seletividade, conforme explicado anteriormente.
[025] Em uma configuração da invenção, os TCRs modificados da invenção são capazes de reconhecer antígenos COL6AS de forma dependente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe |. Conforme aqui utilizado, “forma dependente do MHC classe |” significa que o TOR produz uma resposta imune ao se ligar ao peptídeo COL6A3 no contexto de uma molécula de MHC classe |. A molécula de MHC classe | pode ser qualquer molécula de MHC classe | conhecida na técnica, como, p.ex., moléculas de HLA A. Em uma configuração preferida da invenção, a molécula de MHC classe | é uma molécula de HLA A2.
[026] A invenção fornece tanto estruturas que reconhecem antígenos de cadeia única e cadeia dupla como estruturas que reconhecem antígenos de cadeia dupla, assim como outras moléculas variantes. Em particular, a invenção fornece um TCR modificado como estrutura reconhecedora de antígenos ou fragmento ou derivado da mesma. O TCR modificado é preferivelmente de origem humana, o que é compreendido como um TCR gerado a partir de um lócus de TOR humano e que, portanto, compreende sequências de TOR humano. Ademais, o TCR da invenção é caracterizado por ser um TCR maturado por afinidade capaz de reconhecer o antígeno peptídico COL6A3 de forma específica e seletiva.
[027] Outra configuração da invenção fornece, adicional ou alternativamente, a estrutura reconhecedora de antígenos e indutora de resposta imune descrita anteriormente, sendo que a resposta imune é preferivelmente caracterizada por aumento dos níveis de interferon gama (IFNy).
[028] Os TCRs da invenção podem ser fornecidos na forma de cadeias únicas a ou À ou y e ô, ou, alternativamente, como estruturas de cadeia dupla formadas ao mesmo tempo por cadeias a e Bouyeoõ.
[029] Mais preferivelmente, em algumas outras configurações, onde a revelação se refere a estruturas reconhecedoras de antígenos compreendendo uma, duas ou todas as regiões CDR1 a CDR3 das cadeias de TCR modificadas aqui reveladas (ver Tabela 1). Podem-se preferir estruturas reconhecedoras de antígenos que compreendem a sequência de CDR natural ou modificada com três, dois ou, preferivelmente, apenas um resíduo de aminoácido modificado. Um resíduo de aminoácido modificado pode ser selecionado para inserção, deleção ou substituição de aminoácido. É mais preferível que três, dois ou preferivelmente um resíduo de aminoácido modificado seja o primeiro ou o último resíduo de aminoácido da respectiva sequência de CDR. Se a modificação for uma substituição, então é preferível em algumas configurações que a substituição seja uma substituição de aminoácido conservadora.
[030] Os TCRs da presente invenção também podem compreender uma região constante derivada de qualquer espécie apropriada, tais como qualquer mamífero (p.ex. humano, rato, macaco, coelho, burro ou camundongo). Em uma configuração da invenção, os TCRs da invenção compreendem também uma região constante humana. Em algumas configurações preferidas, a região constante do TCR da invenção pode ser ligeiramente modificada, por exemplo, introduzindo-se sequências heterólogas, preferivelmente sequências de camundongo, que podem aumentar a estabilidade e a expressão do TCR. Podem-se introduzir também outras mutações estabilizadoras conhecidas na técnica (p.ex. DE 10 2016 123 893.7), tais como substituição de aminoácidos desfavoráveis nas regiões V e/ou introdução de pontes bissulfeto entre os domínios C do TCR, seguidas de retirada da cisteína não pareada.
[031] Conforme aqui utilizados em relação a uma estrutura reconhecedora de antígenos, a um TCR ou a qualquer componente de um TCR aqui descrito (p.ex. região determinante de complementaridade (CDR), região variável, região constante, cadeia a e/ou cadeia à), os termos “murino” e
“humano” significam um TCR (ou componente do mesmo) derivado de um lócus de TCR não rearranjado de origem murina ou humana, respectivamente.
[032] Em uma configuração da invenção, são fornecidos TOCRs quiméricos nos quais as cadeias do TOR compreendem sequências de várias espécies. Preferivelmente, um TCR da invenção pode compreender uma cadeia a que compreende uma região variável humana ou uma cadeia a e, por exemplo, uma região constante murina de uma cadeia a de TOR murino.
[033] Em uma configuração, o TCR da invenção é um TCR humano que compreende regiões variáveis humanas de acordo com as configurações acima e com as regiões constantes humanas.
[034] O TCR da invenção também pode ser fornecido na forma de um TCR de cadeia única (scCTCR, “single-chain TCR”). O scTCR pode compreender um polipeptídeo de uma região variável de uma primeira cadeia de TCR (p.ex. uma cadeia alfa) e um polipeptídeo de uma segunda cadeia inteira (completa) de TCR (p.ex. uma cadeia beta) ou vice-versa. Além disso, o seTCR pode, opcionalmente, compreender um ou mais ligantes que unem os dois ou mais peptídeos entre si. O ligante pode ser, por exemplo, um peptídeo que une duas cadeias individuais, conforme aqui descrito. Também é fornecido um ScTCR da invenção fundido com uma citoquina humana, tal como IL-2, IL-7 ou I1L-15.
[035] A estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com a invenção também pode ser fornecida na forma de um complexo multimérico compreendendo pelo menos duas moléculas de scTCR, onde as referidas moléculas de scTCR são fundidas a pelo menos um grupamento biotina e onde os referidos scTCRs são interconectados pela interação biotina-estreptavidina para permitir a formação do referido complexo multimérico. Abordagens semelhantes para geração de TCR multimérico também são possíveis e foram incluídas na presente revelação. Também são fornecidos complexos multiméricos de ordem mais elevada, que compreendem mais de dois scTCR da invenção.
[036] Para as finalidades da presente invenção, um TCR é um grupamento que possui pelo menos uma cadeia alfa ou gama de TCR e/ou um domínio variável beta ou delta de TCR. Geralmente, eles compreendem tanto um domínio alfa variável de TOR como um domínio beta variável de TCR, podendo consistir em heterodímeros af ou em uma cadeia única. Para uso em terapias adotivas, um TCR heterodimérico ab pode, por exemplo, ser transfectado na forma de cadeias integrais possuindo o domínio citoplasmático e o domínio transmembrana. Se desejado, pode-se introduzir uma ponte dissulfeto entre resíduos dos respectivos domínios constantes.
[037] Em uma configuração preferida, a estrutura reconhecedora de antígenos é um TCR humano ou fragmento de TOR. Um TCR humano ou fragmento ou derivado do mesmo é um TCR que compreende mais de 50% da sequência do TCR humano correspondente. Preferivelmente, apenas uma pequena parte da sequência do TCR é de origem artificial ou derivada de outra espécie. Sabe-se, contudo, que são vantajosos os TCRs quiméricos, p.ex., os derivados de origem humana com sequências murinas nos domínios constantes. Portanto, são particularmente preferidos os TCRs de acordo com a presente invenção que contenham sequências murinas nas porções extracelulares de seus domínios constantes.
[038] Logo, também é preferível que a estrutura reconhecedora de antígenos da invenção seja capaz de reconhecer seu antígeno peptídico de forma dependente do antígeno leucocitário humano (HLA), preferivelmente de forma dependente de HLA AO02. No contexto da presente invenção, o termo “forma dependente de HLA” significa que a estrutura reconhecedora de antígenos se liga ao antígeno apenas quando o peptídeo antigênico é apresentado pelo referido HLA.
[039] Preferivelmente, a estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com uma configuração da invenção induz uma resposta imune, que é preferivelmente caracterizada por aumento dos níveis de interferon gama (IFNy).
[040] Conforme aqui utilizado, o termo “polipeptídeo” inclui oligopeptídeos e se refere a uma única da cadeia de aminoácidos conectada por uma ou mais ligações peptídicas. Em relação aos polipeptídeos da invenção, a porção funcional pode ser qualquer porção que compreenda aminoácidos contíguos do TCR (ou variante funcional do mesmo) do qual seja parte, sob a condição de que a porção funcional se ligue especificamente a um antígeno de COL6AS3, preferivelmente conforme aqui revelado na Tabela 1. Quando usado em referência a um TCR ou a uma variante funcional do mesmo, o termo “porção funcional” se refere a qualquer parte ou fragmento do TCR (ou variante funcional do mesmo) da invenção que mantenha a atividade biológica do TCR (ou variante funcional do mesmo) do qual seja parte (o TCR original ou variante funcional original do mesmo). As porções funcionais incluem, por exemplo, as partes do TCR (ou variante funcional do mesmo) que preservam a capacidade de se ligarem especificamente a um antígeno COL6A3 de modo dependente de HLA A2 ou de detectar, tratar ou prevenir o câncer em extensão semelhante, na mesma extensão ou em maior extensão que o TCR original (ou variante funcional do mesmo).
[041] A porção funcional pode compreender mais aminoácidos nas terminações amino ou carboxi da porção, ou em ambas essas terminações, do modo que outros aminoácidos que não os encontrados na sequência de aminoácidos do TCR inicial ou variante funcional do mesmo. É desejável que os aminoácidos adicionais não interfiram na função biológica da porção funcional (p.ex., ligando-se especificamente a antígenos COL6A3) nem na capacidades como a de detectar, tratar ou prevenir câncer. É ainda mais desejável que os aminoácidos adicionais melhorem a atividade biológica em relação à atividade biológica do TCR original ou da variante funcional do mesmo.
[042] Conforme mencionado anteriormente, a funcionalidade de ligação do TCR da invenção pode ser fornecida no âmbito de um anticorpo. O termo “anticorpo” é aqui utilizado, em suas várias formas gramaticais, para designar moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, i.é., moléculas que contêm um sítio ligante de antígenos ou de um paratopo. Tais moléculas também são denominadas “fragmentos ligantes de antígenos” de moléculas de imunoglobulina. A invenção também fornece um anticorpo ou a porção ligante de antígenos do mesmo que se liga especificamente aos antígenos aqui descritos. O anticorpo pode ser qualquer tipo de imunoglobulina conhecida na técnica. Por exemplo, o anticorpo pode ser de qualquer isotipo (p.ex. IgA, IgD, IgE, 1gG, IgM, etc.) e pode ser mono ou policlonal. O anticorpo pode ser um anticorpo que ocorre naturalmente, como, p.ex., um anticorpo isolado e/ou purificado de um mamífero (p.ex. camundongo, coelho, cabra, cavalo, galinha, hamster, humano), pode ser produzido por engenharia genética (p.ex. um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico) e pode estar em forma mono ou polimérica.
[043] A invenção também fornece porções ligantes de antígenos para todos os anticorpos aqui descritos. A porção ligante de antígenos pode ser qualquer porção que possua pelo menos um sítio de ligação de antígenos, tais como Fab, F(ab')2, dsFv, scFv, dianticorpos e trianticorpos. Usando-se técnicas corriqueiras de DNA recombinante, pode-se gerar um fragmento de região variável de cadeia única de um anticorpo (scFv) formado por um fragmento Fab truncado que compreende o domínio variável (V) da cadeia pesada de um anticorpo ligado por um peptídeo sintético a um domínio V de uma cadeia leve de anticorpo. Da mesma forma, pode-se preparar fragmentos da região variável estabilizados por dissulfeto (dsFv, “disulfide-stabilized Fy"”) usando-se tecnologia de DNA, mas os fragmentos de anticorpos da invenção não se limitam a esses tipos exemplares de fragmentos de anticorpos. Além disso, o anticorpo ou a porção ligante de antígenos do mesmo podem ser modificadas de modo a compreender um marcador detectável, tal como, por exemplo, um radioisótopo, um fluoróforo (p.ex. isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), uma enzima (p.ex. fosfatase alcalinay peroxidase de rábano) ou partículas elementares (p.ex. partículas de ouro).
[044] Métodos apropriados de confecção de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos padrão de manipulação de hibridomas são descritos em, p.ex., Kohler e Milstein. Eur. J. Immunol 5, 511- 519 (1976), Harlow e Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) e C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)). Outros métodos alternativos são conhecidos na técnica, tais como métodos de EBV e hibridoma (Haskard e Archer, J Immunol Methods 74(2), 361-67 (1984), e Roder et al, Methods Enzymol 121, 140-67 (1986)) e sistema de expressão de vetores em bacteriófagos (ver, p.ex., Huse et al, Science 246, 1275-81 (1989)). Ademais, métodos de produção de anticorpos em animais não-humanos são descritos, p.ex., nas Patentes dos EUA 5.545.806,
5.569.825 e 5.714.352 e no Pedido de Patente Publicado nos EUA nº 2002/0197266.
[045] Tais configurações de invenção também podem ser atinentes a TORs ou a fragmentos funcionais e polipeptídeos do mesmo, que são TCRs solúveis. Conforme aqui utilizado, o termo “receptor solúvel de células T” refere-se a variantes de cadeia única ou heterodiméricas truncadas de TCRs nativos que compreendem pelo menos um dos domínios variáveis das cadeias a e B e TCR ligadas por um polipeptídeo ligante (SEQ Nº 22, 24,25 e 27). As variantes solúveis de TORs geralmente não possuem um ou mais domínios transmembrana ou citossólicos da proteína nativa; em alguns casos, é preferível que tais estruturas solúveis não compreendam nenhuma sequência dos domínios constantes. Em algumas configurações preferidas, os receptores de células T solúveis da invenção possuem estruturas formadas por domínios variáveis de cadeias a e B conforme aqui fornecidas, conectadas uma à outra por uma sequência ligante apropriada. A sequência de domínio variável de aminoácidos ou de ácido nucleico das cadeias a e 8 de TCRs solúveis podem ser idênticas às sequências correspondentes em um TCR nativo ou podem compreender variantes de sequências de cadeias a solúveis e sequências de domínio variável de cadeia É de TOR solúvel em comparação com as sequências correspondentes do TCR original. Conforme aqui utilizado, o termo “receptor solúvel de células T" compreende TCRs solúveis com sequências de domínios variáveis de cadeias a ou É de TCR solúvel. As variações podem estar presentes no âmbito e/ou em regiões de CDR das cadeias a ou B do domínio variável do TCR solúvel e podem incluir, sem limitação, mutações de deleção, inserção ou substituição de aminoácidos, assim como modificações da sequência de ácidos nucleicos que não alterem a sequência de aminoácidos. Em qualquer caso, o TCR solúvel da invenção mantém ou preferivelmente melhora a funcionalidade ligante das moléculas de TCR originais.
[046] O problema acima também é resolvido por um ácido nucleico que codifica uma estrutura reconhecedora de antígenos da invenção ou qualquer uma das estruturas supramencionadas de proteínas ou polipeptídeos. Preferivelmente, o ácido nucleico possui: (a) uma fita que codifica uma estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com a invenção; (b) uma fita complementar à fita (a); ou (c) uma fita que se hibridiza, sob condições rigorosas, com uma das moléculas descritas em (a) ou (b). Tais condições rigorosas são bem conhecidas dos versados na técnica, especificamente de Sambrook et al, “Molecular Cloning”. Além disso, o ácido nucleico pode também incluir outras sequências necessárias à expressão da sequência de ácido nucleico correspondente à proteína, sendo estas específicas para expressão em células mamiíferas ou humanas. O ácido nucleico pode ser contido em um vetor apropriado para permitir a expressão de uma sequência de ácido nucleico correspondente ao polipeptídeo em uma célula. Contudo, os ácidos nucleicos também podem ser usados para transformar uma célula apresentadora de antígeno sem necessariamente se restringir às células apresentadoras de antígenos clássicas, tais como as células dendríticas, de modo que elas produzam as proteínas correspondentes em suas superfícies celulares.
[047] Conforme aqui utilizado, o termo “ácido nucleico” abrange “polinucleotídeo”, “oligonucleotídeo” e “molécula de ácido nucleico” e significa geralmente um polímero de DNA ou RNA, que pode ser de fita única ou dupla, sintético ou de origem natural (p.ex. isolado e/ou purificado), pode conter nucleotídeos naturais, não-naturais ou modificados e pode conter ligações internucleotídeo naturais, não-naturais ou modificadas, tais como ligações fosforoamidato ou fosforotioato, em vez da ligação fosfodiéster encontrada entre nucleotídeos de oligonucleotídeos não modificados.
[048] Preferivelmente, os ácidos nucleicos da invenção são recombinantes. Conforme aqui utilizado, o termo “recombinante” se refere a (i) moléculas construídas fora de células vivas pela união de segmentos de ácido nucleico natural ou sintético com moléculas de ácido nucleico que podem ser replicar no interior de células vivas ou (ii) moléculas resultantes da replicação daquelas descritas anteriormente no item (i). Para as finalidades da presente revelação, a replicação pode ser in vitro ou in vivo. O ácido nucleico pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos que codifique qualquer um dos TCRs ou polipeptídeos ou proteínas ou porções funcionais ou variantes funcionais das mesmas aqui descritas.
[049] Ademais, a invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção, conforme descrito anteriormente. É desejável que o vetor seja um vetor de expressão ou um vetor de expressão recombinante. No contexto da presente invenção, o termo “vetor de expressão recombinante” se refere a uma estrutura de ácido nucleico que permite a expressão de um mMRNA, proteína ou polipeptídeo em uma célula hospedeira apropriada. O vetor de expressão recombinante da invenção pode ser qualquer vetor de expressão recombinante apropriado e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro apropriado. São apropriados os vetores designados para propagação e expansão, para expressão ou para ambos, tais como plasmídios e vírus. Alguns exemplos de vetores de expressão animais são EUK-Cl, pMAM e pMAMneo. Preferivelmente, o vetor de expressão recombinante é um vetor viral (p.ex. um vetor retroviral). O vetor de expressão recombinante compreende sequências regulatórias, tals como códons de iniciação da transcrição, tradução e terminação, que são específicos para o tipo de célula hospedeira (p.ex. bacteriana, fúngica, vegetal ou animal) na qual o vetor será introduzido e o ácido nucleico da invenção será expresso. Ademais, o vetor da invenção pode incluir um ou mais genes marcadores que permitem selecionar hospedeiros transformados ou transfectados. O vetor de expressão recombinante pode compreender um promotor nativo ou normativo ou ligação operante a uma sequência de nucleotídeos que codifica as estruturas de invenção ou à sequência de nucleotídeos complementar ou que se hibridiza com a sequência de nucleotídeos que codifica as estruturas da invenção. As seleções de promotores incluem, p.ex., promotores fortes, fracos, induzíveis, específicos para tecidos e de desenvolvimento. O promotor pode ser do tipo viral ou não- viral. Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser designados para expressão transitória, para expressão estável ou para ambas. Outrossim, podem-se criar vetores de expressão recombinantes que tornam a expressão constitutiva ou induzível.
[050] A invenção também se refere a uma célula hospedeira que compreende uma estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com a invenção.
Mais especificamente, a célula hospedeira da invenção compreende um ácido nucleico ou vetor conforme descrito anteriormente.
A célula hospedeira pode ser uma célula eucariota (p.ex. vegetal, animal, fúngica ou de alga) ou procariota (p.ex. bacteriana ou de protozoário). A célula hospedeira pode ser do tipo cultivada ou primária, i.é., isolada diretamente de um organismo (p.ex. um ser humano). A célula hospedeira pode ser aderente ou suspensa, iL.é., uma célula que cresce em suspensão.
Para finalidade de produção de um TCR, polipeptídeo ou proteína recombinante, a célula hospedeira é preferivelmente uma célula mamífera, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO, “Chinese hamster ovary"). Mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula humana.
Embora possa ser de qualquer tipo, possa se originar de qualquer tipo de tecido e possa apresentar qualquer estágio de desenvolvimento, a célula hospedeira é preferivelmente um leucócito de sangue periférico (LSP) ou uma célula mononuclear de sangue periférico (CMSP). Mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula T, que pode ser qualquer tipo de célula T: uma célula T em cultura (p.ex., uma célula T primária), uma célula T de uma linhagem celular cultivada (p.ex.
Jurkat, SupT1) ou uma célula T de um mamífero, preferivelmente uma célula T ou um precursor de célula T de um paciente humano.
Se for originária de um mamífero, a célula T pode ser obtida de diversas fontes, incluindo-se, entre outras, sangue, medula óssea, linfonodos, timo ou outros tecidos ou fluidos.
As células T também podem ser submetidas a enriquecimento ou purificação.
Preferivelmente, a célula T é uma célula T humana.
Mais preferivelmente, a célula T é uma célula T isolada de um indivíduo humano.
A célula T pode ser qualquer tipo de célula T e pode estar em qualquer estágio de desenvolvimento, podendo incluir, entre outras, células T CD4- positivas e/ou CDB8 positivas, célulasT auxiliares CD4-positivas (p.ex. células Th1 e Th2), células T CD8 positivas (p.ex. células T citotóxicas), células infiltradoras de tumores (TIL, “tumor-infiltrating Iymphocytes”), células T de memória ou células T virgens e assemelhadas. Preferivelmente, a célula T é uma célula T CD8-positiva ou uma célula T CD4-positiva.
[051] Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção é um linfócito, preferivelmente um linfócito T, tal como uma célula T CD4-positiva ou CD8-positiva. Ademais, a célula hospedeira é preferivelmente uma célula T reativa a tumores específica para células tumorais que expressam COL6AS3.
[052] Outro aspecto da presente invenção se refere às estruturas reconhecedoras de antígenos aqui reveladas, ácidos nucleicos, vetores, composições farmacêuticas e/ou células hospedeiras para uso em medicina. Em uma configuração preferida, o uso em medicina inclui o uso no diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de uma doença tumoral, podendo esta ser maligna ou benigna. A doença tumoral pode ser, por exemplo, uma doença caracterizada pela expressão de COL6A3 em um câncer ou em uma célula tumoral da referida doença tumoral.
[053] Em relação às aplicações médicas supramencionadas das estruturas reconhecedoras de antígenos e outros materiais derivados dos mesmos, o câncer a ser tratado ou diagnosticado pode ser qualquer tipo de câncer, incluindo-se qualquer um dentre câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do ânus, do canal anal ou anorretal, câncer do olho, câncer do ducto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pescoço, vesícula biliar ou pleura, câncer nasal, da cavidade nasal ou do ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vagina, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer do colo do útero, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofaringe, linfoma não-Hodgkin, câncer da orofaringe, câncer de ovário, câncer de pênis, câncer de pâncreas, câncer de peritônio, omento e mesentério, câncer de faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer do intestino delgado, câncer de tecidos moles, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer do útero, câncer ureteral e câncer de bexiga. São cânceres preferidos os cânceres do colo do útero, orofaringe, ânus, canal anal, anorretal, vagina, vulva e pênis. Um câncer preferido é o câncer positivo para COL6A3, incluindo câncer gastrointestinal e câncer gástrico.
[054] As estruturas, proteínas, TORs, anticorpos, polipeptídeos e ácidos nucleicos da invenção destinam-se especificamente ao uso em imunoterapia, preferiveemente em terapia com célulasT adotivas. A administração dos compostos da invenção pode incluir, por exemplo, a infusão de células T da invenção no referido paciente. Preferivelmente, tais células T são células T autólogas do paciente com tradução in vitro de um ácido nucleico ou estrutura reconhecedora de antígenos da presente invenção.
[055] WO 2016/011210 revela células modificadas para terapia adotiva, incluindo células NK e células T, e composições que contêm essas células e métodos para administração as mesmas a indivíduos. As células podem conter receptores antigênicos modificados que se ligam especificamente a antígenos, tais como receptores antigênicos quiméricos (CARs) e receptores coestimulatórios.
[056] O objeto da presente invenção também é solucionado por um método de fabricação de uma estrutura reconhecedora de antígenos específica para COL6A3, que compreende: a. fornecimento de uma célula hospedeira apropriada; b. fornecimento de uma estrutura genética compreendendo uma sequência codificadora que codifica a estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4;
Cc. introdução da referida estrutura genética na referida célula hospedeira apropriada; e d. expressão da referida estrutura genética pela referida célula hospedeira apropriada.
[057] O método também pode compreender uma etapa de apresentação da referida estrutura reconhecedora de antígenos na superfície celular da referida célula hospedeira apropriada.
[058] Em outras configurações preferidas, a estrutura genética é uma estrutura expressiva que compreende uma sequência promotora com ligação operante à referida sequência codificadora.
[059] A referida estrutura reconhecedora de antígenos é preferivelmente de origem mamiífera e humana. A célula hospedeira apropriada e preferida para uso no método da invenção é uma célula mamiífera, tal como uma célula humana, e em particular um linfócito T humano. As células T para uso na invenção foram descritas anteriormente com mais pormenores.
[060] A invenção abrange também configurações nas quais a referida estrutura reconhecedora de antígenos é um TCR modificado, sendo que tal modificação consiste em adicionar domínios funcionais como um marcador ou uma substância com atividade terapêutica; abrangem-se também TCRs com domínios alternativos, tais como um domínio alternativo de ancoragem na membrana em vez da região transmembrana endógena.
[061] É desejável que o sistema de transfecção para introdução da estrutura genética na referida célula hospedeira apropriada seja um sistema de vetor retroviral. Tais sistemas são bem conhecidos dos versados na técnica.
[062] Em uma configuração, a presente invenção abrange também a etapa adicional de isolamento e purificação da estrutura reconhecedora de antígenos da célula e, opcionalmente, reconstituição dos fragmentos traduzidos da estrutura reconhecedora de antígenos em uma célula T.
[063] Em um aspecto alternativo da invenção, uma célula T é fornecida, obtida ou obtenível por um método de produção de um receptor de célula T (TCR) específico para células tumorais que possui alta avidez, conforme descrito anteriormente. Dependendo da célula hospedeira usada no método da invenção, tal célula T pode ser, por exemplo, uma célula T humana ou não- humana, sendo preferível um TCR humano.
[064] Os TCRs, polipeptídeos, proteínas (incluindo variantes funcionais das mesmas), ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras (incluindo populações das mesmas) e anticorpos (incluindo porções ligantes de antígenos dos mesmos) podem ser isolados e/ou purificados. Conforme aqui utilizados, o termo “isolado” significa removido de seu ambiente natural e o termo “purificado” significa tendo tido sua pureza aumentada, sendo “pureza” um termo relativo e não interpretado como pureza absoluta. Por exemplo, a pureza pode ser de pelo menos 50%, pode ser maior que 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% ou pode ser 100%.
[065] As estruturas reconhecedoras de antígenos, TCRs, polipeptídeos, proteínas (incluindo variantes funcionais das mesmas), ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras (incluindo populações das mesmas) e anticorpos (incluindo porções ligantes de antígenos dos mesmos) são todos denominados coletivamente “materiais do TCR da invenção” e podem ser formulados em uma composição, tal como uma composição farmacêutica. Neste sentido, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende qualquer uma das estruturas reconhecedoras de antígenos, TCRs, polipeptídeos, proteínas, porções funcionais, variantes funcionais, ácidos nucleicos, vetores de expressão, células hospedeiras (incluindo populações das mesmas) e anticorpos (incluindo porções ligantes de antígenos dos mesmos) aqui descritos e um veículo, excipiente e/ou estabilizante farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas da invenção que contenham um dos TCRs da invenção podem compreender mais de um TCR da invenção, p.ex., um polipeptídeo e um ácido nucleico, ou dois ou mais TCRs (incluindo porções funcionais e variantes funcionais dos mesmos). Alternativamente, a composição farmacêutica pode compreender material do TCR da invenção em combinação com outra(s) agente(s) ou droga(s) farmaceuticamente ativas, tais como agentes quimioterápicos (p.ex. asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, — daunorrubicina, doxorrubicina, fluoruracila, gemcitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximabe, vimblastina, vincristina, etc.), sendo que o veículo é, preferivelmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Em relação às composições farmacêuticas, o veículo pode ser qualquer um dos usados convencionalmente para o TCR específico da invenção em questão. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos versados na técnica e estão amplamente disponíveis ao público. É preferido que o veículo farmaceuticamente aceitável seja apenas um e que não exerça efeitos deletérios nem apresente toxicidade sob as condições de uso.
[066] Portanto, é fornecida também uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos produtos aqui descritos e materiais de TCR da invenção, especificamente proteínas, ácidos nucleicos e células hospedeiras. Em uma configuração preferida, a composição farmacêutica destina-se à imunoterapia e, preferivelmente, à terapia com células adotivas.
[067] Preferivelmente, o material de TCR da invenção é administrado por injeção (p.ex. intravenosa). Quando o TCR da invenção é uma célula hospedeira que expressa o TCR da invenção (ou uma variante funcional do mesmo), o veículo farmaceuticamente aceitável para as células a serem injetadas pode incluir qualquer veículo isotônico como, por exemplo, solução salina normal (cerca de 0,90% p/v de NaCl em água, com cerca de 3200 mOsm/L NaCl em água ou cerca de 9,0 g NaCl por litro de água), solução eletrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL, EUA) cerca de 5% de dextrose em água ou lactato de Ringer. Em uma configuração, o veículo farmaceuticamente aceitável é suplementado por albumina sérica humana.
[068] Para finalidades da invenção, a quantidade ou dose (p.ex. número de células em casos onde o TCR da invenção consiste em uma ou mais células) do material do TOR administrado pode ser suficiente para efetuar, p.ex., uma resposta terapêutica ou profilática em um indivíduo ou animal ao longo de um período de tempo razoável. Por exemplo, a dose do TCR da invenção deve ser suficiente para ligar um antígeno de câncer, tratar ou prevenir câncer em um período de cerca de duas horas ou mais (p.ex. 12 a 24 horas ou mais) a partir do momento da administração. Em determinadas configurações, este período pode ser ainda mais longo. A dose será determinada pela eficácia do TOR específico da invenção, pelas condições do animal (p.ex. ser humano) e pelo peso corporal do animal (p.ex. ser humano) a ser tratado.
[069] Contempla-se que as composições farmacêuticas da invenção, TCRs (incluindo variantes funcionais do mesmo), polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinante, células hospedeiras ou populações de células podem ser usadas no tratamento ou na prevenção do câncer ou em doenças pré-malignas positivas para COL6A3. Acredita-se que o TCR da invenção (e as variantes funcionais do mesmo) se ligam especificamente ao antígeno COL6A3 de modo que o TCR ou polipeptídeo ou proteína da invenção (e as variantes funcionais do mesmo) são capazes de, quando expressos por uma célula, mediar uma resposta imune contra uma célula-alvo que expressa os antígenos COL6A3 da invenção. Neste sentido, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma patologia, em particular o câncer, em um mamífero, método este que compreende administração ao referido mamífero de qualquer uma das composições farmacêuticas e estruturas reconhecedoras de antígenos, em particular TORs (e variantes funcionais dos mesmos), polipeptídeos ou proteínas aqui descritas, qualquer ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante que compreenda uma sequência de nucleotídeos que codifique qualquer um dos TCRs (ou variantes funcionais dos mesmos), polipeptídeos ou proteínas aqui descritas ou qualquer célula hospedeira ou população de células que compreenda um vetor recombinante que codifique qualquer uma das estruturas da invenção (e variantes funcionais das mesmas), polipeptídeos ou proteínas aqui descritas em uma quantidade que seja eficaz para tratar ou evitar a patologia no referido mamífero, onde a patologia em questão é o câncer, preferivelmente um câncer positivo para COL6A3.
[070] São exemplos de veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção os estabilizadores como SPGA, carboidratos (p.ex. sorbitol, manitol, amido, sucrose, glicose e dextrana), proteínas como a albumina e a caseína, agentes que contêm proteínas (p.ex. soro bovino ou leite desnatado) e tampões (p.ex. tampão fosfato).
[071] Conforme aqui usados, os termos “tratar” e “prevenir”, assim como palavras derivadas dos mesmos, não significam necessariamente tratamento ou prevenção integrais ou completos. Com efeito, existem diversos graus de tratamento ou prevenção, que aqueles com habilidade ordinária na técnica reconhecerão como potencialmente benéficos ou como surtindo efeito terapêutico. Neste sentido, os métodos da invenção podem fornecer qualquer quantidade de qualquer nível de tratamento ou prevenção de uma patologia em um mamífero. Outrossim, o tratamento ou prevenção fornecidos pelo método da invenção pode incluir o tratamento ou a prevenção de uma ou mais patologias ou sintomas da patologia (p.ex. câncer) a ser tratada ou prevenida. Por exemplo,
o tratamento ou a prevenção podem incluir a promoção da regressão de um tumor. Também para os propósitos atuais, a prevenção pode incluir retardar o início da patologia ou de um sintoma ou manifestação da mesma.
[072] A presente invenção também se refere a um método de tratamento do câncer que compreende a administração de um TCR, um ácido nucleico ou uma célula hospedeira da presente descrição em combinação com pelo menos um agente quimioterápico ou com radioterapia.
[073] Também é fornecido um método de tratamento do câncer para um indivíduo que disso necessite, que compreende: a) isolamento de uma célula do referido indivíduo; b) transformação da célula com pelo menos um vetor que codifica uma estrutura reconhecedora de antígenos da presente invenção de modo a produzir uma célula transformada; Cc) expansão da célula transformada de modo a produzir uma pluralidade de células transformadas; e d) administração da pluralidade de células transformadas no referido indivíduo.
[074] Também é fornecido um método de tratamento do câncer para um indivíduo que disso necessite, que compreende: a) isolamento de uma célula de um doador saudável; b) transformação da célula com um vetor que codifica uma estrutura reconhecedora de antígenos da presente invenção de modo a produzir uma célula transformada; c) expansão da célula transformada de modo a produzir uma pluralidade de células transformadas; e d) administração da pluralidade de células transformadas no referido indivíduo.
[075] Também é fornecido um método de detecção do câncer em uma amostra biológica, que compreende: a) colocação da amostra biológica em contato com uma estrutura reconhecedora de antígenos da presente descrição; b) detecção da ligação da estrutura reconhecedora de antígenos com a amostra biológica.
[076] Em algumas configurações, o método de detecção de câncer é realizado in vitro, in vivo ou in situ.
[077] Também é fornecido um método para detectar a presença de uma patologia em um animal mamífero, que compreende (i) colocar uma amostra com uma ou mais células em contato com qualquer um dos TCRs da invenção (e variantes funcionais dos mesmos), polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células, anticorpos ou porções ligantes de antígenos dos mesmos ou as composições farmacêuticas aqui descritas, formando-se assim um complexo, e detecção do referido complexo, sendo que a detecção do complexo indica a presença da patologia no mamífero, patologia esta que pode ser câncer, tal como um câncer positivo para COL6A3.
[078] Em relação ao método da invenção para detectar uma patologia em um mamífero, a amostra de células pode ser uma amostra de células inteiras, lisados das mesmas ou uma fração de lisados de células inteiras, p.ex., uma fração nuclear ou citoplasmática, uma fração de proteína inteira ou uma fração de ácido nucleico.
[079] Para fins do método de detecção da invenção, o contato pode ocorrer in vitro ou in vivo em relação ao animal. Preferivelmente, o contato ocorre in vitro.
[080] A detecção do completo também pode ocorrer por meio de diversas maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, as estruturas reconhecedoras de antígenos da invenção (e variantes funcionais das mesmas),
polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células ou anticorpos ou TCRs, ou porções ligantes de antígenos dos mesmos, conforme aqui descritos, podem ser rotulados por marcadores detectáveis, tais como, por exemplo, um radioisótopo, um fluoróforo (p.ex. isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE)), uma enzima (p.ex. fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano) e partículas elementares (p.ex. partículas de ouro).
[081] Para fins dos métodos da invenção empregados para administrar células hospedeiras ou populações de células, as células podem ser células alogênicas ou autólogas do mamífero, sendo preferidas as células autólogas.
[082] Em relação às aplicações médicas supramencionadas dos TCRs contemplados pela invenção, o câncer a ser tratado ou diagnosticado pode ser qualquer tipo de câncer, incluindo-se qualquer um dentre câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossarcoma alveolar, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do ânus, canal anal ou anorretal, câncer do olho, câncer do ducto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pescoço, vesícula biliar ou pleura, câncer nasal, da cavidade nasal ou do ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vagina, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer do colo do útero, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofaringe, linfoma não-Hodgkin, câncer da orofaringe, câncer de ovário, câncer de pênis, câncer de pâncreas, câncer de peritônio, omento e mesentério, câncer de faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer do intestino delgado, câncer de tecidos moles, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer do útero,
câncer da uretra e câncer de bexiga. São cânceres preferidos os cânceres do colo do útero, orofaringe, ânus, canal anal, anorretal, vagina, vulva e pênis. Um câncer preferido é o câncer positivo para COL6A3, tais como câncer gastrointestinal ou câncer gástrico.
[083] Em geral, a invenção fornece um método para tratamento de indivíduos que apresentam tumores ou uma doença tumoral, que compreende a administração de estruturas reconhecedoras de antígenos, ácidos nucleicos, vetores, composições farmacêuticas e/ou células hospedeiras, conforme discutido na presente invenção. Preferivelmente, o indivíduo é um indivíduo que necessita de tal tratamento. Em configurações preferidas, o indivíduo é um indivíduo mamífero, preferivelmente um paciente humano, que apresenta um tumor ou uma doença tumoral positiva para COL6A3.
[084] A presente invenção será descrita mais pormenorizadamente nos exemplos a seguir, com referências às figuras que os acompanham, mas sem limitar-se aos mesmos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas ficam integralmente incorporadas por referência. Nas Figuras e Sequências:
[085] A Figura 1 mostra a conversão de um TCR em um TCR de cadeia única (scTv) Va/VB estabilizado por meio de exibição em superfície de levedura. As moléculas de ScTv exibidas na superfície do Saccharomyces cerevisiae transformado EBY100 foram coradas com anticorpo anti-Vbeta1 marcado com FITC e com tetrâmero HLA A*02/COL6A3-002 marcado com PE. A scTv R4P3F9 não modificada (SEQ Nº 22, painel esquerdo) é comparada com um clone de scTv que apresenta mutações pontuais para estabilizar o suporte de scTv (painel direito), que foi derivado da seleção de uma mutação aleatória na biblioteca de scTv.
[086] A Figura 2 mostra a maturação por afinidade da scTv por meio da exibição na superfície de leveduras. As moléculas de scTv estabilizadas
(com ou sem CDR1 beta maturado por afinidade) foram coradas com tetrâmeros de HLA A*02 contendo COL6A3-002 (SEQ Nº 1) e contracoradas com uma mistura de tetrâmeros de HLA A*02 contendo nove peptídeos (SEQ Nº 28 a 36) com sequências altamente semelhantes à do COL6A3-002. O scTv estabilizado (SEQ Nº 27) com sequência de cadeia beta de CDR1 não-mutante RSGDLS (SEQ Nº 13) foi comparado com clones de scTv que apresentam cadeias beta de CDR1 maturado por afinidade AMDHPY (SEQ Nº 40) e ARWHRN (SEQ Nº 39).
[087] A Figura 3 mostra os perfis de eluição de cromatografia por exclusão de tamanho de variantes de fusão de Fab anti-CD3 Fab com scTv R4P3F9S 75-1 a 75-25.
[088] A Figura4 mostra a cinética de ligação de HLA A*02/COL6A3-002 a variantes de fusão de Fab-scTv R4P3F9S anti-CD3 75-1 a 75-25, conforme aferida por interferometria em biocamada. As concentrações analisadas de HLA A*02/COL6A3-002 são indicadas.
[089] A Figura 5 mostra a análise de ligação de variantes de fusão de Fab-secTtv R4P3F9S anti-cCD3 75-1 a 75-25, conforme aferida por interferometria em biocamada (IBC). Foi analisado 1 uM de HLA A*02 em complexo com os peptídeos semelhantes indicados.
[090] A Figure 6 mostra uma comparação da cinética de ligação de HLA A*02/COL6A3-002 com HLA A*02/COL6A1-001 (SEQ Nº 30) para diferentes variantes de fusão de anti-CD3 Fab-scTv R4P3F9S. As concentrações das moléculas de Fab-scTv analisadas são indicadas.
[091] A Figura 7 mostra a coloração de células T CD8* humanas maturadas que expressam uma variante do TOR R4P3F9 para tetrâmetros de HLA A*02/COL6A3-002 marcados por PE. Para fins de controle, foram usadas células sem TCR (simulado) ou o TCR 1G4 específico para células NYESO1- 001 expresso. A coloração para tetrâmeros HLA A*02/NYESO1-001 marcados com PE foi usada.
[092] A Figura 8 mostra a liberação de IFN-gama por células T CD8* humanas maturadas que expressam uma variante do TOR R4P3F9 em resposta a COL6AS3-002. Para fins de controle, nenhum TCR (simulado) ou TOR 1G4 específico para NYESO1-001 foi expresso. A liberação de IFN-gama foi determinada por ELISA após cultura simultânea de células T CD8* eletroporadas com células T2 carregadas com diluições seriadas de COL6A3-002.
[093] A Figura 9 mostra a liberação de IFN-gama por células T CD8* humanas maturadas que expressam uma variante do TOR R4P3F9 em resposta a COL6A3-002 e a vários peptídeos semelhantes. Para fins de controle, nenhum TCR (simulado) ou TCR 1G4 específico para NYESO1-001 foi expresso. A liberação de IFN-gama foi determinada por ELISA após cultura simultânea de células T CD8* eletroporadas com células T2 carregadas com diluições seriadas de COL6A3-002 ou peptídeos semelhantes.
[094] A Figura 10 mostra a coloração de células T CD8* humanas maturadas que expressam uma variante do TOR R4P3F9 para tetrâmetros de peptídeo A*02 marcados por PE. Para fins de controle, foram usadas células sem TCR (simulado) ou o TCR 1G4 específico para células NYESO1-001 expresso. A coloração para tetrâneros HLA A*02/NYESO1-001 marcados com PE foi usada.
[095] A Figura 11 mostra a liberação de IFN-gama em resposta a COLG6A3-002 ou a COL6A1-001 por células T CD8* humanas maturadas que expressam uma variante do TOR R4P3F9. Para fins de controle, nenhum TOR (simulado) ou TCR 1G4 específico para NYESO1-001 foi expresso. A liberação de IFN-gama foi determinada por ELISA após cultura simultânea de células T CD8* eletroporadas com células T2 carregadas com diluições seriadas de COL6A3-002 COL6A1-001.
[096] A Figura 12 mostra a liberação de IFN-gama por células T
CD8* humanas que expressam variantes do TOR R4P3F9 quando cultivadas junto com várias linhagens de células tumorais. As células SF539, SW982 e Hs840.T apresentam o peptídeo-alvo em diferentes concentrações. As células MCF-7 não apresentam o peptídeo-alvo. Para fins de controle, foram analisadas células efetoras sem TCR exógeno junto com células com os TOCRs em questão. A liberação de IFN-gama foi determinada por ELISA. * pontos de dados fora da escala.
[097] Tabela 1: Sequências dos peptídeos da invenção. (As posições são indicadas por numeração IMGT: (François Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Protein displays: human (Homo sapiens) TRAV; IMGT Repertoire. IMGTGO, the international ImMunoGenetics information systemO http://www.imgt.org.; Criado em: 16/03/2011. Versão: 03/06/2016; François Ehrenmann, Patrice Duroux, Chantal Ginestoux; Exibição de proteínas: humana (Homo sapiens) TRBV; Repertório IMGT. IMGTG, the international ImMunoGenetics information systemO http://www.imgt.org.; Criado em: 16/03/2011. Versão: 03/06/2016.) Nº, 1 COL6A3- FLLDGSANV 002 2 R4P3F9 | Cadeia alfa MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVP alfa completa de EGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIY TCR R4P3F9 | SNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATY
LCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQL RDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKT VLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPE DTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFOQNLSVIGFR
ILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 3 Segmento | Peptídeo líder | MKSLRVLLVILWLOLSWVWSQ líder de da cadeia alfa R4P3F9 | deTCR alfa R4P3F9 4 R4P3F9 | Domínio QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFW alfa, variável da YRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQY variável | cadeia alfa de | VSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKL TCRR4P3F9 | SVIP CDRa1 Região CDR1 | DRGSQS R4P3F9 da cadeia alfa do TCR
[1] Jreesse | 6 CDRa2 Região CDR2 | IYSNGD R4P3F9 da cadeia alfa do TCR R4P3F9 7 CDRa3 Região CDR3 | CAAYSGAGSYQLT R4P3F9 da cadeia alfa do TCR R4P3F9 8 Região Domínio NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQ alfa constante da SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA constante | cadeia alfa de | CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTN de TCR R4P3F9 LNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS R4P3F9 9 Início da | Início do NIQN região domínio alfa constante da constante | cadeia alfa de de TCR R4P3F9 R4P3F9 R4P3F9 Cadeia beta MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGO beta completa de RVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDAGLQOFLIQYYNG TCR R4P3F9 EERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALY
FCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAV FEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNG KEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSAT FWQONPRNHFRCQOVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTOQ! VSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT
LYAVLVSALVLMAMVKRKDF "1 Segmento | Peptídeo líder | MGFRLLCCVAFCLLGAGPV líder de da cadeia beta R4P3F9 de TCR beta R4P3F9 12 Segmento | Domínio DSGVTQTPKHLITATGARVTLRCSPRSGDLSVYWYQ variável variável da QSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDL de cadeia beta de | HSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTR R4P3F9 TCR R4P3F9 LTVWV beta 13 CDRb1 Região CDR1 RSGDLS de da cadeia beta R4P3F9 do TCR R4P3F9 14 CDRb2 Região CDR2 | YYNGEE de da cadeia beta R4P3F9 do TCR R4P3F9 CDRb3 Região CDR3 | CASSVESSYGYT de da cadeia beta R4P3F9 do TCR R4P3F9 16 Segmento | Domínio EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTOKATLVCLATGFF beta constante da PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDS constante | cadeia beta de | RYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSEND de TCR R4P3F9 EWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGV R4P3F9 LSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
17 Segmento | Início do EDLNK beta domínio constante | constante 1 da inicial 1 cadeia beta de de TCR R4P3F9 R4P3F9 18 Segmento | Início do EDLKN beta domínio constante | constante 2 da inicial 2 cadeia beta de de TCR R4P3F9 R4P3F9 19 Aga2p — Proteína de MOQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYS R4P3F9 fusão de LSTTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTT Aga2p com SKGSPINTAYVFGGGGSDYKDDDDKGGGASQKEVE scTv R4P3F9 | QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYS e marcadores | GKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIR
DSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNI QNGGGGESCEGESCEGESGEGESEGVTATPKHLITA TGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQAGLQFLIQY YNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGD SALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKAAAG
GSGGEQKLISEEDL Aga2p Sequência MOQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYS líder e Aga2p LSTTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTT
SKGSPINTQYVF 21 Marcador | Marcador GGGGSDYKDDDDKGGGAS FLAG FLAG e ligantes 22 seTv Domínios QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFW R4P3F9 variáveis de YRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQY cadeia única VSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKL de R4P3F9 SVIPNIOQNGGGGSGGGGSCGGGGSGGGESEVTATP com ligantes e | KHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDAGL aF55S no QFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSS domínio alfa LELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLN variável K 23 Marcador | Ligante e AAAGGSGGEQKLISEEDL Myc marcador Myc 24 seTv sceTv R4P3F9 | QOKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFW R4P3F9 coma YRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQY com mutação VSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKL mutação estabilizante SVIPNIOQNGGGGSGEGGSGGGGSGGGESEVTATP bA43K bQ43K em seu | KHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQOSLDQGLQO domínio beta FLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSL variável ELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNK seTv sceTv R4P3F9 | QOKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFW R4P3F9 coma YRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQY com mutação VSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKL mutação | estabilizante SVIPNIOQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGESEVTATP bL72S bL72S em seu | KHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDAGL domínio beta QFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSS variável LELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLN
K do aG29R CDRa1 27 seTv Forma QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQOSFFWY R4P3F9S | estabilizada do | ROYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYV scTv R4P3F9 | SLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLS
VIPGGGGSCECEESCSCSEGSGGGESGGGESSVTAT PKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQOGL QFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSS
LELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVV 28 AGRN- Peptídeos ALLDGRVQL 001 semelhantes 29 CLASP1- | Peptídeos RLLDGAFKL 001 semelhantes COL6A1- | Peptídeos ILLDGSASV 001 semelhantes 31 COL6A2- | Peptídeos FLLDGSERL 001 semelhantes 32 COL6A3- | Peptídeos FLFDGSANLV 006 semelhantes 33 COL6A3- | Peptídeos FLFDGSANL 008 semelhantes 34 COL6A3- | Peptídeos FLLDGSEGV 014 semelhantes VWA2- Peptídeos FLLDGSNSV 001 semelhantes 36 |vWwF-001 | Peptídeos FLLDGSSRL semelhantes 37 Mutante 1 | Cadeia beta ARWHNN de da variante 1 CDRb1 de CDR1 38 Mutante 2 | Cadeia beta AKDHLN de da variante 2 CDRb1 de CDR1 39 Mutante 3 | Cadeia beta ARWHRN de da variante 3 CDRb1 de CDR1 40 Mutante 4 | Cadeia beta AMDHPY de da variante 4 CDRb1 de CDR1 41 Mutante 5 | Cadeia beta ATDHYN de da variante 5 CDRb1 de CDR1 42 Mutante 6 | Cadeia beta ARYHTN de da variante 6 CDRb1 de CDR1 43 Mutante 7 | Cadeia beta APYHLN de da variante 7 CDRb1 de CDR1 44 Mutante 8 | Cadeia beta AKDHTN de da variante 8 CDRb1 de CDR1
ARVARN de da variante 9 CDRb1 de CDR1 46 Mutante Cadeia beta ARWHSN de da variante 10 CDRb1 de CDR1 47 Mutante Cadeia beta ATDHYN 11 de da variante 11 CDRb1 de CDR1 48 Mutante Cadeia beta RWGDLN 12 de da variante 12 CDRb1 de CDR1 49 Mutante Cadeia beta ARDHLN 13 de da variante 13 CDRb1 de CDR1 50 75-1 Cadeia MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSL pesada Fab RLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINP com scTv YKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAE R4P3F9S DTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSA estabilizado STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQATYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTS PPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYS DRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFT AQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSY QLTFGKGTKLSVIPNIOQNGGGGSGGGEGSCGEGESSGÇE GGSGGGGSECVTATPKHLITATGQARVTLRCSPRSGD LSVYWYKQOSLDOQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFS AQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGY
TFGSGTRLTVVEDLKN 51 75- Fab Cadeia MKWVTFISLLFLFSSAYSEVOQLVESGGGLVQPGGSL Cadeia pesada Fab RLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINP pesada YKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAE
DTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTS
PPSPAPPVAG 52 75- Fab Cadeia leve MKWVTFISLLFLFSSAYSDIQMTQOSPSSLSASVGDRV Cadeia Fab TITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLES leve GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLOPEDFATYYCQQGN
TLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOG
LSSPVTKSFNRGEC 53 [1G4alfa | Cadeia alfa METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGEN completa de LVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIOSSAR TCR 1G4 EQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCA
VRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRD SKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVL DMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDT FFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILL
LKVAGFNLLMTLRLWSS 54 Segmento | Peptídeo líder | METLLGLLILWLALOWVSSK líder de da cadeia alfa 1G4 alfa de TCR 1G4
55 Segmento | Domínio QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQOWFRQ variável variável da DPGKGLTSLLLIOSSAREQTSGRLNASLDKSSGRST de 1G4 cadeia alfa de | LYIMASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLI alfa TCR 1G4 VHP 56 Segmento | Domínio YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQ constante | constante da SKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA de 1G4 cadeia alfa de | CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTN alfa TCR 1G4 LNFOQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 57 Segmento | Cadeia beta MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQOTPKFQVLKTGQ variável completa de SMTLAOCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVG de 1G4 TCR 1G4 AGITDOGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTS beta WVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPE
VAVFEPSEAEISHTQOKATLVCLATGFYPDHVELSWW VNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAK PVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEIL
LGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 58 Segmento | Peptídeo líder | MSIGLLCCAALSLLWAGPVNA líder de da cadeia beta 1G4 beta | de TOR 1G4 59 1G4 beta, | Domínio GVTQTPKFQVLKTGASMTLACAQDMNHEYMSWYR variável variável da QDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTE cadeia beta de | DFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGS TCR 1G4 RLTVL 60 1G4 beta, | Domínio EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY constante | constante da PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDS cadeia beta RYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSEND
EWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGV
LSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 61 NYESO1- | Peptídeo de SLLMWITQV 001 controle 62 Cc-14 Cadeia beta MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQ beta; C-5 | de TOR C-14; | RVTLRCESPAMDHPYVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNG beta C-5 completo EERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALY com CDRb1 FCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAV mutante 4 FEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNG
KEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQOVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTOQ! VSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKAT
LYAVLVSALVLMAMVKRKDF 63 C-14 alfa | Cadeia alfa de | MKSLRVLLVILWLOLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVP TCR C-14 EGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIY completo com | SNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATY CDRa1 LCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQL mutante 1 RDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKT
VLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPE DTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFR
ILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 75-5 Cadeia MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSL pesada Fab RLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINP com scTv YKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAE R4P3F9S DTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSA estabilizado e | STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV mutante 4 de TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS CDRb1 SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTS
PPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYS DRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFT AQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSY QLTFGKGTKLSVIPNIOQNGGGGSCGGGCSCGGEGESSGÇE GGSGGGGSCGVTATPKHLITATGEQRVTLRCSPAMDH PYVYWYKOSLDQOGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFS AQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGY
TFGSGTRLTVVEDLKN 65 75-14 Cadeia MKWVTFISLLFLFSSAYSEVOLVESGGGLVQPGGSL pesada Fab RLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINP com scTv YKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAE R4P3F9S DTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSA estabilizado, STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV mutante 1 de TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS CDRa1 e SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTS mutante 4 de PPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYS CDRb1 DRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFT
AQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSY QLTFGKGTKLSVIPNIOQNGGGGSGCGGCESCGGESEG GGSGGGGSGVTATPKHLITATGQRVTLRCSPAMDH PYVYWYKQOSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFS AQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGY
TFGSGTRLTVVEDLKN 75-25 Cadeia MKWVTFISLLFLFSSAYSEVOLVESGGGLVQPGGSL pesada Fab RLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINP com scTv YKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAE R4P3F9S DTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSA estabilizado STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV em orientação | TVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS beta-alfa e SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTS CDRa1 PPSPAPPVAGGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSG mutante 1 DLSVYWYKQSLDQGLQFLIQY YNGEERAKGNISERF
SAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYG YTFGSGTRLTVVEDLKNGGGGSGGGGSCGGESCG GGSGEGESQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSD RRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTA QLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQ LTFGKGTKLSVIPNIQN EXEMPLOS
[098] Receptores de células T (TCRs) nativos com atividade contra antígenos cancerosos geralmente possuem afinidade inferior à de TORs ativos contra antígenos virais. Isso pode contribuir para explicar o escape tumoral (Aleksic et al. 2012). Portanto, é desejável obter variantes de TOR com afinidade mais elevada para uso como estrutura reconhecedora de antígenos na terapia com células adotivas ou como módulo de reconhecimento de abordagens terapêuticas que usam, por exemplo, moléculas biespecíficas (Hickman et al. 2016). Assim, a invenção se refere a uma modificação e otimização do receptor de células T R4P3F9 que ocorre naturalmente (SEQ Nº 2 e SEQ Nº 10) e atua contra o COL6A3-002 (SEQ Nº 1), um peptídeo associado a tumores, com afinidade de cerca de 60 uM (DE102016115246). EXEMPLO 1: GERAÇÃO DE ScTV ESTÁVEL
[099] Na presente invenção, o TCR R4P3F9 investigado anteriormente (SEQs Nºs 2 e 10) foi convertido em uma estrutura com TCR de cadeia única (scTv, SEQ Nº 22) para maturação por meio de exposição em superfície de leveduras e combinação dos domínios variáveis alfa (SEQ Nº 4) e beta (SEQ Nº 12) com apêndices dos respectivos domínios constantes (SEQ Nº 9 e SEQ Nº 17) e com uma sequência ligante glicina-serina apropriada. O DNA da sequência correspondente foi sintetizado e transformado na sequência EBY 100 de Saccharomyces cerevisiae (MATaAGA1::GAL1IAGA1::URA3 ura352 trp1 leu2delta200 his3delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL) (ATCCO MYA 49417“) junto com um vetor de expressão em leveduras que contém uma sequência líder e a Aga2p, uma proteína baseada em pCT302 que proporciona acoplamento em leveduras (SEQ Nº 20) (Boder et al. 2000). Após recombinação homóloga na levedura, a proteína de fusão resultante (SEQ Nº 19) possui os seguintes elementos: um segmento líder na porção N-terminal da proteína Aga2p, que é responsável pela exibição da proteína de interesse (Boder et al. 1997); marcadores peptídicos curtos, que incluem as sequências de ligação que controlam a expressão e a proteína de interesse (SEQ Nº 21 e SEQ Nº 23), qual seja a scTv R4P3F9 (SEQ Nº 22) ou variantes da mesma. A transformação foi realizada conforme descrito em DE 102016121899 e produziu até 10º clones de levedura por biblioteca. As bibliotecas foram geradas por meio de uma técnica de PCR com mutação aleatória, cobrindo toda a sequência gênica do scTv R4P3F9.
[100] O processo de seleção de clones de levedura que apresentam a melhor expressão de scTv com ligação seletiva a COL6A3-002 no contexto de HLA A*02 foi realizado essencialmente conforme descrito em Smith et al., 2015. Para garantir a expressão elevada e conformação correta da variante seTv R4P3F9 exibida na superfície de leveduras, foi usado um anticorpo anti-Vbeta1 (Beckman Coulter, clone BL37.2) junto com o tetrâmero HLA A*02/COL6A3-002 (Figura 1). A conversão de scTv por meio da exibição em superfície de leveduras revelou duas mutações estabilizantes essenciais na região da estrutura, junto com as sequências originais do CDR para apresentação apropriada do scTv na superfície celular, quais sejam bQ43K (SEQ Nº 24) e bl.72S (SEQ Nº 25), ambas localizadas na cadeia beta. Ademais, durante a estabilização por maturação a posição 29 do CDR1 da cadeia alfa (SEQ Nº 5) foi convertida de glicina para arginina (mutante 1 de CDRa1, SEQ Nº 26), o que melhorou a ligação a tetrâmeros. EXEMPLO 2: MATURAÇÃO POR AFINIDADE DE SCTV ESTABILIZADO
[101] Para gerar moléculas de scTv com maior afinidade de ligação por HLA A*02/COL6A3-002, o CDRb1 (SEQ Nº 13) foi degenerado por meio da estrutura seTv R4P3F9S estabilizada identificada anteriormente (SEQ Nº 27), que expressa as mutações estabilizantes aAG29R, boO43K e bl 72S. Os resíduos de CDRb1 foram randomizados usando-se oligonucleotídeos de DNA degenerados como primers, conforme descrito anteriormente por Smith et al. (2015). A biblioteca de DNA resultante foi transformada conforme descrito no Exemplo 1. Para manter a seletividade de ligação a scTv, foi usada seleção negativa contra tetrâmeros de HLA-A*02 compreendendo peptídeos derivados de tecidos normais (SEQs Nºs 28 a 36), cujas sequências possuem elevada similaridade com a do peptídeo COL6A3-002.
[102] Para seleção de variantes de scTv R4P3F9S seletivas e de maior — afinidade, as concentrações decrescentes do tetrâmero HLA-A*02/COL6A3-002 foram utilizadas a cada ciclo. Após três ciclos de seleção, clones de scTv individuais foram isolados, gerando diversas sequências de CDRb1 maturadas por afinidade (SEQs Nºs 37 a 49). No scTv com sequências de CDRb1 maturadas, foi demonstrada melhora acentuada da ligação a COL6A3-002, e a seletividade pelo COL6A3-002 foi mantida, uma vez que não se observou nenhuma ligação de 9 peptídeos semelhantes (Figura 2). EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO BIESPECÍFICAS PARA ANTICORPOS EscTv
[103] O scTv estabilizado e maturado por afinidade contra HLA-A*02/COL6A3-002 pode ser expresso em fusão com um grupamento de anticorpo anti-CD3, permitindo definir o tumor como alvo e ativar células T independentemente da especificidade original das mesmas. Os inventores geraram proteínas de fusão biespecíficas para anticorpos e TCRs fusionais, formadas por uma cadeia pesada de Fab anti-CD3 (UCHT1) (SEQ Nº 51) fundida com variantes de scTv R4P3F9S (SEQ Nº 50, 64, 65 e 66) e por uma cadeia leve de Fab anti-CD3 (UCHT1) (SEQ Nº 52). As proteínas de fusão Fab-scTv resultantes possuem massa molecular de cerca de 75 kDa. Baseado nas várias sequências da CDR1 das cadeias scTv R4P3F9S alfa (SEQ Nº 5 e SEQ Nº 26) e beta (SEQs Nºs 13 e 37 a 49), diversas variantes da proteína de fusão Fab- scTv (75-1 a 75-25 na Tabela 2) foram expressas em células ExpiCHO transfectadas de maneira transitória, conforme recomendado pelo fabricante. As proteínas foram purificadas por cromatografia de proteína L e exclusão por tamanho. Durante a produção das variantes fusionais, os rendimentos foram de 80vpUg a 1mg (Tabela 2), e os heterodímeros foram gerados de forma homogênea e tinham o tamanho esperado em ensaios de cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 3).
[104] Tabela 2: Nomenclatura e rendimentos para proteínas de fusão Fab-scTv biespecíficas. As moléculas se baseiam em SEQ Nº 50 e SEQ Nº 52 e nas variantes CDRa1 e CDRb1 assinaladas.
[751 — JoRGSaS (SEQ ID NO. 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267,9 752 — JpRGSAS (SEQ ID NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) — [784 753 ——JpRGSAS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 646,7 754 — JpRGSAS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) — [704,3 755 — pRGSaS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 397,2 756 ——JprGSaS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 268,1 757 — jpRGSaS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 83,2 758 ——prGSAS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 765,7 759 ——JprGSAS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 1067,2 75-10 DRRSOQS (SEQIDNO.26) — [RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 389,6 75-11 DRRSOQS (SEQIDNO.26) — JARWHNN(SEQIDNO.37) 270,4 75-12 DRRSOQS (SEQIDNO.26) — JAKDHLN(SEQ ID NO. 38) 943,6 7513 — pRRSOS (SEQIDNO.26) —JARWHRN(SEQIDNO.39) 560,3 7514 — DRRSOS (SEQIDNO.26) — [JAMDHPY (SEQ ID NO. 40) 360,7 75-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) — [ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 541,5 75-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) — [ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 403,6 75-17 DRRSOQS (SEQIDNO.26) — JAPYHLN (SEQID NO. 43) 195,5 75-18 DRRSQS (SEQIDNO.26) — [AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 731,3 7519 — pRRSOS (SEQIDNO.26) — JARYHRN (SEQ ID NO. 45) 794
175.20 — pRRSQS (SEQIDNO.26) —JARWHSN(SEQIDNO.46) 85,5 75-21 DRRSQS (SEQID NO. 26) — JATDHYN (SEQ ID NO. 47) 276 75-22 DRRSQS (SEQIDNO.26) [RWGDLN(SEQIDNO.48) [255 75-23 DRRSOQS (SEQIDNO.26) — [ARDHLN (SEQ ID NO. 49) 217 75-24º — |DRGSQS (SEQ ID NO: 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 166,6
75.255 — [DRRSOS (SEQIDNO.26) — [RSGDLS (SEQ ID NO. 13) à scTv orientado no sentido beta-alfa EXEMPLO 4: LIGAÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO FAB-SCTV AO COLG6A3-002 E
PEPTÍDEOS ASSEMELHADOS
[105] A afinidade de ligação das proteínas de fusão anti-CD3-scTv R4P3F9S por monômeros de HLA A*02 com COL6A3-002 ou outros peptídeos semelhantes foi medida por interferometria em bicamada. As mensurações foram realizadas por um sistema Octet RED384, usando as configurações recomendadas pelo fabricante. Resumidamente, moléculas de Fab-scTv purificadas foram carregadas em biossensores (FAB2G) antes de análise com diluições seriadas de HLA A*02/COL6A3-002. Em comparação com as variantes 75-1 a 75-24, que compreendem CDRa1 do tipo selvagem e CDRb1 do tipo selvagem, foram observados aumentos da afinidade de ligação de até 40 vezes com variantes de Fab-scTv com sequências maturadas de CDRa1 e/ou CDRb1 (Tabela 3, Figura 4). Para avaliar a seletividade de ligação ao HLA A*02/COL6A3-002, moléculas de Fab-scTv purificadas foram carregadas em sensores FAB2G e selecionadas em função da capacidade de ligação a 1 uM de peptídeos similares (SEQ Nº 28 a 36) em complexo com HLA A*02. Excetuando-se o HLA A*02/COL6A1-001 (SEQ Nº 30), que apresentou ligação com a maioria das variantes de Fab-scTv que continham CDRa1 maturado (SEQ Nº 26), as variantes de Fab-scTv não apresentaram ligação a peptídeos semelhantes (Figura 5), o que indica alta seletividade de ligação. Para algumas variantes de Fab-scTvy a janela terapêutica entre a ligação de HLA A*02/COL6A3-002 e HLA A*02/COL6A1-001 foi investigada carregando-se complexos de peptídeo e HLA biotinilados em biossensores (SA) e analisando séries de diluição de variantes Fab-scTv. A variante 75-10, que compreende CDRa1i maturado (SEQ Nº 26), e a sequência CDRb1 do tipo selvagem (SEQ Nº 13) mostraram afinidade de ligação oito vezes maior ao HLA A*02/COL6A3-002 em relação ao HLA A*02/COL6A1-001; para a variante 75-13, que compreende CDRb1 maturado (SEQ Nº 39), foi constatada afinidade de ligação até 57 vezes maior, o que indica melhora da janela terapêutica (Tabela 4, Figura 6).
[106] Tabela 3: Afinidade de ligação das proteínas de fusão Fab- scTv por HLA A*02/COL6A3-002.
75-1 8,06E-06 1,01E+05 8,17E-01
75-7 1,79E-06 1,93E+05 3,44E-01 75-9 1,41E-05 6,02E+04 8,51E-01 75-15 7,78E-07 2,33E+05 1,81E-01 75-17 2,27E-07 3,62E+05 8,20E-02 75-22 8,22E-07 2,48E+05 2,04E-01
[107] Tabela4: Comparação da afinidade de ligação das proteinas de fusão Fab-scTtv por HLAA*O02/COL6A3-002 e por HLA A*02/COL6A1-001. ee roses o as asas meo asse ren e | mo eee e | pm ese ser | a rasos fee paes EXEMPLO 5: Uso DE TCRS MATURADOS POR AFINIDADE PARA EXPRESSÃO CELULAR
[108] A modificação de células T de modo que reconheçam um complexo peptídeo-HLA específico para tumores é uma abordagem promissora para redirecionar células T contra células cancerosas. Como o uso de sequências de CDR1 maturadas melhorou a ligação de TCRs ligados à célula pelo HLA A*02/COL6A3-002, as sequências mutantes CDRa1 e CDRb1 identificadas foram enxertadas no TOR R4P3F9 original (SEQ Nº 2 e SEQ Nº 10). As variantes de TOR mutante daí resultantes (C-1 a C-18, Tabela 5) foram expressas em células T CD8* após eletroporação com os respectivos mMRNAs gerados por transcrição in vitro de estruturas de DNA amplificadas por PCR. Para fins de controle, o TOR 1G4 (SEQ Nº 53 e SEQ Nº 57) contra o peptídeo NYESO1-001 (SEQ Nº 61) foi expresso. Depois de incubação por uma noite das células T CD8* eletroporadas na presença de RNA, foi analisada a expressão das variantes de TCR introduzidas por meio de coloração por tetrâmeros de HLA A*02/COL6A3-002 ou tetrâmeros de HLA A*02/NYESO1-001 marcados com PE, A variante original de TOR R4P3F9 C-1 apresentou coloração mínima para tetrâmeros de HLA A*02/COL6A3-002, ao passo que as variantes TCR R4P3F9 C-2 a C-18 com CDRa1i e/ou CDRb1 maturados exibiram coloração mais acentuada para tetrâmeros (Figura 7). A ativação funcional de células T CD8* (20.000 células por cavidade) que expressam diversas variantes de TCR R4P3F9 maturadas foi investigada por meio de ensaios de liberação de IFN-gama durante cultura simultânea com células T2 (20.000 células por cavidade) carregadas com diluições seriadas de COL6A3-002 (SEQ Nº 1) ou COLG6A3-002 10 uM e peptídeos similares (SEQs Nºs 28 a 36). Em comparação com a variante TOR R4P3F9 C-1 original, as variantes de TOR maturadas C-2 a
C-18 mostraram aumento da liberação de IFN-gama, sendo que os níveis máximos foram atingidos com as concentrações mais baixas dos peptídeos estimulatórios (Figura 8). Como esperado, não foi observada liberação de IFN- gama com células T sem TCR ou com o TCR de controle 1G4 específico para a NYESO1-001. Para analisar a seletividade do reconhecimento de COL6A3-002 por variantes de TOR R4P3F9 maturadas, a liberação de IFN-gama em resposta a células T2 carregadas com diversos peptídeos semelhantes (SEQs Nºs 28 a 36) também foi analisada, revelando vários perfis de seletividade para as variantes de TOR R4P3F9 maturadas. É interessante notar que as variantes de TCR C-5 (SEQs Nºs 62 e 2) e C-14 (SEQs Nºs 62 e 63), que compreendem o mesmo CDRb1 maturado (SEQ Nº 40), não apresentaram nenhuma reatividade cruzada em relação a COL6A1-001 nem a outros peptídeos semelhantes (Figura 9), o que torna as variantes C-5 e C14 de TOR R4P3F9 as candidatas mais promissoras em termos de atividade antitumoral celular baseada em TCR.
[109] Tabela 5: Nomenclatura de variantes de TCR celular. As moléculas se baseiam em SEQ Nº 2 e SEQ Nº 10 e nas variantes CDRa1 e CDRb1 assinaladas. cDRb! ARWHNN (SEGID NO 37) ARMHRN (SEG D NO. 39) ARMANN (SEG O NO 57) AKDHEN (SEQ ID NO. 38)
ATDHYN (SEQ ID NO. 41) ARYHTN (SEQ |D NO. 42) APYHLN (SEQ ID NO. 43) EXEMPLO 6: JANELA DE RECONHECIMENTO DE COL6A3-002 E COL6A1-001 POR
CÉLULAS COM DIVERSAS VARIANTES DE TCR
[110] A expressão e a análise celular das variantes de R4P3F9 foram realizadas conforme descrito anteriormente. Assim como em experimentos anteriores (Figura 7), a coloração de células T que expressam as variantes C-2 a C-18 de R4P3F9 TCR com tetrâmeros de HLA A*02/COL6A3- 002 marcados com PE aumentou em comparação com o TCR C-1 original. Ademais, as variantes C-12 e C-17 de TCR apresentaram ligação ao HLA A*02/COL6A1-001 (Figura 10). A expressão de todas as variantes maturadas de R4P3F9 melhorou a atividade funcional das células T CD8* em resposta a células T2 carregadas com uma série de diluições de COL6A3-002 (SEQ Nº 1), atingindo valores de EC5o 5 a 90 vezes menores que os obtidos com o TCR C-1 original (Figura 11, Tabela 6). O valor mínimo de ECrso foi observado para a variante C-14. Novamente, as variantes de TOR C-5 (SEQ Nº 62 e SEQ Nº 2) e C-14 (SEQ Nº 62 e SEQ Nº 63), que compreendem a mesma CDRb1 maturada (SEQ Nº 40), não apresentaram nenhuma reatividade cruzada contra COL6A1-001, ao passo que outras variantes mostraram reconhecimento acentuado com janelas de EC5so (COL6A3-002 vs. COL6A1-001) atingindo níveis baixos como 5.
[111] Tabela 6: Valores de EC5so [NM] de liberação de IFN-y por células T que expressam variantes de R4P3F9 após cultura simultânea com células T2 carregadas com COL6A3-002 ou COL6A1-001. variante === = = = — — [ECs, para COL6A3-002 [NM] [ECs, para COL6A1-001 [NM] Ber ps F«E
EB EEB RE les ess - es h -
E era E
E E ee os - eo es E Br es 82 Be es [E ea BF les 6% et eba 8 err as as à platô não alcançado EXEMPLO 7: EFICÁCIA DAS VARIANTES C-5 E C-14 DE R4P3F9 MATURADAS CONTRA
LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS
[112] A expressão e a análise celular das variantes de R4P3F9 foram realizadas conforme descrito anteriormente.
[113] A expressão das variantes C-5 maturadas de R4P3F9 (SEQ Nº 62 e 2) e C-14 (SEQ Nº 62 e 63) melhoraram a ativação funcional das células T CD8* em resposta a linhagens de células tumorais que apresentam COL6A3-002 (SEQ Nº 1) em comparação com o TCR C-1 original (Figura 12). As linhagens de células tumorais usadas neste estudo apresentavam o peptídeo- alvo em diferentes quantidades. As células SF539 possuem cerca de 4000 cópias de HLA A*02/COL6A3-002 por célula, e as células SW982 possuem cerca de 460 cópias por célula. O TOR C-1 original não mediou ativação intensa de células T ao ser cultivado junto com linhagens celulares positivas para o alvo, e a variante TOR C-14 apresentou ativação funcional ainda mais intensa que a variante TOR C-5. Esses dados são compatíveis com a melhora de ECso observada com TCR C-1 a C-5 e TOR C-14 (Tabela 6). A linhagem de células tumorais MCF-7, que é negativa para o alvo, não foi reconhecida por nenhum desses TCRs.
[114] Referências: Aleksic et al. 2012: Different affinity windows for virus and cancer- specific T-cell receptors — implications for therapeutic strategies, Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9; Hickman et al. 2016: Antigen Selection for Enhanced Affinity T-Cell Receptor-Based Cancer Therapies, J Biomol Screen. 2016 Sep;21(8):769-85; Boder and Wittrup 2000: Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol. 2000;328:430-44; Boder and Wittrup 1997: Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7; Smith et al. 2015: T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform, Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141; DE102016121899.5 DE102016115246

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS compreendendo um primeiro domínio que compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem as sequências de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 5 (CDRa1), SEQ Nº 6 (CDRa2) e SEQ Nº 7 (CDRa3), e um segundo domínio que compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que compreendem as sequências de aminoácidos de acordo com SEQ Nº 13 (CDRb1), SEQ Nº 14 (CDRb2) e SEQ Nº 15 (CDRb3), caracterizada por pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade é substituída por pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por: a) SEQNº 26 (mutante 1 de CDRa1) e SEQs Nºs 37 a 49 (CDRb1mut1i a CDRb1imut13); e b) uma sequência mutante compreendendo pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo formado por SEQ Nº 26 e SEQs Nº 37 a 49, compreende pelo menos uma sequência de aminoácidos contém uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
2. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela estrutura reconhecedora de antígenos ser estável e capaz de se ligar específica e/ou seletivamente a um peptídeo antigênico de COL6A3 que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ Nº 1, em particular no contexto com MHC.
3. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com as reivindicações | ou 2, caracterizada pela estrutura reconhecedora de antígenos ser um anticorpo ou derivado, tal como uma molécula biespecífica ou fragmento da mesma, ou um receptor de célula T(TCR)
ou um derivado do mesmo, tal como uma molécula biespecífica ou fragmento da mesma.
4. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo primeiro domínio da mesma ser parte de uma cadeia de TCR a ou y e/ou compreende o segundo domínio que é parte de uma cadeia de TOR B ou à.
5. ÁCIDO NUCLEICO caracterizado por codificar uma estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um vetor de ácido nucleico que contém o mesmo.
6. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE que compreende uma estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou um ácido nucleico ou vetor de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela referida célula hospedeira ser preferivelmente a) um linfócito, tal como um linfócito T ou uma célula progenitora de linfócitos T, tal como uma célula T positiva para CD4 ou CD8 ou b) outra célula que não um linfócito, tal como uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).
7. COMPOSIÇÃO “FARMACÊUTICA caracterizada por compreender a estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o ácido nucleico ou vetor de acordo com a reivindicação 5 ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 e um veículo, diluente estabilizador e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.
8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ESTRUTURAS RECONHECEDORAS DE ANTÍGENOS específicas para COL6A3 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por: a. fornecimento de uma célula hospedeira apropriada; b. fornecimento de uma estrutura genética compreendendo uma sequência codificadora que codifica a estrutura reconhecedora de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4;
Cc. introdução da referida estrutura genética na referida célula hospedeira apropriada; e d. expressão da referida estrutura genética pela referida célula hospedeira apropriada.
9. MÉTODO de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender também isolamento e purificação da estrutura reconhecedora de antígenos a partir de uma célula hospedeira apropriada e, opcionalmente, reconstituição da estrutura reconhecedora de antígenos em uma célula T.
10. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o ácido nucleico ou vetor de acordo com a reivindicação 5, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo uso em medicina.
11. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou o ácido nucleico ou vetor de acordo com a reivindicação 5, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo uso no diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de uma doença proliferativa tal como o câncer.
12. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, o ácido nucleico ou vetor de acordo com a reivindicação 5, a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 ou a composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7 para uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo referido câncer ser selecionado dentre os cânceres nos quais o COL6A3 apresenta sobrexpressão, mutação ou apresentação de um antígeno tumoral derivado de COL6AS3, tais como, por exemplo, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de fígado, câncer de ovário e câncer gástrico.
13. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela sequência mutante consistir em uma combinação de uma primeira e uma segunda sequências de aminoácidos, de modo que a sequência mutante é fornecida por meio da substituição de um, dois ou três aminoácidos da primeira sequência por um, dois ou três aminoácidos correspondentes da segunda sequência.
14. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela sequência mutante consistir em uma combinação de uma primeira e uma segunda sequências de aminoácidos, de modo que a sequência mutante é fornecida por meio da substituição de um, dois ou três aminoácidos consecutivos da primeira sequência por um, dois ou três aminoácidos consecutivos correspondentes da segunda sequência.
15. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e 13 a 14, caracterizada pela sequência mutante (b) conter pelo menos uma substituição conservadora de aminoácidos em comparação com a sequência de pelo menos um aminoácido (a).
16. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade ser substituída por SEQ Nº 40, sendo que SEQ Nº 40 contém uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
17. ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade é substituída por SEQ Nº 40.
18. “ESTRUTURA RECONHECEDORA DE ANTÍGENOS de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por uma variante selecionada do grupo formado por 75-1 a 75-25 da Tabela 2€ C-1 a C- 18 da Tabela 5.
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