BR112019025323A2 - Receptores de células t e imunoterapia empregando os mesmos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a construtos reconhecedores de antígenos contra antígenos associados a tumores (AAT), em especial contra o AAT inibidor de serina protease Kazal do tipo 2 (SPINK2).Mais particularmente, a invenção fornece moléculas seletivas específicas para o antígeno da invenção, que é expresso em tumores baseados em receptores de células T (TCR). O TCR da presente invenção e os fragmentos ligantes de SPINK2 derivados dos mesmos são empregados para diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças oncológicas que expressam SPINK2. Também são fornecidos ácidos nucleicos que codificam os construtos reconhecedores de antígenos da invenção, vetores que compreendem esses ácidos nucleicos, células recombinantes que expressam os construtos reconhecedores de antígenos e composições farmacêuticas que compreendem os compostos da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECEPTORES DE CÉLULAS T E IMUNOTERAPIA EMPREGANDO OS MESMOS".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a construtos reconhecedores de antígenos contra antígenos associados a tumores (AAT), em espe- cial contra o AAT inibidor de serina protease Kazal do tipo 2 (SPINK2, "Serine protease inhibitor Kazal-type 2"). Mais particularmente, a in- venção fornece moléculas seletivas específicas para o antígeno da invenção, que é expresso em tumores baseadas em receptores de cé- lulas T (TCR, "T-cell receptor"). O TCR da presente invenção e os fra- gmentos ligantes de SPINK2 derivados dos mesmos são empregados para diagnóstico, tratamento e prevenção de doenças oncológicas que expressam SPINK2. Também são fornecidos ácidos nucleicos que co- dificam os construtos reconhecedores de antígenos da invenção, ve- tores que compreendem esses ácidos nucleicos, células recombinan- tes que expressam os construtos reconhecedores de antígenos e composições farmacêuticas que compreendem os compostos da in- venção.
DESCRIÇÃO
[002] Os inibidores de serina protease Kazal do tipo 2 (SPINK2), também denominados inibidores de acrosina tripsina, são proteínas codificadas pelo gene SPINK2 em seres humanos. A proteína codifi- cada é encontrada no trato genital, atua como inibidora da tripsina e acrosina e está associada com a progressão de linfomas. O gene pode sofrer splicing de várias maneiras, criando diversas variantes de trans- crição.
[003] A imunoterapia baseada em células T age contra epítopos peptídicos derivados de proteínas associadas a ou específicas para tumores, que são apresentadas por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Tais antígenos associados a tumores (AAT) podem ser peptídeos derivados de todas as classes de proteí- nas (por exemplo, enzimas, receptores e fatores de transcrição) que são expressas e normalmente apresentam sobrerregulação em células tumorais em comparação com células inalteradas da mesma origem.
[004] Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir especificamente células tumo- rais. O isolamento de células T de populações de células infiltrantes de tumor ou do sangue periférico sugere que tais células podem desem- penhar um importante papel nas defesas imunes naturais contra o câncer. Em particular, desempenham importante papel nessa resposta as células T CD8-positivas capazes de reconhecer moléculas de clas- se I do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) acopladas a peptídeos com 8 a 10 aminoácidos de comprimento derivados de pro- teínas ou de produtos ribossômicos defeituosos (DRiPs, "defective ri- bosomal products"). As moléculas de MHC humanas também são de- signadas como antígenos leucocitários humanos (HLA, "human leu- cocyte antigen").
[005] As moléculas de MHC podem ser de duas classes: MHC classe I e MHC classe II. Os complexos formados por peptídeos aco- plados a MHC classe I são reconhecidos por células T CD8-positivas que apresentam o receptor de célula (TCR) apropriado, ao passo que complexos formados por peptídeos acoplados a MHC classe II são re- conhecidos por células T auxiliares CD4-positivas que apresentam o TCR apropriado. Como ambos os tipos de resposta (a dependente de CD8 e a dependente de CD4) contribuem conjunta e sinergicamente para o efeito antitumoral, a identificação e a caracterização dos antí- genos associados a tumores e dos receptores de células T correspon- dentes é importante para o desenvolvimento de imunoterapias anti- câncer, tais como vacinas e terapias celulares.
[006] Nas reações imunes dependentes do MHC classe I, os pep- tídeos precisam ser capazes de se ligarem a determinadas moléculas de MHC classe I expressas em células tumorais e de serem posteri- ormente reconhecidos por células T que apresentam receptores espe- cíficos de células T (TCR). Portanto, os AATs servem como ponto de partida para o desenvolvimento de tratamentos à base de células T, incluindo, entre outros, vacinas e terapias celulares antitumorais.
[007] Cerca de 90% das células T do sangue periférico expres- sam um TCR que consiste em um polipeptídeo α e um polipeptídeo β. Demonstrou-se que uma pequena porcentagem das células T (cerca de 5% do total) expressa um TCR que consiste em um polipeptídeo γ e um polipeptídeo δ. As células T γδ são mais abundantes na mucosa intestinal, onde constituem parte de uma população linfocitária deno- minada linfócitos intraepiteliais (LIE). Ainda não se sabe quais são as moléculas antigênicas que ativam as células T γδ. Sabe-se, porém, que as células T γδ não sofrem restrição por MHC e parecem ser ca- pazes de reconhecer proteínas inteiras sem a necessidade de apre- sentação de peptídeos por moléculas de MHC em células apresenta- doras de antígenos, embora algumas reconheçam moléculas de MHC da classe IB. As células T Vγ9/Vδ2 humanas, que constituem a princi- pal população de células T γδ no sangue periférico, são únicas porque respondem de forma rápida e específica ao HMB-PP, um metabólito microbiano não peptídico que é precursor do isopentenil pirofosfato. Estima-se que as porcentagens de células T encontradas no sangue periférico de doadores saudáveis sejam as seguintes: CD3+= 70,78 ± 4,71%; CD3+CD4= 38,97 ± 5,66%; CD3+CD8= 28,955 ± 7,43%; CD3+CD56+= 5,22 ± 1,74%; CD3−CD56+= 10,305 ± 4,7%; CD3+CD45RA+= 45,00 ± 7,19%; e CD3+CD45RO+= 27,21 ± 7,34%.
[008] Cada clone de células T possui um receptor antigênico cuja cadeia é composta de uma combinação única de domínios denomina- dos variável (V), diversidade (D), juncional (J) e constante (C). Em ca- da clone de células T, a combinação dos domínios V, D e J das cadei- as alfa e beta ou das cadeias delta e gama define um sítio de ligação específico para as células T em questão, também denominado idiótipo do referido clone de células T, que influencia a capacidade do clone em questão de reconhecer antígenos. O domínio C não participa da ligação antigênica.
[009] O TCR é uma proteína heterodimérica da superfamília das imunoglobulinas, que se localiza na superfície celular e está associada com proteínas invariantes do complexo CD3 que participam da media- ção da transdução de sinais. Os TCRs podem ser da forma αβ ou γδ. Ambas essas formas possuem estruturas semelhantes, mas são en- contradas em sítios anatômicos diferentes e provavelmente apresen- tam diferenças funcionais. Os TCR αβ e γδ heterodiméricos nativos contêm dois polipeptídeos em suas porções extracelulares e possuem um domínio constante proximal à membrana e um domínio variável distal à membrana. Cada um dos domínios constante e variável possui uma ponte dissulfeto em sua cadeia. Os domínios variáveis contêm alças altamente polimórficas, que são análogas às regiões determinan- tes de complementaridade (CDR, "complementarity determining re- gions") dos anticorpos. O uso da terapia gênica com TCRs permite so- brepujar diversos obstáculos encontrados atualmente, pois é capaz de dotar as células T do paciente das especificidades desejadas e de ge- rar células T rapidamente e em número suficiente, evitando assim que elas se esgotem. O TCR sofre transdução em células T de memória centrais ou em células T com características de células-tronco, o que pode torná-las mais persistentes e funcionais após a transferência. Em seguida, as células T modificadas por engenharia genética são infun- didas em pacientes com câncer após indução de linfopenia por quimio-
terapia ou radioterapia, de modo a proporcionar enxertia eficaz e inibir a imunossupressão.
[0010] Embora tenha havido avanços no desenvolvimento de dro- gas direcionadas a moléculas específicas para tratamento anticâncer, persiste na técnica a necessidade de se desenvolver novos agentes anticâncer que atuem especificamente sobre moléculas altamente es- pecíficas para células cancerosas. A presente descrição aborda tal ne- cessidade fornecendo novos TCRs específicos para SPINK2-001, os respectivos construtos de TCR recombinante, ácidos nucleicos, veto- res e células hospedeiras que se ligam especificamente aos epítopos de AAT, conforme será revelado, e métodos para uso dessas molécu- las no tratamento de câncer. No contexto da presente invenção, o ter- mo AAT denota especificamente a proteína SPINK2 e, mais preferi- velmente, o epítopo SPINK2-001 conforme revelado em outras partes deste documento. Construtos reconhecedores de antígenos
[0011] Em um primeiro aspecto, o objeto da invenção é resolvido por um construto reconhecedor de antígenos que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) 3 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou, preferivelmente, 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID Nºs 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 e 117.
[0012] Em algumas modalidades, o construto reconhecedor de antígenos da invenção se liga especificamente a um complexo de HLA com o peptídeo AAT, sendo que o peptídeo AAT compreende (ou con- siste em) uma variante do AAT que é pelo menos 66%, preferivelmen- te pelo menos 77% e, o mais preferido, pelo menos 88% homólogo (preferivelmente pelo menos 77% ou pelo menos 88% idêntico) à se- quência de aminoácidos do AAT da invenção, sendo que tal variante se liga a uma molécula de HLA classe I ou classe II e/ou induz reação cruzada de células T com o referido peptídeo ou com um sal farma- ceuticamente aceitável do mesmo, sendo que o referido peptídeo não é o peptídeo original completo.
[0013] Conforme aqui utilizados, os termos "idêntico" ou porcentu- al de "identidade" referem-se, quando usados em qualquer local no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de prote- ínas e polipeptídeos, a duas ou mais sequências ou subsequências que são idênticas ou que possuem (ao menos) um porcentual especí- fico de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos (isto é, identidade pelo menos igual a 60%, sendo preferida identidade de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93% ou 94%, ou, o mais preferido, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade ao longo de uma região específica em comparação com uma região designada delimitada por uma janela de comparação e alinhada de modo a maximizar a correspondência), conforme medida por algoritmos comparadores de sequências ou por alinhamento ma- nual seguido de inspeção visual (ver, por exemplo, o website da NCBI). Em uma modalidade específica, por exemplo, ao se comparar as sequências de proteína ou de ácido nucleico de um construto reco- nhecedor de antígenos da invenção com outro gene ou proteína, o porcentual de identidade pode ser determinado pelas buscas Blast su- portadas pelo website da NCBI, em particular para identidade de ami- noácidos, usando-se BLASTP com os seguintes parâmetros: Expected threshold [limiar esperado] 10; Word size [tamanho da palavra]: 6; Ma- trix [matriz]: BLOSUM62; Gap Costs [custos de ‘gap’]: Existence [exis- tência]: 11, Extension [extensão]: 1; Neighboring words threshold [limi- ar para palavas adjacentes]: 11; Compositional adjustments [ajustes de composição]: Escore de composição condicional com ajuste de ma- triz.
[0014] No contexto da presente invenção, fica entendido que a de- nominação de quaisquer modalidades como "compreendendo" deter- minadas características da invenção abrange, em algumas modalida- des mais preferidas, as denominações mais restritivas "consistindo em" ou "consistindo essencialmente em" em relação às mesmas ca- racterísticas da presente invenção.
[0015] Em outra modalidade adicional ou alternativa, o construto reconhecedor de antígenos pode compreender também uma sequên- cia de domínio CDR1 e/ou CDR2. Dentro do domínio variável, o CDR1 e o CDR2 são encontrados na região variável (V) de uma cadeia poli- peptídica, e o CDR3 inclui parte da região V e a totalidade das regiões de diversidade (D) e de junção (J). O domínio mais variável é o CDR3, que é também o CDR mais importante para reconhecimento antigênico de forma específica e seletiva. As sequências de CDR1 e CDR2 po- dem ser selecionadas de uma sequência de CDR de um alelo de ca- deia variável humana.
[0016] Os TCRs alfa-beta heterodiméricos nativos possuem uma cadeia alfa e uma cadeia beta. Cada uma dessas cadeias possui regi- ões variável, juncional e constante, e a cadeia beta normalmente tam- bém possui uma pequena região diversificadora localizada entre a re- gião variável e a região juncional, mas essa região diversificadora normalmente é considerada parte da região juncional. Cada região va- riável compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs, "complementarity determining regions") estruturadas em uma sequência, sendo uma delas a região hipervariável denominada CDR3. Existem diversos tipos de regiões da cadeia alfa variável (Vα) e diversos tipos de cadeia beta variável (Vβ) que se diferenciam em fun- ção de sua estrutura, de suas sequências CDR1 e CDR2, e de uma sequência de CDR3 definida parcialmente. Na nomenclatura IMGT, cada tipo de Vα é definido por um único número TRAV e cada tipo de
Vβ por um único número TRBV. Para mais informações sobre genes de anticorpos do tipo imunoglobulina e de TCR, consulte o ImMuno- GeneTics information system®, Lefranc M-P et al. (Nucleic acids Res 2015 Jan;43(Database issue):D413-22 e http://www.imgt.org/).
[0017] Portanto, em uma modalidade adicional ou alternativa, o construto reconhecedor de antígenos da invenção compreende se- quências de CDR1, CDR2 e CDR3 em combinação (conforme mostra- do a seguir na Tabela 1), que mostra os alelos das respectivas cadei- as variáveis junto com as sequências de CDR3. Portanto, preferem-se os construtos reconhecedores de antígenos da invenção que compre- endam pelo menos uma, e preferivelmente as três, sequências de CDR: CDR1, CDR2 e CDR3. Preferivelmente, o construto reconhece- dor de antígenos da invenção compreende os respectivos CDR1 a CDR3 de uma das regiões de TCR variável da invenção aqui revela- das. (Ver Tabela 1 neste documento e a seção de exemplos.)
[0018] Conforme aqui utilizados, os termos "especificidade", "es- pecificidade antigênica" e "específico para" um determinado antígeno podem indicar que o construto reconhecedor de antígenos se liga de forma específica ao referido antígeno, que é preferivelmente um antí- geno AAT, e mais preferivelmente ligação com avidez elevada, onde o referido antígeno é apresentado por HLA, preferivelmente por HLA- A*02. Por exemplo, pode-se considerar que um TCR usado como construto reconhecedor de antígenos possui "especificidade antigêni- ca" para AAT se as células T que expressam o referido TCR secreta- rem pelo menos cerca de 200 pg/ml ou mais (por exemplo, 250 pg/ml ou mais, 300 pg/ml ou mais, 400 pg/ml ou mais, 500 pg/ml ou mais, 600 pg/ml ou mais, 700 pg/ml ou mais, 1000 pg ml ou mais, 2000 pg/ml ou mais, 2500 pg/ml ou mais, 5000 pg/ml ou mais) de inter- feron γ (IFNγ) ao entrarem em contato com o HLA apresentador de AAT em cultura simultânea com células-alvo pulsadas com o antígeno
AAT em baixas concentrações, tais como epítopos de AAT e os antí- genos aqui descritos a seguir (por exemplo, cerca de 10-11 mol/l, 10-10 mol/l, 10-9 mol/l, 10-8 mol/l, 10-7 mol/l, 10-6 mol/l e 10-5 mol/l). Alternativa ou adicionalmente, pode-se considerar que um TCR apresenta "espe- cificidade antigênica" para um AAT se as células T que expressam o referido TCR secretarem pelo menos duas vezes mais IFNγ que o ní- vel basal de IFNγ de células não submetidas a transdução ao serem cultivadas simultaneamente com células-alvo pulsadas com baixas concentrações de antígenos COL6A3. A "especificidade" descrita ante- riormente pode ser ensaiada, por exemplo, pelo método ELISA.
[0019] Em uma modalidade alternativa ou adicional da invenção, o construto reconhecedor de antígenos se liga seletivamente a um pep- tídeo antigênico derivado do AAT, preferivelmente quando o peptídeo antigênico derivado do AAT é um epítopo proteico um ou peptídeo que possui uma das sequências de aminoácidos abaixo na Tabela 2, em particular onde o peptídeo antigênico é o SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou uma variante do mesmo, onde a variante é uma deleção, adição, inserção ou substituição de aminoácidos em não mais que três, prefe- rivelmente duas e, o mais preferido, não mais que uma posição. As variantes preferidas do SPINK2-001 são mostradas a seguir na Tabela
2.
[0020] O termo "seletividade" ou "ligação/reconhecimento seletivo" é entendido como a propriedade de um construto reconhecedor de antígenos (por exemplo, um TCR ou um anticorpo) de reconhecer se- letivamente ou se ligar preferivelmente a apenas um epítopo específi- co e, preferivelmente, apresentar pouca ou nenhuma reatividade cru- zada com outro epítopo. Preferivelmente, "seletividade" ou "liga- ção/reconhecimento seletivo" significa que o construto reconhecedor de antígenos (por exemplo, um TCR) reconhece seletivamente ou se liga preferivelmente a um único epítopo específico e, preferivelmente,
apresenta pouca ou nenhuma reatividade cruzada com outro epítopo, sendo que o referido epítopo é único para uma proteína, de modo que o construto reconhecedor de antígenos possui pouca ou nenhuma re- atividade cruzada com outros epítopos e outras proteínas.
[0021] O construto reconhecedor de antígenos de acordo com a invenção é selecionado preferivelmente entre um anticorpo ou um de- rivado ou fragmento de anticorpo ou um receptor de célula T (TCR) ou um derivado ou fragmento de TCR. Um derivado ou fragmento de um dos anticorpos ou TCRs da invenção deve preferivelmente ter preser- vada a capacidade de ligação e reconhecimento antigênico da molécu- la parental, em especial sua especificidade e/ou seletividade, conforme explicado anteriormente. Tal funcionalidade de ligação pode ser pre- servada pela presença de uma região CDR3, conforme aqui descrito.
[0022] Em uma modalidade da invenção, os TCRs da invenção são capazes de reconhecer antígenos AAT de forma dependente do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I. Conforme aqui utilizado, "forma dependente do MHC classe I" significa que o TCR produz uma resposta imune ao se ligar a antígenos AAT no con- texto de uma molécula de MHC classe I. A molécula de MHC classe I pode ser qualquer molécula de MHC classe I conhecida na técnica, como, por exemplo, moléculas de HLA-A. Em uma modalidade preferi- da da invenção, a molécula de MHC classe I é uma molécula de HLA- A*02.
[0023] A invenção fornece tanto construtos que reconhecem antí- genos de cadeia única como construtos que reconhecem antígenos de cadeia dupla.
[0024] Em uma modalidade, o domínio variável da cadeia alfa do TCR apresenta pelo menos uma mutação em relação ao domínio vari- ável da cadeia alfa do TCR mostrado na Tabela 1 e/ou o domínio vari- ável da cadeia beta do TCR apresenta pelo menos uma mutação em relação ao domínio variável da cadeia alfa do TCR mostrado na Tabe- la 1. Em uma modalidade, um TCR que compreende pelo menos uma mutação no domínio variável alfa do TCR e/ou no domínio variável be- ta do TCR possui afinidade de ligação por e/ou meia-vida de ligação para um complexo de peptídeo AAT com molécula de HLA que cor- responde a pelo menos o dobro da de um TCR que compreende o domínio alfa não mutante do TCR e/ou o domínio variável beta não mutante do TCR.
[0025] As cadeias alfa de TCR da presente descrição podem com- preender também um domínio transmembrana de TCR alfa e/ou um domínio intracelular de TCR alfa. As cadeias beta de TCR da presente descrição podem compreender também um domínio transmembrana de TCR beta e/ou um domínio intracelular de TCR beta.
[0026] Em particular, a invenção fornece um TCR como construto reconhecedor de antígenos ou fragmento ou derivado da mesma. O TCR é preferivelmente de origem humana, o que é compreendido co- mo um TCR gerado a partir de um lócus de TCR humano e que, por- tanto, compreende sequências de TCR humano. Além disso, o TCR da invenção pode ser caracterizado como sendo de origem humana e é capaz de reconhecer especificamente um antígeno de AAT da inven- ção.
[0027] Outra modalidade da invenção fornece, adicional ou alter- nativamente, o construto reconhecedor de antígenos descrito anteri- ormente, que induz resposta imune, sendo que a resposta imune é preferivelmente caracterizada por aumento dos níveis de interferon gama (IFNγ).
[0028] Os TCRs da invenção podem ser fornecidos na forma de cadeias únicas α ou β ou γ e δ, ou, alternativamente, como construtos de cadeia dupla formadas ao mesmo tempo por cadeias α e β, ou γ e δ. Além disso, se no contexto da presente invenção qualquer uma ou quaisquer duas ou todas as regiões CDR de um determinado TCR conforme descrito na presente invenção for enxertado de uma cadeia de TCR em outra, prefere-se em algumas modalidades que tal CDR seja enxertado em uma cadeia γ ou δ quando derivado de uma cadeia α ou em uma cadeia γ ou δ quando derivado de uma cadeia β. Pode- se, portanto, obter um TCR γ/δ partindo-se de um TCR α/β de duas maneiras: uma delas consiste em enxertar um CDR de uma cadeia α em uma cadeia γ ou de uma cadeia β em uma cadeia δ; e a outra, descrita anteriormente, consiste em enxertar um CDR de uma cadeia α em uma cadeia δ ou de uma cadeia β em uma cadeia γ. Os versados na técnica perceberão as semelhanças estruturais entre as cadeias de TCR α/β e γ/δ TCR; portanto, tais modalidades são contempladas pela presente invenção (ver também Lefranc M-P et al, Nucleic acids Res. 2015 Jan;43 (Database issue):D413-22 e http://www.imgt.org/).
[0029] O construto reconhecedor de antígenos da invenção pode compreender uma cadeia α ou γ de TCR e/ou uma cadeia β ou δ de TCR, sendo que a cadeia α ou γ de TCR compreende um CDR3 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99 e 111, e/ou onde as cadeias de TCR β ou δ compreendem um CDR3 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105 e 117.
[0030] Mais preferivelmente, em algumas modalidades adicionais nas quais a revelação se refere a construtos reconhecedores de antí- genos que compreendem uma, duas ou todas as regiões CDR1 a CDR3 das cadeias de TCR aqui reveladas (ver Tabela 1), podem-se preferir construtos reconhecedores de antígenos que compreendam sequências de CDR da invenção que não possuam mais que, respec-
tivamente, três, dois ou, preferivelmente, apenas um resíduo de ami- noácido modificado. Um resíduo de aminoácido modificado pode ser selecionado para inserção, deleção ou substituição de aminoácido. É mais preferível que três, dois ou preferivelmente apenas um resíduo de aminoácido modificado seja o primeiro ou o último resíduo de ami- noácido da respectiva sequência de CDR. Se a modificação for uma substituição, então é preferível em algumas modalidades que a substi- tuição seja uma substituição de aminoácido conservadora.
[0031] Se o construto reconhecedor de antígenos da invenção consistir em pelo menos duas cadeias de aminoácidos (por exemplo, um TCR de cadeia dupla) ou um fragmento ligante de antígeno do mesmo, o construto reconhecedor de antígenos pode compreender a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 3 em uma primeira ca- deia polipeptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 9 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoáci- dos segundo SEQ ID Nº 15 em uma primeira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 21 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 27 em uma primeira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoá- cidos segundo SEQ ID Nº 33 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 39 em uma pri- meira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 45 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 51 em uma primeira cadeia poli- peptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 57 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 63 em uma primeira cadeia polipeptídica e a se- quência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 69 em uma segunda ca- deia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 75 em uma primeira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoáci-
dos segundo SEQ ID Nº 81 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 87 em uma primeira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 93 em uma segunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de ami- noácidos segundo SEQ ID Nº 99 em uma primeira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 105 em uma se- gunda cadeia polipeptídica, ou a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 111 em uma primeira cadeia polipeptídica e a sequência de aminoácidos segundo SEQ ID Nº 117. Qualquer um dos TCRs de ca- deia dupla supramencionados ou fragmentos ligantes de antígenos do mesmo são TCRs preferidos da presente invenção. Em algumas mo- dalidades, o CDR3 do TCR de cadeia dupla pode apresentar mutação. As mutações das sequências de CDR3 conforme apresentadas anteri- ormente incluem preferivelmente substituição, deleção, adição ou in- serção de não mais que três, preferivelmente dois e, mais preferivel- mente, não mais que um resíduo de aminoácido. Em algumas modali- dades, a primeira cadeia polipeptídica pode ser uma cadeia α ou γ de TCR, e a segunda cadeia polipeptídica pode ser uma cadeia β ou δ de TCR. É preferida a combinação de TCR αβ ou γδ.
[0032] Em algumas modalidades, o TCR ou o fragmento ligante de antígeno do mesmo é composto de uma cadeia TCR α e uma cadeia TCR β ou γ e δ. Esses TCRs de cadeia dupla compreendem regiões de cadeia variável, e cada uma dessas regiões variáveis compreende uma sequência CDR1, uma sequência CDR2 e uma sequência CDR3. Os TCRs compreendem as sequências CDR1 a CDR3, conforme compreendidas nas sequências de cadeia variável de aminoácidos SEQ Nºs 4 e 10 ou 16 e 22 ou 28 e 34 ou 40 e 46 ou 52 e 58 ou 64 e 70 ou 76 e 82 ou 88 e 94 ou 100 e 106 ou 112 e 118.
[0033] Tais modalidades da presente invenção são pertinentes a um TCR ou a um fragmento de TCR formado por uma cadeia TCR α e uma cadeia TCR β, sendo que o referido TCR compreende as se- quências de regiões variáveis cujas sequências são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou, preferivelmente, 100% idênticas às sequências de aminoácidos selecionadas para as cadeias α e β a partir das SEQ ID Nºs 4 e 10 ou 16 e 22 ou 28 e 34 ou 40 e 46 ou 52 e 58 ou 64 e 70 ou 76 e 82 ou 88 e 94 ou 100 e 106 ou 112 e
118.
[0034] Os TCRs da presente invenção também podem compreen- der uma região constante derivada de qualquer espécie apropriada, tais como qualquer mamífero (por exemplo, humano, rato, macaco, coelho, burro ou camundongo). Em uma modalidade da invenção, os TCRs da invenção compreendem também uma região constante hu- mana. Em algumas modalidades preferidas, a região constante do TCR da invenção pode ser ligeiramente modificada, por exemplo, in- troduzindo-se sequências heterólogas, preferivelmente sequências de camundongo, que podem aumentar a estabilidade e a expressão do TCR.
[0035] Os TCRs da invenção podem compreender também cadei- as α ou β de receptores de células T (TCR, "T-cell receptor") modifica- das ou heterodímeros compreendendo as mesmas, sendo que no do- mínio variável da referida cadeia α ou β modificada o aminoácido cujo número é 44 segundo a numeração IMGT é substituído por outro ami- noácido apropriado a fim de melhorar o emparelhamento das cadeias desejadas. De acordo com uma modalidade do referido receptor de células T (TCR) heterodimérico recombinante, o aminoácido na posi- ção 44 do domínio variável de pelo menos uma dentre as cadeias α e β é substituído por um aminoácido do grupo formado por Q, R, D, E, K, L, W e V.
[0036] Segundo outra modalidade, os TCRs da invenção podem incluir também um dos pares de substituição preferidos selecionados das listas a seguir: αQ44D/βQ44R; αQ44R/βQ44D; αQ44E/βQ44K; αQ44K/βQ44E; αQ44D/βQ44K; αQ44K/βQ44D; αQ44E/βQ44R; αQ44R/βQ44E; αQ44L/βQ44W; αQ44W/βQ44L; αQ44V/βQ44W; e αQ44W/βQ44V; αW44D/βQ44R; αW44R/βQ44D; αW44E/βQ44K; αW44K/βQ44E; αW44D/βQ44K; αW44K/βQ44D; αW44E/βQ44R; αW44R/βQ44E; αW44L/βQ44W; αW44/βQ44L; αW44V/βQ44W; e αW44/βQ44V; αH44D/βQ44R; αH44R/βQ44D; αH44E/βQ44K; αH44K/βQ44E; αH44D/βQ44K; αH44K/βQ44D; αH44E/βQ44R; αH44R/βQ44E; αH44L/βQ44W; αH44W/βQ44L; αH44V/βQ44W; e αH44W/βQ44V; αK44D/βQ44R; αK44R/βQ44D; αK44E/βQ44K; αK44/βQ44E; αK44D/βQ44K; αK44/βQ44D; αK44E/βQ44R; αK44R/βQ44E; αK44L/βQ44W; αK44W/βQ44L; αK44V/βQ44W; e αK44W/βQ44V; αE44D/βQ44R; αE44R/βQ44D; αE44/βQ44K; αE44K/βQ44E; αE44D/βQ44K; αE44K/βQ44D; αE44/βQ44R; αE44R/βQ44E; αE44L/βQ44W; αE44W/βQ44L; αE44V/βQ44W; e αE44W/βQ44V; αQ44D/βR44; αQ44R/βR44D; αQ44E/βR44K; αQ44K/βR44E; αQ44D/βR44K; αQ44K/βR44D; αQ44E/βR44; αQ44R/βR44E; αQ44L/βR44W; αQ44W/βR44L; αQ44V/βR44W; e αQ44W/βR44V; αW44D/βR44; αW44R/βR44D; αW44E/βR44K; αW44K/βR44E; αW44D/βR44K; αW44K/βR44D; αW44E/βR44; αW44R/βR44E; αW44L/βR44W; αW44/βR44L; αW44V/βR44W; e αW44/βR44V; αH44D/βR44; αH44R/βR44D; αH44E/βR44K; αH44K/βR44E; αH44D/βR44K; αH44K/βR44D; αH44E/βR44; αH44R/βR44E; αH44L/βR44W; αH44W/βR44L; αH44V/ βR44W; e αH44W/βR44V; αK44D/βR44; αK44R/βR44D; αK44E/βR44K; αK44/βR44E; αK44D/βR44K; αK44/βR44D; αK44E/βR44; αK44R/βR44E; αK44L/βR44W; αK44W/βR44L; αK44V/βR44W; and αK44W/βR44V; αE44D/βR44; αE44R/βR44D; αE44/βR44K; αE44K/βR44E; αE44D/βR44K; αE44K/βR44D; αE44R/βR44E; αE44L/βR44W;
αE44W/βR44L; αE44V/βR44W; e αE44W/βR44V.
[0037] Nessa listagem, "αQ44R/βQ44D" significa, por exemplo, que o aminoácido Q44 do domínio variável da cadeia α é substituído por R e o aminoácido Q44 do domínio variável da cadeia β é substituí- do por D.
[0038] Tais modalidades da presente invenção são pertinentes a um TCR ou a um fragmento de TCR formado por uma cadeia TCR α e uma cadeia TCR β, sendo que o referido TCR compreende as regiões constantes cujas sequências são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou, preferivelmente, 100% idênticas a uma das sequências de aminoácidos selecionadas para as cadeias α e β a par- tir das SEQ ID Nºs 5 e 11 ou 17 e 23 ou 29 e 35 ou 41 e 47 ou 53 e 59 ou 65 e 71 ou 77 e 83 ou 89 e 95 ou 101 e 107 ou 113 e 119.
[0039] As cadeias de TCR α ou γ da invenção podem compreen- der também um CDR1 cuja sequência é 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID Nºs 1, 13, 25, 37, 49, 61, 73, 85, 97 e 109; e/ou um CDR2 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 2, 14, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98 e 110.
[0040] De acordo com a invenção, as cadeias β ou δ de TCR po- dem compreender também um CDR1 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 7, 19, 31, 43, 55, 67, 79, 91, 103 e 115; e/ou um CDR2 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 8, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104 e 116.
[0041] Em outra modalidade, o construto reconhecedor de antíge-
nos pode compreender um fragmento ligante de um TCR, sendo que o referido fragmento ligante compreende CDR1 a CDR3 em uma cadeia, selecionado opcionalmente entre as sequências CDR1 a CDR3 cujas sequências de aminoácidos são as SEQ ID Nºs 1, 2, 3 ou 7, 8 e 9 ou 13, 14 e 15 ou 19, 20 e 21 ou 25, 26 e 27 ou 31, 32 e 33 ou 37, 38 e 39 ou 43, 44 e 45 ou 49, 50 e 51 ou 55, 56 e 57 ou 61, 62 e 63 ou 67, 68 e 69 ou 73, 74 e 75 ou 79, 80 e 81 ou 85, 86 e 87 ou 91, 92 e 93 ou 97, 98 e 99 ou 103, 104 e 105 ou 109, 110 e 111 ou 115, 116 e 117.
[0042] Em outras modalidades da invenção, o construto reconhe- cedor de antígenos é um TCR ou um fragmento de um TCR, composto por pelo menos uma sequência de cadeia α de TCR e uma sequência de cadeia β de TCR, sendo que a referida sequência de cadeia α de TCR compreende sequências de CDR1 a CDR3 que possuem as se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 1 a 3, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que pos- suem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 7 a 9, ou onde a referi- da sequência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 13 a 15, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 19 a 21, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 25 a 27, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 31 a 33, ou onde a referida se- quência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 37 a 39, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 43 a 45, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen-
de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 49 a 51, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 55 a 57, ou onde a referida se- quência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 61 a 63, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 67 a 69, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 73 a 75, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 79 a 81, ou onde a referida se- quência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 85 a 87, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 91 a 93, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 97 a 99, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 103 a 105, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 109 a 111, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as se- quências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 115 a 117.
[0043] Em outras modalidades da invenção, o construto reconhe- cedor de antígenos descrito anteriormente é um TCR ou fragmento do mesmo que compreende pelo menos uma sequência α de TCR e pelo menos uma sequência β de TCR, onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a se- quência de aminoácidos SEQ ID Nº 4 e a referida sequência β da ca- deia de TCR compreende uma sequência de região variável com a se- quência de aminoácidos SEQ ID Nº 10, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 16 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 22, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 28 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 34, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 40 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 46, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma se- quência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 52 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 58, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 64 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 70, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR com- preende uma sequência de região variável com a sequência de ami- noácidos SEQ ID Nº 76 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 82, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID Nº 88 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID Nº 94, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 100 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 106, ou onde a referida sequên- cia de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 112 e a referida sequên- cia β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 118.
[0044] Em outras modalidades da invenção, o construto reconhe- cedor de antígenos descrito anteriormente é um TCR ou fragmento de um TCR, compreendendo também uma região constante de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113 e 119, preferivelmente na qual o TCR é formado por pelo menos uma cadeia de TCR α e outra de TCR β, sendo que a ca- deia de TCR α compreende uma região constante cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 5, 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101 e 113, e onde a sequência β da cadeia do TCR compreende uma região constante cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 11, 23, 35, 47, 59, 71, 83, 95, 107 e 119.
[0045] Também são revelados construtos reconhecedores de antí- genos conforme descritos anteriormente que compreendem uma pri-
meira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoá- cidos SEQ ID Nº 6 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 12. A invenção tam- bém fornece TCRs que compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 18 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 24. Em outras modalidades, a invenção fornece construtos reconhecedores de antígenos que consistem em um TCR e compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 30 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 36. Em outras modalidades, a invenção fornece constru- tos reconhecedores de antígenos que consistem em um TCR e com- preendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à se- quência de aminoácidos de SEQ ID Nº 42 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 48. Em outras modalidades, a invenção fornece construtos reco- nhecedores de antígenos que consistem em um TCR e compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 54 e uma segunda cadeia de TCR cuja se- quência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou
100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 60. Em ou- tras modalidades, a invenção fornece construtos reconhecedores de antígenos que consistem em um TCR e compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 66 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 72. Em outras modalida- des, a invenção fornece construtos reconhecedores de antígenos que consistem em um TCR e compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 78 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 84. Em outras modalidades, a invenção fornece construtos reconhecedores de antígenos que consistem em um TCR e compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 90 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 96. Em outras modalidades, a invenção fornece constru- tos reconhecedores de antígenos que consistem em um TCR e com- preendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à se- quência de aminoácidos de SEQ ID Nº 102 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 108. Em outras modalidades, a invenção fornece construtos reco- nhecedores de antígenos que consistem em um TCR e compreendem uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 114 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 120.
[0046] Conforme aqui utilizados em relação a um construto reco- nhecedor de antígenos, a um TCR ou a qualquer componente de um TCR aqui descrito (por exemplo, região determinante de complemen- taridade (CDR), região variável, região constante, cadeia α e/ou cadeia β), os termos "murino" e "humano" significam um TCR (ou componente do mesmo) derivado de um lócus de TCR não rearranjado de origem murina ou humana, respectivamente.
[0047] Em uma modalidade da invenção, são fornecidos TCRs quiméricos nos quais as cadeias do TCR compreendem sequências de várias espécies. Preferivelmente, um TCR da invenção pode compre- ender uma cadeia α que compreende uma região variável humana ou uma cadeia α e, por exemplo, uma região constante murina de uma cadeia α de TCR murino.
[0048] Em uma modalidade, o TCR da invenção é um TCR huma- no que compreende regiões variáveis humanas de acordo com as mo- dalidades acima e com as regiões constantes humanas.
[0049] Em algumas modalidades, o construto reconhecedor de antígenos é murinizado ou humanizado . Esses termos são emprega- dos quando sequências de aminoácidos de espécies exógenas são introduzidas em um construto da invenção.
[0050] O TCR da invenção também pode ser fornecido na forma de um TCR de cadeia única (scTCR). Um scTCR de acordo com a in- venção compreende uma cadeia polipeptídica com uma sequência completa ou parcial de cadeia alfa e uma sequência completa ou par- cial de cadeia beta, preferivelmente ligadas uma à outra por um peptí-
deo ligante. O scTCR pode compreender um polipeptídeo de uma re- gião variável de uma primeira cadeia de TCR (por exemplo, uma ca- deia alfa) e um polipeptídeo de uma segunda cadeia inteira (completa) de TCR (por exemplo, uma cadeia beta) ou vice-versa. Além disso, o scTCR pode, opcionalmente, compreender um ou mais ligantes que unem os dois ou mais peptídeos entre si. O ligante pode ser, por exemplo, um peptídeo que une duas cadeias individuais, conforme aqui descrito. Também é fornecido um scTCR da invenção fundido a uma citoquina humana, tal como IL-2, IL-7 ou IL-15.
[0051] O construto reconhecedor de antígenos de acordo com a invenção também pode ser fornecido na forma de um complexo mul- timérico compreendendo pelo menos duas moléculas de scTCR, onde as referidas moléculas de scTCR são fundidas a pelo menos um gru- pamento biotina ou outra molécula ou ligante conector e onde os refe- ridos scTCRs são interconectados pela interação biotina-estreptavidina para permitir a formação do referido complexo multimérico. Aborda- gens semelhantes para geração de TCR multimérico são conhecidas na técnica e foram incluídas na presente revelação. Também são for- necidos complexos multiméricos de ordem mais elevada, que compre- endem mais de dois scTCR da invenção.
[0052] Para as finalidades da presente invenção, um TCR é um grupamento que possui pelo menos uma cadeia alfa ou gama de TCR e/ou um domínio variável beta ou delta de TCR. Geralmente, eles compreendem tanto um domínio alfa variável de TCR como um domí- nio beta variável de TCR, podendo conter tanto um domínio variável gama de TCR como um domínio variável delta de TCR. Os TCRs po- dem consistir em heterodímeros αβ/γδ ou em TCRs de cadeia única. Para uso em terapias adotivas, pode-se, por exemplo, transfectar um TCR heterodimérico αβ ou γδ formado por cadeias integrais e pos- suindo um domínio citoplasmático e um domínio transmembrana. Se desejado, pode-se introduzir uma ponte dissulfeto entre resíduos dos respectivos domínios constantes.
[0053] Em uma modalidade preferida, o construto reconhecedor de antígenos é um TCR humano ou fragmento de TCR. Um TCR hu- mano ou fragmento ou derivado do mesmo é um TCR que compreen- de mais de 50% da sequência do TCR humano correspondente. Prefe- rivelmente, apenas uma pequena parte da sequência do TCR é de ori- gem artificial ou derivada de outra espécie. Sabe-se, contudo, que são vantajosos os TCRs quiméricos, por exemplo, os derivados de origem humana com sequências murinas nos domínios constantes. Portanto, são particularmente preferidos os TCRs de acordo com a presente in- venção que contenham sequências murinas nas porções extracelula- res de seus domínios constantes.
[0054] Logo, também é preferível que o construto reconhecedor de antígenos da invenção seja capaz de reconhecer seu antígeno de forma dependente do antígeno leucocitário humano (HLA), preferivel- mente de forma dependente de HLA-A*02. No contexto da presente invenção, o termo "forma dependente de HLA" significa que o constru- to reconhecedor de antígenos se liga ao antígeno apenas quando o peptídeo antigênico é apresentado pelo referido HLA.
[0055] O construto reconhecedor de antígenos de acordo com uma modalidade da invenção preferivelmente induz uma resposta imune, que é preferivelmente caracterizada por aumento dos níveis de interferon gama (IFNγ).
[0056] Também é fornecido pela invenção um polipeptídeo que compreende uma porção funcional de qualquer um dos TCRs aqui descritos ou de variantes funcionais do mesmo, como, por exemplo, de qualquer um dos TCRs selecionados entre R39P1C12, R39P1F5, R40P1C2, R41P3E6, R43P3G4, R44P3B3, R44P3E7, R49P2B7, R55P1G7 e R59P2A7, conforme fornecidos na seção de exemplos e na Tabela 1. Conforme aqui utilizado, o termo "polipeptídeo" inclui oli- gopeptídeos e se refere a uma única da cadeia de aminoácidos conec- tada por uma ou mais ligações peptídicas. Em relação aos polipeptí- deos da invenção, a porção funcional pode ser qualquer porção que compreenda aminoácidos contínuos do TCR (ou variante funcional do mesmo) do qual seja parte, sob a condição de que a porção funcional se ligue especificamente a um antígeno de AAT, preferivelmente con- forme aqui revelado na Tabela 2, e os peptídeos A2 a A9 (SEQ ID Nºs 134 a 140 e peptídeos T1 a T9 (SEQ ID Nºs 141 a 149)). Quando usa- do em referência a um TCR ou a uma variante funcional do mesmo, o termo "porção funcional" se refere a qualquer parte ou fragmento do TCR (ou variante funcional do mesmo) da invenção que mantenha a atividade biológica do TCR (ou variante funcional do mesmo) do qual seja parte (o TCR original ou variante funcional original do mesmo). As porções funcionais incluem, por exemplo, as partes do TCR (ou varian- te funcional do mesmo) que preservam a capacidade de se ligarem especificamente ao antígeno AAT de modo dependente de HLA ou de detectar, tratar ou prevenir o câncer em extensão semelhante, na mesma extensão ou em maior extensão que o TCR original (ou varian- te funcional do mesmo). Em referência ao TCR original (ou variante funcional do mesmo), a porção funcional pode compreender, por exemplo, cerca de 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% ou mais das sequências variáveis do TCR original (ou variante funcional do mesmo).
[0057] A porção funcional pode compreender mais aminoácidos nas terminações amino ou carboxi da porção, ou em ambas essas terminações, do modo que outros aminoácidos que não os encontra- dos na sequência de aminoácidos do TCR inicial ou variante funcional do mesmo. É desejável que os aminoácidos adicionais não interfiram na função biológica da porção funcional (por exemplo, ligando-se es-
pecificamente aos antígenos AAT), nem em propriedades como a ca- pacidade de detectar câncer, tratar ou prevenir o câncer, etc. É ainda mais desejável que os aminoácidos adicionais elevem a atividade bio- lógica acima da obtida com o TCR original ou de variantes funcionais do mesmo.
[0058] O polipeptídeo pode compreender uma porção funcional de uma ou de ambas as cadeias α e β dos TCRs da invenção ou de vari- antes funcionais dos mesmos, tais como uma porção funcional que compreende um ou mais dentre CDR1, CDR2 e (preferivelmente) CDR3 das regiões variáveis da cadeia α e ou da cadeia β de um TCR da invenção ou de uma variante funcional do mesmo. Em uma modali- dade da invenção, o polipeptídeo pode compreender uma porção fun- cional que compreende uma das sequências de aminoácidos em SEQ ID Nºs 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 e 117 (CDR3 das regiões variáveis do TCR da invenção) ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade da invenção, o polipeptídeo da invenção pode compreender, por exemplo, a região variável do TCR da invenção ou uma variante funcional do mesmo que compreenda uma combinação de regiões de CDR descritas anterior- mente. Neste sentido, o polipeptídeo pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos entre SEQ ID Nºs 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112 e 118 (as regi- ões variáveis de uma cadeia α ou β do TCR da invenção).
[0059] Em alguns casos, o construto da invenção pode compre- ender uma ou duas cadeias polipeptídicas que compreendem qualquer uma das sequências entre SEQ ID Nºs 1 a 120 (sequências de CDR, regiões variáveis e constantes ou sequências completas) ou fragmen- tos funcionais das mesmas; compreende também outras sequências de aminoácidos, por exemplo, uma sequência de aminoácidos que co- difique uma imunoglobulina ou uma porção de uma imunoglobulina,
então a proteína da invenção pode ser uma proteína de fusão. Neste sentido, a invenção também fornece uma proteína de fusão que com- preende pelo menos um dos polipeptídeos da invenção aqui descritos, junto com pelo menos um outro polipeptídeo. O outro polipeptídeo po- de existir na forma de um polipeptídeo separado da proteína de fusão ou pode existir como polipeptídeo, que é expresso em um "frame" (em tandem) com um dos polipeptídeos da invenção aqui descritos. O ou- tro polipeptídeo pode incluir qualquer molécula peptídica ou proteiná- cea ou porção da mesma, incluindo, entre outras, uma imunoglobulina, CD3, CD4, CD8, uma molécula de MHC, uma molécula de CD1, por exemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1b, entre outras.
[0060] A proteína de fusão pode compreender uma ou mais cópias do polipeptídeo da invenção e/ou uma ou mais cópias do outro poli- peptídeo. Por exemplo, a proteína de fusão pode compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou mais cópias do polipeptídeo da invenção e/ou do outro polipep- tídeo. Métodos apropriados de confecção de proteínas de fusão são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, métodos recombinan- tes. Em algumas modalidades da invenção, os TCRs e as porções funcionais e variantes funcionais dos mesmos, polipeptídeo e proteí- nas da invenção podem ser expressos como uma única proteína que compreende um peptídeo de ligação que liga a cadeia α e a cadeia β e liga a cadeia γ e a cadeia δ. Neste sentido, os TCRs e variantes funci- onais e porções funcionais dos mesmos, polipeptídeos e proteínas da invenção compreendem as sequências de aminoácidos das regiões variáveis do TCR da invenção e podem compreender também um pep- tídeo de ligação. É vantajoso que o peptídeo de ligação facilite a ex- pressão do TCR recombinante (incluindo as porções funcionais e vari- antes funcionais), polipeptídeo e/ou proteína em uma célula hospedei- ra. O peptídeo de ligação pode compreender qualquer sequência de aminoácidos apropriada. As sequências de ligação de construtos usa-
dos em TCRs de cadeia única são bem conhecidas na técnica. Tais construtos de cadeia única podem compreender também uma ou duas sequências de domínio constante. Quando o construto que inclui o peptídeo de ligação é expresso por uma célula hospedeira, o peptídeo de ligação também pode ser clivado, criando cadeias α e β separadas e cadeias γ e δ separadas.
[0061] Conforme mencionado anteriormente, a funcionalidade de ligação do TCR da invenção pode ser fornecida no âmbito de um anti- corpo. Por exemplo, sequências de CDR do TCR da invenção, possi- velmente incluindo 3, 2 ou 1 resíduo estruturante em sua terminação N ou C, podem ser enxertados diretamente na sequência da cadeia vari- ável leve ou pesada de um anticorpo. O termo "anticorpo" é aqui utili- zado, em suas várias formas gramaticais, para designar moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio ligante de antí- genos ou de um paratopo. Tais moléculas também são denominadas "fragmentos ligantes de antígenos" de moléculas de imunoglobulina. A invenção também fornece um anticorpo ou a porção ligante de antíge- nos do mesmo que se liga especificamente aos antígenos aqui descri- tos. O anticorpo pode ser qualquer tipo de imunoglobulina conhecida na técnica. Por exemplo, o anticorpo pode ser de qualquer isotipo (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc.) e pode ser mono ou policlonal. O anticorpo pode ser um anticorpo que ocorre naturalmente, como, por exemplo, um anticorpo isolado e/ou purificado de um mamífero (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, galinha, hamster, hu- mano) ou pode ser um anticorpo produzido por engenharia genética (por exemplo, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico). O anticorpo pode estar em forma mono ou polimérica.
[0062] O termo "anticorpo" inclui, sem limitações, formas de imu- noglobulinas produzidas por engenharia genética ou submetidas a ou-
tras modificações, tais como intracorpos, anticorpos quiméricos, anti- corpos totalmente humanizados, anticorpos humanizados (por exem- plo, produzidos por "enxertia de CDR"), fragmentos de anticorpos e anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, etc.). O termo "anticorpo" inclui cis- diacorpos e minicorpos. Portanto, todas as modalidades aqui forneci- das em relação a "anticorpos" ou "construtos assemelhados a anticor- pos" também contemplam, salvo indicação em contrário, anticorpos biespecíficos, diacorpos, fragmentos de scFv, construtos receptores de anticorpos quiméricos (CAR, "chimeric antibody receptors"), modalida- des incluindo diacorpos ou minicorpos. O termo "anticorpo" abrange um polipeptídeo da família das imunoglobulinas ou um polipeptídeo que compreende fragmentos de uma imunoglobulina capaz de se ligar de forma não covalente, reversível e específica a um antígeno corres- pondente, preferivelmente o AAT da invenção conforme aqui revelado. Uma unidade estrutural de anticorpos exemplar compreende um te- trâmero. Em algumas modalidades, um anticorpo completo pode con- sistir em dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, onde cada par possui uma cadeia "leve" e outra "pesada" ligadas uma à outra por uma ponte dissulfeto. A estrutura e os isotipos dos anticorpos são bem conhecidos dos versados na técnica (por exemplo, Janeway's Immu- nobiology, 9ª edição, 2016).
[0063] Em imunoglobulinas de mamíferos, são reconhecidos os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, assim como inúmeros genes de região variável de imunoglobulina. Para mais informações sobre os genes de imunoglobulina, consulte o international Im-MunoGeneTics information system®, Lefranc M-P et al, Nucleic acids res 2015 Jan; 43(Database issue):D413-22; e http://www.imgt.org. Em relação a cadeias completas, as cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda e as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, res- pectivamente.
A porção N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos, que é a principal responsável pelo reconhecimento de antígenos.
Os termos cadeia leve variável (VL) e cadeia pesada variável (VH) se referem a essas regi- ões de cadeias leves e pesadas, respectivamente.
Conforme usado na presente invenção, o termo "anticorpo" abrange todas as variações de anticorpos e fragmentos dos mesmos.
Assim, este conceito abrange anticorpos completos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos de cadeia única (scFv), Fab, Fab’ e versões multiméricas desses fragmentos (por exemplo, F(ab')2) que possuam especificidade de ligação idêntica, fundamentalmente idêntica ou semelhante.
Em algumas modalidades, o anticorpo se liga especificamente a um peptí- deo AAT da invenção.
São construtos reconhecedores de antígenos preferidos de acordo com a invenção uma cadeia pesada de anticorpo, preferivelmente o domínio variável da mesma, ou um fragmento ligante de antígeno da mesma e/ou uma cadeia leve de anticorpo, preferivel- mente o domínio variável da mesma ou um fragmento ligante de antí- geno da mesma.
Da mesma forma, pode-se preparar fragmentos da região variável estabilizados por dissulfeto (dsFv) usando-se tecnolo- gia de DNA, mas os fragmentos de anticorpos da invenção não se limi- tam a esses tipos exemplares de fragmentos de anticorpos.
Além dis- so, o anticorpo ou a porção ligante de antígenos do mesmo podem ser modificados de modo a compreender um marcador detectável, tal co- mo, por exemplo, um radioisótopo, um fluoróforo (por exemplo, isotio- cianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de rábano) ou partículas ele- mentares (por exemplo, partículas de ouro). Em algumas situações, a sequência CDR3 do TCR pode ser ligeiramente modificada, mas pre-
ferivelmente em não mais de três resíduos de aminoácidos, preferi- velmente em apenas dois e mais preferivelmente em apenas uma po- sição de aminoácido, em comparação com as sequências de CDR3 fornecidas na Tabela 1. Preferivelmente, os anticorpos compreendem a região CDR3 e, preferivelmente, todas as regiões CDR1 a e CDR3 da combinação, conforme indicado para o TCR da invenção na Tabe- la 1 em cada caso independente, opcionalmente com não mais de três ou duas ou, preferivelmente, apenas uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácidos em comparação com as referidas sequências.
[0064] Métodos apropriados de confecção de anticorpos são bem conhecidos na técnica. Os métodos padrão empregados com hibrido- mas são descritos em, por exemplo, Kohler e Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow e Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988) e C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobio- logy, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)). Outros méto- dos alternativos são conhecidos na técnica, tais como métodos de EBV e hibridoma (Haskard e Archer, J immunol methods 74(2), 361-67 (1984), e Roder et al., Methods enzymol 121, 140-67 (1986)) e sistema de expressão de vetores em bacteriófagos (ver, por exemplo, Huse et al., Science 246, 1275-81 (1989)). Ademais, métodos de produção de anticorpos em animais não humanos são descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA 5.545.806, 5.569.825 e 5.714.352 e no Pedido de Patente Publicado nos EUA nº 2002/0197266.
[0065] Tais modalidades de invenção também podem ser atinen- tes a TCRs ou a fragmentos funcionais e polipeptídeos do mesmo, que são TCRs solúveis. Conforme aqui utilizado, o termo "receptor solúvel de célula T" se refere a variantes heterodiméricas truncadas de TCRs nativos, que compreendem porções extracelulares da cadeia α e da cadeia β de TCR ligadas, por exemplo, por uma ponte dissulfeto, mas que não possuem os domínios transmembrana ou citossólicos da pro-
teína nativa. Os termos "sequência de cadeia α de receptor solúvel de célula T" e "sequência de cadeia β de receptor solúvel de célula T" se referem a sequências de cadeia α e de cadeia β que não possuem domínios transmembrana e citossólicos. As sequências de aminoáci- dos ou de ácido nucleico das cadeias α e β de TCRs solúveis podem ser idênticas às sequências correspondentes em um TCR nativo ou podem compreender sequências variantes de cadeias α e β de TCR solúvel em comparação com as sequências correspondentes do TCR original. Conforme aqui utilizado, o termo "receptor solúvel de células T" inclui TCRs solúveis com sequências de cadeias α ou β de TCR so- lúvel variante ou não variante. As variações podem estar presentes nas regiões variáveis ou constantes das sequências das cadeias α ou β do TCR solúvel e podem incluir, sem limitação, mutações de dele- ção, inserção ou substituição de aminoácidos, assim como modifica- ções da sequência de ácidos nucleicos que não alterem a sequência de aminoácidos. Em qualquer caso, o TCR solúvel da invenção man- tém a funcionalidade ligante das moléculas originais.
[0066] O problema acima também é resolvido por um ácido nuclei- co que codifica um construto reconhecedor de antígenos da invenção ou qualquer um dos construtos supramencionados de proteínas ou po- lipeptídeos. Preferivelmente, o ácido nucleico possui (a) uma fita que codifica um construto reconhecedor de antígenos de acordo com a invenção, (b) uma fita complementar à fita (a), ou (c) uma fita que se hibridiza, sob condições rigorosas, com uma das moléculas descritas em (a) ou (b). Tais condições rigorosas são bem conhecidas dos ver- sados na técnica, especificamente de Sambrook et al., "Molecular Clo- ning". Além disso, o ácido nucleico pode também incluir outras se- quências necessárias à expressão da sequência de ácido nucleico cor- respondente à proteína e especificamente para expressão em células mamíferas ou humanas. O ácido nucleico pode ser contido em um ve-
tor apropriado para permitir a expressão de uma sequência de ácido nucleico correspondente ao peptídeo em uma célula. Contudo, os áci- dos nucleicos também podem ser usados para transformar uma célula apresentadora de antígeno sem necessariamente se restringir às célu- las apresentadoras de antígenos clássicas, tais como as células den- dríticas, de modo que elas produzam as proteínas correspondentes em suas superfícies celulares.
[0067] Em algumas modalidades, os peptídeos do construto reco- nhecedor de antígenos podem ser codificados por ácidos nucleicos e expressos in vivo ou in vitro. Assim, um ácido nucleico que codifica um construto reconhecedor de antígenos é fornecido em algumas modali- dades. Em algumas modalidades, o ácido nucleico codifica uma parte do monômero de um construto reconhecedor de antígenos da inven- ção (por exemplo, uma das duas cadeias de um TCR da invenção) e/ou outro ácido nucleico codifica outra parte do monômero de um construto reconhecedor de antígenos da invenção (por exemplo, as outras duas cadeias do TCR). Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico codifica duas ou mais cadeias polipeptídicas de construtos re- conhecedores de antígenos (por exemplo, pelo menos duas cadeias de TCR). Os ácidos nucleicos que codificam vários construtos reco- nhecedores de antígenos podem conter sítios de clivagem de ácidos nucleicos entre pelo menos duas sequências de cadeias, podem codi- ficar sítios de início e transcrição ou tradução entre duas ou mais se- quências de cadeias e/ou podem codificar sítios de alvos proteolíticos entre duas ou mais cadeias de construtos reconhecedores de antíge- nos.
[0068] Conforme aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" abrange "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "molécula de ácido nucleico", e significa geralmente um polímero de DNA ou RNA, que pode ser de fita única ou de fita dupla, sintetizado ou obtido (por exemplo, isolado e/ou purificado) a partir de fontes naturais que podem conter nucleotí- deos naturais, não naturais ou modificados e podem conter ligações internucleotídeo naturais, não naturais ou modificadas, tais como liga- ções fosforoamidato ou fosforotioato, em vez da ligação fosfodiéster encontrada entre nucleotídeos de um oligonucleotídeo não modificado.
[0069] Preferivelmente, os ácidos nucleicos da invenção são re- combinantes. Conforme aqui utilizado, o termo "recombinante" se refe- re a (i) moléculas construídas fora de células vivas pela união de seg- mentos de ácido nucleico natural ou sintético com moléculas de ácido nucleico que podem se replicar no interior de células vivas ou (ii) mo- léculas resultantes da replicação daquelas descritas anteriormente no item (i). Para as finalidades da presente revelação, a replicação pode ser replicação in vitro ou replicação in vivo. O ácido nucleico pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos que codifique qual- quer um dos TCRs ou polipeptídeos ou proteínas ou porções funcio- nais ou variantes funcionais das mesmas aqui descritas.
[0070] Ademais, a invenção fornece um vetor que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção, conforme descrito anterior- mente. É desejável que o vetor seja um vetor de expressão ou um ve- tor de expressão recombinante. No contexto da presente invenção, o termo "vetor de expressão recombinante" se refere a um construto de ácido nucleico que permite a expressão de um mRNA, proteína ou po- lipeptídeo em uma célula hospedeira apropriada. O vetor de expressão recombinante da invenção pode ser qualquer vetor de expressão re- combinante apropriado e pode ser usado para transformar ou transfec- tar qualquer hospedeiro apropriado. São apropriados os vetores de- signados para propagação e expansão ou para expressão ou ambos, tais como plasmídios e vírus. Alguns exemplos de vetores de expres- são animais são EUK-Cl, pMAM e pMAMneo. Preferivelmente, o vetor de expressão recombinante é um vetor viral (por exemplo, um vetor retroviral). O vetor de expressão recombinante compreende sequên- cias regulatórias, tais como códons de iniciação da transcrição, tradu- ção e terminação, que são específicos para o tipo de célula hospedeira (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) no qual o vetor será introduzido e no qual a expressão do ácido nucleico da invenção pode- rá ser realizada. Ademais, o vetor da invenção pode incluir um ou mais genes marcadores, que permitem a seleção de hospedeiros transfor- mados ou transfectados. O vetor de expressão recombinante pode compreender um promotor nativo ou normativo ou ligação operante a uma sequência de nucleotídeos que codifica os construtos da inven- ção ou à sequência de nucleotídeos complementar ou que se hibridiza com a sequência de nucleotídeos que codifica os construtos da inven- ção. As seleções de promotores incluem, por exemplo, promotores for- tes, fracos, induzíveis, específicos para tecidos e de desenvolvimento. O promotor pode ser do tipo viral ou não viral. Os vetores de expres- são recombinantes da invenção podem ser designados para expres- são transitória, para expressão estável ou para ambas. Outrossim, os vetores de expressão recombinantes podem ser criados para expres- são constitutiva ou para expressão induzível.
[0071] A invenção também se refere a uma célula hospedeira que compreende um construto reconhecedor de antígenos de acordo com a invenção. Mais especificamente, a célula hospedeira da invenção compreende um ácido nucleico ou vetor conforme descrito anterior- mente. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariota (por exem- plo, planta, animal, fungo ou alga) ou procariota (por exemplo, bactéria ou protozoário). A célula hospedeira pode ser uma célula cultivada ou uma célula primária, isto é, uma célula isolada diretamente de um or- ganismo (por exemplo, um ser humano). A célula hospedeira pode ser uma célula aderente ou uma célula suspensa, isto é, uma célula que cresce em suspensão. Para finalidade de produção de um TCR, poli-
peptídeo ou proteína recombinante, a célula hospedeira é preferivel- mente uma célula mamífera. Mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula humana. Embora a célula hospedeira possa ser de qual- quer tipo, possa se originar de qualquer tipo de tecido e possa apre- sentar qualquer estágio de desenvolvimento, a célula hospedeira é preferivelmente um leucócito de sangue periférico (LSP) ou uma célula mononuclear de sangue periférico (CMSP). Mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula T. A célula T pode ser qualquer célu- la T, tal como uma célula T em cultura (por exemplo, uma célula T pri- mária) ou uma célula T de uma linhagem celular cultivada (por exem- plo, Jurkat, SupT1) ou uma célula T de um mamífero, preferivelmente uma célula T ou um precursor de célula T de um paciente humano. Se for originária de um mamífero, a célula T pode ser obtida de diversas fontes, incluindo-se, entre outras, sangue, medula óssea, linfonodos, timo ou outros tecidos ou fluidos. As células T também podem ser submetidas a enriquecimento ou purificadas. Preferivelmente, a célu- la T é uma célula T humana. Mais preferivelmente, a célula T é uma célula T isolada de um indivíduo humano. A célula T pode ser qualquer tipo de célula T e pode estar em qualquer estágio de desenvolvimento, podendo incluir, entre outras, células T CD4-positivas e/ou CD8- positivas, células T auxiliares CD4-positivas (por exemplo, células Th1 e Th2), células T CD8-positivas (por exemplo, células T citotóxicas), células infiltradoras de tumores (TIL, "tumor-infiltrating lymphocytes"), células T de memória, células T virgens e assemelhadas. Preferivel- mente, a célula T é uma célula T CD8-positiva ou uma célula T CD4- positiva.
[0072] Preferivelmente, a célula hospedeira da invenção é um lin- fócito, preferivelmente um linfócito T, tal como uma célula T CD4- positiva ou CD8-positiva. Ademais, a célula hospedeira é preferivel- mente uma célula T reativa a tumores específica para células tumorais que expressam AAT.
[0073] O objetivo da presente invenção também é solucionado por um método de fabricação de um construto reconhecedor de antígenos específico para AAT ou de uma linhagem celular que expresse um construto reconhecedor de antígenos específico para AAT, que com- preende: a. fornecimento de uma célula hospedeira apropriada; b. fornecimento de um referido construto genético compre- endendo uma sequência codificadora que codifica um construto reco- nhecedor de antígenos de acordo com a invenção aqui revelada; c. introdução do referido construto na referida célula hospe- deira apropriada; e d. expressão do referido construto genético pela referida célula hospedeira apropriada.
[0074] O método também pode compreender uma etapa de apre- sentação do referido construto reconhecedor de antígenos na super- fície celular da referida célula hospedeira apropriada.
[0075] Em outras modalidades preferidas, o construto genético é um construto expressivo que compreende uma sequência promotora com ligação operante à referida sequência codificadora.
[0076] Preferivelmente, o referido construto reconhecedor de an- tígenos é de origem mamífera e preferivelmente de origem humana. A célula hospedeira apropriada e preferida para uso no método da in- venção é uma célula mamífera, tal como uma célula humana, e em particular um linfócito T humano. As células T para uso na invenção foram descritas anteriormente com mais pormenores.
[0077] A invenção abrange também modalidades nas quais o re- ferido construto reconhecedor de antígenos é um TCR modificado, sendo que tal modificação consiste em adicionar domínios funcionais como um marcador ou uma substância com atividade terapêutica.
Ademais, abrangem-se também TCRs com domínios alternativos, tais como um domínio alternativo de ancoragem na membrana, em vez da região transmembrana endógena.
[0078] É desejável que o sistema de transfecção para introdução do construto genético na referida célula hospedeira apropriada seja um sistema de vetor retroviral. Tais sistemas são bem conhecidos dos versados na técnica.
[0079] A presente invenção abrange também, em uma modalida- de, a etapa adicional de isolamento e purificação do construto reco- nhecedor de antígenos da célula e, opcionalmente, a reconstituição dos fragmentos traduzidos do construto reconhecedor de antígenos em uma célula T.
[0080] Em um aspecto alternativo da invenção, uma célula T é for- necida, obtida ou obtenível por um método de produção de um recep- tor de célula T (TCR) específico para células tumorais que possui alta avidez, conforme descrito anteriormente. Dependendo da célula hos- pedeira usada no método da invenção, tal célula T pode ser, por exemplo, uma célula T humana ou não humana, sendo preferível um TCR humano.
[0081] Conforme aqui utilizado no contexto de um polipeptídeo (por exemplo, um construto reconhecedor de antígenos, que pode in- clusive ser um anticorpo), o termo "isolado" se refere a um polipeptí- deo purificado a partir de proteínas, polipeptídeos ou outros contami- nantes que possam interferir em sua aplicação terapêutica, diagnósti- ca, profilática em pesquisa ou qualquer outra aplicação. Um construto reconhecedor de antígenos de acordo com a invenção pode ser uma construto ligante de antígenos não natural (isto é, recombinante, sinté- tico ou modificado ). Conforme aqui utilizado no contexto de um ácido nucleico ou de células referentes, o termo "isolado" se refere a ácidos nucleicos ou células que foram purificados de modo a eliminar o DNA,
RNA, proteínas, polipeptídeos e outros contaminantes (por exemplo, outras células) que possam interferir em suas aplicações terapêuticas, diagnósticas, profiláticas, em pesquisa ou qualquer outra aplicação, ou se refere a ácidos nucleicos recombinantes, sintéticos ou modificados (não naturais). Neste contexto, proteínas, polipeptídeos ou ácidos nu- cleicos "recombinantes" são aqueles produzidos por técnicas recombi- nantes. Métodos e técnicas de produção de ácidos nucleicos e proteí- nas recombinantes são bem conhecidos na técnica. Doenças e métodos de tratamento
[0082] Um outro aspecto da presente invenção se refere aos construtos reconhecedores de antígenos aqui revelados, ácidos nu- cleicos, vetores, composições farmacêuticas e/ou células hospedeiras para uso em medicina. Em uma modalidade preferida, o uso em medi- cina inclui o uso no diagnóstico, prevenção e/ou tratamento de uma doença tumoral, tal como uma doença tumoral maligna ou benigna. A doença tumoral pode ser, por exemplo, uma doença caracterizada pe- la expressão de AAT em um câncer ou em uma célula tumoral da refe- rida doença tumoral.
[0083] Em relação às aplicações médicas supramencionadas dos construtos reconhecedores de antígenos e outros materiais derivados dos mesmos, referentes aos mesmos ou que codificam os mesmos, de acordo com a presente revelação, a doença a ser tratada ou diagnosti- cada pode ser qualquer doença proliferativa, sendo preferivelmente caracterizada pela expressão de AAT ou de uma sequência de epítopo de AAT, podendo ser, por exemplo, qualquer câncer, incluindo qual- quer um dentre câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, ra- bdomiossarcoma alveolar, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer do ânus, canal anal ou anorretal, câncer do olho, câncer do ducto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pes- coço, vesícula biliar ou pleura, câncer nasal, da cavidade nasal ou do ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vagina, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer do colo do útero, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofa- ringe, linfoma non-Hodgkin, câncer da orofaringe, câncer de ovário, câncer de pênis, câncer de pâncreas, câncer de peritônio, omento e mesentério, câncer de faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer do intestino delgado, câncer de tecidos moles, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, cân- cer do útero, câncer ureteral e câncer de bexiga. São cânceres prefe- ridos os cânceres do colo do útero, orofaringe, ânus, canal anal, anor- retal, vagina, vulva e pênis. Um câncer particularmente preferido é um câncer positivo para AAT, incluindo-se, preferivelmente, linfoma.
[0084] Os construtos , proteínas, TCRs, anticorpos, polipeptídeos e ácidos nucleicos da invenção destinam-se especificamente ao uso em imunoterapia, preferivelmente em terapia com células T adotivas. A administração dos compostos da invenção pode incluir, por exemplo, a infusão de células T da invenção no referido paciente. Preferivelmente, tais células T são células T autólogas do paciente com tradução in vi- tro de um ácido nucleico ou construto reconhecedor de antígenos da presente invenção.
[0085] Os construtos reconhecedores de antígenos, TCRs, poli- peptídeos, proteínas (incluindo variantes funcionais das mesmas), áci- dos nucleicos, vetores de expressão recombinantes, células hospedei- ras (incluindo populações das mesmas) e anticorpos (incluindo por- ções ligantes de antígenos dos mesmos) são todos denominados cole- tivamente "materiais do TCR da invenção" e podem ser formulados em uma composição, tal como uma composição farmacêutica. Neste sen-
tido, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compre- ende qualquer um dentre os construtos reconhecedores de antígenos, TCRs, polipeptídeos, proteínas, porções funcionais, variantes funcio- nais, ácidos nucleicos, vetores de expressão, células hospedeiras (in- cluindo populações das mesmas) e anticorpos (incluindo porções li- gantes de antígenos dos mesmos) aqui descritos e um veículo, excipi- ente e/ou estabilizante farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas da invenção que contenham um dos TCRs da invenção podem compreender mais de um TCR da invenção, por exemplo, um polipeptídeo e um ácido nucleico, ou dois ou mais TCRs (incluindo porções funcionais e variantes funcionais dos mesmos). Alternativa- mente, a composição farmacêutica pode compreender material do TCR da invenção em combinação com outra(s) agente(s) ou droga(s) farmaceuticamente ativas, tais como agentes quimioterápicos (por exemplo, asparaginase, bussulfano, carboplatina, cisplatina, daunorru- bicina, doxorrubicina, fluoruracila, gemcitabina, hidroxiureia, metotre- xato, paclitaxel, rituximabe, vimblastina, vincristina, etc.), sendo que o veículo é, preferivelmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. Em relação às composições farmacêuticas, o veículo pode ser qual- quer um dos usados convencionalmente para o TCR específico da in- venção em questão. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos versados na técnica e estão amplamente dispo- níveis ao público. É preferido que o veículo farmaceuticamente aceitá- vel seja apenas um e que não exerça efeitos deletérios nem apresente toxicidade sob as condições de uso.
[0086] Portanto, é fornecida também uma composição farmacêuti- ca que compreende qualquer um dos produtos aqui descritos e mate- riais de TCR da invenção, especificamente proteínas, ácidos nucleicos e células hospedeiras. Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica destina-se à imunoterapia e, preferivelmente, à terapia com células adotivas.
[0087] Preferivelmente, o material TCR da invenção é administra- do por injeção (por exemplo, intravenosa). Quando o TCR da invenção é uma célula hospedeira que expressa o TCR da invenção (ou uma variante funcional do mesmo), o veículo farmaceuticamente aceitável para as células a serem injetadas pode incluir qualquer veículo isotôni- co como, por exemplo, solução salina normal (cerca de 0,90% p/v de NaCl em água, com cerca de 300 mOsm/L NaCl em água ou cerca de 9,0 g NaCl por litro de água), solução eletrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL, EUA) cerca de 5% de dextrose em água ou lactato de Ringer. Em uma mo- dalidade, o veículo farmaceuticamente aceitável é suplementado por albumina sérica humana.
[0088] Para finalidades da invenção, a quantidade ou dose (por exemplo, número de células em casos onde o TCR da invenção con- siste em uma ou mais células) do material do TCR administrado pode ser suficiente para efetuar, por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática em um indivíduo ou animal ao longo de um período de tem- po razoável. Por exemplo, a dose do TCR da invenção deve ser sufici- ente para ligar um antígeno de câncer, tratar ou prevenir câncer em um período de cerca de duas horas ou mais (por exemplo, 12 a 24 ho- ras ou mais) a partir do momento da administração. Em determinadas modalidades, este período pode ser ainda mais longo. A dose será de- terminada pela eficácia do TCR específico da invenção, pelas condi- ções do animal (por exemplo ser humano) e pelo peso corporal do animal (por exemplo ser humano) a ser tratado.
[0089] Contempla-se que as composições farmacêuticas, constru- tos reconhecedores de antígenos, TCRs (incluindo variantes funcio- nais do mesmo), polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinante, células hospedeiras ou populações de célu-
las da invenção podem ser usados no tratamento ou na prevenção do câncer ou em doenças pré-malignas positivas para COL6A3. Acredita- se que o TCR da invenção (e as variantes funcionais do mesmo) se ligam especificamente ao AAT da invenção, de modo que o TCR ou polipeptídeo ou proteína da invenção e variantes funcionais do mes- mo) são capazes de, quando expressos por ou localizados sobre uma célula, mediar uma resposta imune contra uma célula-alvo que ex- pressa o AAT da invenção, preferivelmente apresentando peptídeos AAT via MHC I ou II na superfície da referida célula alvo. Neste senti- do, a invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma patologia, em particular o câncer, em um mamífero, que compre- ende administração ao referido mamífero de qualquer uma das com- posições farmacêuticas e construtos reconhecedores de antígenos, em particular TCRs (e variantes funcionais dos mesmos), polipeptí- deos ou proteínas aqui descritas, qualquer ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante que compreenda uma sequência de nucleotí- deos que codifique qualquer um dos TCRs (ou variantes funcionais dos mesmos), polipeptídeos ou proteínas aqui descritas ou qualquer células hospedeira ou população de células que compreenda um ácido nucleico ou vetor recombinante que codifique qualquer um dos cons- trutos da invenção (e variantes funcionais das mesmas), polipeptídeos ou proteínas aqui descritas em uma quantidade que seja eficaz para tratar ou evitar a patologia no referido mamífero, onde a patologia em questão é preferivelmente o câncer, tal como um câncer que expresse o AAT da invenção.
[0090] São exemplos de veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção os estabilizadores como o SPGA, carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, amido, sucrose, glicose e dextrana), proteínas como a albumina e a caseína, agentes que con- têm proteínas como o soro bovino ou leite desnatado, e tampões (por exemplo tampão fosfato).
[0091] Conforme aqui usados, os termos "tratar" e "prevenir", as- sim como palavras derivadas dos mesmos, não significam necessari- amente tratamento ou prevenção integrais ou completos. Com efeito, existem diversos graus de tratamento ou prevenção, que os mediana- mente versados na técnica reconhecerão como potencialmente bené- ficos ou como surtindo efeito terapêutico. Neste sentido, os métodos da invenção podem fornecer qualquer quantidade de qualquer nível de tratamento ou prevenção de uma patologia em um mamífero. Outros- sim, o tratamento ou prevenção fornecidos pelo método da invenção pode incluir o tratamento ou a prevenção de uma ou mais patologias ou sintomas da patologia (porexemplo, câncer) a ser tratada ou preve- nida. Por exemplo, o tratamento ou a prevenção podem incluir a pro- moção da regressão de um tumor. Também para os propósitos atuais, a prevenção pode incluir retardar o início da patologia ou de um sinto- ma ou manifestação da mesma.
[0092] A presente invenção também se refere a um método de tra- tamento do câncer que compreende a administração de um TCR, um ácido nucleico ou uma célula hospedeira da presente descrição em combinação com pelo menos um agente quimioterápico ou com radio- terapia.
[0093] Outro aspecto da invenção se refere também a um método de detecção da proteína do AAT ou de um complexo do MHC com a proteína do AAT (epítopo proteico do AAT) em uma amostra biológica, tal como se pode obter de um indivíduo ou paciente colocando-se a amostra em contato com um construto reconhecedor de antígenos que se ligue especificamente ao referido peptídeo AAT ou ao comple- xo de peptídeo AAT com MHC e detectando-se a ligação entre o refe- rido construto reconhecedor de antígenos e o referido peptídeo AAT ou o complexo formado pelo peptídeo AAT com o complexo MHC. Em algumas modalidades, o construto reconhecedor de antígenos é um TCR ou anticorpo ou construto assemelhado ou, preferivelmente, o construto reconhecedor de antígenos de acordo com a invenção aqui descrita. Em algumas modalidades, a amostra biológica é uma amos- tra de um tumor ou de um câncer (semelhantes aos aqui descritos), tal como, por exemplo, uma amostra que compreende células tumorais ou cancerosas.
[0094] Também é fornecido um método de tratamento do câncer para um indivíduo que disso necessite, que compreende: a) isolamento de uma célula do referido indivíduo; b) transformação da célula com pelo menos um vetor que codifica um construto reconhecedor de antígenos da presente inven- ção de modo a produzir uma célula transformada; c) expansão da célula transformada de modo a produzir uma pluralidade de células transformadas; e d) administração da pluralidade de células transformadas no referido indivíduo.
[0095] Também é fornecido um método de tratamento do câncer para um indivíduo que disso necessite, que compreende: a) isolamento de uma célula de um doador saudável; b) transformação da célula com um vetor que codifica um construto reconhecedor de antígenos da presente invenção de modo a produzir uma célula transformada; c) expansão da célula transformada de modo a produzir uma pluralidade de células transformadas; e d) administração da pluralidade de células transformadas no referido indivíduo.
[0096] Também é fornecido um método de detecção do câncer em uma amostra biológica, que compreende: a) colocação da amostra biológica em contato com um construto reconhecedor de antígenos da presente descrição; b) detecção da ligação do construto reconhecedor de antí- genos com a amostra biológica.
[0097] Em algumas modalidades, o método de detecção de câncer é realizado in vitro, in vivo ou in situ.
[0098] Também é fornecido um método para detectar a presença de uma patologia em um animal mamífero, que compreende (i) colocar uma amostra com uma ou mais células em contato com qualquer um dos TCRs da invenção (e variantes funcionais dos mesmos), polipeptí- deos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de expressão recombinan- tes, células hospedeiras, populações de células, anticorpos ou porções ligantes de antígenos dos mesmos, ou as composições farmacêuticas aqui descritas, formando-se assim um complexo, e detecção do referi- do complexo, sendo que a detecção do complexo indica a presença da patologia no mamífero, sendo que a patologia pode ser câncer, tal co- mo um câncer positivo para COL6A3.
[0099] Em relação ao método da invenção para detectar uma pato- logia em um mamífero, a amostra de células pode ser uma amostra de células inteiras, lisados das mesmas ou uma fração de lisados de célu- las inteiras, por exemplo, uma fração nuclear ou citoplasmática, uma fração de proteína inteira ou uma fração de ácido nucleico.
[00100] Para fins do método de detecção da invenção, o contato pode ocorrer in vitro ou in vivo em relação ao animal. Preferivelmente, o contato ocorre in vitro.
[00101] A detecção do complexo também pode ocorrer por meio de diversas maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, os construtos reconhecedores de antígenos da invenção (e variantes funcionais das mesmas), polipeptídeos, proteínas, ácidos nucleicos, vetores de ex- pressão recombinantes, células hospedeiras, populações de células ou anticorpos ou TCRs, ou porções ligantes de antígenos dos mes-
mos, conforme aqui descritos, podem ser rotulados por marcadores detectáveis, tais como, por exemplo, um radioisótopo, um fluoróforo (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE)), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano) e partículas elementares (por exemplo, partículas de ouro).
[00102] Para fins dos métodos da invenção, segundo os quais as células hospedeiras ou populações de células são administradas, as células podem ser células halogênicas ou autólogas do mamífero. As células são preferivelmente células autólogas do mamífero.
[00103] Em relação às aplicações médicas supramencionadas dos TCRs contemplados pela invenção, o câncer a ser tratado ou diagnos- ticado pode ser qualquer tipo de câncer, incluindo-se qualquer um den- tre câncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiossar- coma alveolar, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, cân- cer do ânus, canal anal ou anorretal, câncer do olho, câncer do ducto biliar intra-hepático, câncer das articulações, câncer do pescoço, vesí- cula biliar ou pleura, câncer nasal, da cavidade nasal ou do ouvido médio, câncer da cavidade oral, câncer da vagina, câncer da vulva, leucemia linfocítica crônica, câncer mieloide crônico, câncer de cólon, câncer de esôfago, câncer do colo do útero, tumor carcinoide gastroin- testinal, glioma, linfoma de Hodgkin, câncer da hipofaringe, câncer de rim, câncer de laringe, câncer de fígado, câncer de pulmão, mesoteli- oma maligno, melanoma, mieloma múltiplo, câncer da nasofaringe, linfoma não-Hodgkin, câncer da orofaringe, câncer de ovário, câncer de pênis, câncer de pâncreas, câncer de peritônio, omento e mesenté- rio, câncer de faringe, câncer de próstata, câncer retal, câncer renal, câncer de pele, câncer do intestino delgado, câncer de tecidos moles, câncer de estômago, câncer testicular, câncer de tireoide, câncer do útero, câncer da uretra e câncer de bexiga. São cânceres preferidos os cânceres do colo do útero, orofaringe, ânus, canal anal, anorretal, va-
gina, vulva e pênis. Um câncer particularmente preferido é um câncer positivo para AAT, incluindo-se um linfoma positivo para SPINK2.
[00104] Em geral, a invenção fornece um método para tratamento de indivíduos que apresentam tumores ou uma doença tumoral, que compreende a administração de construtos reconhecedores de antí- genos, ácidos nucleicos, vetores, composições farmacêuticas e/ou cé- lulas hospedeiras, conforme discutido na presente invenção. Preferi- velmente, o indivíduo é um indivíduo que necessita de tal tratamento. Em modalidades preferidas, o indivíduo é um indivíduo mamífero, pre- ferivelmente um paciente humano, que apresenta um tumor ou uma doença tumoral positiva para AAT.
[00105] Diante da presente revelação, fica entendido que a inven- ção refere-se também aos seguintes itens:
[00106] Item 1: Um construto reconhecedor de antígenos que com- preende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) do tipo 3 cuja sequência é pelo menos 50% idêntica a uma se- quência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 e 117.
[00107] Item 2: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com o item 1, em que o construto reconhecedor de antígenos é capaz de se ligar específica ou seletivamente a um peptídeo antigênico do AAT da invenção.
[00108] Item 3: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com os itens 1 ou 2, em que o construto reconhecedor de antígenos é um anticorpo ou um derivado ou fragmento do mesmo ou um receptor de célula T (TCR) ou um derivado ou fragmento de TCR.
[00109] Item 4: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, onde o referido construto reconhe- cedor de antígenos se liga ao peptídeo antigênico de AAT apresentado por um antígeno leucocitário humano (HLA) e o referido HLA é, opcio-
nalmente, do tipo A2.
[00110] Item 5: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, onde o construto se liga de forma específica e/ou seletiva a um epítopo que possui sequência de amino- ácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 133 a 158.
[00111] Item 6: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, onde o construto é um TCR α ou β ou um fragmento ou derivado do mesmo, ou o construto é um TCR γ ou δ ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[00112] Item 7: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6, onde o construto é de origem hu- mana e reconhece o peptídeo antigênico AAT de forma específica e/ou seletiva.
[00113] Item 8: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 7, onde o referido construto reconhe- cedor de antígenos é capaz de induzir uma resposta imune em um in- divíduo e, opcionalmente, a resposta imune é caracterizada por um aumento dos níveis de interferon gama (IFNγ).
[00114] Item 9: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, compreendendo uma cadeia α ou γ de TCR e/ou uma cadeia β ou δ de TCR, sendo que a cadeia α ou γ de TCR compreende um CDR3 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma se- quência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99 e 111, e/ou onde as cadeias de TCR β ou δ compreendem um CDR3 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105 e 117. Item 10: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com o item
9, onde as cadeias α ou γ de TCR compreendem também um CDR1 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 1, 13, 25, 37, 49, 61, 73, 85, 97 e 109; e/ou um CDR2 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos seleci- onada entre SEQ ID Nºs 2, 14, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98 e 110.
[00115] Item 11: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com os itens 9 ou 10, onde as cadeias β ou δ de TCR compreendem também um CDR1 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 7, 19, 31, 43, 55, 67, 79, 91, 103 e 115; e/ou um CDR2 cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma se- quência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 8, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104 e 116.
[00116] Item 12: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, compreendendo um TCR cuja regi- ão de cadeia variável é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos seleci- onada entre SEQ ID Nºs 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112 e 118.
[00117] Item 13: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 12, onde o construto é humanizado , quimerizado e/ou murinizado .
[00118] Item 14: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 13, compreendendo um fragmento li- gante de um TCR, sendo que o referido fragmento ligante compreende CDR1 a CDR3, selecionado opcionalmente entre CDR1 a CDR3 cujas sequências de aminoácidos são as SEQ ID Nºs 1, 2 e 3 ou 7, 8 e 9 ou
13, 14 e 15 ou 19, 20 e 21 ou 25, 26 e 27 ou 31, 32 e 33 ou 37, 38 e 39 ou 43, 44 e 45 ou 49, 50 e 51 ou 55, 56 e 57 ou 61, 62 e 63 ou 67, 68 e 69 ou 73, 74 e 75 ou 79, 80 e 81 ou 85, 86 e 87 ou 91, 92 e 93 ou 97, 98 e 99 ou 103, 104 e 105 ou 109, 110 e 111 ou 115, 116 e 117.
[00119] Item 15: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 14, onde o construto é um TCR ou um fragmento de um TCR, composto por pelo menos uma sequência de cadeia α de TCR uma cadeia β de TCR, onde a referida cadeia α de TCR compreende sequências de CDR1 a CDR3 que possuem as se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 1 a 3, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que pos- suem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 7 a 9, ou onde a referi- da sequência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 13 a 15, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 19 a 21, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 25 a 27, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 31 a 33, ou onde a referida se- quência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 37 a 39, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 43 a 45, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 49 a 51, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 55 a 57, ou onde a referida se-
quência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 61 a 63, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 67 a 69, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 73 a 75, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 79 a 81, ou onde a referida se- quência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 85 a 87, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 91 a 93, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreen- de as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de amino- ácidos SEQ ID Nºs 97 a 99, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem se- quências de aminoácidos SEQ ID Nºs 103 a 105, ou onde a referida sequência de cadeia α do TCR compreende as sequências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 109 a 111, e a referida sequência de cadeia β do TCR compreende as se- quências CDR1 a CDR3 que possuem sequências de aminoácidos SEQ ID Nºs 115 a 117.
[00120] Item 16: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 15, onde o construto é um TCR ou fra- gmento de um TCR que compreende pelo menos uma sequência α de TCR e pelo menos uma sequência β de TCR, onde a referida sequên- cia de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 4 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 10, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 16 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 22, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 28 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 34, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma se- quência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 40 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 46, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 52 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 58, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR com- preende uma sequência de região variável com a sequência de ami- noácidos SEQ ID Nº 64 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 70, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID Nº 76 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequên- cia de aminoácidos SEQ ID Nº 82, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 88 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 94, ou onde a referida sequên-
cia de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 100 e a referida sequên- cia β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 106, ou onde a referida sequência de cadeia α de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 112 e a referida sequência β da cadeia de TCR compreende uma sequência de região variável com a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 118.
[00121] Item 17: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 16, onde o construto é um TCR ou fra- gmento de um TCR, compreendendo também uma região constante de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113 e 119, preferivelmente onde o TCR é formado por pelo menos uma sequência α de TCR uma sequência β de TCR, sendo que a sequência α de TCR compreende uma região constante cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 5, 17, 29, 41, 53, 65, 77, 89, 101 e 113 e onde a sequência β de TCR compreende uma região constante cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID Nºs 11, 23, 35, 47, 59, 71, 83, 95, 107 e 119.
[00122] Item 18: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira ca- deia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 6 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 12.
[00123] Item 19: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira ca- deia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 18 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 24.
[00124] Item 20: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira ca- deia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 30 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 36.
[00125] Item 20b: O construto reconhecedor de antígenos de acor- do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 42 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 48.
[00126] Item 20c: O construto reconhecedor de antígenos de acor- do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 54 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 60.
[00127] Item 20d: O construto reconhecedor de antígenos de acor-
do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 66 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 72.
[00128] Item 20e: O construto reconhecedor de antígenos de acor- do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 78 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 84.
[00129] Item 20f: O construto reconhecedor de antígenos de acor- do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 90 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 96.
[00130] Item 20g: O construto reconhecedor de antígenos de acor- do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 102 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 108.
[00131] Item 20h: O construto reconhecedor de antígenos de acor- do com qualquer um dos itens 1 a 17, compreendendo uma primeira cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%,
90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 114 e uma segunda cadeia de TCR cuja sequência é pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº 120.
[00132] Item 21: Um ácido nucleico que codifica: um construto re- conhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a
20.
[00133] Item 22: Um vetor que compreende um ácido nucleico de acordo com o item 21.
[00134] Item 23: Uma célula hospedeira que compreende um cons- truto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 20 ou um ácido nucleico de acordo com o item 21 ou um vetor de acordo com o item 22.
[00135] Item 24: A célula hospedeira de acordo com o item 23, on- de a célula é um linfócito, preferivelmente um linfócito T ou um precur- sor de linfócito, e mais preferivelmente uma célula T positiva para CD4 ou CD8.
[00136] Item 25: Uma composição farmacêutica que compreende o construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 20 ou o ácido nucleico de acordo com o item 21 ou o ve- tor de acordo com o item 22 ou a célula hospedeira de acordo com os itens 23 ou 24 e um veículo, estabilizador e/ou veículo farmaceutica- mente aceitável.
[00137] Item 26: O construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 20 ou um ácido nucleico de acordo com o item 21 ou um vetor de acordo com o item 22 ou uma célula hospedeira de acordo com os itens 23 ou 24 ou uma composição far- macêutica de acordo com o item 25 para uso em medicina.
[00138] Item 27: O construto reconhecedor de antígenos ou o ácido nucleico ou o vetor ou a célula hospedeira ou a composição farmacêu-
tica para uso de acordo com o item 26 para emprego no diagnóstico, prevenção ou tratamento de uma doença proliferativa, sendo que tal doença compreende uma doença tumoral maligna ou benigna.
[00139] Item 28: O construto reconhecedor de antígenos ou o ácido nucleico ou o vetor ou a célula hospedeira ou a composição farmacêu- tica para uso de acordo com o item 27, onde a doença tumoral é ca- racterizada pela expressão de AAT em uma célula tumoral da referida doença tumoral.
[00140] Item 29: O construto reconhecedor de antígenos ou o ácido nucleico ou o vetor ou a célula hospedeira ou a composição farmacêu- tica para uso de acordo com qualquer um dos itens 26 a 28, onde o uso em medicina consiste na imunoterapia que compreende, opcio- nalmente, a transferência de células adotivas, sendo que tal imunote- rapia compreende terapia com células T adotivas autólogas ou heteró- logas.
[00141] Item 30: Um método de fabricação de um construto reco- nhecedor de antígenos específico para AAT, que compreende: a. fornecimento de uma célula hospedeira apropriada; b. fornecimento de um construto genético compreendendo uma sequência codificadora que codifica o construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer um dos itens 1 a 20; c. introdução do referido construto genético na referida cé- lula hospedeira apropriada; e d. expressão do referido construto genético pela referida célula hospedeira apropriada.
[00142] Item 31: O método de acordo com o item 30, compreen- dendo também apresentação na superfície celular do referido cons- truto reconhecedor de antígenos.
[00143] Item 32: O método de acordo com os itens 30 ou 31, onde o construto genético é um construto expressivo que compreende uma sequência promotora com ligação operante à referida sequência codi- ficadora.
[00144] Item 33: O método de acordo com qualquer um dos itens 30 a 32, onde o referido construto reconhecedor de antígenos é de ori- gem mamífera e, preferivelmente, de origem humana.
[00145] Item 34: O método de acordo com qualquer um dos itens 30 a 33, onde a referida célula hospedeira apropriada é uma célula mamí- fera, opcionalmente selecionada entre uma célula T humana e um lin- fócito T humano.
[00146] Item 35: O método de acordo com qualquer um dos itens 30 a 34, onde o referido construto reconhecedor de antígenos é um TCR modificado, sendo que a referida modificação compreende a inclusão de um domínio funcional que compreende um marcador ou um domí- nio alternativo que compreende um domínio de ancoragem em mem- brana.
[00147] Item 36: O método de acordo com o item 35, onde o referi- do construto reconhecedor de antígenos é um TCR alfa/beta, um TCR gama/delta ou um TCR de cadeia única (scTCR).
[00148] Item 37: O método de acordo com os itens 30 a 36, onde o referido construto genético é introduzido na referida célula hospedeira apropriada por transfecção mediada por retrovírus.
[00149] Item 38: O método de acordo com qualquer um dos itens 30 a 37, compreendendo também o isolamento e a purificação do cons- truto reconhecedor de antígenos a partir de uma célula hospedeira apropriada e, opcionalmente, reconstituição do construto reconhece- dor de antígenos em uma célula T.
[00150] A presente invenção será descrita mais pormenorizada- mente nos exemplos a seguir, com referências às figuras que os acompanham, mas sem limitar-se aos mesmos. Para os fins da pre- sente invenção, todas as referências aqui citadas ficam integralmente incorporadas por referência. Nas Figuras e Sequências:
[00151] Figura 1: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R39P1C12 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 car- regadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas vari- antes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posições 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptí- deo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre libe- ração de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00152] Figura 2: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R39P1F5 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00153] Figura 3: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R40P1C2 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00154] Figura 4: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R41P3E6 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00155] Figura 5: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R43P3G4 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00156] Figura 6: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R44P3B3 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian-
tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00157] Figura 7: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R44P3E7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00158] Figura 8: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R49P2B7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00159] Figura 9: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro-
poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R55P1G7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00160] Figura 10: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R59P2A7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133), diversas varian- tes de SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina nas posi- ções 1 a 9 de SEQ ID Nº 133 (SEQ ID Nºs 134 a 149) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois do- adores saudáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ ele- troporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com cé- lulas-alvo não carregadas.
[00161] Figura 11: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R39P1C12 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 car- regadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo, porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle
NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00162] Figura 12: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R39P1F5 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou com os peptí- deos homólogos, porém não relacionados CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6-001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ co- lhidas de dois doadores saudáveis. Foram usadas como controles cé- lulas T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incuba- das junto com células-alvo não carregadas.
[00163] Figura 13: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R40P1C2 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou com os peptí- deos homólogos, porém não relacionados CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6-001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ co-
lhidas de dois doadores saudáveis. Foram usadas como controles cé- lulas T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incuba- das junto com células-alvo não carregadas.
[00164] Figura 14: Liberação de IFNγ por células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R41P3E6 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou com os peptí- deos homólogos, porém não relacionados CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6-001 (SEQ ID Nº 151), XRCC5-001 (SEQ ID Nº 152), TMEM147- 001 (SEQ ID Nº 153), SEC-001 (SEQ ID Nº 154), GMPPA-001 (SEQ ID Nº 155), EXOC4-002 (SEQ ID Nº 156), ARFGAP3-001 (SEQ ID Nº 157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00165] Figura 15: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R43P3G4 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo, porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00166] Figura 16: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R44P3B3 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo, porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00167] Figura 17: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R44P3E7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo, porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00168] Figura 18: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro-
poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R49P2B7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00169] Figura 19: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R55P1G7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo, porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00170] Figura 20: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R59P2A7 (Tabela 1) após incubação junto com células alvo T2 carre-
gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) ou o peptídeo homólogo, porém não relacionado CYP-003 (SEQ ID Nº 150), BAG6- 001 (SEQ ID NO:151), XRCC5-001 (SEQ ID NO:152), TMEM147-001 (SEQ ID NO:153), SEC-001 (SEQ ID NO:154), GMPPA-001 (SEQ ID NO:155), EXOC4-002 (SEQ ID NO:156), ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) ou ANKRD29-002 (SEQ ID Nº 158) ou o peptídeo de controle NYESO1-001 (SEQ ID Nº 159). Os dados sobre liberação de IFNγ fo- ram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores sau- dáveis. Foram usadas como controles células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA, isoladas ou incubadas junto com células-alvo não carregadas.
[00171] Figura 21: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R39P1C12 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00172] Figura 22: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R39P1F5 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00173] Figura 23: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R40P1C2 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00174] Figura 24: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R41P3E6 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00175] Figura 25: Liberação de IFNγ de células T CD8+eletroporadas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R43P3G4 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carre- gadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias con- centrações entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudáveis.
[00176] Figura 26: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R44P3B3 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00177] Figura 27: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R44P3E7 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00178] Figura 28: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R49P2B7 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00179] Figura 29: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R55P1G7 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00180] Figura 30: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro- poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta do TCR R59P2A7 (Tabela 1) após incubação com células alvo T2 carregadas com o peptídeo SPINK2-001 (SEQ ID Nº 133) em várias concentra- ções entre 10 pM e 10 µM. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a partir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudá- veis.
[00181] Figura 31: Colorações para tetrâmeros HLA- A*02/SPINK2-001 ou HLA-A*02/NYESO1-001, respectivamente, de células T CD8+ eletroporadas na presença de RNA das cadeias alfa e beta dos TCRs R41P3E6, R44P3B3, R49P2B7 e R55P1G7, respecti- vamente. Células T CD8+ eletroporadas com RNA do TCR 1G4 (SEQ Nº 121 a 132) que se ligam especificamente ao complexo HLA- A*02/NYESO1-001 e células T CD8+ submetidas a eletroporação si- mulada que serviram como controles.
[00182] Figura 32: Liberação de IFNγ de células T CD8+ eletro-
poradas na presença de RNA das cadeias alfa e beta de TCR R55P1G7 (A) ou R44P3B3 (B) (Tabela 1) após incubação junto com células-alvo A375 que sobre-expressam SPINK2 ou células A375 do tipo selvagem. Os dados sobre liberação de IFNγ foram obtidos a par- tir de células T CD8+ colhidas de dois doadores saudáveis: TCRA-61 e TCRA-62. Os dados após subtração do sinal de fundo são mostrados (isto é, pré-ativação com controles usando apenas os efetores; o sinal dos efetores sem transdução cultivados junto com a linhagem de célu- las-alvo foi subtraído das amostras a serem examinadas).
[00183] Figura 33: Análise de ligação por interferometria em bio- camada de HLA-A*02:01:SPINK2-001 (imobilizado sobre o sensor) e variantes solúveis dos TCRs R39P1F5, R39P1C12, R41P3E6, R44P3B3 e R55P1G7. O painel esquerdo mostra o sinal das curvas de ligação (eixo y) e ajuste das curvas para várias concentrações de TCR ao longo do tempo (eixo x), e o painel direito mostra a resposta no ponto de equilíbrio (eixo y) sob várias concentrações e ajustes de TCR (eixo x). Tabela 1: Sequências de TCR da invenção SEQ Ca- TCR Região Sequência Nº deia 1 R39P1C12 alfa CDR1 DSSSTY 2 R39P1C12 alfa CDR2 IFS 3 R39P1C12 alfa CDR3 CAEIDNQGGKLIF
MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDV
EQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTY domínio 4 R39P1C12 alfa LYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQ variável
DQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDS AIYFCAEIDNQGGKLIFGQGTELSVKP NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 5 R39P1C12 alfa constan- NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDV EQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTY LYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQ DQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDS
AIYFCAEIDNQGGKLIFGQGTELSVKP 6 R39P1C12 alfa completa NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS 7 R39P1C12 beta CDR1 SGHDT 8 R39P1C12 beta CDR2 YYEEEE 9 R39P1C12 beta CDR3 CASSQLNTEAFF
MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQ
SPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTV domínio SWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQR 10 R39P1C12 beta variável GNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLL
GDSALYLCASSQLNTEAFFGQGTRLT VV EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 11 R39P1C12 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF MGPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQ SPTHLIKTRGQQVTLRCSPKSGHDTV SWYQQALGQGPQFIFQYYEEEERQR GNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLL GDSALYLCASSQLNTEAFFGQGTRLT
VVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQ 12 R39P1C12 beta completa
KATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGK EVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCL SSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAW GRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILL
GKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 13 R39P1F5 alfa CDR1 DRGSQS 14 R39P1F5 alfa CDR2 IY 15 R39P1F5 alfa CDR3 CAVNNARLMF domínio MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE 16 R39P1F5 alfa QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ variável
SFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKE DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD SATYLCAVNNARLMFGDGTQLVVKP NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 17 R39P1F5 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ SFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKE DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD
SATYLCAVNNARLMFGDGTQLVVKPN 18 R39P1F5 alfa completa IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD
FDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMR SMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFN NSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFE TDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLL
MTLRLWSS 19 R39P1F5 beta CDR1 SNHLY 20 R39P1F5 beta CDR2 FYNNEI 21 R39P1F5 beta CDR3 CASSGQGANEQYF
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT
PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY domínio WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI 22 R39P1F5 beta variável FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED
SAMYFCASSGQGANEQYFGPGTRLT VT EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 23 R39P1F5 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED SAMYFCASSGQGANEQYFGPGTRLT
VTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQ 24 R39P1F5 beta completa
KATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGK EVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCL SSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAW GRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILL GKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
25 R40P1C2 alfa CDR1 TSESDYY 26 R40P1C2 alfa CDR2 QEAY 27 R40P1C2 alfa CDR3 CAYLNYQLIW
MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQ
SQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDY domínio 28 R40P1C2 alfa YLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQN variável
ATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQL GDAAMYFCAYLNYQLIWGAGTKLIIKP DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 29 R40P1C2 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQ SQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDY YLFWYKQPPSRQMILVIRQEAYKQQN ATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQL
GDAAMYFCAYLNYQLIWGAGTKLIIKP 30 R40P1C2 alfa completa DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS 31 R40P1C2 beta CDR1 SNHLY 32 R40P1C2 beta CDR2 FYNNEI 33 R40P1C2 beta CDR3 CASSEMTAVGQYF
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT
PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY domínio WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI 34 R40P1C2 beta variável FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED
SAMYFCASSEMTAVGQYFGPGTRLT VT EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 35 R40P1C2 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT 36 R40P1C2 beta completa PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY
WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED SAMYFCASSEMTAVGQYFGPGTRLT VTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQ KATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGK EVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCL SSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAW GRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILL
GKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 37 R41P3E6 alfa CDR1 DRGSQS 38 R41P3E6 alfa CDR2 IY 39 R41P3E6 alfa CDR3 CAAFSGYALNF
MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE
QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ domínio 40 R41P3E6 alfa SFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKE variável
DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD SATYLCAAFSGYALNFGKGTSLLVTP HIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 41 R41P3E6 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ SFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKE DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD SATYLCAAFSGYALNFGKGTSLLVTP
HIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT 42 R41P3E6 alfa completa DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS 43 R41P3E6 beta CDR1 SNHLY 44 R41P3E6 beta CDR2 FYNNEI 45 R41P3E6 beta CDR3 CASSQYTGELFF
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT
PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY domínio WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI 46 R41P3E6 beta FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED variável
SAMYFCASSQYTGELFFGEGSRLTVL EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 47 R41P3E6 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED SAMYFCASSQYTGELFFGEGSRLTVL
EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA 48 R41P3E6 beta completa
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK
ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 49 R43P3G4 alfa CDR1 DRGSQS 50 R43P3G4 alfa CDR2 IY 51 R43P3G4 alfa CDR3 CAVNGGDMRF
MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE
QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ domínio 52 R43P3G4 alfa SFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKE variável
DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD SATYLCAVNGGDMRFGAGTRLTVKP NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 53 R43P3G4 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ SFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKE DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD
SATYLCAVNGGDMRFGAGTRLTVKP 54 R43P3G4 alfa completa NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS 55 R43P3G4 beta CDR1 SNHLY 56 R43P3G4 beta CDR2 FYNNEI
57 R43P3G4 beta CDR3 CASSGQGALEQYF
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT
PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY domínio WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI 58 R43P3G4 beta variável FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED
SAMYFCASSGQGALEQYFGPGTRLT VT EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 59 R43P3G4 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQT PSHQVTQMGQEVILRCVPISNHLYFY WYRQILGQKVEFLVSFYNNEISEKSEI FDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLED SAMYFCASSGQGALEQYFGPGTRLT
VTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQ 60 R43P3G4 beta completa
KATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGK EVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCL SSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFY GLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAW GRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILL
GKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 61 R44P3B3 alfa CDR1 NSMFDY 62 R44P3B3 alfa CDR2 ISS 63 R44P3B3 alfa CDR3 CAASGLYNQGGKLIF
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKN
DDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDY domínio TNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSI 64 R44P3B3 alfa variável KDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPS
QPGDSAVYFCAASGLYNQGGKLIFGQ GTELSVKP NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 65 R44P3B3 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKN
DDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDY 66 R44P3B3 alfa completa TNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSI
KDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPS QPGDSAVYFCAASGLYNQGGKLIFGQ GTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSS DKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYI TDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKS DFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCD VKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILL
LKVAGFNLLMTLRLWSS 67 R44P3B3 beta CDR1 LGHDT 68 R44P3B3 beta CDR2 YNNKEL 69 R44P3B3 beta CDR3 CASSLGDRGYEQYF
MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQT
PKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTM domínio YWYKQDSKKFLKIMFSYNNKELIINET 70 R44P3B3 beta variável VPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDS
AVYFCASSLGDRGYEQYFGPGTRLTV T EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 71 R44P3B3 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQT PKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTM YWYKQDSKKFLKIMFSYNNKELIINET VPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDS AVYFCASSLGDRGYEQYFGPGTRLTV
TEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQK 72 R44P3B3 beta completa
ATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKE VHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLS SRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYG LSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG RADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLG
KATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 73 R44P3E7 alfa CDR1 DSSSTY 74 R44P3E7 alfa CDR2 IFS 75 R44P3E7 alfa CDR3 CAEINNNARLMF
MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDV
EQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTY domínio 76 R44P3E7 alfa LYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQ variável
DQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDS AIYFCAEINNNARLMFGDGTQLVVKP
NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT 77 R44P3E7 alfa domínio
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM constan-
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF te NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDV EQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTY LYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQ DQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDS
AIYFCAEINNNARLMFGDGTQLVVKP 78 R44P3E7 alfa completa NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS 79 R44P3E7 beta CDR1 PRHDT 80 R44P3E7 beta CDR2 FYEKMQ 81 R44P3E7 beta CDR3 CASSPPDQNTQYF
MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGA
VSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCY domínio PIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFY 82 R44P3E7 beta variável EKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSEL
NMSSLELGDSALYFCASSPPDQNTQY FGPGTRLTVL EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 83 R44P3E7 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MLSPDLPDSAWNTRLLCHVMLCLLGA VSVAAGVIQSPRHLIKEKRETATLKCY PIPRHDTVYWYQQGPGQDPQFLISFY EKMQSDKGSIPDRFSAQQFSDYHSEL NMSSLELGDSALYFCASSPPDQNTQY
FGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEP 84 R44P3E7 beta completa SEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVEL
SWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPA LNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNH FRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVT QIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVL SATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAM
VKRKDSRG 85 R49P2B7 alfa CDR1 SSVPPY 86 R49P2B7 alfa CDR2 YTTG
87 R49P2B7 alfa CDR3 CAVRIFGNEKLTF
MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLG
SHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLF domínio 88 R49P2B7 alfa WYVQYPNQGLQLLLKYTTGATLVKGI variável
NGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDA AEYFCAVRIFGNEKLTFGTGTRLTIIP NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 89 R49P2B7 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MLLLLVPVLEVIFTLGGTRAQSVTQLG SHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLF WYVQYPNQGLQLLLKYTTGATLVKGI NGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDA
AEYFCAVRIFGNEKLTFGTGTRLTIIPN 90 R49P2B7 alfa completa IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTD
FDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMR SMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFN NSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFE TDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLL
MTLRLWSS 91 R49P2B7 beta CDR1 MDHEN 92 R49P2B7 beta CDR2 SYDVKM 93 R49P2B7 beta CDR3 CASSLMGELTGELFF
MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQS
SRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENM domínio FWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKG 94 R49P2B7 beta variável DIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQ
TSMYLCASSLMGELTGELFFGEGSRL TVL EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 95 R49P2B7 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQS SRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENM
FWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKG 96 R49P2B7 beta completa DIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQ
TSMYLCASSLMGELTGELFFGEGSRL TVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHT QKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNG KEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRY CLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQ FYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEA WGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEI LLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDS
RG 97 R55P1G7 alfa CDR1 NSAFQY 98 R55P1G7 alfa CDR2 TY 99 R55P1G7 alfa CDR3 CAMMGDTGTASKLTF
MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKE
VEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSA domínio FQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSG 100 R55P1G7 alfa variável NKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQP
SDSATYLCAMMGDTGTASKLTFGTGT RLQVTL DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 101 R55P1G7 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKE VEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSNSA FQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSG NKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQP
SDSATYLCAMMGDTGTASKLTFGTGT 102 R55P1G7 alfa completa RLQVTLDIQNPDPAVYQLRDSKSSDK
SVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITD KTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDF ACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVK LVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLK
VAGFNLLMTLRLWSS 103 R55P1G7 beta CDR1 MDHEN 104 R55P1G7 beta CDR2 SYDVKM 105 R55P1G7 beta CDR3 CASSFGGYEQYF
MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQS
SRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENM domínio 106 R55P1G7 beta FWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKG variável
DIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQ TSMYLCASSFGGYEQYFGPGTRLTVT
EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA domínio TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV 107 R55P1G7 beta constan- HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS te RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL
SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQS SRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENM FWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKG DIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQ TSMYLCASSFGGYEQYFGPGTRLTVT
EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA 108 R55P1G7 beta completa
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK
ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG 109 R59P2A7 alfa CDR1 DRGSQS 110 R59P2A7 alfa CDR2 IY 111 R59P2A7 alfa CDR3 CAVQPHDMRF
MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE
QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ domínio 112 R59P2A7 alfa SFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKE variável
DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD SATYLCAVQPHDMRFGAGTRLTVKP NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 113 R59P2A7 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVE QNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQ SFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKE DGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSD
SATYLCAVQPHDMRFGAGTRLTVKP 114 R59P2A7 alfa completa NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL
LMTLRLWSS 115 R59P2A7 beta CDR1 GTSNPN 116 R59P2A7 beta CDR2 SVGIG 117 R59P2A7 beta CDR3 CAWSGLVAEQFF domínio MLCSLLALLLGTFFGVRSQTIHQWPA 118 R59P2A7 beta TLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYW variável
YRQAAGRGLQLLFYSVGIGQISSEVP QNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGF YLCAWSGLVAEQFFGPGTRLTVL EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 119 R59P2A7 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MLCSLLALLLGTFFGVRSQTIHQWPA TLVQPVGSPLSLECTVEGTSNPNLYW YRQAAGRGLQLLFYSVGIGQISSEVP QNLSASRPQDRQFILSSKKLLLSDSGF YLCAWSGLVAEQFFGPGTRLTVLEDL
KNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV 120 R59P2A7 beta completa
CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSG VSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSEN DEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADC GFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLY
AVLVSALVLMAMVKRKDSRG 121 1G4 alfa CDR1 DSAIYN 122 1G4 alfa CDR2 IQS 123 1G4 alfa CDR3 CAVRPTSGGSYIPTF
METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIP
AALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQ domínio WFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSG 124 1G4 alfa variável RLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSA
TYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVH P YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFT
DFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDM domínio
RSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAF 125 1G4 alfa constan-
NNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSF te
ETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIP AALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQ WFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSG RLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSA
TYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVH 126 1G4 alfa completa PYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLF
TDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLD MRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANA FNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKS FETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFN LLMTLRLWSS
127 1G4 beta CDR1 MNHEY 128 1G4 beta CDR2 SVGAGI 129 1G4 beta CDR3 CASSYVGNTGELFF
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQT
PKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYM domínio SWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQ 130 1G4 beta variável GEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAP
SQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSR LTVL EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA
TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEV domínio HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSS 131 1G4 beta constan- RLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGL te SENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR
ADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGK ATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQT PKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYM SWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQ GEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAP SQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSR
LTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISH 132 1G4 beta completa TQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVN
GKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSR YCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQV QFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAE AWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYE ILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDS
RG Tabela 2: Sequências de peptídeos da invenção Código do peptídeo Sequência SEQ Nº.
SPINK2-001 ALSVLRLAL 133 SPINK2-001_A2 AASVLRLAL 134 SPINK2-001_A3 ALAVLRLAL 135 SPINK2-001_A4 ALSALRLAL 136 SPINK2-001_A5 ALSVARLAL 137 SPINK2-001_A6 ALSVLALAL 138 SPINK2-001_A7 ALSVLRAAL 139 SPINK2-001_A9 ALSVLRLAA 140
SPINK2-001_T1 TLSVLRLAL 141 SPINK2-001_T2 ATSVLRLAL 142 SPINK2-001_T3 ALTVLRLAL 143 SPINK2-001_T4 ALSTLRLAL 144 SPINK2-001_T5 ALSVTRLAL 145 SPINK2-001_T6 ALSVLTLAL 146 SPINK2-001_T7 ALSVLRTAL 147 SPINK2-001_T8 ALSVLRLTL 148 SPINK2-001_T9 ALSVLRLAT 149 CYP-003 ALMNMKLAL 150 BAG6-001 ALSDLRCNL 151 XRCC5-001 ALSSLIHAL 152 TMEM147-001 ALSTLALYV 153 SEC-001 ALSVLADFL 154 GMPPA-001 ALYASRLYL 155 EXOC4-002 GLSDLRLEL 156 ARFGAP3-001 IVSSLRLAY 157 ANKRD29-002 YLDVIRLLL 158 NYESO1-001 SLLMWITQV 159
EXEMPLOS
[00184] Dez TCRs específicos para SPINK2-001 (R39P1C12, R39P1F5, R40P1C2, R41P3E6, R43P3G4, R44P3B3, R44P3E7, R49P2B7, R55P1G7 e R59P2A7, ver Tabela 1), cada um dos quais codificando cadeias TCR-alfa e TCR-beta especificas para tumores, foram isolados e amplificados a partir das células T de doadores sau- dáveis. Células de doadores saudáveis foram estimuladas in vitro de acordo com um método descrito anteriormente (Walter et al. 2003 J immunol, Nov 15;171(10):4974-8) e células específicas para determi- nados alvos foram separadas individualmente usando-se multímeros de HLA-A*02 e posteriormente usadas para isolamento de TCRs. As sequências de TCR foram isoladas por 5’ RACE usando-se métodos- padrão, como os descritos em, por exemplo, Molecular Cloning A La- boratory Manual 4ª edição, de Green e Sambrook. As regiões alfa e beta variáveis dos TCRs R39P1C12, R39P1F5, R40P1C2, R41P3E6, R43P3G4, R44P3B3, R44P3E7, R49P2B7, R55P1G7 e R59P2A7 fo- ram sequenciadas; em seguida, foram gerados construtos de expres- são por meio de síntese gênica para caracterizar melhor a função das moléculas produzidas.
[00185] O R41P3E6, o R43P3G4, o R55P1G7 e o R59P2A7 são derivados de doadores negativos para HLA-A*02 (configuração alorre- ativa), e R39P1C12, R39P1F5, R40P1C2, R44P3B3, R44P3E7 e R49P2B7 são derivados de um doador positivo para HLA-A*02.
[00186] Os TCRs de interesse foram expressos em células T hu- manas por meio de, por exemplo, eletroporação na presença de mRNA. As células T foram avaliadas por meio da liberação de IFNγ após cultura simultânea na presença de diversas células-alvo, tais co- mo células T2 carregadas com diversos peptídeos e linhagens de célu- las tumorais. Os dados de ativação de células T são mostrados em termos de níveis absolutos de IFNγ ou de dados com subtração dos níveis de fundo, conforme indicado a seguir. A eficácia da expressão dos TCRs R55P1G7 e R44P3B3 por células T CD8+ foi determinada, por exemplo, ensaios de ativação de células T (liberação de IFNγ) usando-se diferentes linhagens de células tumorais como células-alvo.
[00187] O método de subtração em ensaios de liberação de IFNγ foi o seguinte: médiafundo(TCRoi; co) = [média(TCRoi; co) – média(TCRoi; somente efetor)] – [média(simulado; co) – média(simulado; somente efetor)]
[00188] Os DPfundo foram calculados da seguinte maneira: DPfundo(TCRoi; co) = [DP(TCRoi; co)2 + DP(TCRoi; somente efetor)2 + DP(simulado; co)2 + DP(simulado; somente efetor)2]1/2
TCRoi = células efetoras que expressam o TCR de interesse Simulado = células efetoras sem expressão exógena de TCR Co = Células efetoras cultivadas junto com células-alvo Somente efetor = Células efetoras cultivadas separadamente Média(fundo) = Liberação média de IFNγ (subtraídos os níveis de fundo) DP(fundo) = Desvio padrão (subtraídos os níveis de fundo)
[00189] A análise de ligação por interferometria em biocamada ("BLI, biolayer interferometry") dos TCRs de SPINK2-001 foram ex- pressos em termos de TCRs solúveis de acordo com um método des- crito anteriormente em Willcox BE et al. 1999 Protein sci Nov;8(11):2418-23 foi usada para determinação de afinidade. Foram usados como controles dados de ligação de BLI para TCR 1G4 e HLA- A*02/NYESO1-001. Exemplo 1: Receptor de células T R39P1C12
[00190] O TCR R39P1C12 (SEQ Nº 1 a 12) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 11).
[00191] O R39P1C12 reconhece especificamente o SPINK2-001, pois células T CD8+ humanas primárias que tornam a expressar esse TCR liberam IFNγ ao serem incubadas junto com células-alvo HLA- A*02+ carregadas com o peptídeo SPINK2-001 ou com variantes do peptídeo SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina (Figura 1) ou vários peptídeos cujas sequências apresentam alto grau de simi- laridade com SPINK2-001 (Figura 11). O peptídeo NYESO1-001 é usado com controle negativo. O TCR R39P1C12 possui EC50 de 0,81 nM (Figura 21) e afinidade de 18 µM (R2 = 0,9956) (Figura 33). Exemplo 2: Receptor de células T R39P1F5
[00192] O TCR R39P1F5 (SEQ Nº 13 a 24) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura
12).
[00193] O R39P1F5 reconhece especificamente o SPINK2-001, pois células T CD8+ humanas primárias que tornam a expressar esse TCR liberam IFNγ ao serem incubadas junto com células-alvo HLA- A*02+ carregadas com o peptídeo SPINK2-001 ou com variantes do peptídeo SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina (Figu- ra 2) ou vários peptídeos cujas sequências apresentam alto grau de similaridade com SPINK2-001 (Figura 12). O peptídeo NYESO1-001 é usado com controle negativo. O TCR R39P1F5 possui EC50 de 1,52 nM (Figura 22) e afinidade de 34 µM (R2 = 0,9962) (Figura 33). Exemplo 3: Receptor de células T R40P1C2
[00194] O TCR R40P1C2 (SEQ Nº 25 a 36) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 13).
[00195] O R40P1C2 reconhece especificamente o SPINK2-001, pois células T CD8+ humanas primárias que tornam a expressar esse TCR liberam IFNγ ao serem incubadas junto com células-alvo HLA- A*02+ carregadas com o peptídeo SPINK2-001 ou com variantes do peptídeo SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina (Figu- ra 3) ou vários peptídeos cujas sequências apresentam alto grau de similaridade com SPINK2-001 (Figura 13). O peptídeo NYESO1-001 é usado com controle negativo. O TCR R40P1C2 possui EC50 de 1,94 nM (Figura 23). Exemplo 4: Receptor de células T R41P3E6
[00196] O TCR R41P3E6 (SEQ Nº 37 a 48) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 14).
[00197] O R41P3E6 reconhece o SPINK2-001 especificamente, pois células T CD8+ humanas primárias tornam a expressar a libera- ção de IFNγ induzida pelo TCR ao serem incubadas junto com células-
alvo HLA-A*02+ e se ligam a tetrâmeros de HLA-A*02 (Figura 31), respectivamente, carregados com o peptídeo SPINK2-001 ou com va- riantes de SPINK2-001 com substituições de alanina ou treonina (Figu- ra 4) ou com outros peptídeos que mostram elevado grau de seme- lhança com SPINK2-001 (Figura 14). O peptídeo NYESO1-001 é usa- do com controle negativo. O TCR R41P3E6 possui EC50 de 1,03 nM (Figura 24) e afinidade de 13 µM (R2 = 0,9892) (Figura 33). Exemplo 5: Receptor de células T R43P3G4
[00198] O TCR R43P3G4 (SEQ Nº 49 a 60) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 15).
[00199] O R43P3G4 reconhece especificamente o SPINK2-001, pois células T CD8+ humanas primárias que tornam a expressar esse TCR liberam IFNγ ao serem incubadas junto com células-alvo HLA- A*02+ carregadas com o peptídeo SPINK2-001 ou com variantes do peptídeo SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina (Figu- ra 5) ou vários peptídeos cujas sequências apresentam alto grau de similaridade com SPINK2-001 (Figura 15). O peptídeo NYESO1-001 é usado com controle negativo. O TCR R43P3G4 possui EC50 de 1,34 nM (Figura 25). Exemplo 6: Receptor de células T R44P3B3
[00200] O TCR R44P3B3 (SEQ Nº 61 a 72) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 16).
[00201] O R44P3B3 reconhece o SPINK2-001 especificamente, pois células T CD8+ humanas primárias tornam a expressar a libera- ção de IFNγ induzida pelo TCR ao serem incubadas junto com células- alvo HLA-A*02+ e se ligam a tetrâmeros de HLA-A*02 (Figura 31), respectivamente, carregados com o peptídeo SPINK2-001 ou com va- riantes de SPINK2-001 com substituições de alanina ou treonina (Figu-
ra 6) ou com outros peptídeos que mostram elevado grau de seme- lhança com SPINK2-001 (Figura 16). O peptídeo NYESO1-001 é usa- do com controle negativo. O TCR R44P3B3 possui EC50 de 1,06 nM (Figura 26) e afinidade de 37 µM (R2 = 0,9947) (Figura 33).
[00202] Observou-se que células T CD8+ que expressam o TCR R44P3B3 possuem atividade contra células tumorais A375 que sobre- expressam SPINK2-001 (Figure 32), mas não contra linhagens de cé- lulas tumorais A375 do tipo selvagem. As células A375 expressam HLA-A2 endogenamente.
[00203] A ativação de células T durante cultivo simultâneo com li- nhagens celulares que expressam HLA-A*02 e SPINK2-001 reflete o reconhecimento da apresentação endógena do pHLA (peptídeo apre- sentado em antígeno leucocitário humano) pelo TCR R44P3B3. Exemplo 7: Receptor de células T R44P3E7
[00204] O TCR R44P3E7 (SEQ Nº 73 a 84) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 17).
[00205] O R44P3E7 reconhece especificamente o SPINK2-001, pois células T CD8+ humanas primárias que tornam a expressar esse TCR liberam IFNγ ao serem incubadas junto com células-alvo HLA- A*02+ carregadas com o peptídeo SPINK2-001 ou com variantes do peptídeo SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina (Figu- ra 7) ou vários peptídeos cujas sequências apresentam alto grau de similaridade com SPINK2-001 (Figura 17). O peptídeo NYESO1-001 é usado com controle negativo. O TCR R44P3E7 possui EC50 de 0,86 nM (Figura 27). Exemplo 8: Receptor de células T R44P3E7
[00206] O TCR R49P2A7 (SEQ Nº 85 a 96) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Figura 18).
[00207] O R49P2A7 reconhece o SPINK2-001 especificamente, pois células T CD8+ humanas primárias tornam a expressar a libera- ção de IFNγ induzida pelo TCR ao serem incubadas junto com células- alvo HLA-A*02+ e se ligam a tetrâmeros de HLA-A*02 (Figura 31), respectivamente, carregados com o peptídeo SPINK2-001 ou com va- riantes de SPINK2-001 com substituições de alanina ou treonina (Figu- ra 8) ou com outros peptídeos que mostram elevado grau de seme- lhança com SPINK2-001 (Figura 18). O peptídeo NYESO1-001 é usa- do com controle negativo. O TCR R49P2A7 possui EC50 de 83,24 nM (Figura 28). Exemplo 9: Receptor de células T R55P1G7
[00208] O TCR R55P1G7 (SEQ Nº 97 a 108) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Fi- gura 19).
[00209] O R55P1G7 reconhece o SPINK2-001 especificamente, pois células T CD8+ humanas primárias tornam a expressar a libera- ção de IFNγ induzida pelo TCR ao serem incubadas junto com células- alvo HLA-A*02+ e se ligam a tetrâmeros de HLA-A*02 (Figura 31), respectivamente, carregados com o peptídeo SPINK2-001 ou com va- riantes de SPINK2-001 com substituições de alanina ou treonina (Figu- ra 9) ou com outros peptídeos que mostram elevado grau de seme- lhança com SPINK2-001 (Figura 19). O peptídeo NYESO1-001 é usa- do com controle negativo. O TCR R55P1G7 possui EC50 de 91,5 nM (Figura 29) e afinidade de 4,3 µM (R2 = 0,9765) (Figura 33).
[00210] Observou-se que células T CD8+ que expressam o TCR R55P1G7 possuem atividade contra células tumorais A375 que sobre- expressam SPINK2-001 (Figure 32), mas não contra linhagens de cé- lulas tumorais A375 do tipo selvagem. As células A375 expressam HLA-A2 endogenamente.
[00211] A ativação de células T durante cultivo simultâneo com li-
nhagens celulares que expressam HLA-A*02 e SPINK2-001 reflete o reconhecimento da apresentação endógena do pHLA (peptídeo apre- sentado em antígeno leucocitário humano) pelo TCR R55P1G7. Exemplo 10: Receptor de células T R59P2A7
[00212] O TCR R59P2A7 (SEQ Nº 109 a 120) é restrito em relação ao SPINK2-001 apresentado pelo HLA-A*02 (SEQ ID Nº 133) (Ver Fi- gura 20).
[00213] O R59P2A7 reconhece especificamente o SPINK2-001, pois células T CD8+ humanas primárias que tornam a expressar esse TCR liberam IFNγ ao serem incubadas junto com células-alvo HLA- A*02+ carregadas com o peptídeo SPINK2-001 ou com variantes do peptídeo SPINK2-001 com substituição por alanina ou treonina (Figu- ra 10) ou vários peptídeos cujas sequências apresentam alto grau de similaridade com SPINK2-001 (Figura 20). O peptídeo NYESO1-001 é usado com controle negativo. O TCR R59P2A7 possui EC50 de 0,86 nM (Figura 30).

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Construto reconhecedor de antígenos caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) 3 tendo pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111 e 117.
2. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o construto reconhece- dor de antígenos é capaz de se ligar específica ou seletivamente a um peptídeo antigênico de SPINK2-001.
3. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o construto reco- nhecedor de antígenos é um anticorpo, ou derivado ou fragmento do mesmo, ou um receptor de célula T (TCR) ou um derivado ou fragmen- to do mesmo.
4. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia α ou γ de TCR e/ou uma cadeia β ou δ de TCR, sendo que a cadeia α ou γ de TCR compreende um CDR3 tendo pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 3, 15, 27, 39, 51, 63, 75, 87, 99 e 111, e/ou onde as cadeias β ou δ de TCR compreendem um CDR3 tendo pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 9, 21, 33, 45, 57, 69, 81, 93, 105 e 117.
5. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cadeia α ou γ de TCR compreende ainda um CDR1 tendo pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as
SEQ ID Nºs 1, 13, 25, 37, 49, 61, 73, 85, 97 e 109 e/ou um CDR2 ten- do pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 2, 14, 26, 38, 50, 62, 74, 86, 98 e 110.
6. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia β ou δ de TCR compreende ainda um CDR1 tendo pelo menos 80% da identida- de de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 7, 19, 31, 43, 55, 67, 79, 91, 103 e 115 e/ou um CDR2 tendo pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 8, 20, 32, 44, 56, 68, 80, 92, 104 e 116.
7. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de cadeia variável de TCR tendo pelo menos 80% da identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as SEQ ID Nºs 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112 e 118.
8. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento ligante de um TCR, e sendo que o referido fragmento ligante compreende CDR1 a CDR3, selecionado opcional- mente dentre as sequências CDR1 a CDR3 tendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs 1, 2 e 3 ou 7, 8 e 9 ou 13, 14 e 15 ou 19, 20 e 21 ou 25, 26 e 27 ou 31, 32 e 33 ou 37, 38 e 39 ou 43, 44 e 45 ou 49, 50 e 51 ou 55, 56 e 57 ou 61, 62 e 63 ou 67, 68 e 69 ou 73, 74 e 75 ou 79, 80 e 81 ou 85, 86 e 87 ou 91, 92 e 93 ou 97, 98 e 99 ou 103, 104 e 105 ou 109, 110 e 111 ou 115, 116 e 117.
9. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia α ou β , um aminoácido na posição 44 segundo a numeração IMGT, é substituído por outro aminoácido apro- priado, melhorando assim a estabilidade e/ou o emparelhamento das referidas cadeias.
10. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica para um construto reconhecedor de antígenos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico como definido na reivindicação 10.
12. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que com- preende um construto reconhecedor de antígenos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou o ácido nucleico como defi- nido na reivindicação 10 ou o vetor como definido na reivindicação 11, opcionalmente a célula hospedeira é um linfócito, preferivelmente um linfócito T ou um precursor de linfócito T, mais preferivelmente, uma célula T positiva para CD4 ou para CD8.
13. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o construto reconhecedor de antígenos como defini- do em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou o ácido nucleico co- mo definido na reivindicação 10 ou o vetor como definido na reivindi- cação 11 ou a célula hospedeira como definida na reivindicação 12 e um veículo, estabilizador e/ou veículo farmaceuticamente aceitável.
14. Construto reconhecedor de antígenos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10 ou o vetor de acordo com a reivindicação 11 ou a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12 ou a composi- ção farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para uso em medicina, opcionalmente para uso no diag- nóstico, prevenção e/ou tratamento de uma doença proliferativa.
15. Método de fabricação de um construto reconhecedor de antígenos específico para AAT expressando a linhagem de célula, caracterizado pelo fato de que compreende: a. fornecimento de uma célula hospedeira apropriada; b. fornecimento de um construto genético compreendendo uma sequência codificadora que codifica o construto reconhecedor de antígenos como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9; c. introdução do referido construto genético na referida cé- lula hospedeira apropriada; d. expressão do referido construto genético pela referida célula hospedeira apropriada.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que compreende também o isolamento e a purificação do construto reconhecedor de antígenos a partir de uma célula hospe- deira apropriada e, opcionalmente, reconstituição do construto reco- nhecedor de antígenos em uma célula T.
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