JP2023515131A - がんおよび関連する悪性腫瘍の治療のためにｔ細胞を増殖させる方法 - Google Patents

がんおよび関連する悪性腫瘍の治療のためにｔ細胞を増殖させる方法 Download PDF

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Abstract

γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、アミノビスホスホネ-トおよび／またはフィ-ダ-細胞と、少なくとも１つのサイトカインとの存在下で単離γδＴ細胞を活性化するステップと、活性化γδＴ細胞を増殖させるステップと、任意選択的に増殖したγδＴ細胞を再刺激するステップとを含む、γδＴ細胞を増殖させるインビトロ法。

Description

提出された配列表への言及
配列表の公式コピ-は、２０２１年２月２２日に作成され５１，３６０バイトのサイズを有する「３００００１１-０２０９７７_Ｓｅｑ_Ｌｉｓｔｉｎｇ_ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルであり、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ-Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式のドキュメントに含まれている配列表は明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
１．分野
本開示は、Ｔ細胞の増殖および活性化に関する。一態様では、本開示は、導入遺伝子発現のために使用されてもよい、γδＴ細胞の増殖および活性化に関する。別の態様では、本開示は、α-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させる一方で、γδＴ細胞を増殖および活性化させることに関する。増殖したγδＴ細胞と、枯渇または減少したα-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞とを含むＴ細胞集団もまた、本開示によって提供される。本開示は、開示されたＴ細胞集団を使用する方法をさらに提供する。
２．背景
γδＴ細胞は、αβＴＣＲの代わりにγδＴＣＲを発現するＴ細胞のサブセットに相当する。γδＴ細胞は、組織結合型Ｖδ２陰性細胞と、末梢循環型Ｖδ２陽性細胞、より具体的にはＶγ９δ２という、２つの主要なサブセットに分類され得る。どちらのサブセットも、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を有することが示されている。従来のαβＴＣＲ発現細胞とは異なり、γδＴＣＲ発現細胞は、古典的なＭＨＣＩおよびＩＩとは無関係にそれらの標的を認識する。ナチュラルキラ-（ＮＫ）Ｔ細胞と同様に、γδＴ細胞は、ストレスを受けた細胞および／または腫瘍細胞上に存在する非古典的ＭＨＣ分子、すなわちＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）およびＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）に結合する、ＮＫＧ２Ｄを発現する。γδＴＣＲは、例えば、ストレスおよび／または腫瘍関連ホスホ抗原などの様々なリガンドを認識する。γδＴ細胞は、複数の機序、すなわち、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、パ-フォリン、およびグランザイム分泌を介して、それらの標的の直接的な細胞溶解を媒介する。さらに、ＣＤ１６を発現するγδＴ細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強する。
末梢血液中に一般にわずか１～５％の量で存在することもあるγδΤの問題は、特に少量の血液を採取して、次に、そこからの細胞を活性化および／または増殖させる場合に、医学的処置に十分なγδΤ細胞の純度と数が確保され得ないことである。医学的処置に十分なγδΤ細胞の純度と数を確保するために、患者からの採血量を増やすことにはまた、患者の負担が大きいという問題がある。
商業的に実現可能な治療製品として十分な数のγδＴ細胞を調製し得る方法の必要性が、依然として存在する。この技術的問題の解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって提供される。
本出願は、γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、フィ-ダ-細胞および少なくとも１つのサイトカインの存在下で単離されたγδＴ細胞を活性化するステップと、活性化γδＴ細胞を増殖させるステップとを含む、γδＴ細胞を増殖させる方法を提供する。
本開示は、γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、少なくとも１つのサイトカインと、１）アミノビスホスホネ-ト、２）フィ-ダ-細胞、または３）アミノビスホスホネ-トおよびフィ-ダ-細胞の１つまたは複数との存在下で、単離されたγδＴ細胞を活性化するステップと、活性化γδＴ細胞を増殖させるステップと、増殖したγδＴ細胞を再刺激するステップとを含む、γδＴ細胞を増殖させる方法をさらに提供する。
一態様では、血液サンプルは、白血球アフェレ-シス産物を含んでなる。
一態様では、血液サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含んでなる。
いくつかの態様では、活性化は、アミノビスホスホネ-トの存在下である。
いくつかの態様では、アミノビスホスホネ-トは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物を含んでなる。
いくつかの態様では、アミノビスホスホネ-トは、ゾレドロン酸を含んでなる。
いくつかの態様では、少なくとも１つのサイトカインは、インタ-ロイキン（ＩＬ）-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-１８、ＩＬ-１５、ＩＬ-２１、インタ-フェロン（ＩＦＮ）-α、およびＩＦＮ-βからなる群から選択される。
いくつかの態様では、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ-２およびＩＬ-１５を含んでなる。
一態様では、単離は、血液サンプルを抗αおよび抗βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）抗体と接触させ、血液サンプルからα-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させるステップを含んでなる。
一態様では、フィ-ダ-細胞は、腫瘍細胞またはリンパ芽球様細胞株である。
いくつかの態様では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。
いくつかの態様では、腫瘍細胞は、少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの組換えタンパク質は、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、ＩＬ-１５は膜結合型ＩＬ-１５である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの組換えタンパク質は、４-１ＢＢＬおよび／または膜結合型ＩＬ-１５である。
いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は照射されている。
いくつかの態様では、単離γδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約１：１～約５０：１（フィ-ダ-細胞：単離γδＴ細胞）の比率で混合される。いくつかの態様では、単離γδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約２：１～約２０：１（フィ-ダ-細胞：単離γδＴ細胞）の比率で存在する。いくつかの態様では、単離γδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約１：１、約１：５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１または約５０：１（フィ-ダ-細胞：単離γδＴ細胞）の比率で存在する。
一態様では、本出願の方法は、活性化γδＴ細胞を増殖前に組換えウイルスベクタ-で形質導入するステップをさらに含む。
一態様では、増殖は、アミノビスフォスフォネ-トの非存在下で、例えば、ＩＬ-２および／またはＩＬ-１５などの少なくとも１つのサイトカインの存在下である。
いくつかの態様では、本開示の方法は、増殖したγδＴ細胞を再刺激することを含む。
いくつかの態様では、再刺激は、増殖したγδＴ細胞を、活性化中に使用されるフィ-ダ-細胞（存在する場合）と同一であるかまたは異なり得るさらなるフィ-ダ-細胞と接触させることを含んでなる。
いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞およびさらなるフィ-ダ-細胞は、約１：１～約５０：１（さらなるフィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で混合される。いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞およびさらなるフィ-ダ-細胞は、約２：１～約２０：１（さらなるフィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で存在する。いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞とさらなるフィ-ダ-細胞は、約１：１、約１：５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１または約５０：１（さらなるフィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で存在する。
一態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は、単球、ＰＢＭＣ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は、ヒト対象にとって自系である。
いくつかの態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は、ヒト対象にとって同種異系である。
いくつかの態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は、αβＴ細胞が枯渇している。
いくつかの態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は、再刺激の前に、ゾレドロン酸などのアミノビスホスホネ-トによって接触またはパルスされる。
一態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は、腫瘍細胞またはリンパ芽球様細胞株である。
いくつかの態様では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞である。
いくつかの態様では、腫瘍細胞は、少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である。
いくつかの態様では、少なくとも１つの組換えタンパク質は、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの態様では、ＩＬ-１５は膜結合型ＩＬ-１５である。
いくつかの態様では、さらなるフィ-ダ-細胞は照射されている。
一態様では、本出願は、本開示の方法によって調製された増殖γδＴ細胞の集団に関し、その中では増殖したγδＴ細胞の密度は、少なくとも約１×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０８細胞／ｍｌ、または少なくとも約１×１０９細胞／ｍｌである。
一態様では、本出願は、本開示の方法によって調製された、増殖したγδＴ細胞の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、がんを治療する方法に関する。
一態様では、がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん；小脳星細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫などの脳腫瘍；乳がん、気管支腺腫、バ-キットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸がん、小児期がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユ-イング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん；非小細胞および小細胞肺がんなどの肺がん；リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレ-ムマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
一態様では、がんは黒色腫である。
一態様では、本出願は、本開示の方法によって調製された、増殖したγδＴ細胞の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、感染性疾患を治療する方法に関する。
一態様では、感染性疾患は、デング熱、エボラ、マ-ルブルグウイルス、結核（ＴＢ）、髄膜炎、および梅毒からなる群から選択される。
一態様では、本出願は、本開示の方法によって調製された、増殖したγδＴ細胞の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、自己免疫疾患を治療する方法に関する。
一態様では、自己免疫疾患は、関節炎、慢性閉塞性肺疾患、強直性脊椎炎、クロ-ン病（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つのタイプのうちの１つ）、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、子宮内膜症、グッドパスチャ-症候群、バセドウ病、ギラン・バレ-症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、川崎病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマト-デス、混合性結合組織病、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシ-、神経筋強直症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、リウマチ様関節炎、統合失調症、強皮症、シェ-グレン症候群、スティッフパ-ソン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つのタイプのうちの１つ）、脈管炎、白斑、およびウェゲネル肉芽腫からなる群から選択される。
一態様では、本出願は、γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、フィ-ダ-細胞の非存在下で単離γδＴ細胞を活性化するステップと、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコ-ド化する核酸を含んでなるベクタ-を活性化γδＴ細胞に導入するステップと、フィ-ダ-細胞の存在下で形質導入γδＴ細胞を増殖させるステップとを含む、γδＴ細胞を調製する方法に関する。
別の態様では、活性化、形質導入、および／または増殖は、インタ-ロイキン（ＩＬ）-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２１、インタ-フェロン（ＩＦＮ）-α、およびＩＦＮ-βからなる群から択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で実施されてもよい。
別の態様では、フィ-ダ-細胞は、ヒト細胞、非ヒト細胞、ウイルス感染細胞、非イルス感染細胞、細胞抽出物、粒子、ビ-ズ、フィラメント、またはそれらの組み合わせであってもよい。
別の態様では、フィ-ダ-細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を含んでもよい。
別の態様では、活性化、形質導入、および／または増殖は、ＯＫＴ３の存在下で実施されてもよい。
別の態様では、増殖したγδＴ細胞は、δ１および／またはδ２Ｔ細胞を含んでもよい。
別の態様では、ベクタ-は、ウイルスベクタ-または非ウイルスベクタ-であってもよい。
別の態様では、ベクタ-は、ＴＣＲをコ-ド化する核酸と、ＣＤ８αβまたはＣＤ８αをコ-ド化する核酸とを含んでもよい。
特許または出願ファイルには、カラ-で作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラ-図面を含むこの特許または特許出願公開のコピ-は、要求および必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
本開示の性質、目的、および利点のさらなる理解のために、同様の参照番号が同様の要素を示す以下の図面と併せて読まれる、以下の詳細な説明を参照すべきである。
本開示の一実施形態による、同種異系Ｔ細胞療法を示す。同種異系Ｔ細胞療法は、γδＴ細胞を健常ドナ-から採取するステップと、外因性ＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子のウイルス形質導入によってγδＴ細胞を操作するステップと、それに続く細胞増殖、増殖した操作されたγδＴ細胞の収穫を含んでもよく、γδＴ細胞は、患者に輸液する前にＴ細胞製品として凍結保存されもよい。 本開示の一実施形態による、γδＴ細胞製造を示す。γδＴ細胞製造は、例えば、白血球アフェレ-シス産物などの白血球またはＰＢＭＣを採取または入手するステップと、ＰＢＭＣまたは白血球アフェレ-シス産物からαβＴ細胞を枯渇させるステップと、それに続くγδＴ細胞の活性化、形質導入、増殖、および任意選択的に再活性化を含んでもよい。 図３Ａ：γδＴ細胞の増殖に対する、自系単球による再刺激の効果を示す。再刺激工程を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化された。３日目に、活性化γδＴ細胞は模擬形質導入された。４日目に、模擬形質導入細胞が増殖される。７日目に、増殖した細胞は、ＺＯＬ（１００μＭ）の存在下、ＰＢＭＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）からＣＤ１４＋選択によって得られた自系単球によって、１０（単球）：１（γδＴ細胞）の比率で４時間再刺激された。図３Ｂ：単球による再刺激が、再刺激なしの場合と比較して、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られたγδＴ細胞の増殖倍数を増加させることを示す。再刺激細胞の増殖倍数は、１０日後に減少する。１４日目までに、再刺激細胞の増殖倍数は、再刺激なしの場合と同様の増殖倍数まで減少する。 γδＴ細胞の増殖に対する、照射自系単球による再刺激の効果を示す。図４Ａ：再刺激工程を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化された。２日目に、活性化γδＴ細胞は模擬形質導入された。３日目に、模擬形質導入細胞が増殖される。７日目に、増殖した細胞は、ＺＯＬ（１００μＭ）の存在下、照射（１００Ｇｙ）自系αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣによって、５：１または１０：１（αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）の比率で４時間再刺激された。図４Ｂ：αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣによって５：１および１０：１の比率で再刺激すると、再刺激なしの場合と比較して、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られたγδＴ細胞の増殖倍数が増加されることを示す。 図６～図１１に示すデ-タを生成するために使用された増殖工程を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化された。２日目に、活性化γδＴ細胞を模擬形質導入した。３日目に、模擬形質導入細胞が増殖される。７日目および１４日目に、増殖した細胞は、１）１：１、５：１または１０：１（単球：γδＴ細胞）の比率の自系単球（ＰＢＭＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）からＣＤ１４＋選択によって得られ、ＺＯＬ（１００μＭ）で４時間パルスした）、または２）１０：１または２０：１（αβ消耗ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）の比率の照射（１００Ｇｙ）自系αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ（ＺＯＬ（１００μＭ）で４時間パルス処理した）のどちらかによって再刺激された。 ２人のドナ-（Ｄ１（図６Ａ）およびＤ２（図６Ｂ））からのγδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。γδＴ細胞は、図５に示されるように活性化され増殖された。 同上 １人のドナ-からのγδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。γδＴ細胞は、図５に示されるように活性化され増殖された。図７Ａは、全γδＴ細胞の増殖倍数を示し、図７Ｂは、δ２Ｔ細胞の増殖倍数を示し、図７Ｃは、δ１Ｔ細胞の増殖倍数を示す。 同上 同上 第２のドナ-からのγδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣをによる複数回の再刺激の効果を示す。γδＴ細胞は、図５に示されるように活性化され増殖された。図８Ａは、全γδＴ細胞の増殖倍数を示し、図８Ｂは、δ２Ｔ細胞の増殖倍数を示し、図８Ｃは、δ１Ｔ細胞の増殖倍数を示す。 同上 同上 自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激が、増殖したγδＴ細胞の記憶表現型を有意に変化させないことを示す。１人のドナ-からのγδＴ細胞が、図５に示すように活性化され増殖されて、２１日目に採取され、フロ-サイトメトリ-によって分析されて、細胞表面上のＣＤ４５、ＣＤ２７、およびＣＣＲ７の検出によって記憶表現型が判定された。ＣＤ２７発現のわずかな増加が、１０：１の単球で再刺激された増殖したγδＴ細胞で検出された。 自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激が、増殖したγδＴ細胞の記憶表現型を有意に変化させないことを示す。第２のドナ-からのγδＴ細胞が、図５に示すように活性化され増殖されて、２１日目に収穫され、フロ-サイトメトリ-によって分析されて、細胞表面上のＣＤ４５、ＣＤ２７、およびＣＣＲ７の検出によって記憶表現型が判定された。ＣＤ２７発現のわずかな増加が、１０：１の単球で再刺激された増殖したγδＴ細胞で検出された。 増殖したγδＴ細胞の生存率に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。２人のドナ-からのδＴ細胞が、図５に示されるように活性化され増殖されて、２１日目に採取され、フロ-サイトメトリ-によって分析されて、全γδＴ細胞集団中の生細胞の百分率が判定された。ドナ-１からの結果は図１１Ａに、ドナ-２からの結果は図１１Ｂに示される。 同上 操作された腫瘍由来細胞の共培養がγδＴ細胞に及ぼす影響を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化された。照射腫瘍由来細胞（Ｋ５６２）が、２：１の比率（腫瘍由来細胞：γδＴ細胞）で、ＺＯＬの存在下または非存在下で一部のサンプルに添加された。その他のサンプルは、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ２７ｍＡｂで被覆されたプレ-ト上で培養された。３日目に、活性化γδＴ細胞が模擬形質導入された。４日目に、模擬形質導入細胞が増殖された。増殖した細胞は２１日目に冷凍された。図１２Ａ-１２Ｂ：照射腫瘍由来の細胞＋／-ＺＯＬで刺激された２人のドナ-（Ｄ１（図１２Ａ）およびＤ２（図１２Ｂ））から得られたγδＴ細胞が、抗ＣＤ２８抗体＋ＺＯＬ、抗ＣＤ２７抗体＋ＺＯＬ、およびＺＯＬ単独（対照）で刺激されたものより高い増殖倍数を有することを示す。 同上 γδＴ細胞の活性化中に様々な腫瘍由来細胞を共培養した結果を示す。図１３Ａ：ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化された、２人のドナ-（Ｄ１（上側パネル）およびＤ２（下側パネル））から得られたγδＴ細胞の増殖倍数を示す：１）腫瘍由来細胞非存在下で（対照）；２）野生型腫瘍由来細胞（Ｋ５６２ＷＴ）によって；３）改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型１）によって；４）改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；５）ＺＯＬの非存在下で改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；および６）ＺＯＬの非存在下で改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって、７日目および１４日目に再刺激（Ｋ５６２変異型２＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）。図１３Ｂ-１３Ｃ：ドナ-１（図１３Ｂ）およびドナ-２（図１３Ｃ）における、δ１（左パネル）およびδ２（右パネル）Ｔ細胞の双方の増殖を示す。 同上 同上 γδＴ細胞の活性化中に様々な腫瘍由来細胞を共培養した結果を示す。図１４Ａ-４Ｂ：全生細胞集団内に存在するγδＴ細胞の百分率を示す。簡潔に述べると、２人のドナ-（Ｄ１（図１４Ａ）およびＤ２（図１４Ｂ））から得られた細胞は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化された：１）腫瘍由来細胞非存在下で（対照）；２）野生型腫瘍由来細胞（Ｋ５６２ＷＴ）によって；３）改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型１）によって；４）改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；５）ＺＯＬの非存在下で改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；および６）ＺＯＬの非存在下で改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって、７日目および１４日目に再刺激（Ｋ５６２変異型２＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）。 培養物中のゾレドロン酸の欠乏が、ゾレドロン酸が培養物中にある条件と比較して、ポリクロ-ナル集団（δ１およびδ２γδＴ細胞の双方）をもたらすことを示す。簡潔に述べると、２人のドナ-（Ｄ１（上部パネル）およびＤ２（下部パネル））から得られた細胞は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化された：１）腫瘍由来細胞非存在下で（対照）；２）野生型腫瘍由来細胞（Ｋ５６２）によって；３）ＺＯＬの非存在下で改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；４）ＺＯＬの非存在下で改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって、７日目および１４日目に再刺激（Ｋ５６２変異型２＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）、５）改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；および６）改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型１）によって。細胞は２１日目に採取され、フロ-サイトメトリ-によって分析されて、δ１およびδ２集団が判定された。 腫瘍由来の共培養が、増殖したγδＴ細胞の記憶表現型を変化させないことを示す。簡潔に述べると、２人のドナ-（Ｄ１（上部パネル）およびＤ２（下部パネル））から得られた細胞は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化された：１）腫瘍由来細胞非存在下で（対照）；２）野生型腫瘍由来細胞によって；３）ＺＯＬの非存在下で４-１ＢＢＬおよび膜結合型ＩＬ-１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作された腫瘍由来細胞によって；４）ＺＯＬの非存在下で、４-１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５を発現する腫瘍由来細胞（４-１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５を発現する腫瘍由来細胞）によって、７日目および１４日目に再刺激、５）４-１ＢＢＬおよびｍｂＩＬ１５を発現する腫瘍由来細胞によって、および６）ＣＤ８６を発現する腫瘍由来細胞によって。細胞は２１日目に採取され、フロ-サイトメトリ-によって解析されて、細胞表面のＣＤ４５、ＣＤ２７、およびＣＣＲ７を検出することによって記憶表現型が判定された。 ２人のドナ-（Ｄ１（図１７Ａ）およびＤ２（図１７Ｂ））からのγδＴ細胞の増殖に対する、照射同種異系ＰＢＭＣ＋／-ＬＣＬによる複数回の再刺激の効果を示す。簡潔に述べると、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られた細胞は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化され、２日目に模擬形質導入され、３日目に増殖された。７日目および１４日目に、増殖した細胞は、１）対照（１００Ｕ／ｍｌＩＬ-２＋１００ｎｇ／ｍｌＩＬ-１５）；２）ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３（２～３人のドナ-からプ-ルされた２５×１０６照射同種異系ＰＢＭＣ＋５×１０６照射ＬＣＬ＋３０ｎｇ／ｍｌ ｓＯＴＫ３＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）；３）ＰＢＭＣ（２～３人のドナ-からプ-ルされた２５×１０６照射同種異系ＰＢＭＣ＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）；４）ＬＣＬ（５×１０６照射ＬＣＬ＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）；または５）ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ ｓＯＴＫ３＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）によって再刺激された。 同上 ２人のドナ-からのγδＴ細胞の増殖に対する、照射同種異系ＰＢＭＣ＋／-ＬＣＬによる複数回の再刺激の効果を示す。γδＴ細胞は、図１７Ａ-Ｂについて上述したように活性化され、増殖された。図１８Ａ-１８Ｂ：２人のドナ-からのδ１Ｔ細胞の増殖倍数を示す。図１８Ｃ：対照処置（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）およびＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３再刺激処理からの２人のドナ-からの２１日目のフロ-サイトメトリ-の結果を示す。 同上 同上 ＰＢＭＣ＋／-ＬＣＬで再刺激された２人のドナ-からの増殖したγδＴ細胞の記憶表現型を示す。簡潔に述べると、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られた細胞は、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化され、２日目に模擬形質導入され、３日目に増殖された。７日目に、増殖した細胞は、１）対照（１００Ｕ／ｍｌＩＬ-２＋１００ｎｇ／ｍｌＩＬ-１５）；２）ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３（２～３人のドナ-からプ-ルされた２５×１０６照射同種異系ＰＢＭＣ＋５×１０６照射ＬＣＬ＋３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ３＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）；３）ＰＢＭＣ（２～３人のドナ-からプ-ルされた２５×１０６照射同種異系ＰＢＭＣ＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）；または４）ＬＣＬ（５×１０６照射ＬＣＬ＋５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ-２）で再刺激された。細胞は１４日目に採取され、フロ-サイトメトリ-によって解析されて、細胞表面のＣＤ４５、ＣＤ２７、およびＣＣＲ７を検出することによって記憶表現型が判定された。 同上 ペプチド陽性のＵ２ＯＳ細胞（図２０Ａ）またはペプチド陰性のＭＣＦ７細胞（図２０Ｂ）に対して、様々な工程で調製されたＴＣＲを導入したＴ細胞（ＴＣＲ-Ｔ）または導入しないＴ細胞（ＮＴ）の殺滅活性を示す図である。 同上 本開示の一実施形態によるＴ細胞の製造工程を示す。 対照工程（図２２Ａ）、工程１（図２２Ｂ）、工程２（図２２Ｃ）、および工程３（図２２Ｄ）によって調製されたγδＴ細胞の増殖倍数を示す。 同上 様々な工程によって調製されたγδＴ細胞の表現型ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-（図２３Ａ）、ＣＤ６２Ｌ＋（図２３Ｂ）、およびＣＤ５７＋（図２３Ｃ）を示す。 同上 図２４Ａ～２４Ｄは、様々な工程によって調製されたＰＤ１（図２４Ａ）、ＬＡＧ３（図２４Ｂ）、ＴＩＭ３（図２４Ｃ）、およびＴＩＧＩＴ（図２４Ｄ）を発現するγδＴ細胞の％を示す。 同上 同上 同上 様々な工程によって調製された、例えば、ＴＣＲなどの導入遺伝子を発現するγδＴ細胞の％（図２５Ａ）、およびγδＴ細胞に組み込まれたＴＣＲのコピ-数（図２５Ｂ）を示す。 対照工程（図２６Ａ）、工程２（図２６Ｂ）、および工程３（図２６Ｃ）によって調製された、例えば、ＣＤ８や、ＰＲＡＭＥペプチド／ＭＨＣ複合体に結合するＴＣＲなどの導入遺伝子を発現するγδＴ細胞の％を示す。 図２７Ａ：本開示の別の実施形態によるＴ細胞の製造工程を示す。図２７Ｂ：様々な工程によって調製されたγδＴ細胞の増殖倍数を示す。 ０日目にＫ５６２細胞で刺激され、それに続いて６０μｌ（図２８Ａ）、１２０μｌ（図２８Ｂ）、および２４０μｌ（図２８Ｃ）の導入遺伝子をコ-ド化するウイルスベクタ-を２日目に導入することによって調製された、例えば、ＣＤ８およびＴＣＲなどの導入遺伝子を発現するγδＴ細胞の％を示す。図２８Ｄ：図２８Ａ～２８Ｃに示す工程によって調製されたγδＴ細胞における、組み込まれた導入遺伝子のコピ-数を示す。 図２８Ｅ：２日目に６０μｌの導入遺伝子をコ-ドするウイルスベクタ-で形質導入され、それに続いて４日目にＫ５６２細胞で刺激することによって調製された、例えば、ＣＤ８およびＴＣＲなどの導入遺伝子を発現するγδＴ細胞の％を示す。図２８Ｆ：図２８Ｅに示されている工程によって調製されたγδＴ細胞における、組み込まれた導入遺伝子コピ-数を示す。 例えば、ＣＤ８およびＴＣＲなどの導入遺伝子を発現する、様々な工程によって調製されたγδＴ細胞の％を示す。 本開示の別の実施形態によるγδＴ細胞製造工程を示す。 ＵＡＣＣ２５７細胞（図３１Ａ）、Ｕ２ＯＳ細胞（図３１Ｂ）、Ａ３７５細胞（図３１Ｃ）、およびＭＣＦ７細胞（図３１Ｄ）に対する、様々な工程によって調製されたγδＴ細胞の殺滅活性を示す。 同上 ＵＡＣＣ２５７細胞（図３２Ａ）、Ｕ２ＯＳ細胞（図３２Ｂ）、およびＭＣＦ７細胞（図３２Ｃ）に対する、様々な工程によって調製されたγδＴ細胞からのＩＦＮγ分泌を示す。 ＵＡＣＣ２５７細胞（図３３Ａ）、Ｕ２ＯＳ細胞（図３３Ｂ）、およびＭＣＦ７細胞（図３３Ｃ）に対する、様々な工程によって調製されたγδＴ細胞からのＴＮＦα分泌を示す。 ＵＡＣＣ２５７細胞（図３４Ａ）、Ｕ２ＯＳ細胞（図３４Ｂ）、およびＭＣＦ７細胞（図３４Ｃ）に対する、様々な工程によって調製されたγδＴ細胞からのＧＭ-ＣＳＦ分泌を示す。 様々な工程によって調製された、２人のドナ-（ドナ-１（図３５Ａ）およびドナ-２（図３５Ｂ））から得られたγδＴによって誘導されるＵＡＣＣ２５７細胞の増殖阻害を示す。 様々な工程によって調製された、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＴＩＧＩＴを発現する導入遺伝子（ＣＤ８およびＴＣＲ）発現γδＴ細胞の％を示す。 本開示のいくつかの実施形態によるγδＴ細胞の製造工程を示す。 様々な工程によって調製された、ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋γδＴ細胞を示す。 様々な工程によって調製された、３人のドナ-（ＳＤ０１００４６８７（図３９Ａ）、Ｄ１５５４１０（図３９Ｂ）、およびＳＤ０１００００２５６（図３９Ｃ））から得られたγδＴ細胞の増殖倍数を示す。 同上 同上 対照工程（図４０Ａ）、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１（ｗ１）（図４０Ｂ）、およびＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１（ｗ２）（図４０Ｃ）によって調製されたδ１およびδ２Ｔ細胞の％を示す。 同上 同上 様々な工程によって調製された、ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋γδＴ細胞の％を示す。 様々な工程によって調製された、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-γδＴ細胞の％を示す。 様々な工程によって調製された、ＣＤ５７＋γδＴ細胞の％を示す。 本開示のいくつかの実施形態によるγδＴ細胞の製造工程を示す。 ＩＬ-２Ｒα、ＩＬ-２Ｒβ、ＩＬ-２Ｒγ、ＩＬ-７Ｒα、およびＩＬ-２１Ｒを発現する、２人のドナ-（Ｄ１５５４１０（図４３Ａ）およびＳＤ０１０００４８６７（図４３Ｂ））から得られたγδＴ細胞の％を示す。 同上 様々な工程によって調製された、３人のドナ-（ＳＤ０１０００４８６７（図４４Ａ）、Ｄ１５５４１０（図４４Ｂ）、およびＳＤ０１００００２５６（図４４Ｃ））から得られたγδＴ細胞の増殖倍数を示す。 同上 同上 ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８ プライミング（図４５Ａ）、ＩＬ-２＋ＩＬ-１５（図４５Ｂ）、および対照工程（図４５Ｃ）によって調製された、δ１およびδ２Ｔ細胞の％を示す。 同上 同上 様々な工程によって調製された、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-γδＴ細胞の％を示す。 様々な工程によって調製された、ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋γδＴ細胞の％を示す。 様々な工程によって調製された、ＣＤ５７＋γδＴ細胞の％を示す。 様々な工程によって調製された、２人のドナ-（Ｄ１４８９６０（図４７Ａ）およびＳＤ０１００００７２３（図４７Ｂ））から得られたδ１およびδ２Ｔ細胞の％を示す。 同上 様々な工程によって調製された、ドナ-ＳＤ０１００００７２３から得られたδ１（図４８Ａ）およびδ２（図４８Ｂ）Ｔ細胞の％を示す。 同上 様々な工程によって調製された、ドナ-Ｄ１４８９６０から得られたδ１（図４９Ａ）およびδ２（図４９Ｂ）Ｔ細胞の％を示す。 同上
同種異系Ｔ細胞療法は、同種異系γδＴ細胞を遺伝子操作して、外因性ＴＣＲを発現させることに基づいてもよい。異所性ＴＣＲまたはＣＡＲを介した特異的な腫瘍認識に加えて、γδＴ細胞は、本明細書に記載されるような多数の腫瘍タイプに対する活性を有してもよい。
「γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）」という用語は、本明細書の用法では、１本のγ鎖と１本のδ鎖から構成される独特のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、γδＴＣＲを表面に発現しているＴ細胞のサブセットを指す。「γδＴ細胞」という用語は、Ｖδ１およびＶδ２、Ｖδ３γδＴ細胞、ならびにナイ-ブ、エフェクタ-記憶、中央記憶、および最終分化γδＴ細胞をはじめとするがこれらに限定されない、γδＴ細胞の全てのサブセットを具体的に含む。さらなる例として、「γδＴ細胞」という用語は、Ｖδ４、Ｖδ５、Ｖδ７、およびＶδ８γδＴ細胞、ならびにＶγ２、Ｖγ３、Ｖγ５、Ｖγ８、Ｖγ９、Ｖγ１０、およびＶγ１１γδＴ細胞を含む。
「濃縮された」細胞集団または調製物は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率の特定の細胞型を含有する、出発混合細胞集団に由来する細胞集団を指す。例えば、出発混合細胞集団は、特定のγδＴ細胞集団について濃縮され得る。一実施形態では、濃縮されたγδＴ細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率のδ１細胞を含有する。別の例として、濃縮されたγδＴ細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率のδ１細胞および高い百分率のδ３細胞の双方を含有し得る。なおも別の例として、濃縮されたγδＴ細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率のδ１細胞および高い百分率のδ４細胞の双方を含有し得る。なおも別の例として、濃縮されたγδＴ細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率のδ１Ｔ細胞、δ３Ｔ細胞、δ４Ｔ細胞、およびδ５Ｔ細胞を含有し得る。別の実施形態では、濃縮されたγδＴ細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率のδ２細胞を含有する。なおも別の実施形態では、濃縮されたγδＴ細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の百分率よりも高い百分率のδ１細胞およびδ２細胞の双方を含有する。全ての実施形態において、濃縮されたγδＴ細胞集団は、αβＴ細胞集団をより少ない百分率で含有する。
「増殖された」とは、本明細書の用法では、濃縮された調製物中の所望のまたは標的細胞型（例えば、δ１および／またはδ２Ｔ細胞）の数が、最初のまたは出発細胞集団における数よりも高くあってもよいことを意味する。「選択的に増殖させる」とは、標的細胞型（例えば、δ１またはδ２Ｔ細胞）が、例えば、αβＴ細胞またはＮＫ細胞などのその他の非標的細胞型よりも優先的に増殖されてもよいことを意味する。特定の実施形態では、本出願の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の有意な増殖なしに、例えば、操作されたまたは操作されていないδ１Ｔ細胞が選択的に増殖されてもよい。別の実施形態では、本出願の活性化剤は、δ１Ｔ細胞の有意な増殖なしに、例えば、操作されたまたは操作されていないδ２Ｔ細胞が選択的に増殖されてもよい。特定の実施形態では、本出願の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の有意な増殖なしに、例えば、操作されたまたは操作されていないδ１およびδ３Ｔ細胞が選択的に増殖されてもよい。特定の実施形態では、本出願の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の有意な増殖なしに、例えば、操作されたまたは操作されていないδ１およびδ４Ｔ細胞が選択的に増殖されてもよい。特定の実施形態では、本出願の活性化剤は、δ２Ｔ細胞の有意な増殖なしに、例えば、操作されたまたは操作されていないδ１、δ３、δ４、およびδ５Ｔ細胞が選択的に増殖されてもよい。この文脈において、「有意な増殖なし」という用語は、優先的に増殖した細胞集団が、参照細胞集団よりも少なくとも１０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは１，０００倍増殖することを意味する。増殖したＴ細胞集団は、例えば、異なる集団を区別する細胞表面マ-カ-の磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）染色によって特性決定されてもよい。
γδＴ細胞の単離
いくつかの態様では、本出願は、操作されたまたは操作されていないγδＴ細胞の増殖のための生体外法を提供してもよい。場合によっては、方法は、ＩＬ-４、ＩＬ-２、またはＩＬ-１５、またはそれらの組み合わせなどのγδＴ細胞の特定の集団の増殖を促進するサイトカインを含まなくてもよい、１つまたは複数の（たとえば、第１および／または第２の）増殖ステップを採用してもよい。いくつかの実施形態では、本出願は、混合細胞集団を１つまたは複数の薬剤と接触させることを含む、単離混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を作製するための生体外法を提供してもよく、それは、δ１ＴＣＲ；δ１およびδ４ＴＣＲ；またはδ１、δ３、δ４、およびδ５ＴＣＲにそれぞれ特異的なエピト-プに結合させることによって、δ１Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞およびδ３Ｔ細胞；δ１Ｔ細胞およびδ４Ｔ細胞；またはδ１、δ３、δ４、およびδ５Ｔ細胞を選択的に増殖させ、濃縮γδＴ細胞集団を提供する。その他の態様では、本出願は、混合細胞集団を、δ２ＴＣＲに特異的なエピト-プに結合させることによってδ２Ｔ細胞を選択的に増殖させ、濃縮γδＴ細胞集団を提供する１つまたは複数の薬剤と接触させることを含む、単離混合細胞集団から濃縮γδＴ細胞集団を作製するための生体外法を提供してもよい。
一態様では、本開示は、Ｔ細胞の増殖および／または活性化に関する。別の態様では、本開示は、γδＴＣＲに対する抗体などのγδＴＣＲに特異的なエピト-プに結合する薬剤の非存在下における、γδＴ細胞の増殖および／または活性化に関する。一態様では、本開示は、導入遺伝子発現のために使用されてもよい、γδＴ細胞の増殖および／または活性化に関する。
本開示は、α-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させている間における、γδＴ細胞の増殖および活性化にさらに関する。増殖したγδＴ細胞と、枯渇または減少したα-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞とを含むＴ細胞集団もまた、本開示によって提供される。本開示は、開示されたＴ細胞集団を使用する方法をさらに提供する。
一態様では、大規模優良製造規範（ＧＭＰ）グレ-ドのＴＣＲ操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞を製造するための方法が、本明細書で提供される。
支持細胞の非存在下では、精製されたγδＴ細胞へのＩＬ-１８の添加は、ＩＬ-２に対する表面高親和性受容体（ＣＤ２５またはＩＬ-２Ｒａ）の量の顕著な増加を伴う、γδＴ細胞の増殖を促進する。 さらに、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドであるアンホテリシンＢは、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を活性化し、高親和性ＩＬ-２ＲαであるＣＤ２５の表面発現の検出を増強し得る。これらの結果は集合的に、Ｖγ９δ２Ｔ細胞のゾレドロネ-ト媒介性活性化と増殖における、ＩＬ-２シグナル伝達の重要な役割を強調する。したがって、ＩＬ-２シグナル伝達を介したγδＴ細胞増殖のためのＩＬ-２の利用可能性を最大化するために（または多数のαβＴ細胞によるＩＬ-２の隔離を最小化するために）、本開示の方法は、市販のＧＭＰ試薬である抗αβＴＣＲを使用して、正常なＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させることを含んでもよい。組換えＩＬ-１８は、商業的なＧＭＰ試薬として現在入手できないことから、本開示の方法は、低用量のアンホテリシンＢを培養に補給し、ＣＤ２５表面発現を増加させ、ＩＬ-２結合およびシグナル伝達を増強してもよく、それは次に、活性化／増殖中のＩＬ-２応答性を増強してもよい。さらに、ＩＬ-１５は、ＩＰＰで処理されたＶγ９δ２Ｔ細胞の増殖および生存を増加させることが示されているので、ＩＬ-１５が添加されてもよい。
図１は、腫瘍中で関心のある標的を発現する特定のがんを有する適格患者の迅速な治療のために、γδＴ細胞産物などの「既製」Ｔ細胞製品を送達し得る、同種異系Ｔ細胞療法のためのアプロ-チを示す。このアプロ-チは、γδＴ細胞を健常ドナ-から採取するステップと、外因性ＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子のウイルス形質導入によってγδＴ細胞を操作するステップと、それに続く細胞増殖、増殖した操作されたγδＴ細胞の収穫を含んでもよく、γδＴ細胞は、患者に輸液する前に「既製」Ｔ細胞製品として凍結保存されもよい。したがって、このアプロ-チは、個別化Ｔ細胞製造の必要性を排除してもよい。
γδＴ細胞を単離するために、一態様では、γδＴ細胞は、対象から、または対象の複合サンプルから単離されてもよい。一態様では、複合サンプルは、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検、組織、リンパであっても、または外部環境と直接接触する対象の上皮部位からのもの、または幹前駆体細胞に由来するものであってもよい。γδＴ細胞は、例えば、１つまたは複数の細胞表面マ-カ-を発現するγδＴ細胞をフロ-サイトメトリ-技術をによって選別することによって、対象の複合サンプルから直接単離されてもよい。野生型γδＴ細胞は、γδＴ細胞に関連し得る、多数の抗原認識、抗原提示、共刺激、および接着分子を示してもよい。特異的なγδＴＣＲ、抗原認識、抗原提示、リガンド、接着分子、または共刺激分子などの１つまたは複数の細胞表面マ-カ-を使用して、複合サンプルから野生型γδＴ細胞が単離されてもよい。γδＴ細胞に関連する、またはγδＴ細胞によって発現される様々な分子を使用して、複合サンプルからγδＴ細胞が単離されてもよい。別の態様では、本開示は、Ｖδ１＋、Ｖδ２＋、Ｖδ３＋細胞またはそれらの任意の組み合わせを混合集団から単離する方法を提供する。
例えば、末梢血単核細胞は、例えば、Ｆｉｃｏｌ-Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムをはじめとする、アフェレ-シス療法装置、または別の適切な装置／システムを用いて、対象から採取され得る。γδＴ細胞またはγδＴ細胞の所望の亜集団は、採取されたサンプルから、例えば、フロ-サイトメトリ-技術によって精製され得る。臍帯血細胞は、対象の出産時に臍帯血からも入手され得る。
採取されたγδＴ細胞上で発現される細胞表面マ-カ-の陽性および／または陰性選択を使用して、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、腫瘍生検、組織、リンパから、または対象の上皮サンプルから、類似した細胞表面マ-カ-を発現するγδＴ細胞またはγδＴ細胞集団が直接単離され得る。例えば、γδＴ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲδ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４６）、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＣＲ７、およびその他の適切な細胞表面マ-カ-の陽性または陰性発現に基づいて、複合サンプルから単離され得る。
一態様では、γδＴ細胞は、生体外で培養された複合サンプルから単離されてもよい。別の態様では、ＰＢＭＣ集団全体は、単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞などの特定の細胞集団の事前の枯渇なしに、活性化および増殖され得る。別の態様では、富化されたγδＴ細胞集団は、それらの特定の活性化および増殖に先立って作製され得る。別の態様では、γδＴ細胞の活性化および増殖は、ナイ-ブまたは操作されたＡＰＣの存在なしに実施されてもよい。その他の態様では、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離および増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体をはじめとする固定化γδＴ細胞マイトジェン、およびレクチンをはじめとするその他のγδＴＣＲ活性化剤を使用して実施され得る。別の態様では、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離および増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体をはじめとする固定化γδＴ細胞マイトジェン、およびレクチンをはじめとするその他のγδＴＣＲ活性化剤の非存在下で実施され得る。
一態様では、γδＴ細胞は、例えば、ヒト対象などの対象の白血球アフェレ-シスから単離される。別の態様では、γδＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されない。
図２は、本開示の一実施形態による、γδＴ細胞製造を示す。この工程は、白血球またはＰＢＭＣを白血球アフェレ-シス産物から採取または入手することを含んでもよい。白血球アフェレ-シスは、ドナ-から全血を採取し、アフェレ-シス療法装置を使用して成分を分離することを含んでもよい。フェレ-シス療法装置は、所望の血液成分を分離し、残りはドナ-の循環に戻される。例えば、白色血液細胞、血漿、および血小板が、アフェレ-シス療法装置を使用して採取され得て、赤血球と好中球はドナ-の循環に戻される。この工程では、市販の白血球アフェレ-シス産物が使用されてもよい。白血球を入手するための別の方法は、それらをバフィ-コ-トから入手することである。バフィ-コ-トを単離するために、抗凝固全血がドナ-から得られ遠心分離される。遠心分離後に、血液は、血漿、赤血球、およびバフィ-コ-トに分離される。バフィ-コ-トは、血漿層と赤血球層の間に位置する層である。白血球アフェレ-シスの採取は、バフィ-コ-トの採取によって達成されるものよりも、より高い純度と、単核細胞含有量の大幅な増加をもたらしてもよい。白血球アフェレ-シスによって可能な単核細胞含有量は、典型的には、バフィ-コ-トから得られるものの２０倍であってもよい。単核細胞を富化するために、さらなる分離のためのＦｉｃｏｌｌ勾配の使用が必要なこともある。
ＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させるために、例えば、抗αβＴＣＲ抗体で被覆されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）磁気ビ-ズを使用した磁気分離によって、αβＴＣＲ発現細胞をＰＢＭＣから分離してもよく、αβＴＣＲ-Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣの凍結保存がそれに続く。「既製の」Ｔ細胞製品を製造するために、例えば、２～６日間など１～１０日間にわたり、アミノビスホスホネ-ト；および／またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；および／または例えば、インタ-ロイキン２（ＩＬ-２）、インタ-ロイキン１５（ＩＬ-１５）、および／またはインタ-ロイキン１８（ＩＬ-１８）などのサイトカイン；および／または例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドなどのその他の活性化剤の存在下で、例えば、２４から４～６ウェルプレ-トまたはＴ７５／Ｔ１７５フラスコなどの小規模／中規模で、または例えば、５０ｍｌ～１００リットルのバッグなどの大規模で、凍結保存されたαβＴＣＲ-Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣを解凍し、活性化してもよい。
一態様では、単離されたγδＴ細胞は、１つまたは複数の抗原との接触に応答して急速に増殖し得る。Ｖγ９Ｖδ２＋Ｔ細胞などのいくつかのγδＴ細胞は、組織培養中に、プレニルピロリン酸塩、アルキルアミン、および代謝産物または微生物抽出物のようないくつかの抗原との接触に応答して生体外で急速に増殖し得る。刺激されたγδＴ細胞は、複合サンプルからのγδＴ細胞の単離を容易にし得る、多数の抗原提示、刺共激、および接着分子を示し得る。複合サンプル内のγδＴ細胞は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、または別の適当な期間にわたり、少なくとも１つの抗原によって生体外で刺激され得る。適切な抗原によるγδＴ細胞の刺激は、生体外でγδＴ細胞集団を増殖させ得る。
生体外における複合体試料からのγδＴ細胞の増殖を刺激するために使用されてもよい抗原の非限定的な例としては、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、アルキルアミン、ヒト微生物病原体の代謝産物、常在細菌の代謝産物、メチル-３-ブテニル-１-ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（Ｅ）-４-ヒドロキシ-３-メチル-ブト-２-エニルピロリン酸（ＨＭＢ-ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ）、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸塩（ＤＭＡＰ）、ピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）、エチル-アデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ピロリン酸ゲラニル（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル-アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、モノエチルピロリン酸（ＭＥＰＰ）、３-ホルミル-１-ブチル-ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ-ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３-ホルミル-１-ブチル-ウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３-ホルミル-１-ブチル-デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイルピロリン酸、ジメチルアリル-γ-ウリジン三リン酸、クロトイル-γ-ウリジン三リン酸、アリル-γ-ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ-ブチルアミン、イソ-アミルアミン、および窒素含有ビスホスホネ-トなどのプレニルピロリン酸塩が挙げられてもよい。
γδＴ細胞の活性化および増殖は、本明細書に記載の活性化剤および共刺激剤を使用して実施され、特定のγδＴ細胞増殖および持続集団を始動し得る。一態様では、異なる培養からのγδＴ細胞の活性化および増殖は、異なるクロ-ナル集団サブセットまたは混合ポリクロ-ナル集団サブセットを達成し得る。別の態様では、異なる作動薬を使用して、特定のγδ活性化シグナルを提供する作用物質が同定され得る。別の態様では、特定のγδ活性化シグナルを提供する作用物質は、γδＴＣＲに対する異なるモノクロ-ナル抗体（ＭＡｂ）であり得る。別の態様では、細胞エネルギ-およびアポト-シスの誘導なしに、特定のγδＴ細胞増殖を始動させるのを助ける、コンパニオン共刺激剤が使用され得る。これらの共刺激剤としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸ副分子-１（ＤＮＡＭ-１）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、およびＣＤ２８などのγδ細胞上で発現される受容体に結合するリガンドが挙げられ得る。別の態様では、共刺激剤は、ＣＤ２およびＣＤ３分子上の独特のエピト-プに特異的な抗体であり得る。ＣＤ２およびＣＤ３は、αβまたはγδＴ細胞上で発現されたときに、異なる立体構造を有し得る。別の態様では、ＣＤ３およびＣＤ２に対する特異的抗体は、γδＴ細胞の明瞭な活性化をもたらし得る。
いくつかの態様では、γδＴ細胞の活性化および／または増殖は、腫瘍細胞、例えばＫ５６２細胞またはリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）などのフィ-ダ-細胞の存在下で実施され得る。いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、例えば、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、および膜結合型ＩＬ-１５（ｍｂＩＬ-１５）などの１つまたは複数の共刺激剤を発現するように改変される。いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、単球またはＰＢＭＣなどの自系細胞であってもよい。フィ-ダ-細胞は、γ照射フィ-ダ-細胞などの照射フィ-ダ-細胞であってもよい。いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、活性化中にγδＴ細胞と共培養される。フィ-ダ-細胞は、増殖中、例えば、１回または複数回の再刺激段階で、γδＴ細胞と共培養される。活性化中に使用されるフィ-ダ-細胞は、増殖中に使用されるフィ-ダ-細胞と同一であるかまたは異なり得る。
いくつかの態様では、γδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約１：１～約５０：１（フィ-ダ-細胞：γδＴ細胞）の比率で存在する。いくつかの態様では、γδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約２：１～約２０：１（フィ-ダ-細胞：γδＴ細胞）の比率で存在する。いくつかの態様では、γδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約１：１、約１：５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１または約５０：１（フィ-ダ-細胞：γδＴ細胞）の比率で存在する。
γδＴ細胞の操作に先立って、γδＴ細胞の集団が生体外で増殖されてもよい。生体外におけるγδＴ細胞集団の増殖を促進するのに使用され得る試薬の非限定的例としては、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０抗体；ＩＬ-２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１２、ＩＬ-９、ＩＬ-３３、ＩＬ-１８、またはＩＬ-２１、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ヨウシュヤマゴボウ（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、リンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）、またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。
広域スペクトルの抗原を認識するγδＴ細胞の能力は、γδＴ細胞の遺伝子操作によって増強され得る。一態様では、γδＴ細胞は操作され、生体内で選択された抗原を認識する普遍的な同種異系療法が提供され得る。γδＴ細胞の遺伝子操作は、抗原結合およびＴ細胞活性化機能の双方を単一受容体に組み合わせる、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの腫瘍認識部分を発現するコンストラクト、その抗原結合断片、またはリンパ球活性化ドメインを、単離γδＴ細胞、サイトカイン（ＩＬ-１５、ＩＬ-１２、ＩＬ-２．ＩＬ-７．ＩＬ-２１、ＩＬ-１８、ＩＬ-１９、ＩＬ-３３、ＩＬ-４、ＩＬ-９、ＩＬ-２３、ＩＬ１β）のゲノムに安定的に組み込んで、Ｔ細胞の増殖、生存期間、および機能を生体外および生体内で増強することを含んでもよい。単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作はまた、例えば、ＭＨＣ遺伝子座などの単離されたγδＴ細胞のゲノム中の１つまたは複数の内因性遺伝子からの遺伝子発現を欠失させ、または破壊することを含んでもよい。
本明細書で開示されるＴ細胞製造方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（操作されたＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を信頼性が高く再現可能な様式で発現するように改変されたＴ細胞を増殖させるのに有用であってもよい。一実施形態では、Ｔ細胞は、１つまたは複数の操作されたＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子改変されてもよい。本明細書の用法では、Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、またはナチュラルキラ-Ｔ細胞であってもよい。
操作されたＴＣＲ
天然に存在するＴ細胞受容体は、αサブユニットとβサブユニットの２つのサブユニットを含んでなり、これらのサブユニットはそれぞれ、各Ｔ細胞のゲノムにおける組換え事象によって生成される固有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリ-ニングされてもよい。このようにして、標的抗原に対して高い結合力および反応性を有する天然のＴＣＲが選択されクロ-ニングされて、引き続いて養子免疫療法に使用されるＴ細胞集団に導入されてもよい。
一実施形態では、Ｔ細胞は、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性をＴ細胞に付与するＴＣＲを形成する能力を有するＴＣＲのサブユニットをコ-ド化する、ポリヌクレオチドを導入することによって改変されてもよい。特定の実施形態では、サブユニットが、形質移入されたＴ細胞に標的細胞にホ-ミングする能力を付与するＴＣＲを形成する能力を維持し、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、サブユニットは、天然に存在するサブユニットと比較して、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠損、挿入または修飾を有してもよい。操作されたＴＣＲはまた、好ましくは、関連する腫瘍関連ペプチドを提示する標的細胞に高い結合力で結合し、任意選択的に、関連するペプチドを生体内で提示する標的細胞の効率的な殺滅を媒介する。
操作されたＴＣＲをコ-ド化する核酸は、好ましくは、Ｔ細胞の（天然の）染色体におけるそれらの天然の状況から単離されてもよく、本明細書に記載されるような適切なベクタ-に組み込まれ得る。核酸およびそれらを含んでなるベクタ-は、どちらも有用に細胞に移入され得て、この細胞は、好ましくはＴ細胞、より好ましくはγδＴ細胞であってもよい。改変されたＴ細胞は、次に、形質導入された核酸または核酸群によってコ-ド化されるＴＣＲの双方の鎖を発現できてもよい。好ましい実施形態では、操作されたＴＣＲは、特定のＴＣＲを通常は発現しないＴ細胞に導入されるため、外因性ＴＣＲであってもよい。操作されたＴＣＲの本質的側面は、それが、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）または同様の免疫学的成分によって提示される腫瘍抗原に対して高い親和性を有してもよいことである。操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣ非依存様式で標的抗原に結合するように操作されてもよい。
一態様では、操作されたＴＣＲは、ＣＤ８（ＣＤ８αβヘテロ二量体および／またはＣＤ８ααホモ二量体）非依存様式で、γδＴ細胞中で機能してもよい。別の態様では、操作されたＴＣＲは、ＣＤ８（ＣＤ８αβヘテロ二量体および／またはＣＤ８ααホモ二量体）依存様式で、γδＴ細胞中で機能してもよい。後者の場合、γδＴ細胞は、ＴＣＲとＣＤ８（ＣＤ８αとＣＤ８β鎖またはＣＤ８α鎖）の双方をコ-ド化する外因性核酸を発現させることによって改変されてもよい。一態様では、γδＴ細胞は、ＴＣＲおよびＣＤ８（ＣＤ８αおよびＣＤ８β鎖またはＣＤ８α鎖）をコ-ド化する核酸で形質導入または形質移入されてもよく、これらは同じベクタ-または別個のベクタ-上に存在してもよい。
核酸によってコ-ド化されたタンパク質は、付加された付加的なポリペプチドが、α鎖またはβ鎖が機能性Ｔ細胞受容体を形成する能力と、ＭＨＣ依存性の抗原認識に干渉しない限り、ＴＣＲのα鎖またはβ鎖のアミノ末端部分またはカルボキシル末端部分に付加されて発現され得る。
操作されたＴＣＲによって認識される抗原としては、血液学的がんおよび固形腫瘍の双方の抗原をはじめとするが、これらに限定されるものではないがん抗原が挙げられてもよい。例示的な抗原としては、これらに限定されるものではないが、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２が挙げられる。
一態様では、本開示のＴ細胞は、米国特許出願公開第２０１７／０２６７７３８号明細書；米国特許出願公開第２０１７／０３１２３５０号明細書；米国特許出願公開第２０１８／００５１０８０号明細書；米国特許出願公開第２０１８／０１６４３１５号明細書；米国特許出願公開第２０１８／０１６１３９６号明細書；米国特許出願公開第２０１８／０１６２９２２号明細書；米国特許出願公開第２０１８／０２７３６０２号明細書；米国特許出願公開第２０１９／００１６８０１号明細書；米国特許出願公開第２０１９／０００２５５６号明細書；米国特許出願公開第２０１９／０１３５９１４号明細書号明細書；米国特許第１０，５３８，５７３号明細書；米国特許第１０，６２６，１６０号明細書；米国特許出願公開第２０１９／０３２１４７８号明細書；米国特許出願公開第２０１９／０２５６５７２号明細書；米国特許第１０，５５０，１８２号明細書；米国特許第１０，５２６，４０７号明細書；米国特許出願公開第２０１９／０２８４２７６号明細書；米国特許出願公開第２０１９／００１６８０２号明細書；米国特許出願公開第２０１９／００１６８０３号明細書；米国特許出願公開第２０１９／００１６８０４号明細書；米国特許第１０，５８３，５７３号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０３３９６５２号明細書；米国特許第１０，５３７，６２４号明細書；米国特許第１０，５９６，２４２号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０１８８４９７号明細書；米国特許第１０，８００，８４５号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０３８５４６８号明細書；米国特許第１０，５２７，６２３号明細書；米国特許第１０，７２５，０４４号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０２４９２３３号明細書；米国特許第１０，７０２，６０９号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０２５４１０６号明細書；米国特許第１０，８００，８３２号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０１２３２２１号明細書；米国特許第１０，５９０，１９４号明細書；米国特許第１０，７２３，７９６号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０１４０５４０号明細書；米国特許第１０，６１８，９５６号明細書；米国特許出願公開第２０２０／０２０７８４９号明細書；米国特許出願公開第２０２０／００８８７２６号明細書；および米国特許出願公開第２０２０／０３８４０２８号明細書に記載される、ＴＣＲおよび抗原結合タンパク質を発現してもよく、これらの各出版物の内容およびその中に記載される配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、またはナチュラルキラ-Ｔ細胞であってもよい。一実施形態では、本明細書に記載のＴＣＲは、単鎖ＴＣＲまたは可溶性ＴＣＲであってもよい。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で開示されるＴ細胞製造方法は、１つまたは複数のＣＡＲを発現するようにＴ細胞を改変することを含んでもよい。Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、またはナチュラルキラ-Ｔ細胞であってもよい。様々な実施形態において、本開示は、細胞傷害性を腫瘍細胞にリダイレクトするＣＡＲを発現するように設計されたベクタ-で遺伝子操作されたＴ細胞を提供する。ＣＡＲは、例えば、腫瘍抗原などの標的抗原に対する抗体ベ-スの特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書の用法では、「キメラ」という用語は、異なる起源からの異なるタンパク質またはＤＮＡの部分から構成されていることを記述する。
ＣＡＲは、特異的標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含有してもよい。ＣＡＲの主な特徴は、免疫エフェクタ-細胞の特異性をリダイレクトし、それによって主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存様式で、増殖、サイトカイン産生、食作用、または標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発し、モノクロ-ナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を利用する能力であってもよい。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である標的抗原を特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片、係留リガンド、または共同受容体の細胞外ドメインをはじめとするが、これらに限定されるものではない、細胞外結合ドメインを含有してもよい。特定の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、血液がん細胞上で発現されてもよい。別の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、固形腫瘍の細胞上で発現されてもよい。特定の実施形態では、固形腫瘍は、神経膠芽腫、非小細胞肺がん、非小細胞肺がん以外の肺がん、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸がん、胃がん、脾臓のがん、皮膚がん、神経膠芽腫以外の脳がん、腎臓がん、甲状腺がんなどであってもよい。
特定の実施形態では、ＴＡＡまたはＴＳＡは、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、およびＶＥＧＦＲ２からなる群から選択されてもよい。
一態様では、腫瘍関連抗原、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できる、ＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、および米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載される配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
一態様では、本明細書に記載されるＴ細胞は、上記の特許および刊行物の１つまたは複数に記載されるＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。
別の態様では、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できるＴＡＡは、配列番号６～配列番号１６６から選択される少なくとも１つを含む。一態様では、Ｔ細胞は、配列番号６～１６６に記載される、または本明細書に記載の特許または出願のいずれかに記載される、ＴＡＡペプチドを提示する細胞を選択的に認識する。
Figure 2023515131000002
ＣＡＲの結合ドメイン
特定の実施形態では、本明細書で想定されるＣＡＲは、腫瘍細胞上で発現される、例えば標的抗原などの標的ポリペプチドに特異的に結合する細胞外結合ドメインを含んでなる。本明細書の用法では、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、同義的に使用され、目的の標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供してもよい。Ａ結合ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、またはその他の細胞表面標的分子、またはそれらの構成要素）を特異的に認識して結合する能力を保有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含んでもよい。結合ドメインは、目的の生体分子に対する、任意の天然、合成、半合成、または組換産生結合パ-トナ-を含んでもよい。
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含んでもよい。「抗体」は、少なくとも軽鎖または重鎖の免疫グロブリン可変領域を含有するポリペプチドである結合剤を指し、それは、免疫細胞によって認識されるものなどの、抗原決定基を含有するペプチド、脂質、多糖類、または核酸など、標的抗原のエピト-プを特異的に認識して結合する抗体は、それらの抗原結合断片を含んでもよい。用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、例えば、二重特異性抗体などのヘテロ共役抗体、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態もまた含んでもよい。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４-１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）；Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７もまた参照されたい。
特定の実施形態では、標的抗原は、α葉酸受容体のエピト-プ、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドであってもよい。
軽鎖および重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される３つの超可変領域によって中断された「フレ-ムワ-ク」領域を含有してもよい。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（Ｗｕ，ＴＴ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１-５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０-２４４３（１９８７）；（本明細書に参照により援用される、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）による配列、またはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６（４）：９０１-９１７（１９８７）；Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７-８８３（１９８９））による構造などの従来法によって定義または同定され得る。前述の参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。異なる軽鎖または重鎖のフレ-ムワ-ク領域の配列は、ヒトなどの種内で比較的保存されていてもよい。構成要素の軽鎖および重鎖の組み合わされたフレ-ムワ-ク領域である、抗体のフレ-ムワ-ク領域は、三次元空間でＣＤＲを配置および整列させるのにのに役立ってもよい。ＣＤＲは、抗原のエピト-プへの結合を主に担っていてもよい。各鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から始めて順次番号付けされた典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称されてもよく、その中に特定のＣＤＲが位置する鎖によって典型的に同定されてもよい。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３と称されてもよい一方で、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３と称される。特異性の異なる（すなわち、異なる抗原に対する結合部位が異なる）抗体は、異なるＣＤＲを有してもよい。抗体毎に異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。
「ＶＨ」への言及または「ＶＨ」は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、その他の抗体断片をはじめとする、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」への言及または「ＶＬ」は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、その他の抗体断片をはじめとする、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
「モノクロ-ナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クロ-ンによって、またはその中に単一抗体の軽鎖および重鎖遺伝子が形質移入された細胞によって産生される抗体である。モノクロ-ナル抗体は、当業者に知られている方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって、作成されてもよい。モノクロ-ナル抗体は、ヒト化モノクロ-ナル抗体を含んでもよい。
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの生物種からのフレ-ムワ-ク残基と、マウスなどの別の生物種からのＣＤＲ（一般に抗原結合を付与する）とを有する。特定の好ましい実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合断片である抗原特異的結合ドメインを含有してもよい。
特定の実施形態では、抗体は、腫瘍細胞上の表面タンパク質に特異的に結合する、ヒト化抗体（ヒト化モノクロ-ナル抗体など）であってもよい。「ヒト化」抗体は、ヒトフレ-ムワ-ク領域および非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲをはじめとする免疫グロブリンである。ヒト化抗体は、遺伝子操作によって構築され得る（例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照されたい）。
実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ラクダＩｇ（ラクダ科動物抗体（ＶＨＨ））、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス-ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、小型抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）をはじめとするがこれらに限定されるものではない、抗体またはその抗原結合断片を含有してもよい。
「ラクダＩｇ」または「ラクダ科動物ＶＨＨ」とは、本明細書の用法では、重鎖抗体の既知の最小の抗原結合単位を指す（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｋｏｃｈ-Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ ａｌ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１：３４９０-３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科動物抗体」は、２つのＶＨドメインを含み軽鎖を含まない抗体を指す（その内容全体が本明細書に参照により援用される、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５-３８（１９９９）；国際公開第９４／０４６７８号パンフレット；国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；米国特許第６，００５，０７９号明細書）。
「免疫グロブリン新抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」とは、１つの可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインと５つの定常新抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体とからなる、サメ免疫レパ-トリ-からの抗体のクラスを指す。
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合フラグメントと、その名称が容易に結晶化する能力を反映する残りの「Ｆｃ」断片を生成する。Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含めた重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されていることによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’-ＳＨは、その中で定常ドメインのシステイン残基が遊離チオ-ル基を担持するＦａｂ’に対する本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成された。抗体断片のその他の化学共役もまた知られている。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似した「二量体」構造で会合し得るように、可撓性のペプチドリンカ-によって共有結合され得る。
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる、２つの抗原結合部位を有する抗体抗体を指す。同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカ-を使用することによって、ドメインは別の鎖の相補ドメインとの対合を強制され、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号パンフレット；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９-１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４-６４４８（１９９３）でより詳細に説明される。トリアボディおよびテトラボディは、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９-１３４（２００３）にも記載されている。前述の参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」とは、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４-４９０，）。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含んでなり、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中にどちらかの方向で存在する（例えば、ＶＬ-ＶＨまたはＶＨ-ＶＬ）。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカ-をさらに含んでなり、これはｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする。ｓｃＦｖのレビュ-については、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９-３１５を参照されたい。
特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＬＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに結合する。
ＣＡＲのリンカ-
特定の実施形態では、ＣＡＲは、分子の適切な間隔および立体配座のために付加された、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインなどの様々なドメイン間に、リンカ-残基を含有してもよい。ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のリンカ-を含有してもよい。特定の実施形態では、リンカ-の長さは、約１～約２５アミノ酸、約５～約２０アミノ酸、または約１０～約２０アミノ酸、または任意の介在するアミノ酸長であってもよい。いくつかの実施形態では、リンカ-は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。リンカ-の説明に役立つ実例としては、グリシンポリマ-（Ｇ）ｎ；グリシン-セリンポリマ-（Ｇｉ_ｓＳｉ_５）ｎが挙げられ、式中、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数であり；グリシン-アラニンポリマ-；アラニン-セリンポリマ-；およびその他の可撓性リンカ-は、当該技術分野で公知である。グリシンおよびグリシン-セリンポリマ-は比較的構造化されておらず、したがってＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中立テザ-として機能できてもよい。グリシンは、アラニンよりも顕著に多くのｐｈｉ-ｐｓｉ空間にアクセスしてもよく、より長い側鎖を有する残基よりも制限がはるかに少ないくあってもよい（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３-１４２（１９９２）を参照されたい）。通常の熟練した技術者は、所望のＣＡＲ構造を提供するために、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計が、可撓性リンカ-ならびに、より可撓性に劣る構造を付与する１つまたは複数の部分を含み得るように、完全にまたは部分的に可撓性であってもよいリンカ-を含み得ることを認識してもよい。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、可変領域連結配列をさらに含有するｓｃＦＶを含んでもよい。「可変領域連結配列」は、アミノ酸配列であり、これは重鎖可変領域を軽鎖可変領域に連結し、得られたポリペプチドが同じ軽鎖および重鎖可変領域を含有してもよい抗体と同じ標的分子に対する特異的な結合親和性を維持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペ-サ-機能を提供する。一実施形態では、可変領域連結配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長であってもよい。特定の実施形態では、可変領域連結配列は、グリシン-セリンポリマ-（Ｇｉ_ｓＳｉ_５）ｎを含有してもよく、式中、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数である。別の実施形態では、可変領域連結配列は、（Ｇ４Ｓ）３アミノ酸リンカ-を含んでなる。
ＣＡＲのスペ-サ-ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインに１つまたは複数の「スペ-サ-ドメイン」が続いていてもよく、これは、抗原結合ドメインをエフェクタ-細胞表面から遠ざけて、適切な細胞間接触、抗原結合、および活性化を可能にするため領域を指す（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２-４１９）。スペ-サ-ドメインは、天然、合成品、半合成、または組換え源由来のいずれかであってもよい。特定の実施形態では、スペ-サ-ドメインは、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３などの１つまたは複数の重鎖定常領域をはじめとするが、これらに限定されるものではない、免疫グロブリンの部分であってもよい。スペ-サ-ドメインは、天然免疫グロブリンヒンジ領域または改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、スペ-サ-ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３を含んでもよい。
ＣＡＲのヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインの後には、一般に、１つまたは複数の「ヒンジドメイン」が続いてもよく、これは、抗原結合ドメインをエフェクタ-細胞表面から離して配置させ、適切な細胞間接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たしてもよい。ＣＡＲは、一般には、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間の１つまたは複数のヒンジドメインを含んでもよい。ヒンジドメインは、天然、合成品、半合成、または組換え源由来のいずれかであってもよい。ヒンジドメインは、天然免疫グロブリンヒンジ領域または改変免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。ＣＡＲでの使用に適する例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ２８、およびＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含んでもよく、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であってもよく、または改変されていてもよい。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含んでもよい。
ＣＡＲの膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し得て、ＣＡＲを免疫エフェクタ-細胞の原形質膜に固着させる、ＣＡＲの部分であってもよい。ＴＭドメインは、天然、合成品、半合成、または組換え源由来のいずれかであってもよい。例示的なＴＭドメインは、（少なくともその膜貫通領域を含めて）Ｔ細胞受容体のα、β、またはζ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４に由来してもよい。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８ａ由来のＴＭドメインを含有してもよい。別の実施形態では、本明細書で想定されるＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメイン、およびＴＭドメインとＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の間の短いオリゴリンカ-またはポリペプチドリンカ-とを含んでなる。グリシン-セリンリンカ-は、特に適切なリンカ-を提供する。
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含有してもよい。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、標的抗原に効果的に結合したＣＡＲのメッセ-ジを免疫エフェクタ-細胞の内部に伝達し、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、およびＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出をはじめとする細胞傷害活性などのエフェクタ-細胞の機能、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で誘発される他の細胞応答を誘発することに関与する、ＣＡＲの部分を指す。
「エフェクタ-機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ-機能は、例えば、サイトカインの分泌をはじめとする、細胞溶解活性または活性の補助であってもよい。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクタ-機能シグナルを伝達し得て、細胞に特殊な機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用し得るが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケ-ト部分が使用され得る限り、このようなトランケ-ト部分は、エフェクタ-機能シグナルを伝達できる限り、ドメイン全体の代わりに使用されてもよい。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクタ-機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのトランケ-ト部分を含むことを意味してもよい。
ＴＣＲを介して生成されるシグナルだけではＴ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次的なシグナルまたは共刺激シグナルが必要であってもよいことが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）、および抗原非依存様式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインの２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメインによって媒介されると言い得る。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含有してもよい、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでもよい。一次シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性様式、または阻害性様式のどちらかで調節し得る。刺激性様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベ-スの活性化モチ-フまたはＩＴＡＭとして知られている、シグナル伝達モチ-フを含有してもよい。本発明で特に有用なＩＴＡＭ含有一次シグナル伝達ドメインの説明に役立つ実例は、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものを含んでもよい。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインとを含んでもよい。細胞内一次シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端にタンデムで任意の順序で連結されてもよい。
ＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含有して、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増殖を増強してもよい。本明細書の用法では、共「刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。このような共刺激分子の説明に役立つ実例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４-１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ-１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＴＬＡ４、ＬＦＡ-１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＬＣＫ３、ＳＬＡＭ、ＤＡＰ１０、ＬＡＧ３、ＨＶＥＭおよびＮＫＤ２ＣおよびＣＤ８３が挙げられてもよい。一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含有してもよい。
一実施形態では、ＣＡＲは、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＬＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａｌ＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチド；ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチド由来の膜貫通ドメイン；およびＣＤ２８、ＣＤ５４、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、およびＣＤ２７８からなる群から選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインに結合するｓｃＦｖを含有してもよい。
別の実施形態では、ＣＡＲは、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＬＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチド；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３およびＣＤ８α、およびＣＤ８αからなる群から選択されるヒンジドメイン；ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチド由来の膜貫通ドメイン；およびＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン：およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインに結合するｓｃＦｖを含有してもよい。
なおも別の実施形態では、ＣＡＲは、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチド；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３およびＣＤ８α、およびＣＤ８αからなる群から選択されるヒンジドメイン；ＣＤ８ａ、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、およびＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチド由来のＴＭドメインを含んでなる膜貫通ドメイン；およびＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに結び付ける、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の間の短鎖オリゴ-またはポリペプチドリンカ-；およびＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインに結合するリンカ-をさらに含むｓｃＦｖを含有してもよい。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、α葉酸受容体、５Ｔ４、ανβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７-Ｈ３、Ｂ７-Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含めたＥＧＦＲファミリ-、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、＊グリピカン-３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ-Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ-Ａ１＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ２＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＨＬＡ-Ａ３＋ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＩＬ-１１Ｒα、ＩＬ-１３Ｒα２、λ、Ｌｅｗｉｓ-Ｙ、κ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ-ＥＳＯ-１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、またはＶＥＧＦＲ２ポリペプチド；ＣＤ８αポリペプチドを含有するヒンジドメイン；約３アミノ酸のポリペプチドリンカ-を含有するＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択される１つまたは複数の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；およびＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインに結合するｓｃＦｖを含有してもよい。
ウイルス
一態様では、「ウイルス」とは、天然に存在するウイルスならびに人工ウイルスを指す。本開示のいくつかの実施形態によるウイルスは、エンベロ-プウイルスまたは非エンベロ-プウイルスのどちらであってもよい。パルボウイルス（ＡＡＶなど）は、非エンベロ-プウイルスの例である。好ましい実施形態では、ウイルスは、エンベロ-プウイルスであってもよい。好ましい実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであってもよい。真核細胞のウイルス感染を促進し得るウイルス外被タンパク質としては、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ-Ｇ）、改変ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）、および改変テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）からのエンベロ-プ糖タンパク質（ＧＰ）で偽型化されたＨＩＶ-１由来レンチウイルスベクタ-（ＬＶ）が挙げられてもよい。これらのエンベロ-プタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をはじめとするパルボウイルスなどのその他のウイルスの侵入を効率的に促進し得て、それによってそれらの広範な効率を実証する。例えば、モロニ-マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）４０７０ ｅｎｖ（参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４-８４０，２００５に記載されているような）ＲＤ１１４ ｅｎｖ（配列番号２）、キメラエンベロ-プタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏまたはＲＤｐｒｏ（参照により本明細書に援用される、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０；２３５：１２６９-１２７６に記載されているような、ＲＤ１１４のＲペプチド切断配列をＨＩＶ-１マトリックス／カプシド（ＭＡ／ＣＡ）切断配列で置換することによって構築されたＲＤ１１４-ＨＩＶキメラ）バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ（参照により本明細書に援用される、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０８６９-１０８７８，２００７に記載されているような）またはＧＡＬＶ ｅｎｖ（参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４-８４０，２００５に記載されているような）またはそれらの誘導体をはじめとする、その他のウイルスエンベロ-プタンパク質が使用されてもよい。
ＲＤ１１４ＴＲ
ＲＤ１１４ＴＲは、ネコ白血病ウイルスＲＤ１１４の細胞外および膜貫通ドメインと、両種性マウス白血病ウイルスエンベロ-プの細胞質尾部（ＴＲ）とから構成される、キメラエンベロ-プ糖タンパク質である。ＲＤ１１４ＴＲ偽型化ベクタ-は、ヒト造血前駆細胞およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞への効率的な遺伝子移入を媒介し得る。その内容全体が参照により援用される、Ｄｉ Ｎｕｎｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ：８１１-８２０（２００７））。ＲＤ１１４偽型化ベクタ-はまた、大型動物モデルにおける効率的な遺伝子移入も媒介し得て（Ｎｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ．２：１５７-１５９（２００４）；Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ：６１１-６１７（２００３）；およびＫｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，＆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ３０：１３２-１４３（２００３））、これらの各参考文献の内容は、それらの全体が参照により援用される。
本開示は、配列番号１または配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するＲＤ１１４ＴＲ変異型を含んでもよい。例えば、ＲＤ１１４ＴＲ（配列番号１）と、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する、ＲＤ１１４ＴＲ変異型（ＲＤ１１４ＴＲｖ１（配列番号５））が使用されてもよい。一態様では、本開示は、修飾アミノ酸残基を有するＲＤ１１４ＴＲ変異型を提供する。修飾アミノ酸残基は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換から選択されてもよい。一態様では、本明細書に記載の置換は、保存的アミノ酸置換である。すなわち、ＲＤ１１４ＴＲのアミノ酸は、類似特性を有するその他のアミノ酸で置換されてもよい（類似した、疎水性、親水性、抗原性、αらせん構造またはβシ-ト構造を形成または破壊する傾向などの保存的変化）。一態様では、ＲＤ１１４ＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸修飾を有してもよい。別の態様では、ＲＤ１１４ＴＲは、最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸修飾を有してもよい。なおも別の態様では、ＲＤ１１４ＴＲは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸修飾を有してもよい。保存的置換の非限定的例は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙにある。
別の態様では、本開示は、配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する変異型を含んでもよい。
一態様では、保存的置換は、その内容全体が参照により援用される、Ｄａｙｈｏｆｆによって、「Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５」，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載されるものを含んでもよい。例えば、一態様では、以下のグル-プの１つに属するアミノ酸は、互いに交換され得て、したがって、保守的な交換を構成する：グル-プ１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；グル-プ２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）；グル-プ３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；グル-プ４：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；グル-プ５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；およびグル-プ６：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。
一態様では、保存的アミノ酸置換は、例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；および（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど、同一クラスの別のものによるアミノ酸の置換を含んでもよい。その他の保存的アミノ酸置換はまた、以下のように行われてもよい：（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；（２）プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ；および（３）プロトン受容体：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（米国特許第１０１０６８０５号明細書を参照されたい）。
別の態様では、表Ａに従って保存的置換が行なわれてもよい。タンパク質修飾に対する耐性を予測する方法は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５-９２１０（２００４）にある。
Figure 2023515131000003
一態様では、形質導入後約１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約２０％～約６０％、約３０％～約５０％、または約３５％～約４５％である。一態様では、同一条件下における形質導入後１０日目のＶＳＶ-Ｇ偽型化ベクタ-の導入遺伝子発現である約５％～約２５％、約２％～約２０％、約３％～約１５％、または約５％～約１２％と比較して、形質導入後１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約２０％～約６０％、約３０％～約５０％、または約３５％～約４５％である。なおも別の態様では、形質導入後１０日目のＶＳＶ-Ｇ偽型化ベクタ-導入遺伝子発現である約３．６％と比較して、形質導入後１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約４０％である。
なおも別の態様では、形質導入後約５日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約２０％～約５０％、約１５％～約３０％、または約２０％～約３０％である。一態様では、同一条件下における形質導入後５日目のＶＳＶ-Ｇ偽型化ベクタ-の導入遺伝子発現である約１０％～約２０％、約１５％～約２５％、または約１７．５％～約２０％と比較して、形質導入後５日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約２０％～約５０％約１５％～約３０％、または約２０％～約３０％である。なおも別の態様では、形質導入後５日目のＶＳＶ-Ｇ偽型化ベクタ-導入遺伝子発現である約１９％と比較して、形質導入後５日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約２４％である。
別の態様では、形質導入後１０日目のＶＳＶ-Ｇ偽型化ベクタ-の導入遺伝子発現と比較して、形質導入後１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、または約１０倍、約１１倍、または約１２倍以上である。
一態様では、本開示は、ＲＤ１１４ＴＲ偽型（例えば、配列番号１、配列番号５、またはそれらの変異型）を有するレトロウイルスを使用して、Ｔ細胞に形質導入する方法を提供する。別の態様では、Ｔ細胞は、ＶＳＶ-Ｇ疑似型偽型（例えば、配列番号３）を有するレトロウイルスと比較して、ＲＤ１１４ＴＲ偽型（例えば、Ｓ配列番号１、配列番号５、またはその変異型）を有するレトロウイルスによって、より効率的に形質導入される。別の態様では、ＲＤ１１４ＴＲエンベロ-プを利用してレンチベクタ-が偽型化され、次にこれを使用してＴ細胞が優れた効率で形質導入される。
操作されたγδＴ細胞は、様々な方法によって作製されてもよい。例えば、腫瘍認識部分、または別のタイプの認識部分を含んでなる、発現カセットをコ-ドするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザ-ゼシステム；またはレンチウイルスまたはレトロウイルスシステムなどのウイルスベ-スの遺伝子移入システム；または形質移入、電気穿孔、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、オルモシルなどのナノ工学物質などの別の適切な方法；アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスをはじめとするウイルス送達方法、または別の適切な方法によって、γδＴ細胞に安定に導入され得る。ヒト遺伝子治療には、その全体が本明細書に援用される、国際公開第１９９３０２０２２１号パンフレットに記載される方法などのいくつかのウイルス法が用いられている。γδＴ細胞を操作するために用られ得るウイルス法の非限定的例としては、γレトロウイルス法、アデノウイルス法、レンチウイルス法、単純ヘルペスウイルス法、ワクシニアウイルス法、ポックスウイルス法、またはアデノウイルス関連ウイルス法が挙げられてもよい。
図２は、特定のがん抗原およびＣＤ８に対するαβＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子を発現する、ＲＤ１１４ＴＲγレトロウイルスベクタ-およびＲＤ１１４ＴＲレンチウイルスベクタ-などのウイルスベクタ-で、単離されたγδＴ細胞を形質導入することによって、活性化Ｔ細胞が操作されてもよいことを示す。ウイルスベクタ-はまた、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）などの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含有して、核および細胞質双方のｍＲＮＡレベルを増加させることによって、導入遺伝子の発現を増強させてもよい。マウスＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、サルレトロウイルス１型（ＳＲＶ-１）の構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）、およびヒト熱ショックタンパク質７０の５’未翻訳領域（Ｈｓｐ７０ ５’ＵＴＲ）をはじめとする、１つまたは複数の調節要素もまた使用して、および／またはＷＰＲＥと組み合わせて、導入遺伝子発現を増加させてもよい。形質導入は、例えば、１日間などの１／２～５日間にわたり、例えば、２４から４～６ウェルプレ-トなどの小規模で、または中／大規模で、１回または複数回実行して、安定した導入遺伝子発現を達成してもよい。
ＲＤ１１４ＴＲは、マウス白血病ウイルスの細胞質尾部（ＴＲ）に融合した、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）の細胞外および膜貫通ドメインを含有するキメラ糖タンパク質である。一態様では、形質導入後１０日目におけるＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクタ-の導入遺伝子発現は、ＶＳＶ-Ｇ偽型化ベクタ-と比較してより高い。
ＶＳＶ-Ｇ ｅｎｖ、ＭＬＶ４０７０ ｅｎｖ、ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロ-プタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏ、バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ、またはＧＡＬＶ ｅｎｖなどのその他のウイルスエンベロ-プタンパク質、またはその誘導体もまた使用されてもよい。
非ウイルスベクタ-
ベクタ-は、ウイルスに基づいていないという点で、非ウイルスベクタ-である。それは、ベクタ-が細胞に侵入するためのウイルス構成要は含まない。非ウイルスベクタ-は、プラスミド、ミニサ-クル、コスミド、人工染色体（例えば、ＢＡＣ）、直鎖状の共有結合的に閉じた（ＬＣＣ）ＤＮＡベクタ-（例えば、ミニサ-クル、ミニベクタ-、およびミニノット）、直鎖状の共有結合的に閉じた（ＬＣＣ）ベクタ-（例えば、ＭＩＤＧＥ、ＭｉＬＶ、ミニスタリング、ミニプラスミド）、ミニイントロンプラスミド、ｐＤＮＡ発現ベクタ-、または例えば、ジンクフィンガ-ヌクレア-ゼ（ＺＦＮ）や転写アクチベ-タ-様エフェクタ-ヌクレア-ゼ（ＴＡＬＥＮ）や規則的な間隔をもってクラスタ-化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）などのヌクレア-ゼ媒介遺伝子編集から選択されてもよい。
いくつかの実施形態では、核酸の送達のための非ウイルスベクタ-システムは、ポリエチレングリコ-ル（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびＰＴＤ／ＣＰＰ機能を有するペプチド配列からなるポリマ-コンジュゲ-トを含んでもよい。例えば、ＰＴＤ／ＣＰＰ機能を有するタンパク質は、ＴＡＴ-ペプチドまたはＴＡＴ-ペプチドに関連してもよいペプチド配列であってもよい。例えば、ＴＡＴ-ペプチド関連配列は、デカペプチド配列ＧＲＫＫＫＲＲＱＲＣ（配列番号１６７）であってもよい。その他の周知のＴＡＴ-ペプチド関連配列が、代替的に使用され得る。細胞内酵素（例えば、エンドソ-ム、リソソ-ム）に関する安定性に加えて、本出願による核酸の送達のための非ウイルスベクタ-システムは、細胞外環境中でも非常に安定していてもよい。例えば、ＰＥＩと比較して、ＴＡＴ-ＰＥＧ-ＰＥＩ-ポリプレックスの安定性は、高濃度のヘパリン、Ａｌｖｅｏｆａｃｔ（登録商標）、ＢＡＬＦ、およびＤＮａｓｅ Ｉの存在下で有意により高くあってもよい。
いくつかの実施形態では、例えば、ＴＣＲおよびＣＡＲなどの本明細書に記載のポリペプチドはまた、脊椎動物の染色体にＤＮＡ配列を導入する合成ＤＮＡトランスポゾンシステムを指す、「スリ-ピングビュ-ティ-（ＳＢ）トランスポゾンシステム」などの非ウイルスベ-スの送達系を用いて、Ｔ細胞などのエフェクタ-細胞に導入され得る。システムは、例えば、米国特許第６，４８９，４５８号明細書および米国特許第８，２２７，４３２号明細書に記載されている。その内容全体は、参照により本明細書に援用される。
「スリ-ピングビュ-ティ-」送達系は、スリ-ピングビュ-ティ-（ＳＢ）トランスポザ-ゼおよびＳＢトランスポゾンから構成されてもよい。ＤＮＡトランスポゾンは、１つのＤＮＡ部位から別のＤＮＡ部位に単純なカットアンドペ-スト様式で移動する。遺伝子転位は、その中で定義されたＤＮＡセグメントが１つのＤＮＡ分子から切除され、同じかまたは異なるＤＮＡ分子またはゲノム内の別の部位に移動する正確なプロセスであってもよい。その他のＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型トランスポザ-ゼと同様に、ＳＢトランスポザ-ゼは、トランスポゾンを受容者ＤＮＡ配列のＴＡジヌクレオチド塩基対に挿入する。挿入部位は、同じＤＮＡ分子内の別の部位、または別のＤＮＡ分子（または染色体）内であり得る。ヒトをはじめとする哺乳類のゲノムには、およそ２億個のＴＡ部位がある。ＴＡ挿入部位は、トランスポゾン組み込みの過程で複製されてもよい。このＴＡ配列の複製は、遺伝子転位の特徴であってもよく、いくつかの実験で機序を確認するために使用される。トランスポザ-ゼはトランスポゾン内でコ-ド化されるか、またはトランスポザ-ゼは別の起源から供給され得て、その場合は、トランスポゾンは非自律要素になる。非自律性トランスポゾンは、挿入後に独立して切除と再挿入を続けることができないため、遺伝的ツ-ルとして有用であってもよい。ＳＢトランスポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入のため、および遺伝子治療のための非ウイルスベクタ-として使用されることが想定される。
簡潔に述べると、スリ-ピングビュ-ティ-（ＳＢ）システム（Ｈａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８：６７４-８３，（２０１０）） は、Ｔ細胞を遺伝的に改変するために適合された（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０５：１６２２-３１，（２００５））。これは、２つのステップを伴った。（ｉ）ＳＢトランスポゾン(すなわち、Ｔ細胞特異性をリダイレクトするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １８：８４９-５６，（２０１１）；Ｋｅｂｒｉａｅｉ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２３：４４４-５０，（２０１２））およびＳＢトランスポタ-ゼを発現するＤＮＡプラスミドの電気的移送、および（ｉｉ）Ｋ５６２細胞株由来のデザイナ-人工抗原提示細胞（ＡａＰＣ（活性化および増殖細胞）としても知られている）上に組み込み体を安定して発現するＴ細胞の増殖と拡大。前述の参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。一実施形態では、ＳＢトランスポゾンシステムは、ｍｂＩＬ-１５をコ-ド化するコ-ド配列、細胞タグおよび／またはＣＡＲを含んでもよい。一実施形態では、ＳＢトランスポゾンシステムは、ｍｂＩＬ-１５をコ-ド化するコ-ド配列、細胞タグおよび／またはＴＣＲを含んでもよい。別の実施形態では、第２のステップ（ｉｉ）が除外され、遺伝子改変Ｔ細胞が凍結保存されるか、または患者に即座に注入されてもよい。特定の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は、患者への注入前に凍結保存されなくてもよい。いくつかの実施形態では、スリ-ピングビュ-ティ-トランスポザ-ゼは、ＳＢ１１、ＳＢ１００Ｘ、またはＳＢ１１０であってもよい。
本出願による核酸の送達のための非ウイルスベクタ-システムは、吸入、経口、直腸、非経口、静脈内、筋肉内または皮下、大槽内、膣内、腹腔内、血管内、局所（粉末、軟膏、または滴剤）、気管内挿管、気管内滴下注入、またはスプレ-のいずれかによって、薬学的に許容可能な組成物の一部として、患者に適用されてもよい。
一態様では、操作された（または形質導入された）γδＴ細胞は、抗原提示細胞またはアミノビスホスホネ-トによる刺激なしに、生体外で増殖され得る。本開示の抗原反応性の操作されたＴ細胞は、生体外および生体内で増殖されてもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の活性集団は、抗原提示細胞、抗原性ペプチド、非ペプチド分子、または小分子化合物などのアミノビスホスホネ-トによる抗原刺激なしで、特定の抗体、サイトカイン、マイトジェン、またはＩＬ-１７Ｆｃ融合タンパク質、ＭＩＣＡＦｃ融合タンパク質、およびＣＤ７０Ｆｃ融合タンパク質などの融合タンパク質を使用して、生体外で増殖されてもよい。γδＴ細胞集団の増殖に使用され得る抗体の例としては、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０、抗ＮＫＧ２Ｄ、または抗ＣＤ２抗体が挙げられてもよく、サイトカインの例としては、ＩＬ-２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１２、ＩＬ-２１、ＩＬ-１８、ＩＬ-９、ＩＬ-７、および／またはＩＬ-３３が挙げられてもよく、マイトジェンの例としては、ヒトＣＤ２７に対するリガンドであるＣＤ７０、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ），リンゴマイマイ（Ｈ．ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の集団は、６０日間未満、４８日間未満、３６日間未満、２４日間未満、１２日間未満、または６日間未満増殖され得る。
別の態様では、本開示は、養子免疫伝達療法のために、操作されたγδＴ細胞集団を生体外で増殖させる方法を提供する。本開示の操作されたγδＴ細胞は、生体外で増殖されてもよい。本開示の操作されたγδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化なしで、またはＡＰＣおよびアミノリン酸塩との共培養なしで、生体外で増殖され得る。
別の態様では、γδＴ細胞集団は、３６日未満、３５日未満、３４日未満、３３日未満、３２日未満、３１日未満、３０日未満、２９日未満、２８日未満、２７日未満、２６日未満、２５日未満、２４日未満、２３日未満、２２日未満、２１日未満、２０日未満、１９日未満、１８日未満、１７日未満、１６日未満、１５日未満、１４日未満、１３日未満、１２日未満、１１日未満、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満生体外で増殖され得る。
図２は、例えば、１４～２８日間などの１４～３５日間にわたり、例えば、フラスコ／Ｇ-Ｒｅｘなどの小／中規模で、または例えば、５０ｍｌ～１００リットルバッグなどの大規模で、例えば、ＩＬ-２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８などのサイトカインの存在下で、形質導入または操作されたγδＴ細胞の増殖が実行されてもよいことを示す。
いくつかの態様では、γδＴ細胞集団は、増殖中に１回または複数回再刺激され得る。例えば、操作された（または形質導入された）γδＴ細胞集団は、生体外で一定期間増殖され、次に増殖したγδＴ細胞をフィ-ダ-細胞に接触させることによって、再刺激されてもよい。例えば、フィ-ダ-細胞は、単球、ＰＢＭＣ、または単球とＢＭＣとの組み合わせであってもよい。その他の態様では、γδＴ細胞集団は、増殖中に再刺激されない。
いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、ヒト対象にとって自系である。一態様では、フィ-ダ-細胞は、ヒト対象にとって同種異系である。
いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、αβＴ細胞が枯渇している。
いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、δＴ細胞集団への添加前に、ゾレドロン酸などのアミノビスホスホネ-トでパルス処理される。
別の態様では、フィ-ダ-細胞は、腫瘍細胞株またはリンパ芽球様細胞株などの細胞株であってもよい。別の態様では、フィ-ダ-細胞は、自系腫瘍細胞などの腫瘍細胞であってもよい。一態様では、腫瘍細胞は、Ｋ５６２細胞であってもよい。いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、例えば、サイトカインなどの少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である。サイトカインは、例えば、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様では、ＩＬ-１５は膜結合型ＩＬ-１５である。
いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、本明細書に記載の任意のフィ-ダ-細胞の組み合わせである。例えば、フィ-ダ-細胞は、自系単球、同種異系単球、自系ＰＢＭＣ、同種異系ＰＢＭＣ、腫瘍細胞、自系腫瘍細胞、操作された腫瘍細胞、Ｋ５６２細胞、腫瘍細胞株、およびリンパ芽球様細胞株から選択される、２つ以上のフィ-ダ-細胞の組み合わせであってもよい。いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は、ＰＢＭＣとリンパ芽球様細胞株の組み合わせである。
いくつかの態様では、フィ-ダ-細胞は例えば、γ線照射で照射される。
いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約１：１～約５０：１（フィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で存在する。例えば、増殖したγδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約２：１～約２０：１（フィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で存在する。いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞とフィ-ダ-細胞は、約１：１、約１：５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１または約５０：１（フィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で存在する。
いくつかの態様では、本開示の増殖したγδＴ細胞集団は、特定の抗体、サイトカイン、マイトジェン、またはＩＬ-１７ Ｆｃ融合、ＭＩＣＡ Ｆｃ融合、およびＣＤ７０ Ｆｃ融合などの融合タンパク質を使用して再刺激されてもよい。増殖したγδＴ細胞集団を再刺激するために使用され得る抗体の例としては、、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０、抗ＮＫＧ２Ｄ、または抗ＣＤ２抗体が挙げられてもよく、サイトカインの例としては、ＩＬ-２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１２、ＩＬ-２１、ＩＬ-１８、ＩＬ-９、ＩＬ-７、および／またはＩＬ-３３が挙げられてもよく、マイトジェンの例としては、ヒトＣＤ２７に対するリガンドであるＣＤ７０、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、リンゴマイマイ（Ｈ．ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。
増殖したγδＴ細胞の再刺激は、増殖したγδＴ細胞を、本明細書に記載のフィ-ダ-細胞、抗体、サイトカイン、マイトジェン、融合タンパク質などの再刺激剤の任意の組み合わせと接触させることによって実施され得る。
いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞は、増殖中に１回再刺激される。その他の態様では、増殖したγδＴ細胞は、増殖中に２回以上再刺激される。例えば、増殖したγδＴ細胞は、増殖中に２回、３回、４回、５回、６回７回、８回、９回、または１０回またはそれ以上再刺激され得る。当業者は、増殖の条件および長さに応じて、増殖中に実行される再刺激の回数を容易に最適化し得る。
いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞は、増殖中に毎日再刺激される。いくつかの態様では、増殖したγδＴ細胞は、増殖中に１日に２回以上再刺激される。その他の態様では、増殖したγδＴ細胞は、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、８日に１回、９日に１回、１０日に１回、１１日に１回、１２日に１回、１３日に１回、１４日に１回などで再刺激される。その他の態様では、増殖したγδＴ細胞は、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回などで再刺激される。その他の態様では、増殖したγδＴ細胞は、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回などで再刺激される。当業者は、増殖の条件および長さに応じて、増殖中に実行される再刺激の間の時間の長さを容易に最適化し得る。
増殖中に複数の再刺激が実施される場合、各再刺激は同一であってもまたは異なっていてもよいことが理解されるであろう。例えば、各再刺激は、本明細書に記載の再刺激剤の任意の組み合わせを任意の量で使用して、実施されてもよい。使用される特定の再刺激剤およびそれらの量は、再刺激毎に同じであってもまたは異なってもよい。
増殖した形質導入されたＴ細胞産物は、次に、患者への輸液用の「既製」Ｔ細胞製品として凍結保存してもよい。
治療法
本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞を含有する組成物は、予防的および／または治療的治療のために投与されてもよい。治療用途では、医薬組成物は、疾患または病状の症状を治癒しまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、疾患または病状に既に苦しんでいる対象に投与され得る。操作されたγδＴ細胞は、発症、罹患、または病状の悪化の可能性を軽減するためにも投与され得る。治療的使用のための操作されたγδＴ細胞の集団の有効量は、疾患または病状の重症度および経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、および／または薬物に対する応答、および／または治療医の判断に基づいて変動し得る。
本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、例えば、がん、感染症、および／または本明細書に記載の免疫性疾患などの病状の治療を必要とする対象が治療され得る。
対象における病状（例えば、病気）をγδＴ細胞で治療する方法は、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞を対象に投与することを含んでもよい。本開示のγδＴ細胞は、様々なレジメン（例えば、タイミング、濃度、投与量、治療間隔、および／または製剤）で投与されてもよい。対象はまた、本開示の操作されたγδＴ細胞を与られる前に、例えば、化学療法、放射線、または双方の組み合わせで、事前調節され得る。また、操作されたγδＴ細胞の集団は、対象に投与する前に冷凍または凍結保存されてもよい。操作されたγδＴ細胞の集団は、同じ腫瘍認識部分、異なる腫瘍認識部分、または同じ腫瘍認識部分と異なる腫瘍認識部分との組み合わせを発現する、２種以上の細胞を含み得る。例えば、操作されたγδＴ細胞の集団は、異なる抗原を認識し、または同じ抗原の異なるエピト-プを認識するように設計された、いくつかの異なる操作されたγδＴ細胞を含み得る。
本開示のγδＴ細胞を使用して、様々な病状が治療されてもよい。一態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、固形腫瘍および血液学的悪性疾患をはじめとする、がんが治療されてもよい。がんの非限定的例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん；小脳星細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫などの脳腫瘍；乳がん、気管支腺腫、バ-キットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸がん、小児期がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユ-イング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん；非小細胞および小細胞肺がんなどの肺がん；リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレ-ムマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
一態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、例えば、デング熱、エボラ、マ-ルブルグウイルス、結核（ＴＢ）、髄膜炎または梅毒などのウイルス感染症または細菌感染症などの感染性疾患が治療されてもよく、免疫応答がＭＨＣクラスＩ応答である限り、方法は、感染性生物の抗生物質耐性株、自己免疫疾患、マラリアなどの寄生虫感染症、およびＭＳやパ-キンソン病などのその他の疾患に使用されることが好ましい。
なおも別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、自己免疫疾患などの免疫疾患が治療されてもよい。自己免疫疾患の例（自己免疫疾患であることが公式に宣言されていない疾患も含めた）は、関節炎、慢性閉塞性肺疾患、強直性脊椎炎、クロ-ン病（２種類の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の１つ）、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、子宮内膜症、グッドパスチャ-症候群、バセドウ病、ギランバレ-症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、川崎病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマト-デス、混合性結合組織疾患、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシ-、神経筋強直症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、リウマチ様関節炎、統合失調症、強皮症、シェ-グレン症候群、スティフパ-ソン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎（２種類の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の１つ）脈管炎、白斑、およびウェゲネル肉芽腫である。
本開示のγδＴ細胞による治療は、病状の臨床的発症前、発症中、および発症後に、対象に提供されてもよい。治療は、臨床的発症の１日後、１週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２年後に、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間以上を超えて、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、または２年間未満にわたり対象に提供されてもよい。治療は、臨床試験においてヒトを治療することもまた含んでもよい。治療は、本開示の操作されたγδＴ細胞を含んでなる医薬組成物を対象に投与することを含み得る。
別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、対象の体内の内因性リンパ球の活性を調節してもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、内因性Ｔ細胞に抗原を提供してもよく、免疫応答を高めてもよい。別の態様では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、別の免疫細胞の細胞毒性を活性化してもよい。別の態様では、別の免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、別の免疫細胞は、ナチュラルキラ-Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、調節Ｔ細胞を抑制してもよい。別の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸ３＋Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。別の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸ３-Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。本開示の操作されたγδＴ細胞によってその活性が調節され得る細胞の非限定的例としては、造血幹細胞；Ｂ細胞；ＣＤ４；ＣＤ８；赤血球；白色血液細胞；樹状抗原提示細胞をはじめとする樹状細胞；白血球；マクロファ-ジ；記憶Ｂ細胞；記憶Ｔ細胞；単球；ナチュラルキラ-細胞；好中球顆粒球；Ｔヘルパ-細胞；およびＴキラ-細胞が挙げられてもよい。
ほとんどの骨髄移植中に、シクロホスファミドと全身照射の組み合わせが慣習的に用いられて、対象の免疫系による移植中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶が予防されてもよい。一態様では、ドナ-骨髄とインタ-ロイキン-２（ＩＬ-２）との生体外インキュベ-ションが実施されて、ドナ-骨髄中のキラ-リンパ球の作製が増強されてもよい。インタ-ロイキン-２（ＩＬ-２）は、野生型リンパ球の成長、増殖、分化に必要であってもよいサイトカインである。γδＴ細胞のヒトへの養子免疫伝達に関する現在の研究では、γδＴ細胞とインタ-ロイキン-２との同時投与が必要であってもよい。しかし、低用量および高用量のＩＬ-２は、どちらも高度に毒性の副作用を有し得る。ＩＬ-２毒性は、複数の臓器／システム、最も顕著には心臓、肺、腎臓、および中枢神経系で顕在化し得る。別の態様では、本開示は、ナイ-ブサイトカイン、またはＩＬ-２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１２、ＩＬ-２１などのその修飾バ-ジョンの同時投与なしに、操作されたγδＴ細胞を対象に投与する方法を提供する。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、ＩＬ-２との同時投与なしに、対象に投与され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、ＩＬ-２との同時投与なしに、骨髄移植などの処置中に対象に投与されてもよい。
投与方法
１つまたは複数の操作されたγδＴ細胞集団は、任意の順序でまたは同時に、対象に投与されてもよい。同時である場合、複数の操作されたγδＴ細胞は、静脈内注射などの単一の一体化形態で、または、例えば、複数の静脈内輸液、皮下注射、注射または丸薬として、複数の形態で提供され得る。操作されたγδＴ細胞は、単一のパッケ-ジで、または複数のパッケ-ジで、一緒にまたは別々に包装され得る。操作されたγδＴ細胞の１つまたは全ては、複数回用量で投与され得る。同時ではない場合、複数回用量のタイミングは、約１週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または約１年間程度変動してもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、対象への投与後に、対象の体内で、生体内増殖させ得る。操作されたγδＴ細胞は凍結されて、同一の細胞調製物での複数の治療のための細胞が提供され得る。本開示の操作されたγδＴ細胞、および該細胞を含んでなる医薬組成物は、キットとして包装され得る。キットは、操作されたγδＴ細胞、および該細胞を含んでなる医薬組成物の使用に関する指示（例えば、書面による指示）を含んでもよい。
別の態様では、がん、感染性疾患、または免疫性疾患を治療する方法は、治療有効量の操作されたγδＴ細胞を対象に投与するステップを含んでなり、その中では、投与は、、がん、感染性疾患、または免疫性疾患を治療する。別の実施形態では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０秒間、３０秒間、１分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または１年間にわたり投与されてもよい。別の態様では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも１週間にわたり投与されてもよい。別の態様では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも２週間にわたり投与されてもよい。
本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞は、疾患または病状の発生前、発生中、または発生後に投与され得て、操作されたγδＴ細胞を含有する医薬組成物を投与するタイミングは変動し得る。例えば、操作されたγδＴ細胞は予防的に使用され得て、疾患または病状の発生の可能性を軽減するために、病状または疾患の傾向を有する対象に連続的に投与され得る。操作されたγδＴ細胞は、症状の発生中にまたは発生後にできる限り速やかに、対象に投与され得る。操作されたγδＴ細胞の投与は、症状の発生後即座に、症状の発生から最初の３時間以内に、症状の発生から最初の６時間以内に、症状の発生から最初の２４時間以内に、症状の発生から４８時間以内に、または症状の発生から任意の期間内に開始され得る。最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用して、本明細書に記載の任意の経路などの実用的な任意の経路を介し得る。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の投与は、静脈内投与であってもよい。操作されたγδＴ細胞の１回または複数回の投与は、がん、感染性疾患、免疫疾患、敗血症の発症後実行可能な限り早く、または骨髄移植によって、例えば、約２４時間～約４８時間、約４８時間～約１週間、約１週間～約２週間、約２週間～約１ヶ月間、約１ヶ月間～約３ヶ月間などの免疫疾患を治療するのに必要な期間にわたり、投与され得る。がんの治療のために、操作されたγδＴ細胞の１つまたは複数用量は、がんの発症から数年後に、その他の治療の前または後に、投与され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間にわたり投与され得る。治療期間は、対象によって変動し得る。
保存
一態様では、γδＴ細胞は凍結媒体中で調合され、少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、または少なくとも５年間にわたる長期保存のために、液体窒素冷凍庫（-１９６℃）または極低温冷凍庫（-６５℃、-８０℃、-１２０℃、または-１５０℃）などの極低温保存ユニットに入れられてもよい。凍結媒体は、ｐＨを約６．０～約６．５、約６．５～約７．０、約７．０～約７．５、約７．５～約８．０、または約６．５～約７．５の間に維持するための生理学的ｐＨ緩衝剤を有する、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および／またはデキストロ-ス、および／または硫酸デキストランおよび／またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有し得る。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、本明細書に記載されるような抗体、タンパク質、ペプチド、および／またはサイトカインでの刺激によって、さらに処理され得る。凍結保存されたγδＴ細胞は解凍され、本明細書に記載されるようなウイルスベクタ-（レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＡＶ）、およびレンチウイルスベクタ-をはじめとする）または非ウイルス手段（ＲＮＡ、例えばトランスポゾンなどのＤＮＡ、およびタンパク質をはじめとする）で、遺伝子改変され得る。改変γδＴ細胞は、結媒体１ｍＬ当たり少なくとも約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または少なくとも約１０１０個の細胞の少なくとも約１、５、１０、１００、１５０、２００、５００本のバイアルの量でさらに凍結保存されて、細胞バンクが生成され得る。凍凍結保存細胞バンクは、それらの機能を保持していてもよく、解凍されさらに刺激されて増殖され得る。別の態様では、解凍された細胞は、細胞培養バッグおよび／またはバイオリアクタ-などの適切な閉鎖容器内で刺激および増殖され、同種異系細胞産物として一定量の細胞が作製され得る。凍結保存γδＴ細胞は、極低温保存条件下で、少なくとも約６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２０ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、４０ヶ月間、５０ヶ月間、または少なくとも約６０ヶ月間にわたり、それらの生物学的機能を保持し得る。別の態様では、製剤中に保存料を使用することはできない。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、同種異系の既製細胞製品として複数の患者に輸液され得る。
一態様では、本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも１×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０９細胞／ｍｌ、またはそれ以上、約１×１０３細胞／ｍｌ～約少なくとも１×１０８細胞／ｍｌ、約１×１０５細胞／ｍｌ～約少なくとも１×１０８細胞／ｍｌ、または約１×１０６細胞／ｍｌ～約少なくとも１×１０８細胞／ｍｌの量で組成物中に存在してもよい。
例えば、キメラＣＤ８α-ＣＤ４ｔｍ／細胞内タンパク質などの腫瘍抗原特異的ＴＣＲを発現するように操作され得る、生存可能な同種異系Ｔ細胞産物を開発するために、本開示の実施形態は、最終的な同種異系産物中の残留αβＴ細胞の存在を最小化しながら、γδＴ細胞の収量を最大化し得る方法を含んでもよい。例えば、本開示の実施形態は、αβＴ細胞を枯渇させることによってγδＴ細胞を増殖および活性化させ、アンホテリシンＢ、Ｎ-アセチルシステイン（ＮＡＣ）（または高用量グルタミン／グルタマックス）、ＩＬ-２、および／またはＩＬ-１５などの分子で成長培養を補足する方法を含んでもよい。
一態様では、本明細書に記載の方法を使用して、本開示の態様による自己由来または同種異系産物が生成されてもよい。
本発明は、特許請求の範囲を限定することは意図されない、以下の実施例を参照してより良く理解されてもよい。
実施例１
自系細胞による増殖中のγδＴ細胞の再刺激は、増殖の増強と長期化をもたらす。
図３Ａおよび３Ｂは、γδＴ細胞の増殖に対する、自系単球による再刺激の効果を示す。図３Ａは、図３Ｂに提示されたデ-タを生成するために使用された増殖工程を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）を、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化させた。３日目に、活性化γδＴ細胞を模擬形質導入した。４日目に、模擬形質導入細胞を増殖させる。７日目に、増殖した細胞を、自系単球（ＰＢＭＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）からＣＤ１４＋選択によって得られ、ＺＯＬ（１００μＭ）で４時間パルスした）によって１０（単球）：１（γδＴ細胞）の割合で再刺激した。細胞を１４日目に冷凍した。
図３Ｂは、自系単球による再刺激が、再刺激なしの場合と比較して、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られたγδＴ細胞の増殖倍数を増加させることを示す。再刺激細胞の増殖倍数は、１０日後に減少した。１４日目までに、再刺激細胞の増殖倍数は、再刺激なしの場合と同様の増殖倍数まで減少した。
図４Ａおよび４Ｂは、γδＴ細胞の増殖に対する照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる再刺激の効果を示す。図４Ａは、図４Ｂに提示されたデ-タを生成するために使用された増殖工程を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）を、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化させた。２日目に、活性化γδＴ細胞を模擬形質導入した。３日目に、模擬形質導入細胞を増殖させる。７日目に、増殖した細胞を、照射（１００Ｇｙ）自系αβ枯渇ＰＢＭＣ（ＺＯＬ（１００μＭ）で４時間パルス処理した）によって、５：１または１０：１（αβ枯渇ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）の比率で再刺激した。
図４Ｂは、αβ枯渇ＰＢＭＣによって５：１および１０：１の比率で再刺激すると、再刺激なしの場合と比較して、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られたγδＴ細胞の増殖倍数が増加されることを示す。
図５～１１は、γδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。
図５は、図６～図１１に示すデ-タを生成するために使用された増殖工程を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）を、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化させた。２日目に、活性化γδＴ細胞を模擬形質導入した。３日目に、模擬形質導入細胞を増殖させる。７日目および１４日目に、増殖した細胞は、１）１：１、５：１または１０：１（単球：γδＴ細胞）の比率の自系単球（ＰＢＭＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）からＣＤ１４＋選択によって得られ、ＺＯＬ（１００μＭ）で４時間パルス処理した）、または２）１０：１または２０：１（αβ消耗ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）の比率の照射（１００Ｇｙ）自系αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣ（ＺＯＬ（１００μＭ）で４時間パルス処理した）のどちらかによって再刺激した。
図６Ａおよび６Ｂは、２人のドナ-からのγδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。図６Ａは、ドナ-１からのデ-タを示す。対照サンプル、および低い単球：γδＴ細胞比では、増殖はおよそ１４日目までに頭打ちになった。しかしながら、７日目および１４日目における、１０：１の比率（単球：γδＴ細胞）の単球による、または２０：１の比率（αβ枯渇ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）の照射αβ枯渇ＰＢＭＣによる、γδＴ細胞の再刺激は、この平坦域を防ぎ、少なくとも１７日間は増殖が有意に促進された。例えば、７日目および１４日目に２０：１の比率（αβ枯渇ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）で照射されたαβ枯渇ＰＢＭＣで再刺激されると、δ２細胞は１７日目に２４９８倍の増殖に達し、平坦域に達しなかった。
図６Ｂは、第２のドナ-からのγδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。図５Ｂに示したデ-タと同様に、対照サンプル、および低い単球：γδＴ細胞比では、増殖はおよび１４日目までに頭打ちになった。しかしながら、７日目および１４日目における、５：１または１０：１の比率（単球：γδＴ細胞）の単球による、または１０：１または２０：１の比率（αβ枯渇ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）の照射αβ枯渇ＰＢＭＣによる、γδＴ細胞の再刺激は、この平坦域を防ぎ、少なくとも１７日間は増殖が有意に促進された。例えば、７日目および１４日目に２０：１の比率（αβ枯渇ＰＢＭＣ：γδＴ細胞）で照射されたαβ枯渇ＰＢＭＣで再刺激されると、δ２細胞は１７日目に３０５倍の増殖に達し、平坦域に達しなかった。
図７Ａ～Ｃおよび図８Ｂ～Ｃは、２人のドナ-からのγδＴ細胞の増殖に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。これらのデ-タはまた、以下の表１にも要約されている。
Figure 2023515131000004
表１および図１および図７Ａ～Ｃに見られるように、増殖倍数は、ドナ-２と比較してドナ-１で低かった（図８Ａ～Ｃを参照されたい）。この結果は、２１日目に見られた対照サンプルの増殖の突然の増加に起因し得る。それにもかかわらず、照射自系αβ枯渇ＰＭＢＣによる再刺激は、双方のドナ-の自系単球による再刺激と比較して、総γδＴ細胞のより高い増殖倍数をもたらすことことが明らかである。この効果は、主にδ２Ｔ細胞の増加に起因するように見える。
図９および１０は、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激が、増殖したγδＴ細胞の記憶表現型を有意に変化させないことを示す。双方のドナ-において、ＣＤ２７発現のわずかな増加が、１０：１の単球で再刺激された増殖したγδＴ細胞で検出された。
図１１Ａおよび１１Ｂは、増殖したγδＴ細胞の生存率に対する、自系単球または照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣによる複数回の再刺激の効果を示す。増殖したγδＴ細胞の生存率の低下が、再刺激条件で見られた。この効果は、照射自系αβ枯渇ＰＢＭＣで再刺激されたγδＴ細胞中で、最も顕著であった（２０ ＰＢＭＣ：１ γδＴ細胞）。生存率は再刺激後に低下する傾向があり、１週間以内に回復する。
実施例２
腫瘍由来細胞によるγδＴ細胞の刺激は、増殖を促進し延長する。
図１２Ａ～１２Ｂは、操作された腫瘍由来細胞の共培養がγδＴ細胞に及ぼす影響を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）を、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化させた。照射腫瘍由来細胞（Ｋ５６２）を２：１の比率（腫瘍由来細胞：γδＴ細胞）でいくつかのサンプルに添加した。その他のサンプルは、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ２７ｍＡｂで被覆されたプレ-ト上で培養した。３日目に、活性化γδＴ細胞を模擬形質導入した。４日目に、模擬形質導入細胞を増殖させた。増殖した細胞は２１日目に冷凍した。
図１２Ａおよび１２Ｂは、照射腫瘍由来の細胞＋／-ＺＯＬで刺激された２人のドナ-（Ｄ１（図１２Ａ）およびＤ２（図１２Ｂ））から得られたγδＴ細胞が、抗ＣＤ２８抗体＋ＺＯＬ、抗ＣＤ２７抗体＋ＺＯＬ、およびＺＯＬ単独（対照）で刺激されたものより高い増殖倍数を有することを示す。
実施例３
腫瘍由来細胞によるγδＴ細胞の再刺激は、γδＴ細胞の増殖を促進し延長する。
表２は、この実験で試験した条件を要約する。簡潔に述べると、２人のドナ-から得たγδＴ細胞を、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）＋／-ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）＋／-腫瘍由来細胞（腫瘍由来細胞２：Ｔ細胞１）＋／-再刺激の存在下で、以下のように０日目に活性化させた：ａ）腫瘍由来細胞非存在下で（対照）；ｂ）野生型照射腫瘍由来細胞（Ｋ５６２ＷＴ）によって；ｃ）ＺＯＬの非存在下で照射改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；ｃ-Ｒｅｓｔｉｍ）ＺＯＬの非存在下で照射改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって、７日目および１４日目に再刺激；ｄ）照射改変腫瘍由来の細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；およびｅ）照射改変腫瘍由来の細胞（Ｋ５６２変異型１）によって。細胞は２日目に模擬形質導入し、３日目に増殖させた。細胞は７、１０、１４、および１７日目に養分供給し、任意選択的に７日目および１４日目に再刺激した。細胞は、２１日目に凍結した。
Figure 2023515131000005
図１３Ａ～Ｃは、γδＴ細胞の活性化中に様々な腫瘍由来細胞を共培養した結果を示す。図１３Ａは、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で０日目に活性化された、２人のドナ-（Ｄ１（左側パネル）およびＤ２（右側パネル））から得たγδＴ細胞の増殖倍数を示す。１）腫瘍由来細胞非存在下で（対照）；２）野生型照射腫瘍由来細胞（Ｋ５６２ＷＴ）によって；３）照射改変腫瘍由来の細胞（Ｋ５６２変異型１）によって；４）照射改変腫瘍由来の細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；５）ＺＯＬの非存在下で照射改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって；および６）ＺＯＬの非存在下で照射改変腫瘍由来細胞（Ｋ５６２変異型２）によって、７日目および１４日目に再刺激。
図１３Ｂおよび１３Ｃは、ドナ-１（図１３Ｂ）およびドナ-２（図１３Ｃ）における、δ１（左パネル）およびδ２（右パネル）Ｔ細胞の双方の増殖を示す。
図１４Ａおよび１４Ｂは、ドナ-１（図１４Ａ）およびドナ-２（図１４Ｂ）における、全生細胞集団内に存在するγδＴ細胞の百分率を示す。
図１５は、培養物中のゾレドロン酸の欠乏が、ゾレドロン酸が培養物中にある条件と比較して、ポリクロ-ナル集団（δ１およびδ２γδＴ細胞の双方）をもたらすことを示す。細胞は２１日目に採取し、フロ-サイトメトリ-によって分析し、δ１およびδ２集団を判定した。
図１６は、腫瘍由来細胞の共培養が、増殖したγδＴ細胞の記憶表現型を変化させないことを示す。細胞は２１日目に採取し、フロ-サイトメトリ-によって解析して、細胞表面のＣＤ４５、ＣＤ２７、およびＣＣＲ７を検出することによって記憶表現型を判定した。
実施例４
同種異系細胞による増殖中のγδＴ細胞の再刺激は、増殖の増強と長期化をもたらす。
図１７Ａおよび１７Ｂは、γδＴ細胞の増殖に対する、照射同種異系ＰＢＭＣによる再刺激の効果を示す。簡潔に述べると、０日目に、αβ-ＴＣＲ発現Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含めた）枯渇末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（「γδＴ細胞」）を、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２（１００Ｕ／ｍｌ）、およびＩＬ-１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で活性化させた。２日目に、活性化γδＴ細胞を模擬形質導入した。３日目に、模擬形質導入細胞を増殖させた。７日目に、増殖したγδＴ細胞を５つの別々のグル-プに分けて、同種異系フィ-ダ-細胞による再刺激の効果を調べた。具体的には、２×１０６個の増殖γδＴ細胞を各処理群内に配置した。処理群は、次のとおりであった：１）ＩＬ-２＋ＩＬ-１５（対照）；２）ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３＋ＩＬ-２；３）ＰＢＭＣ＋ＩＬ-２；４）ＬＣＬ＋ＩＬ-２；５）ＯＫＴ３＋ＩＬ-２。各グル-プについて、ＰＢＭＣ＝２５×１０６細胞の量で添加された、２～３人のドナ-からプ-ルされ照射された同種異系ＰＢＭＣ。ＬＣＬ＝５×１０６個の量で添加された照射リンパ芽球様細胞。ＯＫＴ３＝可溶性ＯＫＴ３、３０ｎｇ／ｍｌの量で添加された活性化抗ＣＤ３抗体。ＩＬ-２は５０Ｕ／ｍｌの量で添加した。
１４日目に各再刺激処理を繰り返し、２１日目に細胞を採取して分析した。
図１７Ａ～Ｂは、同種異系ＰＢＭＣおよび／またはＬＣＬによる再刺激が、再刺激なしの場合と比較して、２人のドナ-（Ｄ１およびＤ２）から得られたγδＴ細胞の増殖倍数を成長平坦域なしで増加させることを示す。
図１８Ａ～Ｃは、同種異系ＰＢＭＣおよび／またはＬＣＬによる再刺激が、ポリクロ-ナル（δ１およびδ２γδＴ細胞の双方）集団を生成することを示す。生細胞の百分率としてのδ１細胞の存在を、２人のドナ-について図１８Ａおよび１８Ｂに示す。このデ-タは、δ１細胞の存在がドナ-依存性であることを示す。図１８Ｃは、２１日目の２人のドナ-からの対照処理（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）、およびＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３処理（ＩＬ-２の存在下）からの結果を示す。
図１９Ａ～Ｂは、ＰＢＭＣおよび／またはＬＣＬによる再刺激時に増殖したγδＴ細胞集団の記憶表現型を示す。記憶表現型は、２１日目ではなく１４日目に測定したので、７日目に１回だけ再刺激した。増殖したγδＴ細胞集団をフロ-サイトメトリ-によって分析し、細胞表面上のＣＤ４５、ＣＤ２７、およびＣＣＲ７の検出によって記憶表現型を判定した。図１９Ａは、増殖したγδＴ細胞集団上のＣＤ２７検出を示す。ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３で再刺激された増殖したγδＴ細胞では、ＣＤ２７の百分率がわずかに減少したように見える。図１９Ｂは、ＣＤ４５およびＣＣＲ７の発現を示す。ＣＣＲ７の百分率の増加が、ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３で再刺激された増殖したγδＴ細胞で見らる。
実施例５
γδＴ細胞の活性化のためにゾレドロン酸でパルス処理された同種異系ＰＢＭＣの生成。
実施例１で上に示したように、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）でパルス処理し、次に、７日目のγδＴ細胞の再刺激のために、および任意選択的に追加の再刺激ステップ（例えば、１４日目など）で、照射した新鮮な自系ＰＢＭＣを使用し得る。しかしながら、この方法では、臨床ドナ-から数回の採取が必要である。
複数の採取の必要性を回避するために、１つまたは複数の再刺激で使用するために、ＺＯＬでパルス処理されたＰＢＭＣの同種バンクを生成し得る。これらのＰＢＭＣの同種異系バンクは、次のように生成した：ドナ-から採取した凍結同種ＰＢＭＣ（αβＴ細胞を含めた）を解凍し、１００μＭのＺＯＬで４時間パルス処理した。次に、これらのＺＯＬ処理同種異系ＰＢＭＣを洗浄し、凍結した。ＺＯＬ処理した同種異系ＰＢＭＣを含有する凍結バイアルを５０Ｇｙで照射し、将来の使用のために保存した。これらの照射しＺＯＬ処理した同種異系ＰＢＭＣは、製造工程の７日目に再刺激のために解凍した。
実施例６
形質導入Ｔ細胞のペプチド特異的殺滅活性
表３に示す増殖法によって、形質導入Ｔ細胞を調製した。
Figure 2023515131000006
上記の工程は、工程１から６．８％ペプチド／ＭＨＣ特異的ＴＣＲ形質導入Ｔ（Ｔｅｔ＋）細胞を生成し、工程２から２１．９％Ｔｅｔ＋細胞を生成し、工程３から４７．４％Ｔｅｔ＋細胞を生成し、対照から２８．８％Ｔｅｔ＋細胞を生成した。ＴＣＲ（ＴＣＲ-Ｔ）で形質導入されたＴ細胞のペプチド特異的殺滅活性を判定するために、エフェクタ-Ｔ細胞、すなわち工程１、２、３、または対照によって増殖されたＴ細胞と、腫瘍細胞（例えば、細胞当たり約２４２コピ-を呈してもよいペプチド陽性Ｕ２ＯＳ細胞、およびペプチド陰性ＭＣＦ-７細胞など）とを３：１（エフェクタ-細胞：腫瘍細胞）の比率で共培養した。非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）は、陰性対照として機能する。腫瘍細胞の生存率／死滅率は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞解析システムを用いてリアルタイムで解析した。図２０Ａは、ペプチド陽性Ｕ２ＯＳ細胞に対する、工程３によって増殖させたＴ細胞（ＴＣＲ-Ｔ）の殺滅活性が、工程１または工程２によって増殖させたものよりも有意に高く、対照によって増殖したもの（ＴＣＲ-Ｔ）と同様であることを示す。 工程２、工程３、および対照によって増殖させたＴＣＲ-Ｔ細胞は、それらのそれぞれのＮＴ細胞よりも高い殺滅活性を示す。工程１で増殖させたＴＣＲ-Ｔ細胞とＮＴ細胞との間に、殺滅活性の有意差はないようである。図２０Ｂは、ペプチド陰性ＭＣＦ-７に対する、様々な工程によって増殖させたＴ細胞（ＴＣＲ-Ｔ）の殺滅活性が、それらのそれぞれの非形質導入Ｔ細胞（ＮＴ）細胞のものと類似しているように見えることを示す。これらの結果は、工程２、工程３、および対照によって増殖させたＴＣＲ形質導入Ｔ細胞が、ペプチド特異的様式で腫瘍細胞を認識し殺滅し得ることを示唆する。
実施例７
γδＴ細胞製造の最適化
図２１は、γδＴ細胞製造、例えば、対照および工程１～３（表３）工程を示し、その中では、細胞は、フィ-ダ-細胞および／または作動薬ＩまたはＩＩ、例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗４１ＢＢ、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ４０、および抗ＯＸ４０抗体の存在下で、解凍、活性化、および／または増殖されてもよい。０日目（工程１）または７日目（再刺激）および１４日目（再刺激）（工程２および工程３）にフィ-ダ-細胞を添加した。図２２Ａ～２２Ｄは、対照工程（フィ-ダ-なし）（図２２Ａ）によって調製されたγδＴ細胞中で観察された成長平坦域が、フィ-ダ-細胞刺激（例えば、工程１（図２２Ｂ）、工程２（図２２Ｃ）、および工程３（図２２Ｄ））によって克服されたことを示す。対照工程、工程２、および工程３によって生成された細胞で観察された、活性化後のγδＴ細胞の損失は、工程１によって生成された細胞で改善された。他方、工程２および工程３によって生成されたγδＴ細胞は、工程１によって生成されたものよりも高い増殖倍数を示す。工程３によって生成されたγδＴ細胞は、少なくとも１０，０００倍の増殖を達成した。
工程３によって生成されたγδＴ細胞は、「より若い」Ｔ細胞表現型を示。
対照工程および工程１～３によって生成された、γδＴ細胞の表現型を分析した。図２３Ａは、１４日目および２１日目に工程３によって生成されたγδＴ細胞が、対照工程、工程１、および工程２によって生成されたものよりも、例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-などのＴｃｍ表現型を示すより多くのγδＴ細胞％を有することを示す。矛盾なく、１４日目および２１日目の工程３によって生成されたγδＴ細胞は、対照工程、工程１、および工程２によって生成されたものよりも、例えば、ＣＤ６２Ｌ＋（図２３Ｂ）などのＴｃｍ表現型を示すより多くのγδＴ細胞％、および例えば、ＣＤ５７＋（図２３Ｃ）などの非Ｔｃｍ表現型を示すより少いγδＴ細胞％を有する。（ｎ＝４；平均＋ＳＤ；対照と比較したチュ-キ-の事後分散分析；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．５）
様々な工程によって生成されたγδＴ細胞における免疫チェックポイントタンパク質の発現に対する影響
様々な工程によって生成されたγδＴ細胞における免疫チェックポイントタンパク質発現を判定するために、％ＰＤ１＋（図２４Ａ）、ＬＡＧ３＋（図２４Ｂ）、ＴＩＭ３＋（図２４Ｃ）、およびＴＩＧＩＴ＋（図２４Ｄ）γδＴ細胞を判定した。図２４Ａは、１４日目に、工程１～３によって生成されたＰＤ１＋γδＴ細胞の％が、対照工程（Ｃ）によって生成されたものと比較して減少していることを示す。他方、工程１によって生成された％ＰＤ１＋γδＴ細胞は、１４日目から２１日目にかけて増加している。工程２および工程３によって生成された％ＰＤ１＋γδＴ細胞は、１４日目から２１日目まで同程度のようである。図２４Ｂは、工程２および３によって生成された％ＬＡＧ３＋γδＴ細胞が、１４日目に対照工程（Ｃ）によって生成されたものと比較して増加していることを示す。工程２および工程３によって生成された％ＬＡＧ３＋γδＴ細胞は、１４日目から２１日目まで同程度のようである一方で、工程１によって生成された％ＬＡＧ３＋γδＴ細胞は、１４日目から２１日目にかけて増加している。図２４Ｃは、工程１～３によって生成された％ＴＩＭ３＋γδＴ細胞が１４日目から２１日目にかけて減少していることを示す。図２４Ｄは、工程１～３によって生成された％ＴＩＧＩＴ＋γδＴ細胞が１４日目から２１日目にかけて減少していることを示す。
様々な工程によって生成されたγδＴ細胞の導入遺伝子発現に対する影響
工程１～３および対照工程（Ｃ）によって生成されたγδＴ細胞に、ＣＤ８αβおよびＴＣＲαβ（ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ）をコ-ドするウイルスベクタ-を形質導入し、標的ペプチド（ＰＲＡＭＥ）／ＭＨＣ四量体（Ｔｅｔ）染色がそれに続いた。図２５Ａは、最初の再刺激から１４日目に、工程３によって生成されたＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを導入した％Ｔｅｔ＋γδＴ細胞が、工程１、工程２、および対照工程によって生成されたものより高いことを示す。非形質導入（ＮＴ）細胞は、陰性対照として機能する。工程３によって生成されたＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥで形質転換したγδＴ細胞は、対照工程（１８．４％、図２６Ａ）および工程２（１２．１％、図２６Ｂ）によって生成されたものよりも多くのＣＤ８＋ＰＲＡＭＥ Ｔｅｔ＋γδＴ細胞（３９％、図２６Ｃ）をもたらした。ＭＦＩは、形質導入条件間で類似している。図２５Ｂは、工程３によって生成されたγδＴ細胞に組み込まれた導入遺伝子のコピ-数が約２コピ-／細胞であり、これは対照工程によって生成されたものと同等であり、工程１および工程２によって生成されたものよりも高いことを示す。
工程１における最初のＫ５６２刺激が形質導入と増殖に及ぼす影響
図２７Ａに示すように、工程１によって調製されたγδＴ細胞産物に対する初期Ｋ５６２刺激の効果を判定するために、γδＴ細胞を、２日目にＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを形質導入する前の０日目に刺激し、またはγδＴ細胞を、２日目にＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを導入した後の４日目に刺激した。図２７Ｂは、形質導入ありまたはなしで４日目に刺激したγδＴ細胞の増殖倍数が、０日目に刺激したものよりも低いことを示す。図２８Ａ～２８Ｃは、０日目にＫ５６２細胞で刺激したγδＴ細胞について、６０μｌ、１２０μｌ、および２４０μｌのＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥで形質転換したγδＴ細胞が、それぞれ８．６２％、１７．５％、および３１．１％のＣＤ８＋ＰＲＡＭＥ Ｔｅｔ＋細胞を生成したことを示す。図２８Ｄは、組み込まれた導入遺伝子のコピ-数を示す。２４０μｌのＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを導入したγδＴ細胞は、３１．１％のＣＤ８＋ＰＲＡＭＥ Ｔｅｔ＋細胞をもたらしたが（図２８Ｃ）、組み込まれた導入遺伝子のコピ-数は７．５３コピ-／細胞で、安全限界の５コピ-／細胞を超えている。対照的に、図２８Ｅは、６０μｌのＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥで形質導入され、４日目のＫ５６２細胞での刺激がそれに続いたγδＴ細胞が、１．７１コピ-／細胞の統合導入遺伝子のコピ-数で、３１．８％のＣＤ８＋ＰＲＡＭＥ Ｔｅｔ＋細胞をもたらたことを示す。これらのデ-タは、形質導入後４日目のＫ５６２刺激が十分な形質導入を可能にし、形質導入前の０日目に刺激したものよりも良好で安全なＴ細胞産物をもたらしてもよい一方で、それが増殖を制限してもよいことを示唆した。
導入遺伝子発現に対する再刺激の影響
図２９は、導入遺伝子（ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ）発現を示し、例えば、％ＣＤ８＋ＰＲＡＭＥ Ｔｅｔ＋γδ細胞は、（１）４日目に刺激して工程１（ｎ＝２）によって生成された細胞では、１４日目から２１日目にかけて増加し；（２）７日目および１４日目に再刺激して工程２（ｎ＝４）によって生成された細胞では、７日目から２１日目にかけて減少し；（３）７日目と１４日目に再刺激して工程３（ｎ＝４）によって生成された細胞では、７日目から１４日目にかけて増加し、１４日目から２１日目にかけて減少する。導入遺伝子の発現は、対照工程によって生成された細胞と同様のレベルのままである。
様々な工程によって生成されたγδＴ細胞の機能に対する影響
図３０は、７日目の最初の再刺激後、１４日目に実施した機能評価を示す。工程２、３、および対照工程（Ｃ）によって生成されたγδＴ細胞を、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥで形質導入するか（それぞれ２-Ｔ、３-Ｔ、およびＣ-Ｔ）、または形質導入しなかった（それぞれ２-ＮＴ、３-ＮＴ、およびＣ-ＮＴ）。同じＴＣＲで形質導入された、または形質導入されていないＣＤ８＋αβＴ細胞が、陽性対照（Ｐ-ＴおよびＰ-ＮＴ）として機能する。このように調製した細胞を、例えば、ＵＡＣＣ２５７（細胞当たり約１０８１個の標的ペプチド）、Ｕ２ＯＳ（細胞当たり約２４２個の標的ペプチド）、Ａ３７５（細胞当たり約５１個の標的ペプチド）、およびＭＣＦ-７（細胞当たり０個の標的ペプチド）などの標的細胞と共に、３：１のエフェクタ-／標的比でインキュベ-トし、細胞傷害性アッセイがそれに続いた。エフェクタ-細胞は、形質導入効率に対して正規化した。図３１Ａ～３１Ｃは、最初の再刺激の後、工程２（２-Ｔ）および工程３（３-Ｔ）によって生成されたγδＴ細胞の細胞溶解活性が、それぞれＵＡＣＣ２５７、Ｕ２ＯＳ、およびＡ３７５細胞に対するＣ-ＴおよびＰ-Ｔのそれよりも低くなっていることを示す。図３１Ｄは、非標的ＭＣＦ７細胞に対する、工程２（２-Ｔ）および交代３（３-Ｔ）によって生成されたγδＴ細胞の最小の細胞溶解活性を示す。（対照と比較したチュ-キ-の事後分散分析；ｎ＝４人のドナ-；＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．５）
図３２Ａおよび図３２Ｂは、最初の再刺激の後、工程２（２）および工程３（３）によって生成されたγδＴ細胞からのＩＦＮγ分泌が、エフェクタ-／標的比３：１で、それぞれＵＡＣＣ２５７およびＵ２ＯＳ細胞に対して、対照工程（Ｃ）によって生成されたものと同等であることを示す。エフェクタ-細胞は、形質導入効率に対して正規化した。図３２Ｃは、工程２（２）および工程３（３）によって生成されたγδＴ細胞からの、非標的ＭＣＦ７細胞に対する最小限のＩＦＮγ分泌を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞は、陰性対照として機能する。同じＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋αβＴ細胞は、陽性対照（Ｐ）として機能する。（ｎ＝２人のドナ-；２回の技術的反復／ドナ-）
図３３Ａおよび図３３Ｂは、最初の再刺激の後、工程２（２）および工程３（３）によって生成されたγδＴ細胞からのＴＮＦα分泌が、エフェクタ-／標的比３：１で、それぞれＵＡＣＣ２５７およびＵ２ＯＳ細胞に対して、対照工程（Ｃ）によって生成されたものと比較して減少していることを示す。エフェクタ-細胞は、形質導入効率に対して正規化した。図３３Ｃは、工程２（２）および工程３（３）によって生成されたγδＴ細胞からの、非標的ＭＣＦ７細胞に対する最小限のＴＮＦα分泌を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞は、陰性対照として機能する。同じＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋αβＴ細胞は、陽性対照（Ｐ）として機能する。（ｎ＝２人のドナ-；２回の技術的反復／ドナ-）
図３４Ａは、最初の再刺激の後、工程３（３）によって生成されたγδＴ細胞からのＧＭ-ＣＳＦ分泌が、エフェクタ-／標的比３：１で、ＵＡＣＣ２５７に対して工程２（２）および対照工程（Ｃ）によって生成されたものと比較して増加していることを示す。エフェクタ-細胞は、形質導入効率に対して正規化した。図３４Ｂは、このＧＭ-ＣＳＦの増加が、標的ペプチドの発現数が少ないＵ２ＯＳ細胞に対して観察されなかったことを示す。図３４Ｃは、工程２（２）および工程３（３）によって生成されたγδＴ細胞からの、非標的ＭＣＦ-７細胞に対する最小限のＧＭ-ＣＳＦ分泌を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞は、陰性対照として機能する。同じＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋αβＴ細胞は、陽性対照（Ｐ）として機能する。（ｎ＝２人のドナ-；２回の技術的反復／ドナ-）さらに、非導入細胞と導入細胞の間で、ＩＬ-６、パ-フォリン、およびグランザイムＢの発現レベルに差は観察されなかった。試験したが検出限界以下であったその他の検体には、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２ｐ７０、およびＩＬ-１７ａが含まれる。
様々な工程によって生成されたγδＴ細胞による腫瘍細胞殺滅
腫瘍細胞殺滅アッセイは、５：１のエフェクタ-／標的比で実施した。エフェクタ-細胞は、ＵＡＣＣ２５７細胞（１細胞当たり約１０８１個の標的ペプチド）を使用して形質導入効率に対して正規化した。ＵＡＣＣ２５７細胞は、表示された３つの異なる時点でアッセイに加えた。図３５Ａは、工程１（４日目刺激）、工程２、および対照工程によって生成された、ドナ-１から得られたγδＴ細胞によって、ＵＡＣＣ２５７腫瘍細胞増殖が阻害されることを示す。同じＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋αβＴ細胞は、陽性対照（Ｐ）として機能する。図３５Ｂは、工程２、工程３、および対照工程によって生成されたドナ-２から得られたγδＴ細胞によって、ＵＡＣＣ２５７腫瘍細胞増殖が阻害されることを示す。同じＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋αβＴ細胞は、陽性対照（Ｐ）として機能する。
最大３回の腫瘍刺激（１、２、および３）後に様々な工程によって生成されたＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥで形質導入したγδＴ細胞における、例えば、ＬＡＧ３、ＰＤ-１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３などの免疫チェックポイント分子の発現を判定した。図３６は、ＬＡＧ３、ＰＤ-１、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ３の発現が、工程１、工程２、および対照工によって生成されたγδＴ細胞間で同等であるように見えることを示す。同じＴＣＲで形質導入したＣＤ８＋αβＴ細胞は、陽性対照（陽性）として機能する。
実施例８
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）およびＩＬ-２１がγδＴ細胞製造に及ぼす影響
Ｗａｎｇらは、ＨＤＡＣｉとＩＬ２１が協力して、ヒトエフェクタ-ＣＤ８＋Ｔ細胞をメモリ-Ｔ細胞へ再プログラムし得ることを示した。（その内容全体が参照により本明細書に援用される、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ Ｊｕｎｅ １ ２０２０（８）（６）７９４-８０５；）。例えば、ＩＬ-２１の存在下で、例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）またはパノビノスタット（Ｐａｎｏ）などのＨＤＡＣｉで、腫瘍浸潤リンパ球を前処理することで、２週間の培養後にＴｃｍ αβＴ細胞（ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋）を増加させ得る。
工程３フィ-ダ-細胞によって調製されたＴ細胞産物に対するＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１の効果を試験するために、図３７は、実験デザインを示し、例えば、条件４の下で、γδＴ細胞は、０日目にゾレドロン酸＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下で活性化され、０日目から６日目にかけてＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下で増殖されてもよく、７日目のサイトカイン非存在下での工程３フィ-ダ-細胞による再刺激がそれに続き、８日目から１４日目にかけてのＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下での増殖がそれに続いた。条件５の下で、γδＴ細胞は、０日目にゾレドロン酸＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下で活性化され、０日目から６日目にかけてＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１＋ＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下で増殖されてもよく、７日目のサイトカイン非存在下での工程３フィ-ダ-細胞による再刺激がそれに続き、８日目から１４日目にかけてのＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下での増殖がそれに続いた。
図３８は、ＨＤＡＣｉおよびＩＬ-２１の非存在下で、７日目および１４日目に工程３フィ-ダ-細胞（プ-ルされた照射同種異系ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３）による再刺激が、工程１フィ-ダ細胞（照射Ｋ５６２-４１ＢＢＬ-ｍｂＩＬ１５）、工程２フィ-ダ-細胞（ゾレドロネ-トパルス照射同種異系ＰＢＭＣ）、および対照工程（フィ-ダ-細胞なし）によって再刺激されたものよりも、１４日目および２１日目により多くのＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋γδＴ細胞をもたらしたことを示す。ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋γδＴ細胞の量は、全ての工程について１４日目の２回目の再刺激後に減少する。（ｎ＝４；平均＋ＳＤ；対照と比較した多重比較による分散分析；＊＊＊ｐ＜０．０００５；＊ｐ＜０．５）
７日目に工程３フィ-ダ-細胞（プ-ルされた照射同種異系ＰＢＭＣ＋ＬＣＬ＋ＯＫＴ３）による最初の再刺激後の条件４（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２））および条件５（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１））下における、γδＴ細胞の増殖倍数を調べた。図３９Ａ～３９Ｃは、対照（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉなし）、第１週の間（ｗ１）（条件５）、および第２週の間（ｗ２）（条件４）にＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉで処理した、３人の異なるドナ-（ＳＤ０１００４６８７（図３９Ａ）、Ｄ１５５４１０（図３９Ｂ）、およびＳＤ０１０００２５６（図３９Ｃ）から得られた、γδＴ細胞の増殖倍数を示す。結果は、第１週の間（ｗ１）（条件５）にＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉによって調製されたγδＴ細胞の増殖倍数が、第２週の間（ｗ２）にＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉによって（条件４）および対照工程によって調製されたものより低いことを示す。しかしながら、この減少は、ＩＬ-２＋ＩＬ-１５の存在下で細胞を増殖させた後、１４日目に回復した。（＊＊工程３フィ-ダ-細胞再刺激を示す）
７日目に工程３フィ-ダ-細胞による最初の再刺激後の条件４（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２））および条件５（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１））における、δ２およびδ１Ｔ細胞の活性を調べた。図４０Ａ～４０Ｃは、対照（図４０Ａ）、ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１）（図４０Ｂ）、およびＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２）（図４０Ｃ）によって処理した、生存δ２およびδ１Ｔ細胞の％を示す。図４０Ｂは、δ２Ｔ細胞の量が、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ２１存在下での培養の第１週の間（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１））に、対照工程によって調製されたもの（図４０Ａ）と比較して減少していることを示す。図４０Ｃは、δ２およびδ１Ｔ細胞の量が、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ２１の存在下での培養の第２週の間（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２）） に、対照工程によって調製されたもの（図４０Ａ）と同等であることを示す。（＊＊工程３フィ-ダ-細胞再刺激を示す）
図４１Ａは、培養第１週の間にＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１））（条件５）、第２週の間にＩＬ-２＋ＩＬ-１５に切り替えると、ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｃｍ γδＴ細胞が減少することを示す。他方、培養の第１週の間にＩＬ-２＋ＩＬ-１５、第２週の間にＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２）（条件４）に切り替えると、ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔｃｍ γδＴ細胞が増加する。（ｎ＝３；平均＋ＳＤ；対照と比較した多重比較による分散分析；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００５）
同様に、図４１Ｂは、培養第１週の間にＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１））（条件５）、第２週の間にＩＬ-２＋ＩＬ-１５に切り替えると、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-Ｔｃｍ γδＴ細胞が減少することを示す。他方、培養の第１週の間にＩＬ-２＋ＩＬ-１５、第２週の間にＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２）（条件４）に切り替えると、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-Ｔｃｍ γδＴ細胞が増加する。（ｎ＝３；平均＋ＳＤ；対照と比較した多重比較による分散分析；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００５）
図４１Ｃは、培養第１週の間のＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ１））（条件５）または培養第２週の間の（ＩＬ-２１＋ＨＤＡＣｉ（ｗ２））（条件４）が、ＣＤ５７＋γδＴ細胞にほとんど影響を及ぼさないことを示す。（ｎ＝３；平均＋ＳＤ；対照と比較した多重比較による分散分析；＊＊ｐ＜０．０００５；＊ｐ＜０．５）
要約すると、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１は、γδＴ細胞のＴｃｍを促進してもよい。しかしながら、このＴｃｍ表現型は、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１除去後に元に戻ってもよい。さらに、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１を培養の第１週の間（０日目～７日目）に使用した場合、ＨＤＡＣｉ＋ＩＬ-２１は、増殖とδ１およびδ２Ｔ細胞サブセット百分率に影響を及ぼしてもよい。
実施例９
ＩＬ-１２およびＩＬ-１８の存在下での再刺激がγδＴ細胞の製造に及ぼす影響
図４２は、０日目にαβＴＣＲ発現Ｔ細胞からＰＢＭＣを枯渇させ、ゾレドロン酸（ＺＯＬ）（５μＭ）、ＩＬ-２、およびＩＬ-１５の存在下での活性化がそれに続いたことを示す。次に細胞をＩＬ-２とＩＬ-１５の存在下で増殖させた。７日目に、細胞をＩＬ-２とＩＬ-１５の存在下で連続的に増殖させ、またはＩＬ-１２とＩＬ-１８の存在下で増殖させ、７日目から１４日目まではＩＬ-２とＩＬ-１５の非存在下で増殖させた（サイトカインスイッチ）。サイトカインスイッチはγδＴ細胞の増殖を減少させ、ＩＬ-１２およびＩＬ-１８との長期培養が、γδＴ細胞の増殖に悪影響を及ぼしてもよいことが示唆される。例えば、ＩＬ-２Ｒα、ＩＬ-２Ｒβ、およびＩＬ-２γなどのＩＬ-２受容体、例えば、ＩＬ-７ＲαなどのＩＬ-７受容体、およびＩＬ-２１受容体（ＩＬ-２１Ｒ）を発現するγδＴ細胞の％を０、７、１０、および１４日目に判定した。結果は、７日目から１４日目にかけて、ＩＬ-２とＩＬ-１５の非存在下で、ＩＬ-２＋ＩＬ-１５からＩＬ-１２＋ＩＬ-１８にサイトカインを切り替えると、２人のドナ-（Ｄ１５５４１０（図４３Ａ）およびＳＤ０１０００４８６７（図４３Ｂ））から得られた細胞中で、ＩＬ-２Ｒα、ＩＬ-２Ｒγ、およびＩＬ-２１Ｒを発現するγδＴ細胞の％が増加することを示す。点線は、ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８（サイトカインスイッチ）の条件を表す。サイトカインスイッチは、ＩＬ-２ＲβおよびＩＬ-７Ｒαを発現するγδＴ細胞の％にほとんど影響を及ぼさない。
条件３（７日目再刺激時のＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミング）および再刺激後のＩＬ-２＋ＩＬ-１５）におけるγδＴ細胞増殖に対する影響を調べるために、図３７に示す条件１（対照）、条件２（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）、および条件３によって生成された細胞の増殖倍数を比較した。ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミング（条件３）は、対照および条件２（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）によって生成されるものと比較して、γδＴ細胞の増殖にほとんど影響を及ぼさない。３人のドナ-（ＳＤ０１００４６８７（図４４Ａ）、Ｄ１５５４１０（図４４Ｂ）、およびＳＤ０１００００２５６（図４４Ｃ））から得られた細胞からのＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングあり、およびＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングなし（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）のγδＴ細胞間の増殖倍数に有意差はない。さらに、ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングありで調製された％δ１Ｔ細胞および％δ２Ｔ細胞（図４５Ａ）と、ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングなしで調製された％δ１Ｔ細胞および％δ２Ｔ細胞（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）（図４５Ｂ）は、対照（図４５Ｃ）と比較して有意差がない。図３７に示す条件１（対照）、条件２（ＩＬ-２＋ＩＬ-１５）、および条件３（ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミング）によって調製されたδ２Ｔ細胞の表現型を、１４日目（ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミング後７日目）に評価した、ｎ＝３人のドナ-。図４６Ａは、ＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングによって調製されたγδＴ細胞のＴｃｍ表現型、例えば、ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ-が、対照およびＩＬ-２＋ＩＬ-１５によって生成されたものと比較して有意に減少していることを示す。図４６Ｂは、ＩＬ-２＋ＩＬ-１５によって調製されたγδＴ細胞のＴｃｍ表現型、例えば、ＣＤ２８＋ＣＤ６２Ｌ＋が、対照およびＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングによって生成されたものと比較して有意に減少していることを示す。図４６Ｃは、γδＴ細胞の非Ｔｃｍ表現型、例えば、ＣＤ５７＋が、対照、ＩＬ-２＋ＩＬ-１５、およびＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングによって生成された細胞中で、最小であることを示す。
要約すると、サイトカインスイッチまたはＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングは、増殖またはδ１およびδ２Ｔ細胞サブセット百分率に影響を与えなくてもよい。サイトカインスイッチまたはＩＬ-１２＋ＩＬ-１８プライミングは、対照法と比較して、１４日目までにＴｃｍ γδＴ細胞を減少させてもよい。
実施例１０
野生型（ＷＴ）Ｋ５６２対Ｋ５６２-４１ＢＢＬ-ｍｂＩＬ１５を使用した初期刺激がγδＴ細胞製造に及ぼす影響
Figure 2023515131000007
２人のドナ-（Ｄ１４８９６０およびＳＤ０１０００７２３）から得られたγδＴ細胞は、表４に示す工程に従って、Ｋ５６２ＷＴ、Ｋ５６２-４１ＢＢ-ｍｂＩＬ１５、またはＫ５６２-ＣＤ８６（ＣＤ８６を発現するように操作されたＫ５６２細胞）フィ-ダ-細胞を使用した初期刺激を用いて調製した。
結果は、一般に、工程ｂ～ｆによって調製された２人のドナ-（Ｄ１４８９６０（図４７Ａ）およびＳＤ０１０００７２３（図４７Ｂ））から得られた汎γδＴ細胞の増殖倍数が、工程ａ（対照）によって調製されたものより高いことを示す。Ｋ５６２ＷＴ（工程ｂ）またはＫ５６２-４１ＢＢ-ｍｂＩＬ１５（工程ｃ、ｄ、およびｅ）による初回刺激は、同等の結果をもたらす。一般に、工程ｂ～ｆによって調製された２人のドナ-（Ｄ１４８９６０（図４８Ａおよび４８Ｂ）およびＳＤ０１０００７２３（図４９Ａおよび４９Ｂ））から得られたδ１およびδ２サブセットＴ細胞の増殖倍数は、工程ａ（対照）によって調製されたものよりも高い。
本明細書で言及される全ての参考文献は、各参考文献が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。あらゆる参考文献の引用は、出願日より前のその開示に対するものであり、本開示が、先行発明の性質上、そのような参照を先取りする権利を有していないことを認めるものとして、解釈されるべきではない。
上述の要素のそれぞれ、または２つ以上を合わせて、上述の種類とは異なるその他の各種方法においても、有用な用途が見いだされてもよいことが理解されるであろう。さらなる分析なしに、前述のものは、本開示の要旨を完全に明らかにするので、その他の人々は、先行技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の一般的なまたは特定の態様の本質的な特徴を公正に構成する特徴を省略することなく、現在の知識を適用することによって、様々な用途に容易に適応させ得るであろう。前述の実施形態は、例示のためだけに示され；本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (80)

  1. γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、
    フィ-ダ-細胞と、任意選択的に、インタ-ロイキン（ＩＬ）-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２１、インタ-フェロン（ＩＦＮ）-α、およびＩＦＮ-βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインとの存在下で、単離γδＴ細胞を活性化するステップと、
    Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコ-ド化する核酸を含んでなるベクタ-を前記活性化γδＴ細胞に導入するステップと、
    前記導入したγδＴ細胞を増殖させるステップと
    を含んでなる、γδＴ細胞を調製する方法。
  2. 前記血液サンプルが、白血球アフェレ-シス産物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記血液サンプルが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記活性化がアミノビスホスホネ-トの存在下でさらに行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記アミノビスホスホネ-トが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物を含んでなる、請求項４に記載の方法。
  6. 前記アミノビスホスホネ-トが、ゾレドロン酸を含んでなる、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ-２およびＩＬ-１５を含んでなる、請求項１-～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記単離が、前記血液サンプルを抗αおよび抗βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）抗体と接触させ、前記血液サンプルからα-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させることを含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記フィ-ダ-細胞が、ヒト細胞、非ヒト細胞、ウイルス感染細胞、非ウイルス感染細胞、細胞抽出物、粒子、ビ-ズ、フィラメント、またはそれらの組み合わせである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記ヒト細胞がＫ５６２細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ヒト細胞が、少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ＩＬ-１５が膜結合型ＩＬ-１５である、請求項１２記載の方法。
  14. 前記フィ-ダ-細胞を照射する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記単離γδＴ細胞および前記フィ-ダ-細胞を約１：１～約５０：１（フィ-ダ-細胞：単離γδＴ細胞）の比率で混合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ベクタ-が、ウイルスベクタ-または非ウイルスベクタ-である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記増殖させるステップが、アミノビスホスホネ-トの非存在下および少なくとも１つのサイトカインの存在下である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記増殖したγδＴ細胞を再刺激するステップをさらに含んでなる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記再刺激するステップが、前記増殖したγδＴ細胞をさらなるフィ-ダ-細胞と接触させるステップを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、前記フィ-ダ-細胞と同一であるかまたは異なり得る、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記増殖したγδＴ細胞を前記さらなるフィ-ダ-細胞と約１：１～約５０：１（さらなるフィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で混合する、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、単球、ＰＢＭＣ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、前記ヒト対象に対して自系である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、前記ヒト対象に対して同種異系である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記さらなるフィ-ダ-細胞がαβＴ細胞を枯渇させている、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記さらなるフィ-ダ-細胞をアミノビスホスホネ-トと接触させる、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記アミノビスホスホネ-トがゾレドロン酸を含んでなる、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、ヒト細胞、非ヒト細胞、ウイルス感染細胞、非ウイルス感染細胞、細胞抽出物、粒子、ビ-ズ、フィラメント、またはそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
  29. 前記ヒト細胞がＫ５６２細胞である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ヒト細胞が、少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＩＬ-１５が膜結合型ＩＬ-１５である、請求項３１記載の方法。
  33. 前記さらなるフィ-ダ-細胞を照射する、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、
    任意選択的にインタ-ロイキン（ＩＬ）-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２１、インタ-フェロン（ＩＦＮ）-α、およびＩＦＮ-βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインと、アミノビスホスホネ-トまたはフィ-ダ-細胞の１つまたは複数との存在下で、前記単離γδＴ細胞を活性化するステップと、
    前記活性化γδＴ細胞を増殖させるステップと、前記増殖したγδＴ細胞を再刺激するステップと
    を含んでなる、γδＴ細胞を増殖させるインビトロ法。
  35. 前記血液サンプルが、白血球アフェレ-シス産物を含んでなる、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記血液サンプルが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含んでなる、請求項３４または３５に記載の方法。
  37. 前記アミノビスホスホネ-トが存在し、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物を含んでなる、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記アミノビスホスホネ-トが存在し、ゾレドロン酸を含んでなる、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記少なくとも１つのサイトカインが、ＩＬ-２およびＩＬ-１５を含んでなる、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記単離が、前記血液サンプルを抗αおよび抗βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）抗体と接触させ、前記血液サンプルからα-および／またはβ-ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させることを含んでなる、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記フィ-ダ-細胞が存在し、ヒト細胞、非ヒト細胞、ウイルス感染細胞、非ウイルス感染細胞、細胞抽出物、粒子、ビ-ズ、フィラメント、またはそれらの組み合わせである、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記ヒト細胞がＫ５６２細胞である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記ヒト細胞が、少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ＩＬ-１５が膜結合型ＩＬ-１５である、請求項４４記載の方法。
  46. 前記フィ-ダ-細胞を照射する、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記単離γδＴ細胞および前記フィ-ダ-細胞を約１：１～約５０：１（フィ-ダ-細胞：単離γδＴ細胞）の比率で混合する、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記増殖させるステップの前に、前記活性化γδＴ細胞を組換えウイルスベクタ-で形質導入するステップをさらに含んでなる、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記増殖させるステップが、アミノビスホスホネ-トの非存在下および少なくとも１つのサイトカインの存在下である、請求項３４～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記再刺激するステップが、前記増殖したγδＴ細胞をさらなるフィ-ダ-細胞と接触させるステップを含んでなる、請求項３４～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、フ前記ィ-ダ-細胞と同一であるかまたは異なり得る、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記増殖したγδＴ細胞を前記さらなるフィ-ダ-細胞と約１：１～約５０：１（さらなるフィ-ダ-細胞：増殖したγδＴ細胞）の比率で混合する、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、単球、ＰＢＭＣ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、前記ヒト対象に対して自系である、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、前記ヒト対象に対して同種異系である、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記さらなるフィ-ダ-細胞がαβＴ細胞を枯渇させている、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記さらなるフィ-ダ-細胞をアミノビスホスホネ-トと接触させる、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記アミノビスホスホネ-トがゾレドロン酸を含んでなる、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記さらなるフィ-ダ-細胞が、ヒト細胞、非ヒト細胞、ウイルス感染細胞、非ウイルス感染細胞、細胞抽出物、粒子、ビ-ズ、フィラメント、またはそれらの組み合わせである、請求項５０に記載の方法。
  60. 前記ヒト細胞がＫ５６２細胞である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記ヒト細胞が、少なくとも１つの組換えタンパク質を含んでなる操作された腫瘍細胞である、請求項５９または６０に記載の方法。
  62. 前記少なくとも１つの組換えタンパク質が、ＣＤ８６、４-１ＢＢＬ、ＩＬ-１５、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記ＩＬ-１５が膜結合型ＩＬ-１５である、請求項６２記載の方法。
  64. 前記さらなるフィ-ダ-細胞を照射する、請求項５０～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記増殖したγδＴ細胞の密度が、少なくとも約１×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０８細胞／ｍｌ、または少なくとも約１×１０９細胞／ｍｌである、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、増殖したγδＴ細胞の集団。
  66. 請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法によって調製された増殖したγδＴ細胞、または請求項６５に記載の増殖したγδＴ細胞の集団の有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法。
  67. 前記がんが、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん；小脳星細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫などの脳腫瘍；乳がん、気管支腺腫、バ-キットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸がん、小児期がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユ-イング肉腫、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞がん、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん；非小細胞および小細胞肺がんなどの肺がん；リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明がん、尿道がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレ-ムマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記がんが黒色腫である、請求項６７に記載の方法。
  69. 請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法によって調製された増殖したγδＴ細胞、または請求項６５に記載の増殖したγδＴ細胞の集団の有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなる、感染性疾患を治療する方法。
  70. 前記感染性疾患が、デング熱、エボラ、マ-ルブルグウイルス、結核（ＴＢ）、髄膜炎、および梅毒からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法によって調製された増殖したγδＴ細胞、または請求項６５に記載の増殖したγδＴ細胞の集団の有効量を、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなる、自己免疫疾患を治療する方法。
  72. 前記自己免疫疾患が、関節炎、慢性閉塞性肺疾患、強直性脊椎炎、クロ-ン病（２種類の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の１つ）、皮膚筋炎、真性糖尿病１型、子宮内膜症、グッドパスチャ-症候群、バセドウ病、ギランバレ-症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、川崎病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、エリテマト-デス、混合性結合組織疾患、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシ-、神経筋強直症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、乾癬、乾癬性関節炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、リウマチ様関節炎、統合失調症、強皮症、シェ-グレン症候群、スティフパ-ソン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞動脈炎」としても知られている）、潰瘍性大腸炎（２種類の特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の１つ）脈管炎、白斑、およびウェゲネル肉芽腫からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
  73. γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、
    フィ-ダ-細胞の非存在下で前記単離γδＴ細胞を活性化するステップと、
    Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコ-ド化する核酸を含んでなるベクタ-を前記活性化γδＴ細胞に導入するステップと、
    フィ-ダ-細胞の存在下で前記形質導入γδＴ細胞を増殖させるステップと
    を含んでなる、γδＴ細胞を調製する方法。
  74. 前記活性化するステップ、前記形質導入するステップ、および／または前記増殖させるステップが、インタ-ロイキン（ＩＬ）-１、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２１、インタ-フェロン（ＩＦＮ）-α、およびＩＦＮ-βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの存在下で実施される、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記フィ-ダ-細胞が、ヒト細胞、非ヒト細胞、ウイルス感染細胞、非ウイルス感染細胞、細胞抽出物、粒子、ビ-ズ、フィラメント、またはそれらの組み合わせである、請求項７３または７４に記載の方法。
  76. 前記フィ-ダ-細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／またはリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を含んでなる、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記活性化するステップ、前記形質導入するステップ、および／または前記増殖させるステップが、ＯＫＴ３の存在下で実施される、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記ベクタ-が、ウイルスベクタ-または非ウイルスベクタ-である、請求項７３～７７のいずれか一項に記載の方法。
  79. 前記増殖したγδＴ細胞が、δ１および／またはδ２Ｔ細胞を含んでなる、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記ベクタ-が、ＴＣＲをコ-ド化する核酸と、ＣＤ８αβまたはＣＤ８αをコ-ド化する核酸とを含んでなる、請求項１～６４および７３～７９のいずれか一項に記載の方法。

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