TWI727182B

TWI727182B - 新型t細胞受體及其免疫治療

Info

Publication number: TWI727182B
Application number: TW107122290A
Authority: TW
Inventors: 克勞迪亞瓦那; 里歐尼艾爾頓; 賽巴斯汀邦克; 多明尼克馬友若
Original assignee: 德商英麥提克生物技術股份有限公司
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2021-05-11
Also published as: SG11201911437VA; CA3067757A1; MX2019015742A; AU2018293322A1; US20190002556A1; IL271751A; US10590194B2; BR112019025323A2; KR20200023288A; CR20190594A; TW201904989A; CN110753705A; WO2019002444A9; MA49503A; JP7235316B2; US11111294B2; WO2019002444A1; US10723796B2; US20210388079A1; CO2020000357A2

Abstract

本發明涉及針對腫瘤相關抗原 (TAA) 的抗原識別構建體，特別是 TAA 絲氨酸蛋白酶抑制劑 Kazal 2型 (SPINK2)。本發明特別提出了對本發明腫瘤表達抗原具有選擇性和特異性的新型 T 細胞受體 (TCR) 分子。本發明的 TCR 及其衍生的 SPINK2 結合片段可用於診斷、治療和預防表達 SPINK2 的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原識別構建體的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原識別構建體的重組細胞以及包含本發明化合物的藥物組合物。

Description

新型 T 細胞受體及其免疫治療

絲氨酸蛋白酶抑制劑 Kazal 2型 (SPINK2) 也稱為頂體酶-胰蛋白酶抑制劑，是人體中由 SPINK2 基因編碼的蛋白質。編碼的蛋白在生殖道中充當胰蛋白酶和頂體酶抑制劑且位於精子中。該蛋白與淋巴瘤進展有關。選擇性剪接形成多種轉錄物變體。

基於 T 細胞的免疫治療靶標代表作用于主要組織相容性複合體 (MHC) 分子呈遞的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。這些腫瘤相關抗原 (TAA) 可以是源自所有蛋白類型的肽，如酶、受體、轉錄因數等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。

細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的 T 細胞表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是 CD8 陽性 T 細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8⁺ 能識別通常 8 至 10 個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物 (DRiP) 的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體 (MHC) 所載的肽中所含的 I 類分子。人 MHC 分子也稱為人白細胞-抗原 (HLA)。

有兩個類型的MHC 分子：MHC I 類和 MHC II 類。肽和 MHC I 類的複合體由負載相應 T 細胞受體 (TCR) 的 CD8 陽性 T 細胞進行識別，而肽和 MHC II 類分子的複合體由負載相應 TCR 的 CD4 陽性輔助 T 細胞進行識別。由於 CD8 依賴型和 CD4 依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵腫瘤相關抗原和相應 T 細胞受體在開發癌症免疫治療（如：疫苗和細胞治療）中非常重要。

在 MHC I 類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些 MHC-I 類分子結合，而且它們之後還必須能被 T 細胞負載的特異性 T 細胞受體 (TCR) 識別。因此，TAA 是基於 T 細胞療法（包括但不限於腫瘤疫苗和細胞療法）研發的起點。

大約 90% 的外周血 T 細胞表達由 α 多肽和 β 多肽組成的 TCR。一小部分 T 細胞（約占總 T 細胞的 5%）表現出由 γ 多肽和 δ 多肽組成的 TCR。在被稱為上皮內淋巴細胞 (IEL) 的淋巴細胞群內，發現 γδ T 細胞在其腸道黏膜中豐度最高。啟動 γδ T 細胞的抗原性分子仍未廣為人知。但是，γδ T 細胞不是 MHC 限制性細胞，似乎能夠識別整個蛋白質，而不是要求肽在抗原呈遞細胞上由 MHC 分子呈遞，雖然有些識別 MHC IB 類分子。構成外周血中主要 γδ T 細胞群的人 Vγ9/Vδ2 T 細胞具有獨特性，它們特異性且快速地應答小非肽類微生物代謝物 HMB-PP（一種異戊烯基焦磷酸鹽前體）。可在健康供體外周血中發現的 T 細胞百分比估計如下：CD3+=70.78%±4.71；CD3+CD4=38.97%±5.66；CD3+CD8=28.955%±7.43；CD3+CD56+=5.22%±1.74；CD3−CD56+=10.305%±4.7；CD3+CD45RA=45.00%±7.19；CD3+CD45RO+=27.21%±7.34。

T 細胞克隆的 T 細胞抗原受體的鏈各自由指定可變 (V)、[多樣性 (D)]、連接 (J) 和恒定 (C) 結構域的獨特組合構成。在每個 T 細胞克隆中，α 和 β 鏈或 δ 和 γ 鏈的 V、D 和 J 結構域的組合以該 T 細胞克隆獨特特徵的方式參與抗原識別，並定義一個獨特的結合位點（也被稱為獨特型 T 細胞克隆）。而 C 結構域不參與抗原結合。

TCR 是免疫球蛋白超家族的異二聚體細胞表面蛋白，其與參與介導信號轉導的 CD3 複合體的不變蛋白質相關。TCR 以 αβ 和 γδ 形式存在，其結構相似，但解剖位置非常不同，也可能功能也非常不同。天然異二聚體 αβ TCR 和 γδTCR 的細胞外部分各自均由兩個多肽組成，每個多肽都有一個膜近端恒定結構域和一個膜遠端可變結構域。每個恒定和可變結構域都包括一個鏈內二硫鍵。可變結構域包含與抗體互補決定區 (CDR) 類似的高度多態性環。使用 TCR 基因療法可克服目前的一些障礙。它可讓患者自己的 T 細胞在短時間內具有所需的特異性並產生足夠數量的 T 細胞，從而避免其耗盡。TCR 將被轉導至中央記憶 T 細胞或具有幹細胞特徵的 T 細胞中，這可確保轉移時產生更好的持久性和功能。TCR 工程化 T 細胞將透過化學療法或照射被注入淋巴細胞減少的癌症患者，從而獲得有效的植入，但抑制免疫抑制。

雖然在開發用於癌症治療的分子靶向藥物方面取得了進展，但是，本領域仍然需要開發專門靶向作用於癌細胞高度特異性分子的抗癌新藥。本發明說明書透過提出新型 SPINK2-001 TCR、各自的重組 TCR 構建體、核酸、載體和與 TAA 表位特異性結合的公開宿主細胞來滿足此需求；以及使用這些分子治療癌症的方法。本發明背景中術語 TAA 特別涉及蛋白質 SPINK2，更優選涉及如本文其他地方所公開的表位 SPINK2-001。

抗原識別構建體

在第一方面，本發明的目的透過抗原識別構建體來解決，所述抗原識別構建體包含至少一個互補決定區 (CDR) 3，其與選自 SEQ ID NO 3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111 和 117 的氨基酸序列至少具有 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或優選為 100% 序列同一性。

在一些實施方案中，本發明的抗原識別構建體特異性結合 TAA -肽-HLA分子複合體，其中所述 TAA 肽包含 TAA 的變體或由 TAA 的變體組成，其至少 66%、優選至少 77%、更優選至少 88% 同源（優選為至少 77% 或至少 88% 相同），其中所述變體與 HLA I 類或 II 類分子結合和/或誘導與所述肽或其藥用鹽交叉反應的 T 細胞，其中所述肽不是潛在的全長多肽。

用於本文時，當在本文中用於兩個或更多個核酸或蛋白質/多肽序列背景下任何地方時，術語「相同」或「同一性」百分比是指兩個或更多個序列或子序列相同或具有（即，至少具有）特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸，所述氨基酸殘基或核苷酸透過使用序列比較演算法測量或人工比對和目視檢查相同（即，在指定區域中，當在比較視窗或指定區域上進行比較和比對以獲得最大對應性時，優選為在全長序列中，具有或至少具有約 60% 同一性，優選具有或至少具有 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93% 或 94% 同一性，更優選具有或至少具有約 95%、96%、97%、98%、99% 或更高的同一性）（例如參見 NCBI 網站）。在一項特定的實施方案中，例如，當將本發明的抗原識別構建體的蛋白質或核酸序列與另一種蛋白質/基因進行比較時，同一性百分比可透過 NCBI 網站支持的 Blast 搜索來確定；特別是用於確定氨基酸同一性時，使用含有以下參數的 BLASTP 搜索：預期閾值 10；字型大小：6；矩陣：BLOSUM62；空位罰分：存在：11，擴展：1；相鄰詞語閾值：11；成分調整：條件成分分數矩陣調整。

在本發明的背景下，應當理解的是，被稱為「包括」本發明某些特徵的任何實施方案應被理解為在一些更優選的實施方案中納入由本發明非常相同特徵「組成」或「基本上組成」的更加嚴格的描述。

在另一個附加或替代實施方案中，抗原識別構建體還可包含 CDR1 和/或 CDR2 結構域序列。在可變結構域內，CDR1 和 CDR2 位於多肽鏈的可變 (V) 區域，CDR3 包括一部分 V 區域、全部多樣性 (D) 區域和連接 (J) 區域。CDR3 是最可變的，是負責特異性和選擇性識別抗原的主要 CDR。CDR1 和 CDR2 序列可能選自人可變鏈等位基因的 CDR 序列。

天然 α-β 異二聚體 TCR 具有 α 鏈和 β 鏈。每個鏈都包括可變、連接和恒定區域，β 鏈通常還包括可變區和連接區之間的短多樣性區域，但是該多樣性區域常被視為連接區域的一部分。每個可變區都包括嵌入在框架序列中的三個 CDR（互補決定區），其中一個是稱為 CDR3 的高度可變區。存在幾種類型的 α 鏈可變 (Vα) 區和幾種類型的 β 鏈可變 (Vβ) 區，由其框架、CDR1 和 CDR2 序列及部分定義的 CDR3 序列區分。Vα 類型透過唯一的 TRAV 號在 IMGT 命名中提及，Vβ類型透過唯一的 TRBV 號被提及。關於免疫球蛋白抗體和 TCR 基因的更多資訊，參見國際免疫基因學資訊系統®，Lefranc MP 等人 (Nucleic Acids Res.2015 Jan;43(Database issue):D413-22; and http://www.imgt.org/)。

因此，在一個附加或替代實施方案中，本發明的抗原識別構建體包含如下文表 1 中所數的 CDR1、CDR2 和 CDR3 序列組合，其與 CDR3 序列一起顯示相應的可變鏈等位基因。因此，優選的是本發明的抗原識別構建體，其包含至少一個、優選為全部三個 CDR 序列 CDR1、CDR2 和 CDR3。優選情況是，本發明的抗原識別構建體包含本文公開的本發明的單個 TCR 可變區的各 CDR1 至 CDR3（參見下文表 1 和實施例章節）。

本文所用術語「特異性」或「抗原特異性」或「特異性針對」給定抗原系指當所述抗原由 HLA，優選為 HLA-A*02 呈遞時，抗原識別構建體可與所述抗原特異性結合，優選為 TAA 抗原，更優選為具有高親合力的抗原。例如，作為抗原識別構建體的 TCR 可視為對 TAA 具有「抗原特異性」，條件是在與使用低濃度 TAA 抗原，例如下文提出的 TAA表位（例如，約 10^-11 mol/l、10^-10 mol/l、10^-9 mol/l、10^-8 mol/l、10^-7 mol/l、10^-6 mol/l、10^-5 mol/l）脈衝處理的靶細胞共培養時，表達 TCR 並與呈遞 HLA 的 TAA接觸的 T 細胞分泌至少約 200 pg/ml 或以上（例如，250 pg/ml 或以上、300 pg/ml 或以上、400 pg/ml 或以上、500 pg/ml 或以上、600 pg/ml 或以上、700pg/ml 或以上、1000 pg/ml 或以上、2,000 pg/ml 或以上、2,500 pg/ml 或以上、5,000 pg/ml 或以上）的干擾素 γ (IFN-γ)。替代或附加情況是，如果表達 TCR 的 T 細胞在與低濃度 TAA 抗原脈衝的靶細胞共培養時分泌至少兩倍於 IFN-γ 未轉染背景水準的 IFN-γ，則認為 TCR 對 TAA 具有「抗原特異性」。如上所述的這種「特異性」可用 ELISA 進行分析。

在本發明的一個替代或附加實施方案中，抗原識別構建體選擇性地與 TAA 衍生的抗原性肽結合；優選其中 TAA 抗原性肽為具有以下表 2 所示氨基酸序列的蛋白質表位或肽或其變體，特別是抗原性肽為 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO:133)，其中所述變體氨基酸缺失、添加、插入或取代不超過三個、優選為兩個、最優選為不超過一個氨基酸位置。SPINK2-001 的優選變體如下表 2 所示。

術語「選擇性」或「選擇性識別/結合」被理解為是指抗原識別構建體（如 TCR 或抗體）的性質，選擇性地識別或結合至優選僅一個特異性表位，優選為與另一個表位沒有或基本上沒有交叉反應。優選情況為，術語「選擇性」或「選擇性識別/結合」是指抗原識別構建體（例如 TCR）選擇性地識別或結合優選僅一個特異性表位，且優選為與另一個表位沒有或基本上沒有交叉反應，其中所述表位對於一種蛋白質是獨特的，使得抗原識別構建體對另一種表位和另一種蛋白質沒有或基本上沒有交叉反應性。

根據本發明的抗原識別構建體優選為選自抗體或其衍生物或片段、或 T 細胞受體 (TCR) 或其衍生物或片段。本發明的抗體或 TCR 的衍生物或片段應優選為可保留母體分子的抗原結合/識別能力，特別是其如上所述的特異性和/或選擇性。此類結合功能可以透過如本文所定義的 CDR3 區的存在來保留。

在本發明的一實施方案中，本發明的 TCR 能夠以主要組織相容性複合體 (MHC) I 類依賴性方式識別 TAA 抗原。本文使用的「MHC I 類依賴性方式」系指在 MHC I 類分子的背景中在結合 TAA 抗原時 TCR 引起免疫應答。MHC I 類分子可以是本領域已知的任何 MHC I 類分子，例如 HLA-A 分子。在本發明的一項優先實施方案中，MHC I 類分子為 HLA-A*02 分子。

本發明提供單鏈抗原識別構建體和雙鏈識別構建體。

在一實施方案中，該 TCRα可變結構域具有至少一個與表 1 所示 TCRα結構域相關的突變；和/或該 TCRβ可變結構域具有至少一個與表 1 所示 TCRβ結構域相關的突變。在一實施方案中，TCRα可變結構域和/或TCRβ可變結構域中包含至少一個突變的 TCR 對於 TAA 肽 HLA 分子複合體的結合親和力和/或結合半衰期至少是包含未突變 TCRα結構域和/或未突變TCRβ可變結構域的 TCR 的兩倍。

本說明書的 TCR α鏈可能進一步包含 TCR α跨膜結構域和/或TCR α細胞內結構域。本說明書的 TCR β鏈可能進一步包含 TCR β跨膜結構域和/或TCR β細胞內結構域。

本發明特別提出一種作為抗原識別構建體或其片段或衍生物的 TCR。TCR 優選為人 TCR，其被理解為由人 TCR 基因座產生，因此包含人 TCR 序列。此外，本發明 TCR 的特徵在於它源自人，並且特異性地識別本發明的 TAA 抗原。

本發明的另一項實施方案另外提供上述抗原識別構建體，其誘導免疫應答，優選為其中免疫應答的特徵在於干擾素 (IFN) γ水準增加。

本發明的 TCR 可以為單鏈α或β，或γ和δ分子，或為由α和β鏈或γ和δ鏈兩者組成的雙鏈構建體。此外，如果在本發明背景中，本發明所述的給定 TCR 的任何一個、兩個或所有 CDR 區從一種 TCR 鏈類型移植到另一種 TCR 鏈類型中，則在一些實施方案中優選最初源自α鏈的此類 CDR 可以移植到γ或δ鏈中，和/或β鏈可以移植到γ或δ鏈骨架中。因此，如果以α/βTCR 的 CDR 序列開始，則可以用兩種方式獲得γ/δ TCR。一種方法是透過將 CDR 從α移植到γ框架中並從β移植到δ框架中。第二種方法，如上所述，透過將 CDR 從α移植到δ框架中，並從β移植到γ框架中。技術人員知道α/β和γ/δTCR 鏈之間框架區的相似性，因此，此類實施方案包括在本發明中（也參見 Lefranc M-P et al, Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43(Database issue):D413-22; and http://www.imgt.org/)。

本發明的抗原識別構建體可能包含 TCR α 或 γ 鏈；和/或 TCR β 或 δ 鏈；其中所述 TCR α 或 γ 鏈包含與選自 SEQ ID NO. 3、15、27、39、51、63、75、87、99 和 111 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR3，和/或其中所述 TCR β 或 δ 鏈包含與選自 SEQ ID NO. 9、21、33、45、57、69、81、93、105 和 117 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR3。

最優選地，在一些另外的實施方案中，其中本披露是指包含本文公開的 TCR 鏈的任何一個、兩個或全部 CDR1 至 CDR3 區的抗原識別構建體（參見表 1），此類抗原識別構建體可能為優選，其包含本發明相應的 CDR 序列，其不超過三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基。修飾的氨基酸殘基可能選自氨基酸插入、缺失或取代基。最為優先的情況是三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基為相應 CDR 序列的第一個或最後一個氨基酸殘基。如果修飾是取代，則在一些實施方案中優選取代為保守的氨基酸取代。

如果本發明的抗原識別構建體由至少兩個氨基酸鏈（如雙鏈 TCR 或其抗原結合片段）組成，則抗原識別構建體可能包含根據 SEQ ID NO: 3 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 9 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 15 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 21 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 27 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 33 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 39 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 45 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 51 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 57 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 63 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 69 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 75 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 81 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 87 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 93 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 99 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 105 的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據 SEQ ID NO: 111 的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據 SEQ ID NO: 117 的第二個多肽鏈氨基酸序列。上述任一雙鏈 TCR 或其抗原結合片段均是本發明的優選 TCR。在一些實施方案中，本發明雙鏈 TCR 的 CDR3 可能突變。如上所述的 CDR3 序列突變優選包括取代、缺失、添加或插入不超過 3 個、優選為 2 個、最優選為不超過 1 個氨基酸殘基。在一些實施方案中，第一個多肽鏈可能是 TCR α 或 γ 鏈，第二個多肽鏈可能是 TCR β 或 δ 鏈。優選為 αβ 或 γδ TCR 的組合。

在一些實施方案中，TCR 或其抗原結合片段由 TCR α 和 TCR β 鏈或 γ 和 δ 鏈組成。此類雙鏈 TCR 包括在每個鏈可變區內，並且各可變區包含一個 CDR1、一個 CDR2 和一個 CDR3 序列。TCR 包含 SEQ ID NO: 4 和 10；或 16 和 22；或 28 和 34；或 40 和 46；或 52 和 58；或 64 和 70；或 76 和 82；或 88 和 94；或 100 和 106；或 112 和 118 可變鏈氨基酸序列中所包含的 CDR1 至 CDR3 序列。

本發明的一些實施方案涉及由 TCR α 和 TCR β 鏈組成的 TCR 或其片段，其中所述 TCR 包含與選自分別根據 SEQ ID NO: 4 和 10；或 16 和 22；或 28 和 34；或 40 和 46；或 52 和 58；或 64 和 70；或 76 和 82；或 88 和 94；或 100 和 106；或 112 和 118 的 α和 β 鏈的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或優選為 100% 序列同一性的可變區序列。

本發明的 TCR 可以進一步包含源自任何合適物種的恒定區，如任何哺乳動物，例如：人、大鼠、猴、兔、驢或小鼠。在本發明的一項實施方案中，本發明的 TCR 進一步包含人恒定區。在一些優選實施方案中，本發明 TCR 的恒定區可例如透過引入異源序列、優選為小鼠序列來稍加修飾，這可能增加 TCR 的表達和穩定性。

本發明 TCR 可能進一步包括修飾的 T 細胞受體 (TCR) α或β鏈或包含該鏈的異二聚體，其中在所述修飾的α或β鏈的可變結構域中，根據 IMGT 編號第 44 位的氨基酸用另一種合適的氨基酸取代，以改善所需鏈的配對。根據所述重組 T 細胞受體 (TCR) 異二聚體的一實施方案，至少在α或 β鏈中，可變結構域第 44 位置處出現的氨基酸被選自氨基酸 Q、R、D、E、K、L、W 和 V 組成的組中的氨基酸取代。

根據另一實施方案，本發明的 TCR 還可能包括從以下列表中選擇的優選替換對之一： αQ44D/βQ44R; αQ44R/βQ44D; αQ44E/βQ44K; αQ44K/βQ44E; αQ44D/βQ44K; αQ44K/βQ44D; αQ44E/βQ44R; αQ44R/βQ44E; αQ44L/βQ44W; αQ44W/βQ44L; αQ44V/βQ44W; 和αQ44W/βQ44V; αW44D/βQ44R; αW44R/βQ44D; αW44E/βQ44K; αW44K/βQ44E; αW44D/βQ44K; αW44K/βQ44D; αW44E/βQ44R; αW44R/βQ44E; αW44L/βQ44W; αW44/βQ44L; αW44V/βQ44W; 和αW44/βQ44V; αH44D/βQ44R; αH44R/βQ44D; αH44E/βQ44K; αH44K/βQ44E; αH44D/βQ44K; αH44K/βQ44D; αH44E/βQ44R; αH44R/βQ44E; αH44L/βQ44W; αH44W/βQ44L; αH44V/βQ44W; 和αH44W/βQ44V; αK44D/βQ44R; αK44R/βQ44D; αK44E/βQ44K; αK44/βQ44E; αK44D/βQ44K; αK44/βQ44D; αK44E/βQ44R; αK44R/βQ44E; αK44L/βQ44W; αK44W/βQ44L; αK44V/βQ44W; 和αK44W/βQ44V; αE44D/βQ44R; αE44R/βQ44D; αE44/βQ44K; αE44K/βQ44E; αE44D/βQ44K; αE44K/βQ44D; αE44/βQ44R; αE44R/βQ44E; αE44L/βQ44W; αE44W/βQ44L; αE44V/βQ44W; 和αE44W/βQ44V; αQ44D/βR44; αQ44R/βR44D; αQ44E/βR44K; αQ44K/βR44E; αQ44D/βR44K; αQ44K/βR44D; αQ44E/βR44; αQ44R/βR44E; αQ44L/βR44W; αQ44W/βR44L; αQ44V/βR44W; 和αQ44W/βR44V; αW44D/βR44; αW44R/βR44D; αW44E/βR44K; αW44K/βR44E; αW44D/βR44K; αW44K/βR44D; αW44E/βR44; αW44R/βR44E; αW44L/βR44W; αW44/βR44L; αW44V/βR44W; 和αW44/βR44V; αH44D/βR44; αH44R/βR44D; αH44E/βR44K; αH44K/βR44E; αH44D/βR44K; αH44K/βR44D; αH44E/βR44; αH44R/βR44E; αH44L/βR44W; αH44W/βR44L; αH44V/ βR44W; 和αH44W/βR44V; αK44D/βR44; αK44R/βR44D; αK44E/βR44K; αK44/βR44E; αK44D/βR44K; αK44/βR44D; αK44E/βR44; αK44R/βR44E; αK44L/βR44W; αK44W/βR44L; αK44V/βR44W; 和αK44W/βR44V; αE44D/βR44; αE44R/βR44D; αE44/βR44K; αE44K/βR44E; αE44D/βR44K; αE44K/βR44D; αE44R/βR44E; αE44L/βR44W; αE44W/βR44L; αE44V/βR44W; 和αE44W/βR44V。

在上面的內容中，例如「αQ44R/βQ44D」是指：在α鏈的可變域中，Q44 被 R 取代，而在β鏈的可變域中，Q44 被 D 取代。

本發明的一些實施方案涉及由 TCR α 和 TCR β 鏈組成的 TCR 或其片段，其中所述 TCR 包含與選自分別根據 SEQ ID NO: 5 和 11；或 17 和 23；或 29 和 35；或 41 和 47；或 53 和 59；或 65 和 71；或 77 和 83；或 89 和 95；或 101 和 107；或 113 和 119 的 α和 β 鏈的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或優選為 100% 序列同一性的恒定區。

本發明的 TCR α 或 γ 鏈還可能包含與選自 SEQ ID NO.1、13、25、37、49、61、73、85、97 和 109 的氨基酸具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR1 和/或與選自 SEQ ID NO.2、14、26、38、50、62、74、86、98 和 110 的氨基酸具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR2。

根據本發明，TCR β 或 γ 鏈還可能包含與選自 SEQ ID NO. 7、19、31、43、55、67、79、91、103 和 115 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR1 和/或與選自 SEQ ID NO. 8、20、32、44、56、68、80、92、104 和 116 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR2。

在一項進一步的實施方案中，抗原識別構建體可能包含 TCR 的結合片段，並且其中所述結合片段包含一個 CDR1 至 CDR3 鏈，其或可選自具有 SEQ ID NO.1、2、3；或 7、8、9；或 13、14、15；或 19、20、21；或 25、26、27；或 31、32、33；或 37、38、39；或 43、44、45；或 49、50、51；或 55、56、57；或 61、62、63；或 67、68、69；或 73、74、75；或 79、80、81；或 85、86、87；或 91、92、93；或 97、98、99；或 103、104、105；或 109、110、111；或 115、116、117 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列。

在本發明的進一步實施方案中，本文其他地方所述的抗原識別構建體是由至少一個 TCR α 和一個 TCR β 鏈序列組成的 TCR 或其片段，其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:1 至 3 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCRβ 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:7 至 9 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:13 至 15 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:19 至 21 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:25 至 27 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:31 至 33 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:37 至 39 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:43 至 45 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:49 至 51 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:55 至 57 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:61 至 63 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:67 至 69 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:73 至 75 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:79 至 81 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:85 至 87 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:91 至 93 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:97 至 99 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:103 至 105 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:109 至 111 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:115 至 117 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列。

在本發明的進一步實施方案中，前文所述的抗原識別構建體是由至少一個 TCR α 和一個 TCR β 鏈序列組成的 TCR 或其片段，其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.4 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.10 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.16 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.22 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.28 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.34 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.40 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.46 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.52 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.58 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.64 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.70 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.76 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.82 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.88 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.94 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.100 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.106 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.112 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.118 的氨基酸序列的可變區序列。

在本發明的進一步實施方案中，前文所述的抗原識別構建體是 TCR 或其片段，其還包含與選自 ID NO.5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113 和 119 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 TCR 恒定區；優選地，其中 TCR 由至少一個 TCR α 和一個 TCR β 鏈序列組成，其中 TCR α 鏈序列包含與 SEQ ID NO.5、17、29、41、53、65、77、89、101 和 113 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的恒定區，並且其中 TCR β 鏈序列包含與 SEQ ID NO.11、23、35、47、59、71、83、95、107 和 119 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的恒定區。

此外，所披露的是前文所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 6 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 12 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。本發明還提出了 TCR，其包含與 SEQ ID No.18 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 24 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 30 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 36 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 42 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 48 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 54 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 60 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 66 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 72 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 78 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 84 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 90 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 96 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 102 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 108 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為 TCR 並且包含與 SEQ ID No. 114 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 120 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

本文所用的術語「鼠」或「人」在提及抗原識別構建體或 TCR 時，或本文所述的 TCR 的任何組分（例如，互補性決定區 (CDR)、可變區、恒定區，α 鏈和/或β 鏈）是指分別源自小鼠或人未經排列的 TCR 基因座的 TCR（或其組分）。

在本發明的一項實施方案中，提供了嵌合 TCR，其中所述 TCR 鏈包含來自多物種的序列。優選情況為，本發明的 TCR 可包含α鏈，其包含α鏈的人可變區和例如鼠 TCR α鏈的鼠恒定區。

在一項實施方案中，本發明的 TCR 是由根據上述實施方案的人可變區和人恒定區組成的人 TCR。

在一些實施方案中，抗原識別構建體被鼠源化或人源化。當將來自外來物種的氨基酸序列引入本發明的構建體時，使用這些術語。

本發明的 TCR 可能為單鏈 TCR (scTCR)。本發明的 scTCR 應在一個多肽鏈中包含全部或部分α鏈序列和全部或部分β鏈序列，優選為透過肽接頭連接。scTCR 可包含第一 TCR 鏈（例如，α 鏈）的可變區的多肽和整個（全長）第二 TCR 鏈（例如，β 鏈）的多肽，反之亦然。此外，scTCR 可以任選地包含一個或多個將兩個或多個多肽連接在一起的接頭。例如，接頭可以是肽，其將兩個單鏈連接在一起，如本文所述。還提供了本發明的 scTCR，其與人細胞因數如 IL-2、IL-7 或 IL-15 融合。

本發明的抗原識別構建體還可能以包含至少兩個 scTCR 分子的多聚複合體形式提供，其中所述 scTCR 分子各自與至少一種生物素部分或其他相互連接的分子/接頭融合，並且其中所述 scTCR 透過生物素-鏈黴親和素相互作用相互連接，以形成所述多聚體複合體。本領域已知的用於產生多聚體 TCR 的類似方法也是可能的並且包括在本披露資料中。還提出了更高級的多聚體複合體，其包含本發明兩種以上的 scTCR。

為了本發明的目的，TCR 是具有至少一個 TCR α 或γ 和/或 TCR β 或 δ 可變結構域的部分。通常，它們包括 TCRα可變結構域和 TCRβ可變結構域，或者 TCR γ可變結構域和 TCR δ可變結構域兩者。它們可能為αβ/γδ異源二聚體，也可能為單鏈形式。為了用於過繼療法，αβ或γδ異二聚體 TCR 可能例如被轉染為具有細胞質和跨膜結構域的全長鏈。如果需要，相應恒定結構域殘基之間可能存在引入的二硫鍵。

在一項優選的實施方案中，抗原識別構建體為人 TCR 或其片段或衍生物。人 TCR 或其片段或衍生物是一種 TCR，其包含超過 50% 的相應人 TCR 序列。優選情況為，只有少部分 TCR 序列為人工來源或源自其他物種。然而，眾所周知，例如，人源的嵌合 TCR 在恒定結構域含有鼠源序列是有利的。因此，特別優選的是根據本發明的 TCR，其在其恒定結構域的細胞外部分含有鼠序列。

因此，又為優選的是本發明的抗原識別構建體能夠以人白細胞抗原 (HLA) 依賴性方式、優選以 HLA-A*02 依賴性方式識別其抗原。在本發明的上下文中，術語「HLA 依賴性方式」系指抗原識別構建體僅在抗原肽由所述 HLA 呈遞的情況下才與抗原結合。

在一項實施方案中，根據本發明的抗原識別構建體優選為誘導免疫應答，優選為其中免疫應答的特徵在於干擾素 (IFN) γ 水準增加。

本發明還提出了包含本文所述的任何 TCR（或其功能變體）的功能部分的多肽，例如，選自實施例部分和表 1 中所述 R39P1C12、R39P1F5、R40P1C2、R41P3E6、R43P3G4、R44P3B3、R44P3E7、R49P2B7、R55P1G7 和 R59P2A7 中的任何一種 TCR。本文所用的術語「多肽」包括寡肽，並且系指透過一個或多個肽鍵連接的氨基酸的單鏈。關於本發明的多肽，功能部分可以是包含 TCR（或其功能變體）連續氨基酸的任何部分，其中部分條件是功能部分與 TAA 抗原特異性結合，優選為如表 2 中所公開，以及與肽 A2 至 A9 (SEQ ID NO:134-140) 和 T1 至 T9 (SEQ ID NO:141-149) 特異性結合。當使用與 TCR（或其功能變體）相關時，術語「功能部分」系指本發明 TCR（或其功能變體）的任何部分或片段，其中該部分或片段保留 TCR（或其功能變體）的生物活性，其為母體 TCR 或其親代功能變體的一部分。功能部分包括，例如，保留與 TAA 抗原特異性結合的能力（以 HLA 依賴性方式）或以與母體 TCR（或其功能變體）相似程度、相同程度或更高程度檢測、治療或預防癌症的 TCR（或其功能變體）的那些部分。關於母體 TCR（或其功能變體），功能部分可以包括，例如，約 10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95% 或更多母體 TCR 可變序列（或其功能變體）。

功能部分可以在該部分的氨基或羧基末端或兩個末端包含額外的氨基酸，其中在母體 TCR 或其功能變體的氨基酸序列中未發現額外的氨基酸。理想的情況是，額外的氨基酸不干擾功能部分的生物學功能，例如，特異性結合 TAA 抗原；和/或具有檢測癌症、治療或預防癌症等能力。更理想的是，與母體 TCR 或其功能變體的生物學活性相比，額外的氨基酸增強了生物學活性。

多肽可包含本發明 TCR 的 α 和 β 鏈的一個或兩個功能部分或其功能變體，例如包含本發明 TCR 的 α 和/或 β 鏈可變區的 CDR1、CDR2 和（優選）CDR3 之一或其功能變體的功能部分。在本發明的一項實施方案中，多肽可包含功能部分，其包含 SEQ ID NO:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111 和 117 的氨基酸序列（本發明 TCR 可變區的 CDR3）或其組合。在本發明的一項實施方案中，本發明的多肽可包括例如本發明 TCR 的可變區或其功能變體，其包含上述 CDR 區的組合。在這一點來說，多肽可包含 SEQ ID NO: 4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112 和 118 中的任一個氨基酸序列（本發明 TCR 的 α 或 β 鏈的可變區）。

在一些情況下，本發明的構建體可能包含一個或兩個多肽鏈，其包含根據 SEQ ID NO:1 至 120（CDR 序列，恒定和可變區和全長序列）中任一項的一個序列或其功能片段，並且進一步包含其他氨基酸序列，例如，編碼免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，則本發明的蛋白質可以是融合蛋白。就此而言，本發明還提供了包含本文所述的至少一種本發明的多肽與至少一種其他多肽的融合蛋白。其他的多肽可以作為融合蛋白的單獨多肽存在，或者可以作為與本文所述的本發明多肽之一框架（串聯）表達的多肽存在。其他多肽可包括任何肽或蛋白質分子或其部分，包括但不限於免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC 分子、CD1 分子（例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d 等）。

融合蛋白可以包含本發明多肽的一個或多個拷貝和/或另一個多肽的一個或多個拷貝。例如，融合蛋白可包含本發明多肽和/或另一多肽的 1、2、3、4、5 個或更多個拷貝。製備融合蛋白的合適方法是本領域已知的，並且包括例如重組方法。在本發明的一些實施方案中，本發明的 TCR（及其功能部分和功能變體）、多肽和蛋白質可以表達為單一蛋白，其包含連接 α 鏈和 β 鏈和連接 γ 鏈和 δ 鏈的連接肽。就此而言，本發明的 TCR（及其功能變體和功能部分）、多肽和蛋白質包含本發明 TCR 可變區的氨基酸序列，並且可能進一步包含接頭肽。接頭肽可以有利地促進宿主細胞中重組 TCR（包括其功能部分和功能變體）、多肽和/或蛋白質的表達。接頭肽可包含任何合適的氨基酸序列。單鏈 TCR 構建體的接頭序列是本領域公知的。此類單鏈構建體可進一步包含一個或兩個恒定結構域序列。在透過宿主細胞表達包括接頭肽的構建體後，接頭肽也可能被裂解，導致 α 和 β 鏈以及 γ 和 δ 鏈分離。

如上所述，本發明 TCR 的結合功能可能在抗體框架中提供。例如，本發明 TCR 的 CDR 序列，可能包括額外的 3 個、2 個或 1 個 N 和/或 C 末端框架殘基，可以直接接枝到抗體可變重/輕鏈序列中。本文中使用了各種語法形式的術語「抗體」，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結合位點或互補位的分子。此類分子也被稱為免疫球蛋白分子的「抗原結合片段」。本發明還提出了與本文所述的抗原特異性結合的抗體或其抗原結合部分。抗體可以是本領域已知的任何類型的免疫球蛋白。例如，抗體可以是任何同種型免疫球蛋白，例如 IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 等。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。抗體可以是天然存在的抗體，例如從哺乳動物（例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等）中分離和/或純化的抗體。或者，抗體可以是基因工程化抗體，例如人源化抗體或嵌合抗體。抗體可以是單體或聚合體形式。

術語「抗體」包括但不限於基因工程化或其他修飾形式的免疫球蛋白，例如內抗體、嵌合抗體、完全人抗體、人源化抗體（例如由「CDR 移植」產生）、抗體片段和異源偶聯抗體（例如雙特異性抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體等）。術語「抗體」包括 cys 雙價抗體和微型抗體。因此，本文提供的關於「抗體」或「抗體樣構建體」的每個實施方案也被視為雙特異性抗體、雙價抗體、scFv 片段、嵌合抗體受體 (CAR) 構建體，雙價抗體和/或微型抗體，除非另有明確表示。如本文所公開的，術語「抗體」包括免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，所述多肽能夠非共價、可逆地並以特異性方式結合相應的抗原，優選為本發明的 TAA。示例性抗體結構單元包括四聚體。在一些實施方案中，全長抗體可由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一個「輕」和一個「重」鏈（透過二硫鍵連接）。抗體結構和同種型是本領域技術人員所熟知的（例如，Janeway's Immunobiology, 9th edition, 2016 所述）。

公認的哺乳動物免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因（關於免疫球蛋白基因的更多資訊，參見國際免疫基因學資訊系統®，Lefranc M-P et al, Nucleic Acids Res.2015 Jan;43(Database issue):D413-22; and http://www.imgt.org/)。對於全長鏈，輕鏈被分為κ或λ類。對於全長鏈，重鏈分為γ、μ、α、δ或ε類，其又分別定義免疫球蛋白類別為 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。每個鏈的 N 末端限定了主要負責抗原識別的約 100 至 110 個或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈 (VL) 和可變重鏈 (VH) 分別指輕鏈和重鏈的這些區域。用於本發明時，「抗體」包括抗體及其片段的所有變體。因此，在該概念的範圍內，為具有相同、基本上相同或相似結合特異性的全長抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體 (scFv)、Fab、Fab' 和這些片段的多聚體形式（例如，F (ab') 2）。在一些實施方案中，抗體與本發明的肽 TAA 特異性結合。根據本發明的優選抗原識別構建體包括抗體重鏈，優選為其可變結構域，或其抗原結合片段和/或抗體輕鏈，優選為其可變結構域，或其抗原結合片段。類似地，二硫鍵穩定的可變區片段 (dsFv) 可以透過重組 DNA 技術製備，但本發明的抗體片段不限於這些示例性類型的抗體片段。此外，抗體或其抗原結合部分可以被修飾為包括可檢測的標記，例如放射性同位素、螢光團（例如，異硫氰酸螢光素 (FITC)，藻紅蛋白 (PE)）、酶（例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶）和元素顆粒（例如，金顆粒）。在某些情況下，與表 1 中 SEQ ID NO 中提供的 CDR3 序列相比，TCR CDR3序列可以略加修飾，但優選不超過 3 個氨基酸殘基，優選為僅兩個，最優選為僅一個氨基酸位置。優選地，抗體包含該 CDR3，優選為該組合中所有的 CDR1 至 CDR3 區，如表 1 中本發明的 TCR 所示，在每種情況下與這些序列相比，獨立地可選地具有不多於三個或兩個、優選為一個氨基酸取代、插入和/或缺失基。

製備抗體的合適方法是本領域已知的。例如，標準雜交瘤方法描述於例如，Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies:A Laboratory Manual, CSH Press (1988), and C.A. Janeway et al.(eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (201 1) 一文中。或者，其他方法，例如 EBV 雜交瘤方法（Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), 和 Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)）和噬菌體載體表達系統（參見例如，Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)）都是本領域已知的。此外，在非人動物中產生抗體的方法描述於例如美國專利 5,545,806、5,569,825 和 5,714,352 以及美國專利申請公開號 2002/0197266 中。

本發明的一些實施方案也涉及作為可溶性 TCR 的 TCR 或其功能片段和多肽。用於本文時，術語可溶性「T 細胞受體」系指天然 TCR 的異二聚體截短變體，其包含 TCR α鏈和β鏈的細胞外部分，例如，透過二硫鍵連接，但是其缺乏天然蛋白質的跨膜和胞質結構域。術語可溶性「T 細胞受體α鏈和可溶性 T 細胞受體β鏈序列」系指缺乏跨膜和胞質結構域的 TCR α 鏈和 β 鏈序列。可溶性 TCR α 鏈和 β 鏈的序列（氨基酸或核酸）可以與天然 TCR 中的相應序列相同，或者與相應的天然 TCR 序列相比，可以包含變體可溶性 TCR α 鏈和 β 鏈序列。本文所用的術語可溶性「T 細胞受體」包括具有變體或非變體可溶性 TCR α 鏈和 β 鏈序列的可溶性 TCR。這些變異可以在可溶性 TCR α 鏈和β 鏈序列的可變區或恒定區中，並且可以包括但不限於氨基酸缺失、插入、取代突變以及不改變氨基酸序列的核酸序列改變。在任何情況下本發明的可溶性 TCR 都保留其母體分子的結合功能。

上述問題透過編碼本發明抗原識別構建體的核酸或任何上述蛋白質或多肽構建體得以進一步解決。核酸優選為 (a) 具有編碼根據本發明的抗原識別構建體的鏈； (b) 具有與 (a) 中的鏈互補的鏈；或 (c) 具有在嚴格條件下與如 (a) 或 (b) 所述的分子雜交的鏈。嚴格條件是本領域技術人員已知的，具體來自 Sambrook 等人的「Molecular Cloning」一文。除此之外，核酸任選具有進一步的序列，其是表達對應於蛋白質的核酸序列所必需的，特別是用於在哺乳動物/人細胞中表達。使用的核酸可包含於適於允許在細胞中表達對應於該肽的核酸序列的載體中。然而，核酸也可用於轉化抗原呈遞細胞，其可能不限於經典的抗原呈遞細胞，例如樹突狀細胞，這樣，使得他們本身在其細胞表面上產生相應的蛋白質。

在一些實施方案中，抗原識別構建體的多肽可以由核酸編碼並在體內或體外表達。因此，在一些實施方案中，提出了編碼抗原識別構建體的核酸。在一些實施方案中，核酸編碼本發明抗原識別構建體的一個部分或單體（例如：本發明 TCR 的兩條鏈之一），和/或另一個核酸編碼本發明抗原識別構建體的另一部分或單體（例如：TCR 的兩條鏈中的另一條）。在一些實施方案中，核酸編碼兩個或更多個抗原識別構建體多肽鏈，例如，至少 2 個 TCR 鏈。編碼多個抗原識別構建體鏈的核酸可以包括至少兩個鏈序列之間的核酸切割位元點，可以編碼兩個或更多個鏈序列之間的轉錄或翻譯起始位點，和/或可以編碼兩個或更多個抗原識別構建體鏈之間的蛋白水解靶位點。

本文所用的「核酸」包括「多核苷酸」、「寡核苷酸」和「核酸分子」，通常是指可以為單鏈或雙鏈、合成或從自然資源中獲得（例如，分離和/或純化）的 DNA 或 RNA 聚合物，其可含有天然、非天然的或改變的核苷酸，並且可含有天然、非天然的或改變的核苷酸間連接子，例如氨基磷酸酯連接子或磷硫代磷酸酯連接子，而非未修飾寡核苷酸的核苷酸之間的磷酸二酯。

優選地，本發明的核酸為重組核酸。本文所用的術語「重組」系指 (i) 透過將天然或合成核酸區段連接到可在活細胞中複製的核酸分子而構建在活細胞外部的分子，或 (ii) 從複製上述 (i) 中所述內容而產生的分子。為了本文的目的，複製可以是體外複製，也可以是體內複製。核酸可包含編碼本文所述的任何 TCR、多肽或蛋白質或功能部分或其功能變體的任何核苷酸序列。

此外，本發明提出了包含如上所述的本發明核酸的載體。理想情況是，載體為表達載體或重組表達載體。術語「重組表達載體」在本發明背景下系指允許在合適宿主細胞中表達 mRNA、蛋白質或多肽的核酸構建體。本發明的重組表達載體可以是任何合適的重組表達載體，並可用於轉化或轉染任何合適的宿主。合適的載體包括設計用於繁殖和擴增或用於表達或兩者兼有的載體，例如質粒和病毒。動物表達載體的實例包括 pEUK-Cl、pMAM 和 pMAMneo。優選地，重組表達載體為病毒載體，例如，逆轉錄病毒載體。重組表達載體包括調節序列，例如轉錄和翻譯起始和終止密碼子，其特異於宿主細胞（例如，細菌、真菌、植物或動物）的類型，其中載體將被引入其中並且在其中可以進行本發明核酸的表達。此外，本發明的載體可能包括一個或多個標誌物基因，其允許選擇轉化或轉染的宿主。重組表達載體可包含與編碼本發明構建體的核苷酸序列或者與編碼本發明構建體的核苷酸序列互補或雜交的核苷酸序列在操作上可連接的天然或規範性啟動子。啟動子的選擇包括例如強、弱、誘導型、組織特異性和開發特異性啟動子。啟動子可以是非病毒啟動子，也可以是病毒啟動子。本發明的重組表達載體可以被設計用於暫態表達、穩定表達或兩者的表達。此外，重組表達載體可以用於組成型表達或誘導型表達。

本發明還涉及包含根據本發明的抗原識別構建體的宿主細胞。具體地，本發明的宿主細胞包含如上所述的核酸或載體。宿主細胞可以是真核細胞，例如植物、動物、真菌或藻類，也可以是原核細胞，例如細菌或原生動物。宿主細胞可以是培養細胞或原代細胞，即直接從生物體（例如人）分離。宿主細胞可以是貼壁細胞或懸浮細胞（即，在懸浮液中生長的細胞）。為了產生重組 TCR 、多肽或蛋白質的目的，宿主細胞優選為哺乳動物細胞。最優選地，宿主細胞為人細胞。雖然宿主細胞可以是任何細胞類型，可以來自任何類型的組織，可以是任何發育階段的細胞，但是宿主細胞優選為外周血白細胞 (PBL) 或外周血單核細胞 (PBMC)。更優選地，宿主細胞為 T 細胞。T 細胞可以是任何 T 細胞，諸如培養的 T 細胞，例如，原代 T 細胞或來自培養 T 細胞系的 T 細胞，例如 Jurkat、SupT1 等，或獲得自哺乳動物的 T 細胞，優選為來自人類患者的 T 細胞或 T 細胞前體。如果獲得自哺乳動物，T 細胞可從許多來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或液體。T 細胞還可以是富集或純化的。優選地，T 細胞為人 T 細胞。更優選地，T 細胞是分離自人的 T 細胞。T 細胞可以是任何類型的 T 細胞並且可以是任何發育階段的，包括但不限於 CD4 陽性和/或 CD8 陽性、CD4 陽性輔助 T 細胞，例如，Th1 和 Th2 細胞、CD8-陽性 T 細胞（例如，細胞毒性 T 細胞）、腫瘤浸潤細胞 (TIL) 、記憶 T 細胞、幼稚 T 細胞等。優選地，T 細胞為 CD8 陽性 T 細胞或 CD4 陽性 T 細胞。

優選地，本發明的宿主細胞為淋巴細胞，優選為 T 淋巴細胞，例如 CD4 陽性或 CD8 陽性 T 細胞。宿主細胞更優選為對表達 TAA 的腫瘤細胞特異性的腫瘤反應性 T 細胞。

本發明的目的還透過製備 TAA 特異性抗原識別構建體或 TAA 特異性抗原識別構建體表達細胞系的方法來解決，包括 a. 提出合適的宿主細胞， b. 提供一種基因構建體，其包含編碼根據本發明公開的抗原識別構建體的編碼序列， c. 引入所述合適的宿主細胞、所述基因構建體，和 d. 由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。

所述方法可能進一步包括在所述合適宿主細胞上進行細胞表面呈遞所述抗原識別構建體的步驟。

在其他優選的實施方案中，所述基因構建體是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。

優選地，所述抗原識別構建體來源於哺乳動物，優選來源於人。用於本發明方法的優選合適宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如人細胞，特別是人 T 淋巴細胞。用於本發明的 T 細胞在上文中進行了詳細描述。

本發明還包括實施方案，其中所述抗原識別構建體為修飾的 TCR，其中所述修飾是加入功能結構域，諸如標記物或治療活性物質。此外，包括具有可選結構域的 TCR，諸如可選膜錨定結構域而不是內源性跨膜區。

理想情況是，用於將基因構建體引入所述合適宿主細胞的轉染系統為逆轉錄病毒載體系統。此類系統是本領域技術人員所熟知的。

本發明還包括在一項實施方案中，從細胞中分離和純化抗原識別構建體的另外的方法步驟，以及任選地在 T 細胞中重構經翻譯的抗原識別構建體片段。

本發明的另一方面提出了透過產生 T 細胞受體 (TCR) 的方法獲得的或可獲得的 T 細胞，其中 T 細胞受體 (TCR) 對於腫瘤細胞具有特異性並且具有如上所述的高親合力。此類 T 細胞取決於本發明方法中使用的宿主細胞，例如人或非人 T 細胞，優選為人 TCR。

本文中在多肽（例如：抗原識別構建體（其實例可以是抗體））背景下使用的術語「分離」是指從蛋白質或多肽或其他污染物純化的多肽，未經純化會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途。根據本發明的抗原識別構建體可以是重組、合成或修飾（非天然）抗原結合構建體。本文中在多核酸或細胞背景下使用的術語「分離」是指從 DNA、RNA、蛋白或多肽或其他污染物（例如其他細胞）純化的核酸或細胞，未經純化會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途，或者是指重組、合成或修飾（非天然）核酸。在此背景中，「重組」蛋白/多肽或核酸是使用重組技術製備的。產生重組核酸和蛋白的方法和技術是本領域熟知的。治療方法和疾病

本發明的另一方面涉及本文公開的用於藥物中的抗原識別構建體、核酸、載體、藥物組合物和/或宿主細胞。在一項優選實施方案中在藥物中的用途包括在診斷、預防和/或治療諸如惡性或良性腫瘤疾病等腫瘤疾病中的用途。腫瘤疾病為，例如，在所述腫瘤疾病的癌細胞或腫瘤細胞中以表達 TAA 為特徵的腫瘤疾病。

關於根據本公開資料的抗原識別構建體和由其衍生的、與其相關的或編碼所述構建體的其他材料的上述醫療應用，待治療和/或診斷的疾病可以為任何增殖性疾病，優選為其特徵在於表達本發明的 TAA 或 TAA 表位序列，例如，所述疾病可以為任何癌症，包括以下癌症中任一種：急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞癌、結腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸類癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌、腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優選的癌症為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。特別優選的癌症為 TAA 陽性癌症，優選包括淋巴瘤。

本發明的構建體、蛋白質、TCR 抗體、多肽和核酸特別用於免疫治療，優選用於過繼性 T 細胞治療。本發明化合物的給藥可以，例如，涉及將本發明的 T 細胞輸注入所述患者體內。優選地，此類 T 細胞為患者的自體 T 細胞，並且用本發明的核酸或抗原識別構建體在體外轉導。

本發明的抗原識別構建體、 TCR、多肽、蛋白質（包括其功能變體）、核酸、重組表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）以下統稱為「本發明的 TCR 材料」，可以配製成組合物，諸如藥物組合物。就此而言，本發明提出了一種藥物組合物，其包含本文所述的任意抗原識別構建體、TCR、多肽、蛋白質、功能部分、功能變體、核酸、表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）以及藥用載體、賦形劑和/或穩定劑。含有任何本發明 TCR 材料的本發明藥物組合物可包含多於一種本發明的 TCR 材料，例如，多肽和核酸，或兩種或更多種不同的 TCR（包括功能部分及其功能變體）。或者，藥物組合物可包含與另一種藥物活性劑或藥物組合的本發明 TCR 材料，諸如，化學治療劑，例如，天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春花堿、長春新堿等。優選地，載體為藥用載體。關於藥物組合物，載體可以是常規用於所考慮的本發明的特定 TCR 材料的任意載體。這些藥用載體是本領域技術人員所熟知的，並且是公眾容易獲得的。優選情況是，藥用載體是在使用條件下無有害副作用或毒性的一種載體。

因此，本還提出了一種藥物組合物，其包含本文所述的本發明的任何產品和本發明的任何 TCR 材料，特別是任何蛋白質、核酸或宿主細胞。在一項優選的實施方案中，藥物組合物用於免疫治療，優選為繼代細胞治療。

優選地，本發明的 TCR 材料透過注射施用，如，靜脈內施用。當本發明的 TCR 材料為表達本發明 TCR（或其功能變體）的宿主細胞時，用於注射的細胞藥用載體可能包括任何等滲載體，例如，生理鹽水（水中含有約 0.90%w/v 的 NaCl、水中含有約 300mOsm/L NaCl、或每升水中含有約 9.0g NaCl）、NORMOSOL R 電解質溶液 (Abbott, Chicago, IL)、PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL)、水中含約 5% 葡萄糖或林格氏乳酸鹽。在一項實施方案中，藥用載體用人血清白蛋白補充。

為了本發明的目的，施用本發明 TCR 材料的數量或劑量（例如，當本發明 TCR 材料為一個或多個細胞時的細胞數量）可能在合理時間框架內在受試者或動物中足以影響治療或預防反應。例如，本發明 TCR 材料的劑量應該自施用起約 2 個小時或更長時間（例如，12 至 24 小時）或更多小時的期間內與癌症抗原結合或檢測、治療或預防癌症。在某些實施方案中，時間可能更長。劑量將由本發明特定 TCR 材料的療效和動物（例如，人）的狀況以及待治療動物（例如，人）的體重決定。

預期本發明的藥物組合物、抗原識別構建體、TCR（包括其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞或細胞群可用於癌症或 TAA 陽性癌前病變的治療或預防方法。本發明的 TCR（及其功能變體）被認為可與本發明的 TAA 特異性結合，使得 TCR（或本發明相關多肽或蛋白質及其功能變體）由細胞（如 T 細胞）表達或在細胞上表達時能夠介導針對表達本發明 TAA 的靶細胞的免疫應答，優選為經由 MHC I 或 II 在所述靶細胞的表面上呈遞 TAA 肽。就此而言，本發明提出了哺乳動物中病症（特別是癌症）的治療或預防方法，包括向哺乳動物施用任何藥物組合物、抗原識別構建體，特別是 TCR（及其功能變體）、多肽或本文所述的蛋白質、任何核酸或重組表達載體，其包含編碼本文所述的任何 TCR（及其功能變體）、多肽、蛋白質的核苷酸序列或包含核酸或重組載體的任何宿主細胞或細胞群，該重組載體編碼本文所述的本發明的任何構建體（及其功能變體）、多肽或蛋白質，用量為有效治療或預防哺乳動物中病症的量，其中所述病症為癌症，如表達本發明 TAA 的癌症。

可用于本發明的藥用載體或稀釋劑的實例包括諸如 SPGA、碳水化合物（例如，山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）等穩定劑，諸如白蛋白或酪蛋白等蛋白質，諸如牛血清或脫脂牛奶和緩衝液（例如，磷酸鹽緩衝液）等含蛋白製劑。

本文中所用的術語「治療」和「預防」以及源自這些術語的詞語並不一定意味著 100% 或完全治療或預防。相反，存在不同程度的治療或預防，而本領域普通技術人員認識到具有潛在的益處或治療效果。就此而言，本發明的方法可為哺乳動物的病症提供任何治療或預防水準的任意量。此外，本發明方法提出的治療或預防可包括待治療或預防病症（例如，癌症）的一種或多種病症或症狀的治療或預防。例如，治療或預防可以包括促進腫瘤消退。此外，為了本文之目的，「預防」可以包括推遲疾病或其症狀或病症的發作。

本發明還涉及一種治療癌症的方法，其包括與至少一種化學治療劑和/或放射治療組合施用本說明書的 TCR、核酸或宿主細胞。

本發明的另一方面進一步涉及在（生物）樣本（例如從受試者或患者獲得的樣本）中檢測 TAA 蛋白或 MHC 與 TAA 蛋白（TAA 的蛋白表位）的複合體的一種方法，包括使樣本與特異性結合所述 TAA 肽或 TAA 肽/MHC 複合體的抗原識別構建體接觸，並檢測所述抗原識別構建體和所述 TAA 肽之間或與 TAA 肽/MHC 複合體之間的結合情況。在一些實施方案中，抗原識別構建體是根據本文所述發明的 TCR 或抗體或類似構建體，或優選為抗原識別構建體。在一些實施方案中，（生物）樣本為腫瘤或癌症樣本（如：本文別處所述的那些樣本中的一種），例如，包含腫瘤或癌細胞的樣本。

還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括： a) 從所述受試者中分離細胞； b) 用編碼本發明的抗原識別構建體的至少一種載體轉化細胞以產生轉化的細胞； c) 擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d) 將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括： a) 從健康供體中分離細胞； b) 用編碼本發明的抗原識別構建體的一種載體轉化細胞以產生轉化的細胞； c) 擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d) 將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

還提出了一種檢測生物樣本中癌症的方法，包括： a) 使生物樣本與本說明書的抗原識別構建體接觸； b) 檢測抗原識別構建體與生物樣本的結合情況。

在一些實施方案中，檢測癌症的方法在體外、體內或原位進行。

還提出了檢測哺乳動物中有無病症的方法。該方法包括 (i) 將包含哺乳動物一種或多種細胞的樣本接觸本發明的任何 TCR（及其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結合部分或本文所述的藥物組合物，從而形成複合體，並包括檢測複合體，其中所述複合體的檢測提示哺乳動物中是否存在病症，其中所述病症為癌症，諸如表達 TAA 的惡性疾病。

關於檢測哺乳動物疾病的本發明方法，細胞樣本可以是包含全細胞、其裂解物或全部細胞裂解物的一部分的樣本，例如核或細胞質級分、全蛋白質級分或核酸級分。

為了本發明的檢測方法之目的，所述接觸可以在哺乳動物體外或體內進行。優選情況是，接觸在體外進行。

此外，複合體的檢測可以透過本領域已知的任何方式進行。例如，本文所述的本發明抗原識別構建體（及其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群或抗體或 TCR 或其抗原結合部分可以用檢測到的標記（諸如，放射性同位素、螢光團（例如，異硫氰酸螢光素 (FITC)、藻紅蛋白 (PE) ）、酶（例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶）和元素顆粒（例如，金顆粒）進行標記。

為了本發明方法之目的，其中施用宿主細胞或細胞群，所述細胞可以是與哺乳動物同種異體或自體的細胞。優選情況是，細胞為哺乳動物自體細胞。

關於本發明 TCR 材料的上述醫療用途，待治療和/或診斷的癌症可以為任何癌症，包括以下癌症中任一種：急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞癌、結腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸類癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌、腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優選的癌症為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。特別優選的癌症為 TAA 陽性癌症，如：Spink2 陽性淋巴瘤。

總體上，本發明提出了患有腫瘤或腫瘤疾病的受試者的治療方法，其包括施用本發明公開的抗原識別構建體、核酸、載體、藥物組合物和/或宿主細胞。優選地，所述受試者為需要這種治療的受試者。優選實施方案中的受試者為患有 TAA 陽性的腫瘤或腫瘤疾病的哺乳動物受試者，優選為人類患者。

鑒於本文的公開內容，將理解本發明還涉及以下項目：

第 1 項：一種抗原識別構建體，其包含至少一個互補決定區 (CDR) 3，其與選自 NO.3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111 和 117 的氨基酸序列至少具有 50% 的序列同一性。

第 2 項：根據第 1 項的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體能夠特異性地和/或選擇性地與本發明抗原肽的 TAA 結合。

第 3 項：根據第 1 或 2 項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一種抗體或其衍生物或片段、或一種 T 細胞受體 (TCR) 或其衍生物或片段。

第 4 項：根據第 1 至 3 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體與呈遞 TAA 抗原肽的人白細胞抗原 (HLA) 結合，其中所述 HLA 任選為 A2 型。

第 5 項：根據第 1 至 4 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體特異性地和/或選擇性地結合具有選自SEQ ID NO:133 至 158 的氨基酸序列的表位。

第 6 項：根據第 1 至 5 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為α/β-TCR，或其片段或衍生物，或所述構建體為 γ/δ-TCR，或其片段或衍生物。

第 7 項：根據第 1 至 6 項中任一項所述的抗原識別構建體，其特徵在於，所述構建體是人源並特異性地和/或選擇性地識別 TAA 抗原肽。

第 8 項：根據第 1 至 7 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體能夠在受試者中誘導免疫應答，任選其中所述免疫應答的特徵在於干擾素 (IFN) γ 水準增加。

第 9 項：根據第 1 至 8 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含 TCRα 或 γ 鏈；和/或 TCR β 或 δ 鏈；其中所述 TCR α 或 γ 鏈包含與選自 SEQ ID NO. 3、15、27、39、51、63、75、87、99 和 111 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR3，和/或其中所述 TCR β 或 δ 鏈包含與選自 SEQ ID NO. 9、21、33、45、57、69、81、93、105 和 117 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR3。

第 10 項：根據第 9 項中所述的抗原識別構建體，其中 TCR α 或 γ 鏈進一步包含與選自 SEQ ID NO.1、13、25、37、49、61、73、85、97 和 109 的氨基酸具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR1 和/或與選自 SEQ ID NO.2、14、26、38、50、62、74、86、98 和 110 的氨基酸具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR2。

第 11 項：根據第 9 或 10 項中所述的抗原識別構建體，其中 TCR β 或 γ 鏈進一步包含與選自 SEQ ID NO. 7、19、31、43、55、67、79、91、103 和 115 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR1 和/或與選自 SEQ ID NO. 8、20、32、44、56、68、80、92、104 和 116 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 CDR2。

第 12 項：根據第 1 至 11 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與選自 SEQ ID NO.4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112 和 118 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 TCR 可變鏈區。

第 13 項：根據第 1 至 12 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體被人源化、嵌合化和/或鼠源化。

第 14 項：根據第 1 至 13 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含 TCR 的結合片段，並且其中所述結合片段包含 CDR1 至 CDR3，其或可選自具有 SEQ ID NO.1、2、3；或 7、8、9；或 13、14、15；或 19、20、21；或 25、26、27；或 31、32、33；或 37、38、39；或 43、44、45；或 49、50、51；或 55、56、57；或 61、62、63；或 67、68、69；或 73、74、75；或 79、80、81；或 85、86、87；或 91、92、93；或 97、98、99；或 103、104、105；或 109、110、111；或 115、116、117 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列。

第 15 項：根據第 1 至 14 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為由至少一個 TCR α 和一個 TCR β 鏈序列組成的 TCR 或其片段，其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:1 至 3 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:7 至 9 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:13 至 15 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:19 至 21 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:25 至 27 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:31 至 33 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:37 至 39 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:43 至 45 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCRα 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:49 至 51 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCRβ 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:55 至 57 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:61 至 63 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:67 至 69 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:73 至 75 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:79 至 81 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:85 至 87 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:91 至 93 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:97 至 99 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:103 至 105 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:109 至 111 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列，所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID NO:115 至 117 的氨基酸序列的 CDR1 至 CDR3 序列。

第 16 項：根據第 1 至 15 項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為由至少一個 TCRα 和一個 TCRβ 鏈序列組成的 TCR 或其片段，其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.4 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.10 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.16 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.22 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.28 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.34 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.40 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.46 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.52 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.58 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.64 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.70 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.76 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.82 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.88 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.94 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.100 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.106 的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述 TCR α 鏈序列包含具有 SEQ ID No.112 的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述 TCR β 鏈序列包含具有 SEQ ID No.118 的氨基酸序列的可變區序列。

第 17 項：根據第 1 至 16 項中任一項的抗原識別構建體是 TCR 或其片段，其還包含與選自 ID NO.5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113 和 119 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80、90%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的 TCR 恒定區；優選地，其中 TCR 由至少一個 TCRα 和一個 TCRβ 鏈序列組成，其中 TCRα 鏈序列包含與 SEQ ID NO.5、17、29、41、53、65、77、89、101 和 113 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的恒定區，並且其中 TCRβ 鏈序列包含與 SEQ ID NO.11、23、35、47、59、71、83、95、107 和 119 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的恒定區。

第 18 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 6 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 12 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 19 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 18 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 24 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 30 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 36 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20b 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 42 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 48 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20c 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 54 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 60 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20d 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 66 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 72 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20e 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 78 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 84 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20f 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 90 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 96 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20g 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 102 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 108 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 20h 項：根據第 1 至 17 項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與 SEQ ID No. 114 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第一個 TCR 鏈，以及與 SEQ ID No. 120 的氨基酸序列具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99% 或 100% 序列同一性的第二個 TCR 鏈。

第 21 項：一種核酸，其編碼根據第 1 至 20 項中任一項的抗原識別構建體。

第 22 項：一種載體，其包含根據第 21 項所述的核酸。

第 23 項：一種宿主細胞，其包含根據第 1 至 20 項中任一項所述的抗原識別構建體或根據第 21 項所述的核酸或根據第 22 項所述的載體。

第 24 項：根據第 23 項所述的宿主細胞，其中所述細胞為淋巴細胞，優選為 T 淋巴細胞或 T 淋巴細胞祖細胞，更優選為 CD4 或 CD8 陽性 T 細胞。

第 25 項：一種藥物組合物，其包含根據第 1 至 20 項中任一項所述的抗原識別構建體，或根據第 21 項所述的核酸，或根據第 22 項所述的載體，或根據第 23 或 24 項所述的宿主細胞，以及藥用載體、穩定劑和/或賦形劑。

第 26 項：根據第 1 至 20 項中任一項所述的抗原識別構建體，或根據第 21 項所述的核酸，或根據第 22 項所述的載體，或根據第 23 或 24 項所述的宿主細胞，或根據第 25 項用於藥物的藥物組合物。

第 27 項：抗原識別構建體或核酸或載體或宿主細胞或藥物組合物根據第 26 項所述的用途，在診斷、預防和/或治療增殖性疾病的用途，其中所述疾病包括惡性或良性腫瘤疾病。

第 28 項：抗原識別構建體或核酸或載體或宿主細胞或藥物組合物根據第 27 項所述的用途，其中所述腫瘤疾病的特徵在於 TAA 在腫瘤疾病的腫瘤細胞中表達。

第 29 項：抗原識別構建體或核酸或載體或宿主細胞或藥物組合物根據第 26 至 28 項中任一項所述的用途，其中所述在藥物中的用途是在免疫治療中的用途，任選地包含過繼細胞轉移，其中所述免疫治療包括過繼自體或異源 T 細胞治療。

第 30 項：一種製備表達細胞系的 TAA 特異性抗原識別構建體的方法，包括 a.提出合適的宿主細胞， b. 提出一種遺傳構建體，其包含編碼根據第 1 至 20 項中任一項所述的抗原識別構建體的編碼序列， c. 引入所述合適的宿主細胞、所述遺傳構建體， d. 由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。

第 31 項：根據第 30 項所述的方法，還包括所述抗原識別構建體的細胞表面呈遞。

第 32 項：根據第 30 或 31 項所述的方法，其中所述遺傳構建體是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。

第 33 項：根據第 30 至 32 項中任一項所述的方法，其中所述抗原識別構建體為哺乳動物來源，優選為人來源。

第 34 項：根據第 30 至 33 項中任一項所述的方法，其中所述合適的宿主細胞為哺乳動物細胞，其任選地選自人細胞或人 T 淋巴細胞。

第 35 項：根據第 30 至 34 項中任一項所述的方法，其中所述抗原識別構建體為修飾的 TCR，其中所述修飾包括添加包含標記的功能結構域或包含膜錨定結構域的可選結構域。

第 36 項：根據第 35 項所述的方法，其中所述抗原識別構建體為α/βTCR、γ/δTCR 或單鏈 TCR (scTCR)。

第 37 項：根據第 30 至 36 項中任一項所述的方法，其中所述遺傳構建體透過逆轉錄病毒轉染被導入所述合適的宿主細胞。

第 38 項：根據第 30 至 37 項中任一項所述的方法，進一步包括從合適的宿主細胞分離和純化所述抗原識別構建體，或在 T 細胞中重構所述抗原識別構建體。

表 1 ：本發明的 TCR 序列

表 2 ：本發明的肽序列

實施例

從健康供體的 T 細胞中分離和擴增十種 SPINK2-001 特異性 TCR（R39P1C12、R39P1F5、R40P1C2、R41P3E6、R43P3G4、R44P3B3、R44P3E7、R49P2B7、R55P1G7 和 R59P2A7，參見表 1），每種編碼腫瘤特異性 TCR-α 和 TCR-β 鏈。根據之前描述的方法 (Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15;171(10):4974-8) 體外刺激來自健康供體的細胞，靶標特異性細胞使用 HLA-A*02 多聚體進行單細胞分選，然後進行隨後的 TCR 分離。例如根據 Green 和 Sambrook 所著的分子克隆實驗室手冊第四版所述的標準方法透過 5' RACE 分離 TCR 序列。對 TCR R39P1C12、R39P1F5、R40P1C2、R41P3E6、R43P3G4、R44P3B3、R44P3E7、R49P2B7、R55P1G7 和 R59P2A7 的 α 和 β 可變區進行測序，並透過基因合成產生表達構建體用於進一步的功能表征。

R41P3E6、R43P3G4、R55P1G7 和 R59P2A7 來自 HLA-A*02 陰性供體（同種反應性環境），R39P1C12、R39P1F5、R40P1C2、R44P3B3、R44P3E7 和 R49P2B7 來自 HLA-A*02 陽性供體。

相關 TCR，例如透過 mRNA 電穿孔，在人 T 細胞中表達。在用不同靶細胞（例如載有不同肽的 T2 細胞）以及腫瘤細胞系共培養後，評估 T 細胞的 IFN-γ 釋放情況。對於 T 細胞活化，資料以絕對 IFN-γ 水準或背景減除數據顯示，如下所示。例如，透過使用不同腫瘤細胞系作為靶細胞的 T 細胞活化研究（IFNγ 釋放）測定表達 TCR R55P1G7 和 R44P3B3 的 CD8+ T 細胞的療效。

IFNγ釋放的背景減除方法：平均值_{bg (TCRoi; co)} = [平均值_{(TCRoi; co)} -平均值_(TCRoi; _僅效應子 ₎ ]-[平均值₍ _模擬 _{; co)} -平均值₍ _{模擬；僅效應子} ₎ ]

計算各自的 SD_bg ： SD_{bg (TCRoi; co)} = [SD_{(TCRoi; co)} ² + SD_(TCRoi; _僅效應子 ₎ ² + SD₍ _模擬 _;co) ² + SD₍ _{模擬；僅效應子} ₎ ² ]^{^[1/2]} TCRoi = 表達相關 TCR 的相應細胞模擬 = 無外源 TCR 表達的效應細胞 Co = 與靶細胞共培養的效應細胞僅效應子 = 未共培養的效應細胞平均值_(bg) = 平均 IFNγ釋放（背景減除） SD_(bg) = 標準偏差（背景減除）

根據先前描述的方法 (Willcox BE et al., 1999 Protein Sci., Nov;8(11):2418-23) 對表達為可溶性 TCR 的 SPINK2-001 TCR 和 HLA-A*02/SPINK2-001 複合體的 BLI（生物層干涉測量法）結合力分析用於親和力測定。1G4 TCR 和 HLA-A*02/NYESO1-001 的 BLI 結合資料用作對照。實施例 1 ： T 細胞受體 R39P1C12

TCR R39P1C12 (SEQ ID NO:1-12) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 11）。

R39P1C12 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ，其載有SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 1）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 11）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R39P1C12 的 EC₅₀ 為 0.81 nM（圖 21），親和力為 18 µM (R² =0.9956)（圖 33）。實施例 2 ： T 細胞受體 R39P1F5

TCR R39P1F5 (SEQ ID NO:13-24) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 12）。

R39P1F5 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ，其載有SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 2）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 12）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R39P1F5 的 EC₅₀ 為 1.52 nM（圖 22），親和力為 34 µM (R² =0.9962)（圖 33）。實施例 3 ： T 細胞受體 R40P1C2

TCR R40P1C2 (SEQ ID NO:25-36) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 13）。

R40P1C2 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ，其載有SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 3）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 13）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R40P1C2 的 EC₅₀ 為 1.94 nM（圖 23）。實施例 4 ： T 細胞受體 R41P3E6

TCR R41P3E6 (SEQ ID NO:37-48) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 14）。

R41P3E6 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ 並分別與 HLA-A*02 四聚體結合（圖 31），其載有 SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 4）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 14）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R41P3E6 的 EC₅₀ 為 1.03 nM（圖 24），親和力為 13 µM (R² =0.9892)（圖 33）。實施例 5 ： T 細胞受體 R43P3G4

TCR R43P3G4 (SEQ ID NO:49-60) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 15）。

R43P3G4 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ，其載有SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 5）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 15）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R43P3G4 的 EC₅₀ 為 1.34 nM（圖 25）。實施例 6 ： T 細胞受體 R44P3B3

TCR R44P3B3 (SEQ ID NO:61-72) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 16）。

R44P3B3 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ 並分別與 HLA-A*02 四聚體結合（圖 31），其載有 SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 6）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 16）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R44P3B3 的 EC₅₀ 為 1.06 nM（圖 26），親和力為 37 µM (R² =0.9947)（圖 33）。

對於表達 TCR R44P3B3 的 CD8+ T 細胞，觀察到了對 SPINK2-001 過度表達 A375 腫瘤細胞的活性（圖 32），但未觀察到對野生型 A375 腫瘤細胞系的活性。A375 細胞內源性表達 HLA-A2。

與表達 HLA-A*02 和 SPINK2-001 的細胞系共培養後的 T 細胞活化反映了透過 TCR R44P3B3 識別內源性呈遞的靶 pHLA（呈遞在人白細胞抗原上的肽）。實施例 7 ： T 細胞受體 R44P3E7

TCR R44P3E7 (SEQ ID NO:73-84) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 17）。

R44P3E7 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ，其載有SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 7）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 17）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R44P3E7 的 EC₅₀ 為 0.86 nM（圖 27）。實施例 8 ： T 細胞受體 R49P2A7

TCR R49P2A7 (SEQ ID NO:85-96) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 18）。

R49P2A7 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ 並分別與 HLA-A*02 四聚體結合（圖 31），其載有 SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 8）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 18）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R49P2A7 的 EC₅₀ 為＞83.24 nM（圖 28）。實施例 9 ： T 細胞受體 R55P1G7

TCR R55P1G7 (SEQ ID NO:97-108) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 19）。

R55P1G7 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ 並分別與 HLA-A*02 四聚體結合（圖 31），其載有 SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 9）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 19）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R55P1G7 的 EC₅₀ 為 91.5 pM（圖 29），親和力為 4.3 µM (R² =0.9765)（圖 33）。

對於表達 TCR R55P1G7 的 CD8+ T 細胞，觀察到了對 SPINK2-001 過度表達 A375 腫瘤細胞的活性（圖 32），但未觀察到對野生型 A375 腫瘤細胞系的活性。A375 細胞內源性表達 HLA-A2。

與表達 HLA-A*02 和 SPINK2-001 的細胞系共培養後的 T 細胞活化反映了透過 TCR R55P1G7 識別內源性呈遞的靶 pHLA（呈遞在人白細胞抗原上的肽）。實施例 10 ： T 細胞受體 R59P2A7

TCR R59P2A7 (SEQ ID NO:109-120) 受限於 HLA-A*02 呈遞的 SPINK2-001 (SEQ ID NO:133)（參見圖 20）。

R59P2A7 特異性識別 SPINK2-001，因為與 HLA-A*02+ 靶細胞共同培養時再次表達該 TCR 的人原代 CD8+ T 細胞釋放 IFNγ，其載有SPINK2-001 肽或 SPINK2-001 肽的丙氨酸或蘇氨酸取代變體（圖 10）或與 SPINK2-001 具有高度序列相似性的不同肽（圖 20）。NYESO1-001 肽用作陰性對照。TCR R59P2A7 的 EC₅₀ 為 0.86 nM（圖 30）。

無

在以下實施例中將對本發明進一步進行說明，參照隨附圖表和序列，但是不僅限於此。為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式併入本文。在圖和序列中：

圖 1 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R39P1C12（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 2 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R39P1F5（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 3 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R40P1C2（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 4 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R41P3E6（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 5 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R43P3G4（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 6 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R44P3B3（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 7 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R44P3E7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 8 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R49P2B7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 9 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R55P1G7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 10 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或 SEQ ID NO:133 (SEQ ID NO:134-149) 1-9 位置處的各種 SPINK2-001 丙氨酸- 或蘇氨酸- 取代變體或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R59P2A7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 11 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R39P1C12（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 12 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R39P1F5（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 13 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R40P1C2（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 14 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R41P3E6（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 15 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R43P3G4（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 16 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R44P3B3（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 17 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R44P3E7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 18 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R49P2B7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 19 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R55P1G7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 20 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 或同源但不相關肽 CYP-003 (SEQ ID NO:150)、BAG6-001 (SEQ ID NO:151)、XRCC5-001 (SEQ ID NO:152)、TMEM147-001 (SEQ ID NO:153)、SEC-001 (SEQ ID NO:154)、GMPPA-001 (SEQ ID NO:155)、EXOC4-002 (SEQ ID NO:156)、ARFGAP3-001 (SEQ ID NO:157) 或 ANKRD29-002 (SEQ ID NO:158) 或對照肽 NYESO1-001 (SEQ ID NO:159) 的 T2 靶細胞進行共同培養後，用 TCR R59P2A7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖 21 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R39P1C12（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 22 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R39P1F5（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 23 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R40P1C2（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 24 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R41P3E6（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 25 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R43P3G4（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 26 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R44P3B3（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 27 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R44P3E7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 28 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R49P2B7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 29 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R55P1G7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 30 ：在用與載有 SPINK2-001 肽 (SEQ ID NO: 133) 的 T2 靶細胞在 10 μM 至 10 pM 不同肽負載濃度中進行共同培養後用 TCR R59P2A7（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料。

圖 31 ：分別對 TCR R41P3E6、R44P3B3、R49P2B7 和 R55P1G7 的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞進行 HLA-A*02/SPINK2-001 四聚體或 HLA-A*02/NYESO1-001 四聚體染色。與 HLA-A*02/NYESO1-001 複合體特異性結合的 1G4TCR (SEQ ID:121-132) 的 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞和模擬電穿孔 CD8+ T 細胞作為對照。

圖 32 ：在用過度表達 SPINK2 的 A375 靶細胞或野生型 A375 細胞共同培養後用 TCR R55P1G7 (A) 或 R44P3B3 (B)（表 1）的 α 和 β 鏈 RNA 電穿孔的 CD8+ T 細胞的 IFNγ 釋放。用源自兩個不同健康供體的 CD8+ T 細胞獲得 IFNγ釋放資料（TCRA-61 和 TCRA-62）。顯示了背景減除數據（即，從相關樣本減去僅來自效應子對照的預啟動和非轉導效應子共同培養的信號）。

圖 33 ： HLA-A*02:01:SPINK2-001（固定在感測器上）和 TCR R39P1F5、R39P1C12、R41P3E6、R44P3B3 和 R55P1G7 的可溶性 TCR 變體的生物層干涉測量結合分析。左圖顯示了隨時間（x 軸）變化的不同 TCR 濃度的結合曲線擬合的信號（y 軸），右圖顯示了不同 TCR 濃度（x 軸）和擬合平衡（y 軸）時的反應。

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國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

<110> 德商．英麥提克生物技術股份有限公司

<120> 新型T細胞受體及其免疫治療

<150> US 62/527,844

<151> 2017-06-30

<150> DE 10 2017 114 737.3

<151> 2017-06-30

<160> 159

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

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<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Claims

一種抗原識別構建體，當由HLA呈現SEQ ID NO：133的一SPINK2-001抗原肽時該抗原識別構建體特異性地與該肽結合，其中該抗原識別構建體包含一可變區，包含SEQ ID NO：1的一互補決定區(CDR)1、SEQ ID NO：2的一CDR2及SEQ ID NO：3的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：7的一CDR1、SEQ ID NO：8的一CDR2及SEQ ID NO：9的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：13的一CDR1、SEQ ID NO：14的一CDR2及SEQ ID NO：15的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：19的一CDR1、SEQ ID NO：20的一CDR2及SEQ ID NO：21的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：25的一CDR1、SEQ ID NO：26的一CDR2及SEQ ID NO：27的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：31的一CDR1、SEQ ID NO：32的一CDR2及SEQ ID NO：33的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：37的一CDR1、SEQ ID NO：38的一CDR2及SEQ ID NO：39的一 CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：43的一CDR1、SEQ ID NO：44的一CDR2及SEQ ID NO：45的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：49的一CDR1、SEQ ID NO：50的一CDR2及SEQ ID NO：51的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：55的一CDR1、SEQ ID NO：56的一CDR2及SEQ ID NO：57的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：61的一CDR1、SEQ ID NO：62的一CDR2及SEQ ID NO：63的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：67的一CDR1、SEQ ID NO：68的一CDR2及SEQ ID NO：69的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：73的一CDR1、SEQ ID NO：74的一CDR2及SEQ ID NO：75的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：79的一CDR1、SEQ ID NO：80的一CDR2及SEQ ID NO：81的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：85的一CDR1、SEQ ID NO：86的一CDR2及SEQ ID NO：87的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：91的一CDR1、SEQ ID NO：92的一CDR2及SEQ ID NO： 93的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：97的一CDR1、SEQ ID NO：98的一CDR2及SEQ ID NO：99的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：103的一CDR1、SEQ ID NO：104的一CDR2及SEQ ID NO：105的一CDR3，或一可變區，包含SEQ ID NO：109的一CDR1、SEQ ID NO：110的一CDR2及SEQ ID NO：111的一CDR3；以及一可變區，包含SEQ ID NO：115的一CDR1、SEQ ID NO：116的一CDR2及SEQ ID NO：117的一CDR3，其中該等CDR的序列可包含一個保守的氨基酸取代。
如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該等CDR的序列不包含氨基酸取代。
如請求項1所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一抗體或其片段、一α/β T細胞受體(TCR)或其片段，或一γ/δ TCR或其片段。
如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體為一單鏈抗原識別構建體或由至少兩條氨基酸鏈構成。
如請求項3所述的抗原識別構建體，其中該抗體為一雙特異性抗體。
如請求項3所述的抗原識別構建體，其中該TCR為一可溶性TCR。
如請求項1所述的抗原識別構建體，其包含與選自SEQ ID NO：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112和118的一氨基酸序列具有至少80%序列同一性的一TCR可變鏈區以及包含具有SEQ ID NO：1、2、3；或7、8、9；或13、14、15；或19、20、21；或25、26、27；或31、32、33；或37、38、39；或43、44、45；或49、50、51；或55、56、57；或61、62、63；或67、68、69；或73、74、75；或79、80、81；或85、86、87；或91、92、93；或97、98、99；或103、104、105；或109、110、111；或115、116、117之氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。
如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體包含一修飾的TCR α或β鏈，以及其中在該修飾的α或β鏈的可變結構域中，根據IMGT編號的第44位氨基酸用選自由Q、R、D、E、K、L、W及V所組成之群組的一氨基酸取代，從而改善穩定性和/或該α和β鏈的配對。
一種核酸，其編碼如請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體。
一種載體，其包含如請求項9所述的核酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項1所述的抗原識別構建體，或編碼該抗原識別構建體的核酸，或包含編碼該抗原識別構建體的核酸的載體。
一種藥物組合物，其包含如請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體、或如請求項9所述的核酸、或如請求項10所述的載體、或如請求項11所述的宿主細胞，以及一藥用載體、穩定劑和/或賦形劑。
一種如請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體、或如請求項9所述的核酸、或如請求項10所述的載體、或如請求項11所述的宿主細胞、或如請求項12所述的藥物組合物在製造用於診斷、預防和/或治療一增殖性疾病的一藥物上的用途。
一種製備表達細胞系的一腫瘤相關抗原(TAA)特異性抗原識別構建體的方法，包括a.提供一合適的宿主細胞，b.提供一基因構建體，其包含編碼如請求項1至8任一項所述的抗原識別構建體的一編碼序列，c.將該基因構建體引入該合適的宿主細胞，d.由該合適的宿主細胞表達該基因構建體。
如請求項14所述的方法，進一步包括從該合適的宿主細胞分離和純化該抗原識別構建體，以及可選地，在一T細胞中重構該抗原識別構建體。
一種於體外在一生物樣本中檢測癌症的方法，包括：a.使該生物樣本接觸如請求項1至8任一項所述的重組抗原識別構建體，以及b.檢測該抗原識別構建體與該生物樣本的結合情況。