TWI736719B

TWI736719B - 新型t 細胞受體及其免疫治療應用

Info

Publication number: TWI736719B
Application number: TW106143114A
Authority: TW
Inventors: 里歐尼艾爾頓; 賽巴斯汀邦克; 多明尼克馬友若; 克勞迪亞瓦那
Original assignee: 德商英麥提克生物技術股份有限公司
Priority date: 2016-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2021-08-21
Also published as: US20180161396A1; DE102016123847B3; PE20191648A1; WO2018104438A1; KR20190088539A; CN110114085A; EP3551221B1; EP3551221A1; AU2017373740B2; MA49236A; BR112019010972A2; MX2019006724A; AU2017373740C1; TW201827458A; CR20190278A; CA3045233C; MA49236B1; AU2021203099A1; US10874731B2; AU2017373740A1

Abstract

本發明涉及針對腫瘤相關抗原(MAGEA1)的抗原識別構建體。本發明特別提出了對本發明腫瘤表達抗原具有選擇性和特異性的新型T細胞受體(TCR)分子。本發明的TCR及其衍生的TAA結合片段可用於診斷、治療和預防表達TAA的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原識別構建體的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原識別構建體的重組細胞以及包含本發明化合物的藥物組合物。

Description

新型T細胞受體及其免疫治療應用

本發明涉及針對腫瘤相關抗原(TAA)衍生肽的抗原識別構建體。本發明特別提出了對本發明TAA具有選擇性和特異性的新型T細胞受體(TCR)分子。本發明的TCR及其衍生的TAA結合片段可用於診斷、治療和預防表達TAA的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原識別構建體的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原識別構建體的重組細胞以及包含本發明化合物的藥物組合物。

黑色素瘤抗原基因(MAGE-A)被發現在不同組織學來源的各種腫瘤中表達。由MAGE基因編碼的蛋白為腫瘤排斥抗原，其可以誘導具有識別和殺死癌細胞能力的特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。因此，MAGE基因和蛋白是開發透過免疫療法抗癌的新藥的優先靶標。MAGE-A蛋白質構成癌症-睾丸抗原的亞家族，其主要在生殖種系中（但非唯一性地）表達。它們也在各種人類癌症中表達，這些癌症與惡性相關並可能促進惡性。MAGE 抗原在腫瘤中而不是正常周圍健康組織中的這種特異性表達使得該抗原家族對於靶向性過繼性T細胞轉移非常相關。然而，迄今為止，由於缺乏靶向作用於MAGE抗原的特異性和高度親合抗體或T細胞受體，因此，尚無令人滿意的免疫療法。

基於T細胞的免疫治療靶標代表作用於主要組織相容性複合體(MHC)分子提呈的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。這些腫瘤相關抗原(TAA)可以是源自所有蛋白類型的肽，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。

細胞免疫反應的特定元素能選擇性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的T細胞表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8⁺ 能識別通常8至10個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物(DRiP)的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體(MHC)所載的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。

MHC分子有兩類：MHC I類和MHC II類。肽和MHC I類的複合體由負載相應T細胞受體(TCR)的CD8陽性T細胞進行識別，而肽和MHC II類分子的複合體由負載相應TCR的CD4陽性輔助T細胞進行識別。由於CD8依賴型和CD4依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵腫瘤相關抗原和相應T細胞受體在開發癌症免疫治療（如：疫苗和細胞治療）中非常重要。

在MHC I類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些MHC-I類分子結合，而且它們之後還必須能被T細胞負載的特異性T細胞受體(TCR)識別。因此，TAA是基於T細胞療法（包括但不限於腫瘤疫苗和細胞療法）研發的起點。

大約90%的外周血T細胞表達由一個α多肽和一個β多肽組成的TCR。除了T細胞外，還有一小部分T細胞（約占總T細胞的5%）表現出由一個γ多肽和一個δ多肽組成的TCR。在被稱為上皮內淋巴細胞(IEL)的淋巴細胞群內，發現γδ T細胞在其腸道粘膜中豐度最高。啟動γδ T細胞的抗原性分子仍然鮮為人知。但是，γδ T細胞不是MHC限制性細胞，似乎能夠識別整個蛋白質，而不是要求肽在抗原提呈細胞上由MHC分子提呈，雖然有些識別MHC IB類分子。構成外周血中主要γδ T細胞群的人Vγ9/Vδ2T細胞具有獨特性，它們特異性地且快速地應答小非肽類微生物代謝物HMB-PP（一種異戊烯基焦磷酸鹽前體）。

T細胞克隆的T細胞抗原受體的鏈各自由指定可變(V)、[多樣性(D)]、連接(J)和恒定(C)結構域的獨特組合構成。在每個T細胞克隆中，α和β鏈或δ和γ鏈的V、D和J結構域的組合以該T細胞克隆獨特特徵的方式參與抗原識別，並定義一個獨特的結合位點（也被稱為獨特型T細胞克隆）。而C結構域不參與抗原結合。

TCR是免疫球蛋白超家族的異二聚體細胞表面蛋白，其與參與介導信號轉導的CD3複合體的不變蛋白質相關。TCR以αβ和γδ形式存在，其結構相似，但解剖位置非常不同，也可能功能也非常不同。天然異二聚體αβ TCR和γδ TCR的細胞外部分各自均由兩個多肽組成，每個多肽都有一個膜近端恒定結構域和一個膜遠端可變結構域。每個恒定和可變結構域都包括一個鏈內二硫鍵。可變結構域包含與抗體互補決定區(CDR)類似的高度多態性環。使用TCR基因療法可克服目前的一些障礙。它可讓患者自己的T細胞在短時間內具有所需的特異性並產生足夠數量的T細胞，從而避免其耗盡。TCR將被轉導至中央記憶T細胞或具有幹細胞特徵的T細胞中，這可確保轉移時產生更好的持久性和功能。TCR工程化T細胞將透過化學療法或照射被注入淋巴細胞減少的癌症患者，從而獲得有效的植入，但抑制免疫抑制。

雖然在開發用於癌症治療的分子靶向藥物方面取得了進展，但是，本領域仍然需要開發專門靶向作用於癌細胞高度特異性分子的抗癌新藥。本發明說明書透過提出新型MAGEA1 TCR、各自的重組TCR構建體、核酸、載體和與TAA表位特異性結合的公開宿主細胞來滿足此需求；以及使用這些分子治療癌症的方法。本發明背景中的術語TAA具體涉及以下優選的蛋白質，即MAGEA1蛋白質、其片段，特別是由HLA提呈的抗原性肽，優選為與增殖性疾病相關。本發明優選的抗原肽為肽MAGEA1-003，其具有下表2中SEQ ID No：133至142和154至162中任一個所述的氨基酸序列。TAA肽優選為如SEQ ID No：133至142和154至162中任一個所述的肽。

抗原識別構建體

在第一方面，本發明的目的透過抗原識別構建體來解決，所述抗原識別構建體包含至少一個互補決定區(CDR)3，其與選自SEQ ID No：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111和117的氨基酸序列至少具有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或優選為100%序列同一性。

在一些實施方案中，本發明的抗原識別構建體特異性結合TAA-肽-HLA分子複合體，其中所述TAA肽包含TAA的變體或由TAA的變體組成，其至少66%、優選至少77%、更優選至少88%同源(優選為至少77%或至少88%相同)，其中所述變體與HLA I類或II類分子結合和/或誘導與所述肽或其藥用鹽交叉反應的T細胞，其中所述肽不是潛在的全長多肽。

用於本文時，當在本文中用於兩個或更多個核酸或蛋白質/多肽序列背景下任何地方時，術語「相同」或「同一性」百分比是指兩個或更多個序列或子序列相同或具有（即，至少具有）特定百分比的氨基酸殘基或核苷酸，所述氨基酸殘基或核苷酸透過使用序列比較演算法測量或人工比對和目視檢查相同（即，在指定區域中，當在比較視窗或指定區域上進行比較和比對以獲得最大對應性時，優選為在全長序列中，具有或至少具有約60%同一性，優選具有或至少具有65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%或94%同一性，更優選具有或至少具有約95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性）（例如參見NCBI網站）。在一項特定的實施方案中，例如，當將本發明的抗原識別構建體的蛋白質或核酸序列與另一種蛋白質/基因進行比較時，同一性百分比可透過Human Olfactory Data Explorer（例如，https://genome.weizmann.ac.il/cgi-bin/horde/blastHorde.pl)支持的Blast搜索來確定；特別是用於確定氨基酸同一性時，使用含有以下參數的BLASTP 2.2.28+搜索：矩陣：BLOSUM62；空位罰分：存在：11，擴展：1；相鄰詞語閾值：11；多重命中窗口：40。

在本發明的背景下，應當理解的是，被稱為「包括」本發明某些特徵的任何實施方案應被理解為在一些更優選的實施方案中納入由本發明非常相同特徵「組成」或「基本上組成」的更加嚴格的描述。

在另一個附加或替代實施方案中，抗原識別構建體還可包含CDR1和/或CDR2結構域序列。在可變結構域內，CDR1和CDR2位於多肽鏈的可變(V)區域，CDR3包括一部分V區域、全部多樣性(D)區域和連接(J)區域。CDR3是最可變的，是負責特異性和選擇性識別抗原的主要CDR。CDR1和CDR2序列可能選自人可變鏈等位基因的CDR序列。

天然α-β異二聚體TCR具有一個α鏈和一個β鏈。每個鏈都包括可變、連接和恒定區域，β鏈通常還包括可變區和連接區之間的短多樣性區域，但是該多樣性區域常被視為連接區域的一部分。每個可變區都包括嵌入在框架序列中的三個CDR（互補決定區），其中一個是稱為CDR3的高度可變區。存在幾種類型的α鏈可變(Vα)區和幾種類型的β鏈可變(Vβ)區，由其框架、CDR1和CDR2序列及部分定義的CDR3序列區分。Vα類型透過唯一的TRAV號在IMGT命名中提及，Vβ類型透過唯一的TRBV號被提及。關於免疫球蛋白抗體和TCR基因的更多資訊，參見國際免疫基因學資訊系統®，Lefranc MP等人(Nucleic Acids Res.2015 Jan;43(Database issue):D413-22; and http://www.imgt.org/)。

因此，在一個附加或替代實施方案中，本發明的抗原識別構建體包含如下文表1中所述的CDR1、CDR2和CDR3序列組合，其與CDR3序列一起顯示相應的可變鏈等位基因。因此，優選的是本發明的抗原識別構建體，其包含至少一個、優選為全部三個CDR序列CDR1、CDR2和CDR3。優選情況是，本發明的抗原識別構建體包含本文公開的本發明的單個TCR可變區的各CDR1至CDR3（參見下文表1和實施例章節）。

本文所用術語「特異性」或「抗原特異性」或「特異性針對」給定抗原系指當所述抗原由HLA，優選為HLA A2提呈時，抗原識別構建體可與所述抗原特異性結合，優選為TAA抗原，更優選為具有高親合力的抗原。例如，作為抗原識別構建體的TCR可視為對TAA具有「抗原特異性」，條件是在與使用低濃度TAA抗原，例如下文提出的TAA表位和抗原（例如，約10-11 mol/l、10-10 mol/l、10-9 mol/l、10-8 mol/l、10-7 mol/l、10-6 mol/l、10-5 mol/l）脈衝處理的HLA A2陽性靶細胞共培養時，表達TCR的TAA接觸的T細胞分泌至少約200 pg/ml 或以上（例如，250 pg/ml或以上、300 pg/ml或以上、400 pg/ml或以上、500 pg/ml或以上、600 pg/ml或以上、700 pg/ml或以上、1000 pg/ml或以上、2,000 pg/ml或以上、2,500 pg/ml或以上、5,000 pg/ml或以上）的干擾素γ(IFN-γ)。替代或附加情況是，如果表達TCR的T細胞在與低濃度TAA抗原脈衝的靶細胞共培養時分泌至少兩倍於IFN-γ未轉染背景水準的IFN-γ，則認為TCR對TAA具有「抗原特異性」。如上所述的這種「特異性」可用ELISA進行分析。

在本發明的一個替代或附加實施方案中，抗原識別構建體選擇性地與TAA衍生的抗原性肽結合；優選其中TAA抗原性肽為具有SEQ ID No：133所示氨基酸序列的蛋白質表位或肽或其變體，其中所述變體氨基酸缺失、添加、插入或取代不超過三個、優選為兩個、最優選為不超過一個氨基酸位置。在一些實施方案中，本發明的抗原識別構建體選擇性地結合SEQ ID No：132至142和154至162中所述的任何修飾的MAGEA1-003肽。在一些優選的實施方案中，本發明的抗原識別構建體選擇性地結合SEQ ID No：143至152中所述的任何修飾的MAGEA1-003肽。

術語「選擇性」或「選擇性識別/結合」被理解為是指抗原識別構建體(如TCR或抗體)的性質，選擇性地識別或結合至優選僅一個特異性表位，優選為與另一個表位沒有或基本上沒有交叉反應。優選情況為，術語「選擇性」或「選擇性識別/結合」是指抗原識別構建體(例如TCR)選擇性地識別或結合優選僅一個特異性表位，且優選為與另一個表位沒有或基本上沒有交叉反應，其中所述表位對於一種蛋白質是獨特的，使得抗原識別構建體對另一種表位和另一種蛋白質沒有或基本上沒有交叉反應性。

根據本發明的抗原識別構建體優選為選自抗體或其衍生物或片段、或T細胞受體(TCR)或其衍生物或片段。本發明的抗體或TCR的衍生物或片段應優選為可保留母體分子的抗原結合/識別能力，特別是其如上所述的特異性和/或選擇性。此類結合功能可以透過如本文所定義的CDR3區的存在來保留。

在本發明的一實施方案中，本發明的TCR能夠以主要組織相容性複合體(MHC)I類依賴性方式識別TAA抗原。本文使用的「MHC I類依賴性方式」系指在MHC I類分子的背景中在結合TAA抗原時TCR引起免疫應答。MHC I類分子可以是本領域已知的任何MHC I類分子，例如HLA-A分子。在本發明的一項優先實施方案中，MHC I類分子為HLA-A2分子。

本發明提供單鏈抗原識別構建體和雙鏈識別構建體。

在一實施方案中，該TCRα可變結構域具有至少一個與表1所示TCRα結構域相關的突變；和/或該TCRβ可變結構域具有至少一個與表1所示TCRβ結構域相關的突變。在一實施方案中，TCRα可變結構域和/或TCRβ可變結構域中包含至少一個突變的TCR對於TAA肽HLA分子複合體的結合親和力和/或結合半衰期至少是包含未突變TCR α結構域和/或未突變TCR β可變結構域的TCR的兩倍。

本說明書的TCR α鏈可能進一步包含TCR α跨膜結構域和/或TCR α細胞內結構域。本說明書的TCR β鏈可能進一步包含TCR β跨膜結構域和/或TCR β細胞內結構域。

本發明特別提出一種作為抗原識別構建體或其片段或衍生物的TCR。TCR優選為人TCR，其被理解為由人TCR基因座產生，因此包含人TCR序列。此外，本發明TCR的特徵在於它源自人，並且特異性地識別本發明的TAA抗原。

本發明的另一項實施方案另外提供上述抗原識別構建體，其誘導免疫應答，優選為其中免疫應答的特徵在於干擾素(IFN)γ水準增加。

本發明的TCR可以為單鏈α或β，或γ和δ分子，或為由α和β鏈或γ和δ鏈兩者組成的雙鏈構建體。

本發明的抗原識別構建體可能包含TCR α或γ鏈；和/或TCR β或δ鏈；其中所述TCR α或γ鏈包含與選自SEQ ID No：3、15、27、39、51、63、75、87、99和111的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR3，和/或其中所述TCR β或δ鏈包含與選自SEQ ID No：9、21、33、45、57、69、81、93、105和 117的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR3。

最優選地，在一些另外的實施方案中，其中本披露是指包含本文公開的TCR鏈的任何一個、兩個或全部CDR1至CDR3區的抗原識別構建體(參見表1)，此類抗原識別構建體可能為優選，其包含本發明相應的CDR序列，其不超過三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基。修飾的氨基酸殘基可能選自氨基酸插入、缺失或取代基。最為優先的情況是三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基為相應CDR序列的第一個或最後一個氨基酸殘基。如果修飾是取代，則在一些實施方案中優選取代為保守的氨基酸取代。

如果本發明的抗原識別構建體由至少兩個氨基酸鏈(如雙鏈TCR或其抗原結合片段)組成，則抗原識別構建體可能包含根據SEQ ID No：3的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：9的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：15的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：21的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：27的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：33的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：39的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：45的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：51的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：57的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：63的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：69的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：75的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：81的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：87的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：93的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：99的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：105的第二個多肽鏈氨基酸序列；或根據SEQ ID No：111的第一個多肽鏈氨基酸序列和根據SEQ ID No：117的第二個多肽鏈氨基酸序列。上述任一雙鏈TCR或其抗原結合片段均是本發明的優選TCR。在一些實施方案中，本發明雙鏈TCR的CDR3可能突變。如上所述的SEQ ID No：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111和117的CDR3序列突變優選包括取代、缺失、添加或插入不超過3個、優選為2個、最優選為不超過1個氨基酸殘基。在一些實施方案中，第一個多肽鏈可能是TCR α或γ鏈，第二個多肽鏈可能是TCR β或δ鏈。優選為α β或γ δ TCR的組合。

在一些實施方案中，TCR或其抗原結合片段由TCR α和TCR β鏈或γ和δ鏈組成。此類雙鏈TCR包括在每個鏈可變區內，並且各可變區包含一個CDR1、一個CDR2和一個CDR3序列。TCR包含SEQ ID No：4和SEQ ID No：10(R26P1A9)或SEQ ID No：16和 SEQ ID No：22(R26P2A6)；或SEQ ID No：28和SEQ ID No：34(R26P3H1)或SEQ ID No：40和SEQ ID No：46(R35P3A4)或SEQ ID No：52和SEQ ID No：58(R37P1C9)或SEQ ID No：64和SEQ ID No：70(R37P1H1)或SEQ ID No：76和SEQ ID No：82(R42P3A9)或SEQ ID No：88和SEQ ID No：94(R43P3F2)或SEQ ID No：100和SEQ ID No：106(R43P3G5)或SEQ ID No：112和SEQ ID No：118(R59P2E7)可變鏈氨基酸序列中所包含的CDR1至CDR3序列。

本發明的一些實施方案涉及由TCR α和TCR β鏈組成的TCR或其片段，其中所述TCR包含與選自分別根據SEQ ID No：4和10或分別16和22；或分別28和34或分別40和46或分別52和58或分別64和70或分別76和82或分別88和94或分別100和106或分別112和118的α和β鏈的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或優選為100%序列同一性的可變區序列。

本發明的TCR可以進一步包含源自任何合適物種的恒定區，如任何哺乳動物，例如：人、大鼠、猴、兔、驢或小鼠。在本發明的一項實施方案中，本發明的TCR進一步包含人恒定區。在一些優選實施方案中，本發明TCR的恒定區可例如透過引入異源序列、優選為小鼠序列來稍加修飾，這可能增加TCR的表達和穩定性。

本發明的一些實施方案涉及由TCR α和TCR β鏈組成的TCR或其片段，其中所述TCR包含與選自分別根據SEQ ID No：5和11或分別17和23；或分別29和35；或分別41和47；或分別53和59；或分別65和71；或分別77和83；或分別89和95；或分別101和107；或分別113和119的α和β鏈的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或優選為100%序列同一性的恒定區。

本發明的TCR α或γ鏈還可能包含與選自SEQ ID No：1、13、25、37、49、61、73、85、97和109的氨基酸具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR1和/或與選自SEQ ID No：2、14、26、38、50、62、74、86、98和110的氨基酸具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR2。

根據本發明，TCR β或γ鏈還可能包含與選自SEQ ID No：7、19、31、43、55、67、79、91、103和115的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR1和/或與選自SEQ ID No：8、20、32、44、56、68、80、92、104和116的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR2。

在一項進一步的實施方案中，抗原識別構建體可能包含TCR的結合片段，並且其中所述結合片段包含CDR1至CDR3，其或可選自具有SEQ ID No：1、2、3或7、8、9或13、14、15或19、20、21或25、26、27或31、32、33或37、38、39或43、44、45或49、50、51或55、56、57或61、62、63或67、68、69或73、74、75或79、80、81或85、86、87或91、92、93或97、98、99或103、104、105或109、110、111或115、116、117的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

在本發明的進一步實施方案中，本文其他地方所述的抗原識別構建體是由至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列組成的TCR或其片段，其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：1至3的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：7至9的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：13至15的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：19至21的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：25至27的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：31至33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：37至39的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：43至45 的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：49至51的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：55至57的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：61至63的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：67至69的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：73至75的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：79至81的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：85至87的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：91至93的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：97至99的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：103至105的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：109至111的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：115至117的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

在本發明的進一步實施方案中，前文所述的抗原識別構建體是由至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列組成的TCR或其片段，其中所述TCR α鏈序列包含具有 SEQ ID No：4的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：10的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：16的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：22的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：28的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：34的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：40的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：46的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：52的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：58的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：64的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：70的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：76的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：82的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：88的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：94的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：100的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：106的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：112的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：118的氨基酸序列的可變區序列。

在本發明的進一步實施方案中，前文所述的抗原識別構建體是TCR或其片段，其還包含與選自ID NO.5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113和119的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的TCR恒定區；優選地，其中TCR由至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列組成，其中TCR α鏈序列包含與SEQ ID No：5、17、29、41、53、65、77、89、101和113的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的恒定區。

此外，所披露的是前文所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：6的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：12的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。本發明還提出了TCR，其包含與SEQ ID No：18 的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：24的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：30的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：36的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：42的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：48的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：54的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：60的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：66的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：72的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：78的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：84的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：90的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：96的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：102的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：108的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。在進一步的實施方案中，本發明提出的抗原識別構建體為TCR並且包含與SEQ ID No：114的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：120的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

本文所用的術語「鼠」或「人」在提及抗原識別構建體或TCR時，或本文所述的TCR的任何組分(例如，互補性決定區(CDR)、可變區、恒定區，α鏈和/或β鏈)是指分別源自小鼠或人未經排列的TCR基因座的TCR(或其組分)。

在本發明的一項實施方案中，提供了嵌合TCR，其中所述TCR鏈包含來自多物種的序列。優選情況為，本發明的TCR可包含α鏈，其包含α鏈的人可變區和例如鼠TCR α鏈的鼠恒定區。

在一項實施方案中，本發明的TCR是由根據上述實施方案的人可變區和人恒定區組成的人TCR。

在一些實施方案中，抗原識別構建體被鼠源化或人源化。當將來自外來物種的氨基酸序列引入本發明的構建體時，使用這些術語。

本發明的TCR可能為單鏈TCR(scTCR)。scTCR可包含第一TCR鏈(例如，α鏈)的可變區的多肽和整個(全長)第二TCR鏈(例如，β鏈)的多肽，反之亦然。此外，scTCR可以任選地包含一個或多個將兩個或多個多肽連接在一起的接頭。例如，接頭可以是肽，其將兩個單鏈連接在一起，如本文所述。還提供了本發明的scTCR，其與人細胞因子如IL-2、IL-7或IL-15融合。

本發明的抗原識別構建體還可能以包含至少兩個scTCR分子的多聚複合體形式提供，其中所述scTCR分子各自與至少一種生物素部分或其他相互連接的分子/接頭融合，並且其中所述scTCR透過生物素-鏈黴親和素相互作用相互連接，以形成所述多聚體複合體。本領域已知的用於產生多聚體TCR的類似方法也是可能的並且包括在本披露資料中。還提出了更高級的多聚體複合體，其包含本發明兩種以上的scTCR。

為了本發明的目的，TCR是具有至少一個TCRα或γ和/或TCRβ或δ可變結構域的部分。通常，它們包括TCRα可變結構域和TCRβ可變結構域，或者TCRγ可變結構域和TCRδ可變結構域兩者。它們可能為αβ/γδ異源二聚體，也可能為單鏈形式。為了用於過繼療法，αβ或γδ異二聚體TCR可能例如被轉染為具有細胞質和跨膜結構域的全長鏈。如果需要，相應恒定結構域殘基之間可能存在引入的二硫鍵。

在一項優選的實施方案中，抗原識別構建體為人TCR或其片段或衍生物。人TCR或其片段或衍生物是一種TCR，其包含超過50%的相應人TCR序列。優選情況為，只有少部分TCR序列為人工來源或源自其他物種。然而，眾所周知，例如，人源的嵌合TCR在恒定結構域含有鼠源序列是有利的。因此，特別優選的是根據本發明的TCR，其在其恒定結構域的細胞外部分含有鼠序列。

因此，又為優選的是本發明的抗原識別構建體能夠以人白細胞抗原(HLA)依賴性方式、優選以HLA-A02依賴性方式識別其抗原。在本發明的上下文中，術語「HLA依賴性方式」系指抗原識別構建體僅在抗原肽由所述HLA提呈的情況下才與抗原結合。

在一項實施方案中，根據本發明的抗原識別構建體優選為誘導免疫應答，優選為其中免疫應答的特徵在於干擾素(IFN)γ水準增加。

本發明還提出了包含本文所述的任何TCR(或其功能變體)的功能部分的多肽，例如，選自實施例部分和表1中所述R26P1A9、R26P2A6、R26P3H1、R35P3A4、R37P1C9、R37P1H1、R42P3A9、R43P3F2、R43P3G5和R59P2E7中的任何一種TCR。本文所用的術語「多肽」包括寡肽，並且系指透過一個或多個肽鍵連接的氨基酸的單鏈。關於本發明的多肽，功能部分可以是包含TCR(或其功能變體)連續氨基酸的任何部分，其中部分條件是功能部分與TAA抗原特異性結合，優選為如表2中所公開，以及與肽MAGEA1-003_A1至A9(SEQ ID No：134-142)和 MAGEA1-003_T1至T9(SEQ ID No：154-162)特異性結合。當使用與TCR(或其功能變體)相關時，術語「功能部分」系指本發明TCR(或其功能變體)的任何部分或片段，其中該部分或片段保留TCR(或其功能變體)的生物活性，其為母體TCR或其親代功能變體的一部分。功能部分包括，例如，保留與TAA抗原特異性結合的能力(以HLA依賴性方式)或以與母體TCR(或其功能變體)相似程度、相同程度或更高程度檢測、治療或預防癌症的TCR(或其功能變體)的那些部分。關於母體TCR(或其功能變體)，功能部分可以包括，例如，約10%、25%、30%、50%、68%、80%、90%、95%或更多母體TCR可變序列(或其功能變體)。

功能部分可以在該部分的氨基或羧基末端或兩個末端包含額外的氨基酸，其中在母體TCR或其功能變體的氨基酸序列中未發現額外的氨基酸。理想的情況是，額外的氨基酸不干擾功能部分的生物學功能，例如，特異性結合TAA抗原；和/或具有檢測癌症、治療或預防癌症等能力。更理想的是，與母體TCR或其功能變體的生物學活性相比，額外的氨基酸增強了生物學活性。

多肽可包含本發明TCR的α和β鏈的一個或兩個功能部分或其功能變體，例如包含本發明TCR的α和/或β鏈可變區的CDR1、CDR2和(優選)CDR3之一或其功能變體的功能部分。在本發明的一項實施方案中，多肽可包含功能部分，其包含SEQ ID No：3、9、 15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111和117的氨基酸序列(本發明TCR可變區的CDR3)或其組合。在本發明的一項實施方案中，本發明的多肽可包括例如本發明TCR的可變區或其功能變體，其包含上述CDR區的組合。在這一點來說，多肽可包含SEQ ID No：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112和118中的任一個氨基酸序列(本發明TCR的α或β鏈的可變區)。

在一些情況下，本發明的構建體可能包含一個或兩個多肽鏈，其包含根據SEQ ID No：1至120(CDR序列，恒定和可變區和全長序列)中任一項的一個序列或其功能片段，並且進一步包含其他氨基酸序列，例如，編碼免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，則本發明的蛋白質可以是融合蛋白。就此而言，本發明還提供了包含本文所述的至少一種本發明的多肽與至少一種其他多肽的融合蛋白。其他的多肽可以作為融合蛋白的單獨多肽存在，或者可以作為與本文所述的本發明多肽之一框架(串聯)表達的多肽存在。其他多肽可包括任何肽或蛋白質分子或其部分，包括但不限於免疫球蛋白、CD3、CD4、CD8、MHC分子、CD1分子(例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等)。

融合蛋白可以包含本發明多肽的一個或多個拷貝和/或另一個多肽的一個或多個拷貝。例如，融合蛋白可包含本發明多肽和/或另一多肽的1、2、3、4、5個或更多個拷貝。製備融合蛋白的合適方法是本領域已知的，並且包括例如重組方法。在本發明的一些實施方案中，本發明的TCR（及其功能部分和功能變體）、多肽和蛋白質可以表達為單一蛋白，其包含連接α鏈和β鏈和連接γ鏈和δ鏈的連接肽。就此而言，本發明的TCR（及其功能變體和功能部分）、多肽和蛋白質包含本發明TCR可變區的氨基酸序列，並且可能進一步包含接頭肽。接頭肽可以有利地促進宿主細胞中重組TCR（包括其功能部分和功能變體）、多肽和/或蛋白質的表達。接頭肽可包含任何合適的氨基酸序列。單鏈TCR構建體的接頭序列是本領域公知的。此類單鏈構建體可進一步包含一個或兩個恒定結構域序列。在透過宿主細胞表達包括接頭肽的構建體後，接頭肽也可能被裂解，導致α和β鏈以及γ和δ鏈分離。

為了避免TCR鏈錯配，可修飾本發明的TCR。術語「錯配」應涉及本發明的TCRα/γ或β/δ轉基因的TCR鏈與內源性TCRα/γ或β/δ鏈之間的不正確配對，並導致轉基因TCRαβ/γδ異二聚體細胞表面表達稀釋，這降低了修飾T細胞的功能性親合力。優選地，根據IMGT 編號的TCR可變結構域中第44位的Q被本發明TCR的一條或兩條鏈中的另一個氨基酸取代。取代優選地選自R、D、E、K、I、W和V組成的組。

如上所述，本發明TCR的結合功能可能在抗體框架中提供。例如，本發明TCR的CDR序列，可能包括額外的3個、2個或1個N和/或C末端框架殘基，可以直接接枝到抗體可變重/輕鏈序列中。本文中使用了各種語法形式的術語「抗體」，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結合位點或互補位的分子。此類分子也被稱為免疫球蛋白分子的「抗原結合片段」。本發明還提出了與本文所述的抗原特異性結合的抗體或其抗原結合部分。抗體可以是本領域已知的任何類型的免疫球蛋白。例如，抗體可以是任何同種型免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。抗體可以是天然存在的抗體，例如從哺乳動物（例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等）中分離和/或純化的抗體。或者，抗體可以是基因工程化抗體，例如人源化抗體或嵌合抗體。抗體可以是單體或聚合體形式。

術語「抗體」包括但不限於基因工程化或其他修飾形式的免疫球蛋白，例如胞內抗體、嵌合抗體、完全人抗體、人源化抗體（例如由「CDR 移植」產生）、抗體片段和異源偶聯抗體（例如雙特異性抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體等）。術語「抗體」包括半胱氨酸雙鏈抗體和微型抗體。因此，本文提供的關於「抗體」或「抗體樣構建體」的每個實施方案也被視為雙特異性抗體、雙鏈抗體、scFv片段、嵌合抗體受體(CAR)構建體，雙鏈抗體和/或微型抗體，除非另有明確表示。如本文所公開的，術語「抗體」包括免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白片段的多肽，所述多肽能夠非共價、可逆地並以特異性方式結合相應的抗原，優選為本發明的TAA。示例性抗體結構單元包括四聚體。在一些實施方案中，全長抗體可由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一個「輕」和一個「重」鏈（透過二硫鍵連接）。抗體結構和同種型是本領域技術人員所熟知的（例如，Janeway's Immunobiology, 9th edition, 2016所述）。

公認的哺乳動物免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區基因，以及無數免疫球蛋白可變區基因（關於免疫球蛋白基因的更多資訊，參見國際免疫基因學資訊系統®，Lefranc M-P et al, Nucleic Acids Res.2015 Jan;43(Database issue):D413-22; and http://www.imgt.org/）。對於全長鏈，輕鏈被分為κ或λ類。對於全長鏈，重鏈分為γ、μ、α、δ或ε類，其又分別定義免疫球蛋白類別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每個鏈的N末端限定了主要負責抗原識別的約 100至110個或更多個氨基酸的可變區。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指輕鏈和重鏈的這些區域。用於本發明時，「抗體」包括抗體及其片段的所有變體。因此，在該概念的範圍內，為具有相同、基本上相同或相似結合特異性的全長抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(scFv)、Fab、Fab'和這些片段的多聚體形式(例如，F(ab')2)。在一些實施方案中，抗體與本發明的肽TAA特異性結合。根據本發明的優選抗原識別構建體包括抗體重鏈，優選為其可變結構域，或其抗原結合片段和/或抗體輕鏈，優選為其可變結構域，或其抗原結合片段。類似地，二硫鍵穩定的可變區片段(dsFv)可以透過重組DNA技術製備，但本發明的抗體片段不限於這些示例性類型的抗體片段。此外，抗體或其抗原結合部分可以被修飾為包括可檢測的標記，例如放射性同位素、螢光團(例如，異硫氰酸螢光素(FITC)，藻紅蛋白(PE))、酶(例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)和元素顆粒(例如，金顆粒)。在某些情況下，與SEQ ID No：3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111和117中提供的CDR3序列相比，TCR CDR3序列可以略加修飾，但優選不超過3個氨基酸殘基，優選為僅兩個，最優選為僅一個氨基酸位置。優選地，抗體包含該CDR3，優選為該組合中所有的CDR1至CDR3區，如表1中本發明的TCR所示，在每種情況下與這些序列相比，獨立地可選地具有不多於三個或兩個、優選為一個氨基酸取代、插入和/或缺失基。

製備抗體的合適方法是本領域已知的。例如，標準雜交瘤方法描述於例如，Kohler and Milstein,Eur.J.Immunol,5,51 1-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies：A Laboratory Manual, CSH Press(1988), and C.A. Janeway et al.(eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY(201 1)一文中。或者，其他方法，例如EBV雜交瘤方法（Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67(1984),和Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67(1986)）和噬菌體載體表達系統（參見例如，Huse et al., Science, 246, 1275-81(1989)）都是本領域已知的。此外，在非人動物中產生抗體的方法描述於例如美國專利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美國專利申請公開號2002/0197266中。

本發明的一些實施方案也涉及作為可溶性TCR的TCR或其功能片段和多肽。用於本文時，術語可溶性「T細胞受體」系指天然TCR的異二聚體截短變體，其包含TCRα鏈和β鏈的細胞外部分，例如，透過二硫鍵連接，但是其缺乏天然蛋白質的跨膜和胞質結構域。術語可溶性「T細胞受體α鏈和可溶性T細胞受體β鏈序列」系指缺乏跨膜和胞質結構域的TCRα鏈和β鏈序列。可溶性TCRα鏈和β鏈的序列（氨基酸或核酸）可以與天然TCR中的相應序列相同，或者與相應的天然TCR序列相比，可以包含變體可溶性TCRα鏈和β鏈序列。本文所用的術語「可溶性T細胞受體」包括具有變體或非變體可溶性TCRα鏈和β鏈序列的可溶性TCR。這些變異可以在可溶性TCRα鏈和β鏈序列的可變區或恒定區中，並且可以包括但不限於氨基酸缺失、插入、取代突變以及不改變氨基酸序列的核酸序列改變。在任何情況下本發明的可溶性TCR都保留其母體分子的結合功能。

上述問題透過編碼本發明抗原識別構建體的核酸或任何上述蛋白質或多肽構建體得以進一步解決。核酸優選為(a)具有編碼根據本發明的抗原識別構建體的鏈；(b)具有與(a)中的鏈互補的鏈；或(c)具有在嚴格條件下與如(a)或(b)所述的分子雜交的鏈。嚴格條件是本領域技術人員已知的，具體來自Sambrook等人的「Molecular Cloning」一文。除此之外，核酸任選具有進一步的序列，其是表達對應於蛋白質的核酸序列所必需的，特別是用於在哺乳動物/人細胞中表達。使用的核酸可包含於適於允許在細胞中表達對應於該肽的核酸序列的載體中。然而，核酸也可用於轉化抗原呈遞細胞，其可能不限於經典的抗原呈遞細胞，例如樹突狀細胞，這樣，使得他們本身在其細胞表面上產生相應的蛋白質。

在一些實施方案中，抗原識別構建體的多肽可以由核酸編碼並在體內或體外表達。因此，在一些實施方案中，提出了編碼抗原識別構建體的核酸。在一些實施方案中，核酸編碼本發明抗原識別構建體的一個部分或單體（例如：本發明TCR的兩條鏈之一），和/或另一個核酸編碼本發明抗原識別構建體的另一部分或單體（例如：TCR的兩條鏈中的另一條）。在一些實施方案中，核酸編碼兩個或更多個抗原識別構建體多肽鏈，例如，至少2個TCR鏈。編碼多個抗原識別構建體鏈的核酸可以包括至少兩個鏈序列之間的核酸切割位元點，可以編碼兩個或更多個鏈序列之間的轉錄或翻譯起始位點，和/或可以編碼兩個或更多個抗原識別構建體鏈之間的蛋白水解靶位點。

本文所用的「核酸」包括「多核苷酸」、「寡核苷酸」和「核酸分子」，通常是指可以為單鏈或雙鏈、合成或從自然資源中獲得（例如，分離和/或純化）的DNA或RNA聚合物，其可含有天然、非天然的或改變的核苷酸，並且可含有天然、非天然的或改變的核苷酸間連接子，例如氨基磷酸酯連接子或磷硫代磷酸酯連接子，而非未修飾寡核苷酸的核苷酸之間的磷酸二酯。

優選地，本發明的核酸為重組核酸。本文所用的術語「重組」系指(i)透過將天然或合成核酸區段連接到可在活細胞中複製的核酸分子而構建在活細胞外部的分子，或(ii)從複製上述(i)中所述內容而產生的分子。為了本文的目的，複製可以是體外複製，也可以是體內複製。核酸可包含編碼本文所述的任何TCR、多肽或蛋白質或功能部分或其功能變體的任何核苷酸序列。

此外，本發明提出了包含如上所述的本發明核酸的載體。理想情況是，載體為表達載體或重組表達載體。術語「重組表達載體」在本發明背景下系指允許在合適宿主細胞中表達mRNA、蛋白質或多肽的核酸構建體。本發明的重組表達載體可以是任何合適的重組表達載體，並可用於轉化或轉染任何合適的宿主。合適的載體包括設計用於繁殖和擴增或用於表達或兩者兼有的載體，例如質粒和病毒。動物表達載體的實例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo。優選地，重組表達載體為病毒載體，例如，逆轉錄病毒載體。重組表達載體包括調節序列，例如轉錄和翻譯起始和終止密碼子，其特異於宿主細胞（例如，細菌、真菌、植物或動物）的類型，其中載體將被引入其中並且在其中可以進行本發明核酸的表達。此外，本發明的載體可能包括一個或多個標誌物基因，其允許選擇轉化或轉染的宿主。重組表達載體可包含與編碼本發明構建體的核苷酸序列或者與編碼本發明構建體的核苷酸序列互補或雜交的核苷酸序列在操作上可連接的天然或規範性啟動子。啟動子的選擇包括例如強、弱、誘導型、組織特異性和開發特異性啟動子。啟動子可以是非病毒啟動子，也可以是病毒啟動子。本發明的重組表達載體可以被設計用於暫態表達、穩定表達或兩者的表達。此外，重組表達載體可以用於組成型表達或誘導型表達。

本發明還涉及包含根據本發明的抗原識別構建體的宿主細胞。具體地，本發明的宿主細胞包含如上所述的核酸或載體。宿主細胞可以是真核細胞，例如植物、動物、真菌或藻類，也可以是原核細胞，例如細菌或原生動物。宿主細胞可以是培養細胞或原代細胞，即直接從生物體（例如人）分離。宿主細胞可以是貼壁細胞或懸浮細胞（即，在懸浮液中生長的細胞）。為了產生重組TCR、多肽或蛋白質的目的，宿主細胞優選為哺乳動物細胞。最優選地，宿主細胞為人細胞。雖然宿主細胞可以是任何細胞類型，可以來自任何類型的組織，可以是任何發育階段的細胞，但是宿主細胞優選為外周血白細胞(PBL)或外周血單核細胞(PBMC)。更優選地，宿主細胞為T細胞。T細胞可以是任何T細胞，諸如培養的T細胞，例如，原代T細胞或來自培養T細胞系的T細胞，例如Jurkat、SupT1等，或獲得自哺乳動物的T細胞，優選為來自人類患者的T細胞或T細胞前體。如果獲得自哺乳動物，T細胞可從許多來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或液體。T細胞還可以是富集或純化的。優選地，T細胞為人T細胞。更優選地，T細胞是分離自人的T細胞。T細胞可以是任何類型的T細胞並且可以是任何發育階段的，包括但不限於CD4陽性和/或CD8陽性、CD4陽性輔助T細胞，例如，Th1和Th2細胞、CD8-陽性T細胞（例如，細胞毒性T細胞）、腫瘤浸潤細胞(TIL)、記憶T細胞、幼稚T細胞等。優選地，T細胞為CD8陽性T細胞或CD4陽性T細胞。

優選地，本發明的宿主細胞為淋巴細胞，優選為T淋巴細胞，例如CD4陽性或CD8陽性T細胞。宿主細胞更優選為對表達TAA的腫瘤細胞特異性的腫瘤反應性T細胞。

本發明的目的還透過製備TAA特異性抗原識別構建體或TAA特異性抗原識別構建體表達細胞系的方法來解決，包括 a. 提出合適的宿主細胞， b. 提供一種基因構建體，其包含編碼根據本發明公開的抗原識別構建體的編碼序列， c. 引入所述合適的宿主細胞、所述基因構建體，和 d. 由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。

所述方法可能進一步包括在所述合適宿主細胞上進行細胞表面呈遞所述抗原識別構建體的步驟。

在其他優選的實施方案中，所述基因構建體是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。

優選地，所述抗原識別構建體來源於哺乳動物，優選來源於人。用於本發明方法的優選合適宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如人細胞，特別是人T淋巴細胞。用於本發明的T細胞在上文中進行了詳細描述。

本發明還包括實施方案，其中所述抗原識別構建體為修飾的TCR，其中所述修飾是加入功能結構域，諸如標記物或治療活性物質。此外，包括具有可選結構域的TCR，諸如可選膜錨定結構域而不是內源性跨膜區。

理想情況是，用於將基因構建體引入所述合適宿主細胞的轉染系統為逆轉錄病毒載體系統。此類系統是本領域技術人員所熟知的。

本發明還包括在一項實施方案中，從細胞中分離和純化抗原識別構建體的另外的方法步驟，以及任選地在T細胞中重構經翻譯的抗原識別構建體片段。

本發明的另一方面提出了透過產生T細胞受體(TCR)的方法獲得的或可獲得的T細胞，其中T細胞受體(TCR)對於腫瘤細胞具有特異性並且具有如上所述的高親合力。此類T細胞取決於本發明方法中使用的宿主細胞，例如人或非人T細胞，優選為人TCR。

本文中在多肽（例如：抗原識別構建體（其實例可以是抗體））背景下使用的術語「分離」是指從蛋白質或多肽或其他污染物純化的多肽，未經純化會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途。根據本發明的抗原識別構建體可以是重組、合成或修飾（非天然）抗原結合構建體。本文中在多核酸或細胞背景下使用的術語「分離」是指從DNA、RNA、蛋白或多肽或其他污染物（例如其他細胞）純化的核酸或細胞，未經純化會干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途，或者是指重組、合成或修飾（非天然）核酸。在此背景中，「重組」蛋白/多肽或核酸是使用重組技術製備的。產生重組核酸和蛋白的方法和技術是本領域熟知的。治療方法和疾病

本發明的另一方面涉及本文公開的用於藥物中的抗原識別構建體、核酸、載體、藥物組合物和/或宿主細胞。在一項優選實施方案中在藥物中的用途包括在診斷、預防和/或治療諸如惡性或良性腫瘤疾病等腫瘤疾病中的用途。腫瘤疾病為，例如，在所述腫瘤疾病的癌細胞或腫瘤細胞中以表達TAA為特徵的腫瘤疾病。

關於根據本公開資料的抗原識別構建體和由其衍生的、與其相關的或編碼所述構建體的其他材料的上述醫療應用，待治療和/或診斷的疾病可以為任何增殖性疾病，優選為其特徵在於表達本發明的TAA或TAA表位序列，例如，所述疾病可以為任何癌症，包括以下癌症中任一種：急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞癌、結腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸類癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌、腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優選的癌症為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。特別優選的癌症為TAA陽性癌症，優選包括黑色素瘤、胃腸癌和胃癌。

本發明的構建體、蛋白質、TCR抗體、多肽和核酸特別用於免疫治療，優選用於過繼性T細胞治療。本發明化合物的給藥可以，例如，涉及將本發明的T細胞輸注入所述患者體內。優選地，此類T細胞為患者的自體T細胞，並且用本發明的核酸或抗原識別構建體在體外轉導。

本發明的抗原識別構建體、TCR、多肽、蛋白質（包括其功能變體）、核酸、重組表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）以下統稱為「本發明的TCR材料」，可以配製成組合物，諸如藥物組合物。就此而言，本發明提出了一種藥物組合物，其包含本文所述的任意抗原識別構建體、TCR、多肽、蛋白質、功能部分、功能變體、核酸、表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）以及藥用載體、賦形劑和/或穩定劑。含有任何本發明TCR材料的本發明藥物組合物可包含多於一種本發明的TCR材料，例如，多肽和核酸，或兩種或更多種不同的TCR（包括功能部分及其功能變體）。或者，藥物組合物可包含與另一種藥物活性劑或藥物組合的本發明TCR材料，諸如，化學治療劑，例如，天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春花堿、長春新堿等。優選地，載體為藥用載體。關於藥物組合物，載體可以是常規用於所考慮的本發明的特定TCR材料的任意載體。這些藥用載體是本領域技術人員所熟知的，並且是公眾容易獲得的。優選情況是，藥用載體是在使用條件下無有害副作用或毒性的一種載體。

因此，本還提出了一種藥物組合物，其包含本文所述的本發明的任何產品和本發明的任何TCR材料，特別是任何蛋白質、核酸或宿主細胞。在一項優選的實施方案中，藥物組合物用於免疫治療，優選為繼代細胞治療。

優選地，本發明的TCR材料透過注射施用，如，靜脈內施用。當本發明的TCR材料為表達本發明 TCR（或其功能變體）的宿主細胞時，用於注射的細胞藥用載體可能包括任何等滲載體，例如，生理鹽水（水中含有約0.90%w/v的的NaCl、水中含有約300mOsm/L NaCl、或每升水中含有約9.0g NaCl）、NORMOSOL R電解質溶液(Abbott, Chicago, IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter, Deerfield, IL)、水中含約5%葡萄糖或林格氏乳酸鹽。在一項實施方案中，藥用載體用人血清白蛋白補充。

為了本發明的目的，施用本發明TCR材料的數量或劑量（例如，當本發明TCR材料為一個或多個細胞時的細胞數量）可能在合理時間框架內在受試者或動物中足以影響治療或預防反應。例如，本發明TCR材料的劑量應該自施用起約2個小時或更長時間（例如，12至24小時）或更多小時的期間內與癌症抗原結合或檢測、治療或預防癌症。在某些實施方案中，時間可能更長。劑量將由本發明特定TCR材料的療效和動物（例如，人）的狀況以及待治療動物（例如，人）的體重決定。

預期本發明的藥物組合物、抗原識別構建體、TCR（包括其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞或細胞群可用於癌症或TAA陽性癌前病變的治療或預防方法。本發明的TCR（及其功能變體）被認為可與本發明的TAA特異性結合，使得TCR（或本發明相關多肽或蛋白質及其功能變體）由細胞（如T細胞）表達或在細胞上表達時能夠介導針對表達本發明TAA的靶細胞的免疫應答，優選為經由MHC I或II在所述靶細胞的表面上提呈TAA肽。就此而言，本發明提出了哺乳動物中病症（特別是癌症）的治療或預防方法，包括向哺乳動物施用任何藥物組合物、抗原識別構建體，特別是TCR（及其功能變體）、多肽或本文所述的蛋白質、任何核酸或重組表達載體，其包含編碼本文所述的任何TCR（及其功能變體）、多肽、蛋白質的核苷酸序列或包含核酸或重組載體的任何宿主細胞或細胞群，該重組載體編碼本文所述的本發明的任何構建體（及其功能變體）、多肽或蛋白質，用量為有效治療或預防哺乳動物中病症的量，其中所述病症為癌症，如表達本發明TAA的癌症。

可用於本發明的藥用載體或稀釋劑的實例包括諸如 SPGA、碳水化合物（例如，山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）等穩定劑，諸如白蛋白或酪蛋白等蛋白質，諸如牛血清或脫脂牛奶和緩衝液（例如，磷酸鹽緩衝液）等含蛋白製劑。

本文中所用的術語「治療」和「預防」以及源自這些術語的詞語並不一定意味著100%或完全治療或預防。相反，存在不同程度的治療或預防，而本領域普通技術人員認識到具有潛在的益處或治療效果。就此而言，本發明的方法可為哺乳動物的病症提供任何治療或預防水準的任意量。此外，本發明方法提出的治療或預防可包括待治療或預防病症（例如，癌症）的一種或多種病症或症狀的治療或預防。例如，治療或預防可以包括促進腫瘤消退。此外，為了本文之目的，「預防」可以包括推遲疾病或其症狀或病症的發作。

本發明還涉及一種治療癌症的方法，其包括與至少一種化學治療劑和/或放射治療組合施用本說明書的TCR、核酸或宿主細胞。

本發明的另一方面進一步涉及在（生物）樣本（例如從受試者或患者獲得的樣本）中檢測TAA蛋白或MHC與TAA蛋白（TAA的蛋白表位）的複合體的一種方法，包括使樣本與特異性結合所述TAA肽或TAA肽/MHC複合體的抗原識別構建體接觸，並檢測所述抗原識別構建體和所述TAA肽之間或與TAA肽/MHC複合體之間的結合情況。在一些實施方案中，抗原識別構建體是根據本文所述發明的TCR或抗體或類似構建體，或優選為抗原識別構建體。在一些實施方案中，（生物）樣本為腫瘤或癌症樣本（如：本文別處所述的那些樣本中的一種），例如，包含腫瘤或癌細胞的樣本。

還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括： a) 從所述受試者中分離細胞； b) 用編碼本發明的抗原識別構建體的至少一種載體轉化細胞以產生轉化的細胞； c) 擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d) 將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括： a) 從健康供體中分離細胞； b) 用編碼本發明的抗原識別構建體的一種載體轉化細胞以產生轉化的細胞； c) 擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d) 將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。

還提出了一種檢測生物樣本中癌症的方法，包括： a) 使生物樣本與本說明書的抗原識別構建體接觸； b) 檢測抗原識別構建體與生物樣本的結合情況。

在一些實施方案中，檢測癌症的方法在體外、體內或原位進行。

還提出了檢測哺乳動物中有無病症的方法。該方法包括(i)將包含哺乳動物一種或多種細胞的樣本接觸本發明的任何TCR（及其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結合部分或本文所述的藥物組合物，從而形成複合體，並包括檢測複合體，其中所述複合體的檢測提示哺乳動物中是否存在病症，其中所述病症為癌症，諸如表達TAA的惡性疾病。

關於檢測哺乳動物疾病的本發明方法，細胞樣本可以是包含全細胞、其裂解物或全部細胞裂解物的一部分的樣本，例如核或細胞質級分、全蛋白質級分或核酸級分。

為了本發明的檢測方法之目的，所述接觸可以在哺乳動物體外或體內進行。優選情況是，接觸在體外進行。

此外，複合體的檢測可以透過本領域已知的任何方式進行。例如，本文所述的本發明抗原識別構建體（及其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群或抗體或TCR或其抗原結合部分可以用檢測到的標記（諸如，放射性同位素、螢光團（例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)）、酶（例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶）和元素顆粒（例如，金顆粒）進行標記。

為了本發明方法之目的，其中施用宿主細胞或細胞群，所述細胞可以是與哺乳動物同種異體或自體的細胞。優選情況是，細胞為哺乳動物自體細胞。

關於本發明TCR材料的上述醫療用途，待治療和/或診斷的癌症可以為任何癌症，包括以下癌症中任一種：急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞癌、結腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸類癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌、腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優選的癌症為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。特別優選的癌症為TAA陽性癌症，例如：皮膚癌（優選為如黑色素瘤）、胃腸癌或胃癌。

總體上，本發明提出了患有腫瘤或腫瘤疾病的受試者的治療方法，其包括施用本發明公開的抗原識別構建體、核酸、載體、藥物組合物和/或宿主細胞。優選地，所述受試者為需要這種治療的受試者。優選實施方案中的受試者為患有TAA陽性的腫瘤或腫瘤疾病的哺乳動物受試者，優選為人類患者。

鑒於本文的公開內容，將理解本發明還涉及以下項目：

第1項：一種抗原識別構建體，其包含至少一個互補決定區(CDR)3，其與選自NO.3、9、15、21、27、33、39、45、51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111和117的氨基酸序列至少具有50%的序列同一性。

第2項：根據第1項的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體能夠特異性地和/或選擇性地與本發明抗原肽的TAA結合。

第3項：根據第1或2項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一種抗體或其衍生物或片段、或一種T細胞受體(TCR)或其衍生物或片段。

第4項：根據第1至3項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體與提呈TAA抗原肽的人白細胞抗原(HLA)結合，其中所述HLA任選為A2型。

第5項：根據第1至4項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體特異性地和/或選擇性地結合具有選自SEQ ID No：133至142、優選為SEQ ID No：133的氨基酸序列的表位。

第6項：根據第1至5項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為α/β-TCR，或其片段或衍生物，或所述構建體為γ/δ-TCR，或其片段或衍生物。

第7項：根據第1至6項中任一項所述的抗原識別構建體，其特徵在於，所述構建體是人源並特異性地和/或選擇性地識別TAA抗原肽。

第8項：根據第1至7項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體能夠在受試者中誘導免疫應答，任選其中所述免疫應答的特徵在於干擾素(IFN)γ水準增加。

第9項：根據第1至8項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含TCR α或γ鏈；和/或TCR β或δ鏈；其中所述TCR α或γ鏈包含與選自SEQ ID No：3、15、27、39、51、63、75、87、99和111的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR3，和/或其中所述TCR β或δ鏈包含與選自SEQ ID No：9、21、33、45、57、69、81、93、105和117的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR3。

第10項：根據第9項中所述的抗原識別構建體，其中TCR α或γ鏈進一步包含與選自SEQ ID No：1、13、25、37、49、61、73、85、97和109的氨基酸具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR1和/或與選自SEQ ID No：2、14、26、38、50、62、74、86、98和110的氨基酸具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR2。

第11項：根據第9或10項中所述的抗原識別構建體，其中TCR β或γ鏈進一步包含與選自SEQ ID No：7、19、31、43、55、67、79、91、103和115的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR1和/或與選自SEQ ID No：8、20、32、44、56、68、80、92、104和116的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的CDR2。

第12項：根據第1至11項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與選自SEQ ID No：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112和118的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的TCR可變鏈區。

第13項：根據第1至12項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體被人源化、嵌合化和/或鼠源化。

第14項：根據第1至13項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含TCR的結合片段，並且其中所述結合片段包含CDR1至CDR3，其或可選自具有SEQ ID No：1、2、3或7、8、9或13、14、15或19、20、21或25、26、27或31、32、33或37、38、39或43、44、45或49、50、51或55、56、57或61、62、63或67、68、69或73、74、75或79、80、81或85、86、87或91、92、93或97、98、99或103、104、105或109、110、111或115、116、117的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

第15項：根據第1至14項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為由至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列組成的TCR或其片段，其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：1至3的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：7至9的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：13至15的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：19至21的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：25至27的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：31至33的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：37至39的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：43至45的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：49至51的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：55至57的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：61至63的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：67至69的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：73至75的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：79至81的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：85至87的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：91至93的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：97至99的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：103至105的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：109至111的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列，所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：115至117的氨基酸序列的CDR1至CDR3序列。

第16項：根據第1至15項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為由至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列組成的TCR或其片段，其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：4的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：10的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：16的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：22的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：28的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：34的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：40的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：46的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：52的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：58的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：64的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：70的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：76的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：82的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：88的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：94的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：100的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：106的氨基酸序列的可變區序列；或其中所述TCR α鏈序列包含具有SEQ ID No：112的氨基酸序列的可變區序列，並且其中所述TCR β鏈序列包含具有SEQ ID No：118的氨基酸序列的可變區序列。

第17項：根據第1至16項中任一項所述的抗原識別構建體，其中所述構建體為TCR或其片段，其還包含與選自ID NO.5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113和119的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80、90%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的TCR恒定區；優選地，其中TCR由至少一個TCR α和一個TCR β鏈序列組成，其中TCR α鏈序列包含與SEQ ID No：5、17、29、41、53、65、77、89、101和113的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的恒定區。

第18項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：6的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：12的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第19項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：18的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：24的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第20項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：30的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：36的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第21項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：42的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：48的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第22項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：54的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、 99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：60的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第23項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：66的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：72的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第24項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：78的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：84的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第25項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：90的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：96的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、 80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第26項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：102的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：108的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第27項：根據第1至17項中任一項所述的抗原識別構建體，其包含與SEQ ID No：114的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第一個TCR鏈，以及與SEQ ID No：120的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%序列同一性的第二個TCR鏈。

第28項：一種核酸，其編碼根據第1至27項中任一項的抗原識別構建體。

第29項：一種載體，其包含根據第28項所述的核酸。

第30項：一種宿主細胞，其包含根據第1至27項中任一項所述的抗原識別構建體或根據第28項所述的核酸或根據第29項所述的載體。

第31項：根據第30項所述的宿主細胞，其中所述細胞為淋巴細胞，優選為T淋巴細胞或T淋巴細胞祖細胞，更優選為CD4或CD8陽性T細胞。

第32項：一種藥物組合物，其包含根據第1至27項中任一項所述的抗原識別構建體，或根據第28項所述的核酸，或根據第29項所述的載體，或根據第30或31項所述的宿主細胞，以及藥用載體、穩定劑和/或賦形劑。

第33項：根據第1至27項中任一項所述的抗原識別構建體，或根據第28項所述的核酸，或根據第29項所述的載體，或根據第30或31項所述的宿主細胞，或根據第32項用於藥物的藥物組合物。

第34項：抗原識別構建體或核酸或載體或宿主細胞或藥物組合物根據第33項所述的用途，在診斷、預防和/或治療增殖性疾病的用途，其中所述疾病包括惡性或良性腫瘤疾病。

第35項：抗原識別構建體或核酸或載體或宿主細胞或藥物組合物根據第34項所述的用途，其中所述腫瘤疾病的特徵在於TAA在腫瘤疾病的腫瘤細胞中表達。

第36項：抗原識別構建體或核酸或載體或宿主細胞或藥物組合物根據第33至35項中任一項所述的用途，其中所述在藥物中的用途是在免疫治療中的用途，任選地包含過繼細胞轉移，其中所述免疫治療包括過繼自體或異源T細胞治療。

第37項：一種製備表達細胞系的TAA特異性抗原識別構建體的方法，包括 a. 提出合適的宿主細胞， b. 提出一種遺傳構建體，其包含編碼根據第1至27項中任一項所述的抗原識別構建體的編碼序列， c. 引入所述合適的宿主細胞、所述遺傳構建體， d. 由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。

第38項：根據第37項所述的方法，還包括所述抗原識別構建體的細胞表面提呈。

第39項：根據第37或38項所述的方法，其中所述遺傳構建體是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。

第40項：根據第37至39項中任一項所述的方法，其中所述抗原識別構建體為哺乳動物來源，優選為人來源。

第41項：根據第37至40項中任一項所述的方法，其中所述合適的宿主細胞為哺乳動物細胞，其任選地選自人細胞或人T淋巴細胞。

第42項：根據第37至41項中任一項所述的方法，其中所述抗原識別構建體為修飾的TCR，其中所述修飾包括添加包含標記的功能結構域或包含膜錨定結構域的可選結構域。

第43項：根據第42項所述的方法，其中所述抗原識別構建體為α/β TCR、γ/δ TCR或單鏈TCR(scTCR)。

第44項：根據第37至43項中任一項所述的方法，其中所述遺傳構建體透過逆轉錄病毒轉染被導入所述合適的宿主細胞。

第45項：根據第37至44項中任一項所述的方法，進一步包括從合適的宿主細胞分離和純化所述抗原識別構建體，或在T細胞中重構所述抗原識別構建體。

第46項：一種在靶細胞異常表達TAA的患者中殺傷靶細胞的方法，所述方法包含患者施用有效量的表達前項任一項中的TCR的T細胞、核酸、表達載體、宿主細胞和/或前項中的藥物組合物。

第47項：前項任一項中所述的TCR，其中所述α鏈包含與SEQ ID No：4所述的氨基酸序列至少95%相同的TCR α可變結構域；β鏈包含與SEQ ID No：10至少95%相同的TCR β可變結構域，其中TCR與TAA肽-MHC分子複合體特異性結合。

第48項：前項任一項中所述的TCR，其相對於SEQ ID No：4在α鏈中有至少一個突變和/或相對於SEQ ID No：10在β鏈中有至少一個突變，並且其中TCR對TAA肽HLA分子複合體的結合親和力和/或結合半衰期是未突變TCR對相同肽的結合親和力和/或結合半衰期的至少兩倍。

第49項：前項任一項中所述的TCR，其相對於SEQ ID No：4在α鏈中有至少一個突變和/或相對於SEQ ID No：10在β鏈中有至少一個突變，並且其中與未突變的TCR相比，TCR已經修飾了糖基化。

第50項：前項中所述疾病的治療方法，其中TCR、核酸、表達載體、宿主細胞或藥物組合物兩次施用時間的間隔至少為24小時。

第51項：第50項所述的方法，其中TCR、核酸、表達載體、宿主細胞或藥物組合物透過局部輸注(例如：透過輸液泵和/或導管系統)施用給受試者數天、數週或數月。

第52項：第51項所述的方法，其中所述局部輸注為注入實體腫瘤、供應實體腫瘤的血管和/或實體腫瘤周圍區域。

第52項：前項任一項中所述疾病的治療方法，其中TCR、核酸、表達載體、宿主細胞或藥物組合物的施用劑量為每劑約10⁴至約10¹⁰個細胞。

第53項：一種TCR，其包含至少一個選自SEQ ID No：4的的α鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組中的α鏈互補決定區(CDR)；和/或包含至少一個選自SEQ ID No：10的的β鏈CDR1、CDR2和CDR3組成的組中的β鏈互補決定區(CDR)，並且其中所述TCR與TAA肽-MHC分子複合體特異性結合。

實施例

從健康供體的T細胞中分離和擴增十種MAGEA1-003特異性TCR（R26P1A9、R26P2A6、R26P3H1、R35P3A4、R37P1C9、R37P1H1、R42P3A9、R43P3F2、R43P3G5和R59P2E7，參見表1），每種編碼腫瘤特異性TCR-α和TCR-β鏈。根據之前描述的方法(Walter et al., 2003 J Immunol., Nov 15; 171(10):4974-8)體外刺激來自健康供體的細胞，靶標特異性細胞使用HLA-A*02多聚體進行單細胞分選，然後進行隨後的TCR分離。例如根據Green和Sambrook所著的分子克隆實驗室手冊第四版所述的標準方法透過5'RACE分離TCR序列。對TCR R26P1A9、R26P2A6、R26P3H1 R42P3A9、R43P3F2、R43P3G5、R59P2E7 35P3A4、R37P1C9和R37P1H1的的α和β可變區進行測序，並透過基因合成產生表達構建體用於進一步的功能表征。

R26P1A9、R26P2A6、R26P3H1、R42P3A9、R43P3F2、R43P3G5和R59P2E7來自 HLA-A*02陰性供體（同種反應性環境），R35P3A4、R37P1C9和R37P1H1來自HLA-A*02陽性供體。

相關TCR透過轉導，例如透過mRNA電穿孔或慢病毒轉導，在人T細胞中表達。對於慢病毒轉導，將PBMC解凍並靜置過夜，然後使用固定抗體活化。使用編碼MAGEA1特異性TCR的慢病毒載體轉導活化細胞，並在有細胞因子的情況下擴增。收集T細胞並透過離心濃縮，然後冷凍保存。

在與不同靶細胞（例如載有不同肽的T2細胞以及腫瘤細胞系和來自健康組織的原代細胞）共培養後，評估T細胞的IFN-γ釋放情況。T細胞活化資料以絕對IFN-γ水準或背景減除方法顯示，如下所示。

例如，透過使用不同腫瘤細胞系作為靶細胞的T細胞活化研究（IFN-γ釋放）或殺傷測定方法確定表達TCR R35P3A4、R37P1C9和R43P3G5的的CD8+T細胞的療效。在與來自健康組織的分離原代細胞類型和HLA-A * 02陽性供體的誘導多能幹細胞(iPSC)來源的細胞類型共同培養後，透過測定TCR表達T細胞的潛在活化，逐步獲得相關TCR的安全性特徵的表徵(圖33)。細胞類型選擇的方式是涵蓋關鍵器官，例如，腦、心臟和肝臟以及作為上皮、內膜或平滑肌的不同細胞類型。腫瘤細胞系被逐側分析為陽性和陰性對照。

IFN-γ釋放的背景減除方法：平均值_{bg(TCRoi；co)}=[平均值_(TCRoi；co)-平均值_{(TCRoi；僅效應子)}]-[平均值_{(模擬；co)}-平均值_{(模擬；僅效應子)}]

計算各自的SD_bg：SD_{bg(TCRoi；co)}=[SD_(TCRoi；co) ²+SD_{(TCRoi；僅效應子)} ²+SD_{(模擬；co)} ²+SD_{(模擬；僅效應子)} ²]^[1/2]

TCRoi=表達相關TCR的相應細胞

模擬=無外源TCR表達的效應細胞

Co=與靶細胞共培養的效應細胞

僅效應子=未共培養的效應細胞

平均值_(bg)=平均IFN-γ釋放(背景減除)

SD_(bg)=標準偏差(背景減除)

實施例1：T細胞受體R26P1A9

TCR R26P1A9(SEQ ID No：1-12)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖11)。R26P1A9特異性識別 MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，其載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖1和22)。TCR R26P1A9確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖11)。NYESO1-001肽用作陰性對照。TCR R26P1A9的的EC50為6nM(圖36)。

實施例2：T細胞受體R26P2A6

TCR R26P2A6(SEQ ID No：13-24)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖12)。R26P2A6特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖2和23)。TCR R26P2A6確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖12)。NYESO1-001肽用作陰性對照。TCR R26P2A9的的EC50為100nM(圖37)。

實施例3：T細胞受體R26P3H1

TCR R26P3H1(SEQ ID No：25-36)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖13)。R26P3H1特異性識別 MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖3和24)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖13)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為16nM。

實施例4：T細胞受體R35P3A4

TCR R35P3A4(SEQ ID No：37-48)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見上圖14)。R35P3A4特異性識別MAGEA1-003，因為在HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞當釋放IFN-γ並分別結合HLA-A * 02四聚體，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖4和25)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖14)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為16nM(圖38)，親和力為29μM。

對於表達TCRR35P3A4的的CD8+T細胞，在與來自健康組織的HLA-A * 02陽性細胞類型共培養後未觀察到活化(參見圖33)，而對表達HLA-A * 02和MAGEA1作為MAGEA1-003肽源基因的腫瘤細胞系 UACC-257和U266B1有活性(圖32和33)。在表達NYESO1特異性對照TCR1G4的的CD8+T細胞中觀察到相應的反應性模式，其對表達HLA-A * 02陽性腫瘤細胞系的NYESO1具有反應性，但對指定的健康組織細胞組沒有反應性。

與表達HLA-A * 02和MAGEA1的細胞系共培養後的T細胞活化反映了透過TCR R35P3A4識別內源表達和提呈的靶pHLA(提呈在人白細胞抗原上的肽)。

實施例5：T細胞受體R37P1C9

TCR R37P1C9(SEQ ID No：49-60)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖15)。R37P1C9特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖5和26)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖15)。NYESO1-001肽用作陰性對照。TCR的的EC50為13nM(圖34B和39)，親和力為8.7μM。

R37P1C9在人原代CD8+T細胞中再次表達導致HLA-A * 02/MAGEA1-003四聚體而不是HLA-A * 02/NYESO1-001四聚體的選擇性結合(圖 21)。NYESO1-001特異性TCR1G4的再次表達和模擬表達作為對照。

對於表達TCR R37P1C9的的CD8+T細胞，在與來自健康組織的HLA-A * 02陽性細胞類型共培養後未觀察到活化(參見圖33)，而對表達HLA-A * 02和MAGEA1作為MAGEA1-003肽源基因的腫瘤細胞系UACC-257和U266B1有活性(圖32和33)。在表達NYESO1特異性對照TCR 1G4的的CD8+T細胞中觀察到相應的反應性模式，其對表達HLA-A * 02陽性腫瘤細胞系的NYESO1具有反應性，但對指定的健康組織細胞組沒有反應性。

與表達HLA-A * 02和MAGEA1的細胞系共培養後的T細胞活化反映了透過TCR R37P1C9識別內源表達和提呈的靶pHLA，獨立於基因傳遞方法，例如：mRNA電穿孔、慢病毒轉導等(圖32和34)。

實施例6：T細胞受體R37P1H1

TCR R37P1H1(SEQ ID No：61-72)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖16)。R37P1H1特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖6和27)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖16)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為26nM(圖40)。

R37P1H1在人原代CD8+T細胞中再次表達導致HLA-A * 02/MAGEA1-003四聚體而不是HLA-A * 02/NYESO1-001四聚體的選擇性結合(圖21)。NYESO1-001特異性TCR1G4的再次表達和模擬表達作為對照。

實施例7：T細胞受體R42P3A9

TCR R42P3A9(SEQ ID No：73-84)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖17)。R42P3A9特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖7和28)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖17)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為823nM(圖41)。

實施例8：T細胞受體R43P3F2

TCR R42P3F2(SEQ ID No：85-96)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖18)。R42P3F2特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖8和29)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖18)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為1,7nM(圖42)。

實施例9：T細胞受體R43P3G5

TCR R43P3G5(SEQ ID No：97-108)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖19)。R43P3G5特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖9和30)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖19)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為6,6nM(圖43)，親和力為38μM。

R43P3G5在人原代CD8+T細胞中再次表達導致HLA-A * 02/MAGEA1-003四聚體而不是HLA-A * 02/NYESO1-001四聚體的選擇性結合(圖21)。NYESO1-001特異性TCR 1G4的再次表達和模擬表達作為對照。

對於表達TCR R43P3G5的的CD8+T細胞，在與來自健康組織的HLA-A * 02陽性細胞類型共培養後未觀察到活化(參見圖33)，而對表達HLA-A * 02和MAGEA1作為MAGEA1-003肽源基因的腫瘤細胞系UACC-257和U266B1有活性(圖32和33)。在表達NYESO1特異性對照TCR 1G4的的CD8+T細胞中觀察到相應的反應性模式，其對表達HLA-A * 02陽性腫瘤細胞系的NYESO1具有反應性，但對指定的健康組織細胞組沒有反應性。與表達HLA-A * 02和MAGEA1的細胞系共培養後的T細胞活化反映了透過TCR R43P3G5識別內源表達和提呈的靶pHLA。

實施例10：T細胞受體R59P2E7

TCR R59P2E7(SEQ ID No：109-120)受限於HLA-A * 02提呈的MAGEA1-003(SEQ ID No：133)(參見圖20)。R59P2E7特異性識別MAGEA1-003，因為與HLA-A * 02+靶細胞共同培養後再次表達該TCR的人原代CD8+T細胞釋放IFN-γ，該靶細胞載有MAGEA1-003肽或MAGEA1-003的丙氨酸和蘇氨酸取代變體(圖10和31)。該TCR確實可特異性識別MAGEA1-003，但不是與MAGEA1-003顯示出高度序列相似性的不同肽(圖20)。NYESO1-001肽用作陰性對照。該TCR的EC50為386nM(圖44)。

R59P2E7在人原代CD8+T細胞中再次表達導致HLA-A * 02/MAGEA1-003四聚體而不是HLA-A * 02/NYESO1-001四聚體的選擇性結合(圖21）。NYESO1-001特異性TCR 1G4的再次表達和模擬表達作為對照。

無

在以下實施例中將對本發明進一步進行說明，參照隨附圖表和序列，但是不僅限於此。為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式併入本文。在圖和序列中：圖1：用TCR R26P1A9(SEQ ID No：1-12)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖2：用TCR R26P2A6(SEQ ID No：13-24)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖3：用TCR R26P3H1(SEQ ID No：25-36)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖4：用TCR R35P3A4(SEQ ID No：37-48)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004) 顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖5：用TCR R37P1C9(SEQ ID No：49-60)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖6：用TCR R37P1H1(SEQ ID No：61-72)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖7：用TCR R42P3A9(SEQ ID No：73-84)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖8：用TCR R43P3F2(SEQ ID No：85-96)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖9：用TCR R43P3G5(SEQ ID No：97-108)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的 IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖10：用TCR R59P2E7(SEQ ID No：109-120)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：134-142)1-9位置處的各種MAGEA1-003丙氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖11：用TCR R26P1A9(SEQ ID No：1-12)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖12：用TCR R26P2A6(SEQ ID No：13-24)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、 TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖13：用TCR R26P3H1(SEQ ID No：25-36)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖14：用TCR R35P3A4(SEQ ID No：37-48)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖15：用TCR R37P1C9(SEQ ID No：49-60)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖16：用TCR R37P1H1(SEQ ID No：61-72)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、 TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖17：用TCR R42P3A9(SEQ ID No：73-84)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖18：用TCR R43P3F2(SEQ ID No：85-96)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖19：用TCR R43P3G5(SEQ ID No：97-108)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖20：用TCR R59P2E7(SEQ ID No：109-120)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)、或同源但不相關肽TMEM175-001(SEQ ID No：143)、EPAS-001(SEQ ID No：144)、PTRF-001(SEQ ID No：145)、GALNTL4-001(SEQ ID No：146)、PSME2-001(SEQ ID No：147)、KIAA103-002(SEQ ID No：148)、NSD1-001(SEQ ID No：149)、TBC1D9-002(SEQ ID No：150)、 TMTC4-001(SEQ ID No：151)或RASAL2-002(SEQ ID No：152)或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)的T2靶細胞進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0004)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0005)顯示於右側Y軸上。

圖21：分別對TCR R26P2A6和R26P3H1的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞進行HLA-A * 02/MAGEA1-003四聚體或HLA-A * 02/NYESO1-001四聚體染色。與HLA-A * 02/NYESO1-001複合體特異性結合的1G4TCR的的RNA電穿孔的CD8+T細胞和模擬電穿孔CD8+T細胞作為對照。

圖22：用TCR R26P1A9(SEQ ID No：1-12)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006) 顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖23：用TCR R26P2A6(SEQ ID No：13-24)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖24：用TCR R26P3H1(SEQ ID No：25-36)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖25：用TCR R35P3A4(SEQ ID No：37-48)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖26：用TCR R37P1C9(SEQ ID No：49-60)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖27：用TCR R37P1H1(SEQ ID No：61-72)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的 IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自一個供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖28：用TCR R42P3A9(SEQ ID No：73-84)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自一個供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。

圖29：用TCR R43P3F2(SEQ ID No：85-96)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖30：用TCR R43P3G5(SEQ ID No：97-108)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006)顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖31：用TCR R59P2E7(SEQ ID No：109-120)的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞、或SEQ ID No：1(SEQ ID No：154-162)1-9位置處的各種MAGEA1-003蘇氨酸取代變體或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)進行共同培養後。用源自兩個不同供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨或與未載入靶細胞共孵育作為對照。供體1(TCR A-0006) 顯示於左側Y軸上，供體2(TCR A-0007)顯示於右側Y軸上。

圖32：用TCR R35P3A4(SEQ ID No：37-48)、R37P1C9(SEQ ID No：49-60)和R43P3G5(SEQ ID No：97-108)的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放，在與不同腫瘤細胞系共同培養後。U266B1和UACC-257提呈靶細胞，KMM-1、NCI-H2023、L-1236、MCF-7和A-375不提呈靶細胞。載有MAGEA1-003的的T2靶細胞或對照肽NYESO1-001(SEQ ID No：153)和RNA電穿孔的CD8+T細胞單獨作為對照。

圖33：用含有TCR R35P3A4(SEQ ID No：37-48；構建體R35D、R35G)、R37P1C9(SEQ ID No：49-60；構建體R37D)和R43P3G5(SEQ ID No：97-108；構建體R43A、R43H)的α和β鏈的不同構建體進行慢病毒轉導後自T細胞的IFN-γ釋放，在與不同原代細胞和iPSC衍生細胞類型共同培養後。U266B1和UACC-257和T細胞單獨作為對照。

圖 34 ：用含有TCR R37P1C9的α和β鏈的不同構建體進行慢病毒轉導後自T細胞的IFN-γ釋放，以評估LV-R37D介導識別內源性地處理和提呈的MAGEA1-003。(A)來自三個健康供體的未轉導(NT)或用LV-R37D轉導的T細胞與3種不同腫瘤細胞系進行共同培養。用內源性表達MAGEA1（UACC257和U266B1）或缺乏表面提呈(KMM1)的HLA-A*02+腫瘤細胞系產生IFN-γ。顯示了E:T目標值。(B)用連續稀釋的MAGEA1肽脈衝T2細胞產生IFN-γ。共培養以E:T比4:1（60,000個T細胞；15,000個T2細胞）確立。三次重複（供體）20小時後釋放的IFN-γ平均值和標準偏差顯示為ELISA的重複測量值。

圖 35 ：效力測定，評估表達TCR R37P1C9（構建體R37D）的慢病毒轉導的T細胞針對MAGEA1+腫瘤細胞的細胞溶解活性。針對(A)U138MG MAGEA1+腫瘤細胞(HLA-A*02+)、(B)U138MG MAGEA1-(HLA-A*02+)或(C)U2-OS MAGEA1+(HLA-A*02+)腫瘤細胞測量的LV-R37D轉導的和未轉導的(NT)T細胞的細胞毒性應答。在基於96小時螢光顯微鏡檢查的細胞毒性測定中，以各種E:T比（A和B）或以E:T比10:1(C)進行了測定。結果以3次重複的平均值±SD表示。NT-未轉導的。對於圖A和圖B，%殺傷=(T細胞實驗樣本的曲線下面積/腫瘤靶區曲線下面積) * 100，其中曲線下面積根據縱向生長測量值計算，如圖C所示；陰性%殺傷值設定為0。

圖36：用TCR R26P1A9的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。用源自兩個不同健康供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。

圖37：用TCR R26P2A6的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。用源自兩個不同健康供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。

圖38：用TCR R35P3A4的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。

圖39：用TCR R37P1C9的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。用源自兩個不同健康供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。

圖40：用TCR R37P1H1的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。

圖41：用TCR R42P3A9的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。

圖42：用TCR R43P3F2的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。用源自兩個不同健康供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。

圖43：用TCR R43P3G5的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。用源自兩個不同健康供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。

圖44：用TCR R59P2E7的的α和β鏈RNA電穿孔的CD8+T細胞的IFN-γ釋放(表1)，在用與載有MAGEA1-003肽(SEQ ID No：133)的T2靶細胞在10μM至10pM不同肽負載濃度中進行共同培養後。用源自兩個不同健康供體的CD8+T細胞獲得IFN-γ釋放資料。

<110> 德商英麥提克生物技術股份有限公司

<120> 新型T細胞受體及其免疫治療應用

<130> 106143114

<150> DE 102016123847.3

<151> 2016-12-08

<150> US 62/431,588

<151> 2016-12-08

<160> 162

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

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Claims

一種抗原識別構建體，當SEQ ID No：133的MAGEA1抗原肽由HLA提呈時，所述抗原識別構建體特異性地和選擇性地結合至SEQ ID No：133的MAGEA1抗原肽，其中所述抗原識別構建體包含一TCR α可變結構域與一TCR β可變結構域，或一TCR γ可變結構域與一TCR δ可變結構域，且其中a.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：49的互補決定區(CDR)1、一根據SEQ ID No：50的CDR2與一根據SEQ ID No：51的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：55的CDR1、一根據SEQ ID No：56的CDR2與一根據SEQ ID No：57的CDR3，或b.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：1的CDR1、一根據SEQ ID No：2的CDR2與一根據SEQ ID No：3的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：7的CDR1、一根據SEQ ID No：8的CDR2與一根據SEQ ID No：9的CDR3，或c.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：13的CDR1、一根據SEQ ID No：14的CDR2與一根據SEQ ID No：15的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：19的CDR1、一根據SEQ ID No：20的CDR2與一根據SEQ ID No：21的CDR3，或d.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：25的CDR1、一根據SEQ ID No：26的CDR2與一根據SEQ ID No：27的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：31的CDR1、一根據SEQ ID No：32的CDR2與一根據SEQ ID No：33的CDR3，或e.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：37的CDR1、一根據SEQ ID No：38的CDR2與一根據SEQ ID No：39的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：43的CDR1、一根據SEQ ID No：44的CDR2與一根據SEQ ID No：45的CDR3，或f.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：61的CDR1、一根據SEQ ID No：62的CDR2與一根據SEQ ID No：63的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：67的CDR1、一根據SEQ ID No：68的CDR2與一根據SEQ ID No：69的CDR3，或g.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：73的CDR1、一根據SEQ ID No：74的CDR2與一根據SEQ ID No：75的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：79的CDR1、一根據SEQ ID No：80的CDR2與一根據SEQ ID No：81的CDR3，或h.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：85的CDR1、一根據SEQ ID No：86的CDR2與一根據SEQ ID No：87的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：91的CDR1、一根據SEQ ID No：92的CDR2與一根據SEQ ID No：93的CDR3，或i.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：97的CDR1、一根據SEQ ID No：98的CDR2與一根據SEQ ID No：99的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：103的CDR1、一根據SEQ ID No：104的CDR2與一根據SEQ ID No：105的CDR3，或j.所述TCR α可變結構域或TCR γ可變結構域包括一根據SEQ ID No：109的CDR1、一根據SEQ ID No：110的CDR2與一根據SEQ ID No：111的CDR3，且所述TCR β可變結構域或TCR δ可變結構域包括一根據SEQ ID No：115的CDR1、一根據SEQ ID No：116的CDR2與一根據SEQ ID No：117的CDR3，其中當SEQ ID No：143至152的任何修飾MAGEA1-003肽由HLA提呈時，所述抗原識別構建體並不選擇性地結合至SEQ ID No：143至152的任何修飾MAGEA1-003肽。
根據請求項1所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一抗體或其片段、或一α/β T細胞受體(TCR)或其片段或一γ/δ TCR或其片段。
根據請求項2所述的抗原識別構建體，其中所述抗體為一雙特異性抗體。
根據請求項2所述的抗原識別構建體，其中所述TCR為一單鏈TCR(scTCR)。
根據請求項1或2所述的抗原識別構建體，其包含與選自SEQ ID No：4、10、16、22、28、34、40、46、52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112和118的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的TCR可變鏈區。
根據請求項1或2所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一包括至少一TCR α鏈序列與一TCR β鏈序列的TCR或其片段，其中a.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：52的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：58的可變區序列，或b.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：4的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：10的可變區序列，或c.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：16的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：22的可變區序列，或d.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：28的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：34的可變區序列，或e.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：40的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據 SEQ ID No：46的可變區序列，或f.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：64的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：70的可變區序列，或g.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：76的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：82的可變區序列，或h.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：88的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：94的可變區序列，或i.所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：100的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：106的可變區序列，或j.其中所述TCR α鏈序列包括一根據SEQ ID No：112的可變區序列，且其中所述TCR β鏈序列包括一根據SEQ ID No：118的可變區序列。
根據請求項1或2所述的抗原識別構建體，其中所述抗原識別構建體為一TCR或其片段，所述TCR或其片段進一步包含與選自SEQ ID No：5、11、17、23、29、35、41、47、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113和119的氨基酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、 98%、99%、或100%序列同一性的TCR恆定區。
根據請求項2所述的抗原識別構建體，其中所述TCR為一可溶性TCR
一種核酸，其編碼根據請求項1至8中任一項的抗原識別構建體。
一種載體，其包含根據請求項9所述的核酸。
一種宿主細胞，其包含根據請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體，或根據請求項9所述的核酸或根據請求項10所述的載體。
一種藥物組合物，其包含根據請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體，或根據請求項9所述的核酸，或根據請求項10所述的載體，或根據請求項11所述的宿主細胞，以及藥用載體、穩定劑和/或賦形劑。
一種藥物組合物，其包含一治療有效劑量的請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體，或請求項9所述的核酸，或請求項10所述的載體，或請求項11所述的宿主細胞，或請求項12所述的藥物組合物。
一種請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體、或請求項9所述的核酸、或請求項10所述的載體、或請求項11所述的宿主細胞、或請求項12所述的藥物組合物用於製造一藥物的用途，所述藥物用於診斷、預防和/或治療一增殖性疾病。
根據請求項14所述的用途，其中所述治療包括給予需要所述治療患者的過繼性免疫細胞轉移(adoptive immune cell transfer)。
一種製備MAGEA1特異性抗原識別構建體的方法，包括a.提供一合適的宿主細胞，b.提供一基因構建體，其包含編碼根據請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體的編碼序列，c.將所述基因構建體引入所述合適的宿主細胞，d.由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。
根據請求項16所述的方法，進一步包括從所述合適的宿主細胞分離和純化所述抗原識別構建體。
一種體外檢測生物樣本中癌症的方法，包括：a)使生物樣本與請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體接觸，以及b)檢測抗原識別構建體與生物樣本的結合情況。