KR102032354B1 - 신규한 배양보조세포 및 이를 이용한 감마 델타 ｔ 세포의 증식 방법 - Google Patents

신규한 배양보조세포 및 이를 이용한 감마 델타 ｔ 세포의 증식 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 배양보조세포 및 이를 이용한 감마 델타 T 세포의 증식 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 보조자극분자가 도입된 배양보조세포와 저 농도의 IL-2를 이용하여 T 세포 수용체의 자극 없이 순도 높은 γδT 세포를 인 비트로에서 대량 증식할 수 있고, 상기 배양보조세포로 자극 시 중심기억세포로의 분화가 가능하며, 종양세포에 대한 세포살해능을 지닌다.

Description

신규한 배양보조세포 및 이를 이용한 감마 델타 Ｔ 세포의 증식 방법{Novel feeder cells and expansion method of gamma delta T cells using the same}
본 발명은 보조자극분자가 도입된 신규한 배양보조세포와 이를 이용하여 T 세포 수용체의 자극 없이 저 농도의 IL-2를 사용하여 인 비트로에서 순도 높은 감마 델타 T 세포를 대량 증식하는 방법에 관한 것이다.
최근, 사람 γδT 세포의 역할을 이해하기 위한 의미 있는 과정들은 감염, 종양 및 자가면역 질환에 대한 면역 반응에서 이루어져 왔다. Vγ9Vδ2 TCR을 발현하는 사람 γδT 세포는 말초혈액에서 작은 비펩타이드성 인산항원(phosphoantigen)에 의한 HLA-비제한적 방식으로 활성화할 수 있는 주요 서브세트인 것으로 알려져 있다. Vγ9Vδ2 T 세포는 종양세포에서 발현되는 NKG2D와 ULBP4를 포함하여 그들의 리간드를 인식할 수 있어 종양세포에 대한 강한 세포독성활성을 나타낼 수 있다. 또한, 새로운 면역치료적 접근 시 인 비보에서 Vγ9Vδ2 T 세포 및 입양 전달된 엑스 비보에서 확장된 자기 유래의 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화하는 두 조작이 배치되어야 하는 것으로 간주되고 있다. 사람 Vγ9Vδ2 T 세포에 대한 천연 항원인 이소펜테닐 파이로포스페이트(isopentenyl pyrophosphate)을 이용한 Vγ9Vδ2 T 세포의 엑스 비보 확장에 대한 많은 프로토콜들이 개발되어 있다. 특히, Correia 등은 인산항원 자체는 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 수 없고, 고 농도의 IL-2 첨가가 Vγ9Vδ2 T 세포 활성화를 완성하는데 중요하다고 보고하였다. 더 중요한 것은, 아미노비스포스포네이트로 전처리된 성숙된 수지상세포는 전통적인 배양 프로토콜에 해당하지 않는 PBMCs에서 고 순도의 Vγ9Vδ2 T 세포 확장을 유도할 수 있다는 것이다. 성숙한 수지상세포는 CD80, CD83 및 4-1BBL를 포함하여 다양한 보조자극 분자들을 발현하기 때문에, 이들 데이터는 다수의 보조자극 수용체를 통한 신호전달이 Vγ9Vδ2 T 세포를 활성화할 것임을 시사한다. 비록 CD80 및 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 포함하여 다양한 보조자극분자들이 참여하여 말초 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식 및 생존을 촉진한다는 점이 입증되어 있긴 하나, γδT 세포 활성화에 대한 CD83 및 그것의 리간드의 기능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
Lee, S. J. et al. (2013) Eur. J. Immunol. 43, 1839-1848. Testi, R. et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19, 185-188. DeBarros, A. et al. (2011) Eur. J. Immunol. 41, 195-201. Cabillic, F. et al. (2010) Cancer Immunol. Immunother. 59, 1611-1619.
본 발명의 목적은 보조자극분자군을 발현하면서 γδT 세포를 자극할 수 있는 배양보조세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 배양보조세포를 이용하여 T 세포 수용체 자극 없이 저 농도의 IL-2 하에서 순도 높은 γδT 세포를 인 비트로에서 증식할 수 있는 조성물 및 증식 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 4-1BBL, CD80 및 CD83를 포함하는 보조자극분자군(costimulatory molecule group)를 발현하고, HLA(human leukocyte antigen)를 발현하지 않는, 감마 델타 T 세포(γδT cell) 세포 자극용 배양보조세포(feeder cells)를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포를 포함하는 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, T 세포 수용체 자극이 없는 조건에서 상기 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포 및 감마 델타 T 세포를 인체 외에서 공동-배양하는 것을 포함하는 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식 방법을 제공한다.
본 발명은 T 세포 수용체 자극이 없는 저 농도의 IL-2 하에서 배양보조세포로 γδT 세포를 자극하여 인 비트로에서 순도 높은 γδT 세포를 대량 증식할 수 있고, 상기 γδT 세포는 중심기억세포로의 분화가 가능하며, 종양세포에 대한 세포살해능을 지닌다.
도 1은 본 발명에 따른 γδT 세포의 인 비트로 증식을 위한 보조자극분자를 발현하는 배양보조세포를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 배양보조세포에 발현하는 보조자극분자, 4-1BBL, CD80 및 CD83의 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포를 이용한 γδT 세포의 증식 결과를 도시한 것이다.
도 4는 다른 종류의 보조자극분자의 조합을 발현하는 배양보조세포를 이용한γδT 세포의 증식 결과를 도시한 것이다.
도 5는 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산 및 IL-2(1000 IU/mL)로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell)를 저 농도의 IL-2(20 IU/mL) 하에서 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포로 자극하여 얻은 γδT 세포의 증식률을 도시한 그래프이다.
도 6은 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산 및 IL-2(1000 IU/mL)로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell)를 저 농도의 IL-2(20 IU/mL) 하에서 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포로 자극하여 얻은 γδT 세포의 증식률을 도시한 FACS 분석 결과다.
도 7은 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산 및 IL-2(1000 IU/mL)로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell)를 저 농도의 IL-2(20 IU/mL) 하에서 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포로 자극하여 얻은 γδT 세포의 분화 마커의 FACS 분석(아형 분석) 결과이다.
도 8은 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산 및 IL-2(1000 IU/mL)로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell)를 저 농도의 IL-2(20 IU/mL) 하에서 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포로 자극하고, 항-CD3 항체의 유무에 따라 인 비트로에 증식된 γδT 세포의 FACS 분석(아형 분석) 결과이다.
도 9는 세포사멸억제분자 BCLA2A1가 4-1BBL/CD80/CD83를 발현하는 배양보조세포로 증식한 γδT 세포에서 발현하는 것을 보여주는 RT-PCR 결과이다.
도 10은 4-1BBL/CD80/CD83를 발현하는 배양보조세포로 증식한 γδT 세포의 종양세포에 대한 세포독성능을 확인한 결과이다.
도 11A는 보조자극분자 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포 에서의 각 보조자극 분자의 발현을 보여주는 FACS 분석 결과고, 도 11B는 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포와 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포의 자극 시 항-CD3-항체의 유무에 따른 γδT 세포의 증식 결과를 도시한 것이다.
도 12는 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포와 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포의 자극에 의한 증식 14일과 28일째의 γδT 세포의 순도 분석 결과를 도시한 것이다.
도 13은 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포와 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포의 자극에 의한 증식 14일과 28일째의 γδT 세포의 중심기억세포로의 분화능을 분석한 결과를 도시한 것이다.
본 발명자들은 인 비트로에서 사람 宸 T 세포의 생존, 증식 및 사이토카인 생성에 대한 CD83을 포함한 보조자극분자들의 역할을 조사하였다. 우선, K562 세포가 HLA 분자를 발현하지 않지만 점착 분자, 예컨대 ICAM, LFA-3, NKG2D 리간드 및 MHC 클래스 I-관련 사슬 A(MHC class I-related chain A)를 발현하는 이점을 갖고 있기 때문에 4-1BBL/CD80/CD83로 이루어진 보조자극분자군 또는 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L로 이루어진 보조자극분자군을 발현하는 K562-기반 안정한 형질전환체를 제조하였다. 이들 형질전환체들은 CD32 및/또는 CD64 등의 Fc 수용체의 발현율을 높이기 위해 이들을 추가로 형질도입하였다.
4-1BB/4-1BBL 상호작용은 B7/CD28 신호전달과는 독립적이고, 인 비보에서 활성화된 세포의 생존을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 특히, 수지상세포의 성숙화 동안 두드러지게 상향 조절된 CD83의 참여는 세포사멸을 억제하여 T 세포의 장기간 생존을 향상시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 감마 델타 T 세포 자극 분자인 MIC, ULBP와 같은 보조자극분자를 추가로 세포에 전이하여 자극할 수도 있다. 본 발명자들은 K562-기반 배양보조세포가 기능성 효과기-메모리 Vγ9Vδ2 T 세포의 장기간 생장을 허용하고, 인 비트로에서 T 세포 수용체 자극 없이도 저 농도의 IL-2 하에서 순도 높은 Vγ9Vδ2 T 세포의 증식율을 높임을 확인하였다.
상기 결과로부터 사람 γδT 세포 활성화 및 생존에서의 보조자극신호가 결과적으로 암, 감염 및 자가면역질환에 대한 γδT 세포-기반 면역치료전략을 개선함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명은 4-1BBL, CD80 및 CD83를 포함하는 보조자극분자군(costimulatory molecule group)를 발현하고, HLA(human leukocyte antigen)를 발현하지 않는, 감마 델타 T 세포(γδT cell) 세포 자극용 배양보조세포(feeder cells)에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 "배양보조세포(feeder cell)"란 인공적으로 제작된 항원제시세포를 의미하며, 면역분자를 발현하도록 개질된 비면역세포이다. MHC 클래스 I 또는 II(MHC I 또는 II) 분자를 단독으로 또는 다른 부속분자(보조자극분자 및/또는 접착 분자)와 함께 발현하는 배양보조세포는 생체 내에서 종양세포 또는 섬유아세포 세포주와 같은 쉽게 배양될 수 있는 T 세포 활성화 세포의 다양한 측면을 연구하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상, 조직적합성항원(HLA) 발현능이 없는 사람 세포, 예컨대, K562 세포 또는 인위적으로 HLA 유전자를 제거한 재조합 HEK 293T 세포 중 어느 하나에 보조자극분자들의 cDNA가 주입된 세포를 의미하나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 배양보조세포는 조직적합성항원(HLA) 발현능이 없는 세포로부터 제조된 것으로, 보조자극분자인 4-1BBL, CD80 및 CD83로 이루어진 보조자극분자군, 또는 4-1BBL, CD80, CD83 및 CD40L로 이루어진 보조자극분자군을 코딩하는 각각의 핵산을 HLA 발현능이 없거나 제거된 세포에 도입하여 제조되며, 종래의 배양보조세포와는 달리 면역 자극 리간드, 즉 T 세포 수용체 자극 없이 T 세포를 자극할 수 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 상기 배양보조세포는 T 세포 수용체 자극 없이도 인 비트로에서 보조자극분자의 조합만으로 순도 높은 γδT 세포를 대량 생산할 수 있다.
상기 배양보조세포는 보조자극분자 외에 Fc 수용체인 CD32 및/또는 CD64가 추가로 형질도입되어 CD32 및/또는 CD64의 발현율을 높인 것을 특징으로 한다.
상기 배양보조세포는 사람 말초혈액단핵구에서 분리한 나이브 감마 델타 T 세포(naive γδT cell) 또는 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산으로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell) 중 어느 하나를 자극하는 것일 수 있다.
상기 나이브 γδT 세포는 사람 말초혈액단핵구에서 FACS 소팅 또는 항-감마 델타 항체가 부착된 미세구체를 이용하여 분리하여 Vγ9Vδ2 아형을 나타내고, CD83/4-1BBL/항-CD28 시그널을 갖는 것일 수 있다.
상기 순도가 증가된 γδT 세포는 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산으로 자극하여 얻거나, 졸레드론산으로 자극시킨 후 FACS 소팅 또는 항-감마 델타 항체가 부착된 미세구체를 이용하여 분리하여 순도가 증가된 것일 수 있다. 상기 순도가 증가된 γδT 세포는 나이브 γδT 세포와 동일한 Vγ9Vδ2 아형을 나타내고, CD83/4-1BBL/항-CD28 시그널을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 배양보조세포는 항원 특이성을 제공하기 위해, 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원을 코딩하는 핵산이 추가로 형질도입된 것일 수 있다.
용어 "항원"은 당업계에서 잘 공지되어 있으며, 항체에 결합할 수 있는 모든 분자뿐만 아니라 에피토프, MHC 분자에 결합할 수 있는 항원의 펩타이드 단편, 및 면역원을 포함한다. 본 발명에서는 항원으로 종양 항원, 병원체 항원 또는 자가-항체(정상 또는 질환성) 등을 사용하나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 종양 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen, TAA)으로 종양과 관련 있는 항원을 의미한다. 잘 알려져 있는 TAA의 예로 오브알부민(Ovalalbumin), 서바이빈(survivin), gp75, gp1OO, MDM2, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, 티로시나제, 텔로머라제, her-2/neu, α-1 페토단백질(fetoprotein), G250, NY-ESO-1 등을 포함한다. MHC 분자에 결합하는 TAA의 일부 펩타이드 단편의 서열은 Ova257(SIINFEKL), tyrosinase-related protein 1455(Trp1455; TAPDNLGYA), Trp2180(SVYDFFVWL), 및 gp10025(gp10025; EGSRNQDWL), MAGE 1 노나펩타이드(EADPTGHSY), MART-APL 펩타이드(LAGIGILTV), 천연 펩타이드(AAGIGILTV) 또는 PSA-1 펩타이드(FLTPKKLQCV)등을 포함한다. 추가적인 종양 관련 펩타이드 및 항원의 서열은 당업자들에게 공지되어 있다.
상기 병원체 항원은 질환을 초래하는 유기체 또는 바이러스뿐만 아니라 이들의 약독화된 유도체를 의미한다. 용어 병원체는 질환의 발생에 관여하는 임의의 바이러스 또는 유기체, 및 그의 약독화된 유도체를 의미한다. 이러한 병원체로는 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및 바이러스 병원체, 예컨대 헬리코박터, 예컨대 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 균(Salmonella sp.), 시겔라 균(Shigella sp.), 엔터로박터 균(Enterobacter sp.), 캄필로박터 균(Campylobacter sp.), 다양한 마이코박테리아, 예컨대 마이코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라 균(Brucella sp.), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 스타필로코커스 균(Staphylococcus sp.), 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스 균(Streptococcus sp.), 클로스트리디움 균(Clostridum sp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 플라스모디움 균(Plasmodium sp.), 레쉬마니아 균(Leishmania sp.), 트리파노조마 균(Trypanosoma sp.), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), C 형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 사이토메갈로바이러스(CMV), HTLV, 헤르페스 바이러스(예, 1형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 2형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 코로나바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엡스타인-바 바이러스), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스 또는 루벨라 바이러스 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
상기 자가-항체는 항핵항체, 항γ글로불린 항체, 자기혈구성분에 대한 항체 또는 자기장기에 대한 항체 등이 있으나 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 자가-항체를 외래 항원으로 사용하는 경우, CD4 T 세포 백신은 강력한 항종양 면역을 유도할 수 있어, 정상조직에서 발현된 자가-항원에 대한 잠재적 면역 내성을 극복하는데 효과적일 수 있다.
본 명세서에서, 용어, "보조자극분자(costimulatory molecule)"는 항원제시세포의 표면에 발현된 수용체-리간드 쌍과 T 세포 간의 상호작용에 참여하는 물질로, 사이토카인 유전자 발현과 증식 유도를 위해서는 휴지기 T 세포에 2 이상의 신호가 필요하며, 한 가지 신호는 특이성을 부여하는 신호로 MHC/펩타이드 복합체와 TCR/CD3 복합체의 상호작용에 의해 생성되며, 두 번째 신호는 항원 비특이적이고, "보조자극성" 신호라 한다. 이 신호는 대식세포 및 수지상세포 등 골수 유래 보조 세포에 의해 제공되는 활성으로 알려져 있다. 보조자극분자는 정상적인 생리 조건 하에서 필요한 보조자극 신호를 매개하여 γδT 세포의 완전한 활성화를 수행한다. 본 발명에서는 이러한 보조자극 리간드로 4-1BBL, CD80 및 CD83의 조합 또는 4-1BBL, CD80, CD83 및 CD40L의 조합을 사용한다.
본 발명의 배양보조세포는 공지의 형질전환 기술을 이용하여 보조자극분자들이 HLA 발현능이 없거나 제거된 사람 세포에 형질도입되어 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, K562 세포에 보조자극분자들이 형질도입되어 제조될 수 있다.
상기 보조자극분자를 코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
바람직하게는, 상기 4-1BBL은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대, SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 CD80은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 CD83은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대, SEQ ID NO: 3에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 CD40L은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대, SEQ ID NO: 4에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 보조자극분자를 코딩하는 핵산으로 DNA를 선택하는 경우 벡터에 삽입된 형태로 HLA 발현능이 없거나 제거된 사람 세포에 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"란 용어는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드는 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
상기 레트로바이러스는 용균성 바이러스와는 상이한 생활주기를 가진 RNA 바이러스이다. 이 점에 있어서 레트로바이러스는 DNA 중간물질을 통해서 복제하는 전염성 독립체이다. 레트로바이러스가 세포를 감염시킬 때, 게놈은 역전사효소에 의해 DNA 형성으로 전환된다. DNA 카피는 새로운 RNA 게놈 및 감염성 바이러스 입자의 조립(assembly)을 위해 필수적인 바이러스성으로 인코딩되는 단백질의 생성을 위한 주형으로 쓰인다. 많은 레트로바이러스가 있는데, 예를 들면 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 생쥐 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 설치류 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨솔 쥐 백형병 바이러스(A-MLV), 조류 골수 세포증 바이러스-29(MC29) 및 조류의 적아구증 바이러스(AEV) 및 렌티바이러스를 포함하는 모든 다른 레트로바이러스과를 들 수 있다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffin et al("Retroviruses" 1997 Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)에 기술되어 있다.
형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 사람의 보조자극분자 4-1BBL, CD80, CD83 및 CD40L의 유전자에 대해 PCR 증폭을 통해 각각의 cDNA를 제조하고, 각각 레트로바이러스 벡터에 삽입하였다. 상기의 pcDNA3/CD80, pLXSN/4-1BBL, pcDNA3/CD83, pcDNA3/CD40L는 연속적으로 K562 세포에 형질전환되었다.
본 명세서에서, 용어 "감마 델타 T 세포"는 "γδT 세포"와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포를 포함하는 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 T 세포 수용체 자극이 없는 조건에서 상기 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포 및 감마 델타 T 세포를 인체 외에서 공동-배양하는 것을 포함하는 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 γδT 세포의 인 비트로 증식 방법에 사용된 γδT 세포는 사람 말초혈액단핵구에서 분리한 나이브 감마 델타 T 세포(naive γδT cell) 또는 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산으로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell) 중 어느 하나일 수 있다.
배양보조세포와 γδT 세포의 공동-배양은 T 세포 수용체 자극이 없는 조건에서 수행될 수 있다.
상기 T 세포 수용체 자극은 항-CD3 항체 또는 항-감마 델타 TCR 항체 하에서 배양하는 것이다.
따라서, 배양보조세포와 γδT 세포의 공동-배양은 항-CD3 항체 또는 항-감마 델타 TCR 항체가 없는 조건에서 저 농도의 IL-2가 포함된 세포 배양 배지에서 수행된다.
상기 세포 배양 배지는 동물 세포 배양용 안전 배지일 수 있다. 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(αMinimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 IL-2는 20 내지 100 IU/mL의 농도로 첨가될 수 있다. 이는 종래의 300 IU/mL 이상의 고 농도에서 수행되는 γδT 세포의 인 비트로 증식 방법에 비해 현저히 낮은 저 농도의 IL-2에서 수행되는 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식은 항-CD3 항체 또는 항-감마 델타 TCR 항체가 없는 조건에서 20 내지 100 IU/mL의 IL-2 하에서 4-1BBL, CD80, CD83 및 CD40L로 이루어진 보조자극분자군을 발현하는 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포와 나이브 감마 델타 T 세포(naive γδT cell) 또는 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell)를 공동-배양하여 수행되거나, 항-CD3 항체 또는 항-감마 델타 TCR 항체가 없는 조건에서 20 내지 100 IU/mL의 IL-2 하에서 4-1BBL, CD80 및 CD83로 이루어진 보조자극분자군을 발현하는 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포와 나이브 감마 델타 T 세포 또는 순도가 증가된 감마 델타 T 세포를 공동-배양하여 수행되는 것일 수 있다.
배양보조세포를 이용한 자극은 7일 내지 10일 간격으로 반복되며, 인 비트로 배양 가능 기간이 90일 이상, 보다 구체적으로 14일 내지 100일일 수 있다. 이는 종래의γδT 세포의 인 비트로 증식 방법이 최대 14일 이내라는 점을 고려하면 장기간 배양이 가능하다.
상기 공동-배양 조건은 CO2 배양기에서, 5 내지 15%의 이산화탄소의 통기량으로 35 내지 37℃에서 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L 또는 4-1BBL/CD80/CD83를 발현하는 배양보조세포의 자극은 졸레드론산에 의한 자극에 비해 순도 높은 γδT 세포를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 중심기억세포로의 분화가 더 오래 지속되었다. 게다가, 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L를 발현하는 배양보조세포의 자극은 4-1BBL/CD80/CD83를 발현하는 배양보조세포의 자극에 비해 γδT 세포의 장기간 증식이 가능하고, 순도 높은 γδT 세포를 얻을 수 있으며, 중심기억세포로의 분화가 더 오래 지속되었다.
또한, 4-1BBL/CD80/CD83를 발현하는 배양보조세포의 자극에 의해 증식된 γδT 세포의 경우, 세포사멸억제분자(anti-apoptotic molecule)이 발현하여 세포 증식이 오랫동안 유지되었고, 이러한 γδT 세포들이 종양세포에 대해 세포사멸능을 보였다
이하, 본 발명에 따르는 실시 예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 배양보조세포를 이용한 γδT 세포의 인 비트로 증식
(세포)
사람 시료는 가톨릭대학교의 연구윤리심의위원회의 검토와 승인을 받았다. 백혈구성분채집술에 따라 PBMC를 수집하고, Ficoll-paque(GE Healthcare) 밀도 구배를 이용하여 원심분리하였다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 이용하여 포지티브 선별에 의한 자성 세포 분류(magnetic cell sorting)에 따라 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 분리하였다(95% 이상의 순도에 이르도록 분리). γδT 세포는 항-TCRγ/δ MicroBead 키트(Miltenyi Biotec)를 이용하여 자성 세포 분류(magnetic cell sorting)에 따라 새롭게 정제된 PBMC에서 분리하였다(60% 이상의 순도에 이르도록 분리함). 특히 Vγ9Vδ2 T 세포를 분리하기 위해(95% 이상의 순도에 이르도록 분리함), FACSAria (Becton Dickinson)로 분류하여 γδT 세포를 CD3+ 및 Vγ9+ 서브세트로 추가 분리하였다.
세포 표면 염색을 위해, 세포를 항-TCRVγ9-PE(B3) 및 항-CD3-FITC(OKT3)에서 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 버킷 림프종 세포주 Daudi, 적혈구계 골수세포주 K562 및 백혈병 세포주 U937는 ATCC에서 얻었고, 완전 배지에서 배양하였다. 완전 배양 배지는 10% 열처리로 불활성화된 FBS(Gibco), 2 mM L-글루타민(Lonza), 100 U/mL의 페니실린(Lonza), 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신(Lonza)이 첨가된 1640 RPMI(Lonza)로 구성되어 있다.
(배양보조세포의 확립)
사람 CD80, 4-1BBL 및 CD83 유전자들은 PCR에 의해 cDNA로부터 증폭되고 나서, 각각 3.1-neo(Invitrogen) 및 pLXSN 레트로바이러스 벡터(Clontech)에 클로닝되었다. 우선, CD80을 K562 세포에 형질도입하여 K32를 제조하였다. 다음으로, 4-1BBL 또는 CD83을 K80 세포에 형질도입하여 K80/4-1BBL 및 K80/CD83를 생산하였다. 마지막으로, CD83을 K80/4-1BBL에 형질도입하여 K80/4-1BBL/CD83를 생산하였다. 사람 CD80, 4-1BBL 유전자들은 U937 세포주로부터 클로닝되었고, CD83 유전자는 성숙 DC로부터 클로닝되었다. pcDNA3/CD80 및/또는 pLXSN/4-1BBL 및/또는 pcDNA3/CD83 플라스미드는 Nucleofector kit V(Amaxa)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 연속적으로 K562 세포에 형질전환되었다. 형질전환체를 1 mg/mL의 G-418 DISULPHATE(Duchefa Biochemie)의 존재 하에서 배양하였다. 형질전환된 세포는 FACSAria에 의해 추가로 선별되었다. 모든 인공 APCs에 대해 PCR을 수행한 결과, 마이코플라즈마 무병주인 것으로 측정되었다(미도시됨).
(FACS 분석)
하기 mAb는 K562 및 Vγ9Vδ2 T 세포에서 보조자극분자들 및 활성화 마커들의 표면 발현을 시험하기 위해 사용되었다. 결합된, FITC-, PE-, Alexa Fluor 488-, APC-, 또는 Cy5-결합된 mAb: anti-CD3(OKT3), anti-TCRVδ2(B6), anti-HLA-A,B,C(W6/32), anti-CD27(O323), anti-CD27(O323), anti-CD45RA(HI100), anti-CD32(FUN-2), anti-CD25(BC96), anti-CD69(FN50), anti-CD28(CD28.2), anti-CD86(IT 2.2), anti-137(4B4-1), anti-137L(5F4), anti-CD83(HB15e), anti-CD80(2D10), anti-NKG2D(CD314), anti-TCRVγ9(B3), anti-TCRγ/δ(B1), 및 anti-HLA-DR,DQ-PE Abs.
모든 항체들은 BioLegend 또는 Ancell에서 구입하였다. 간단히 말해, 100㎕의 PBS(Lonza) 내 1×106개의 살아있는 T 세포를 2% FBS 함유 PBS로 2회 세척하였다. 세포 표면 마커들로 염색된 세포들은 PBS 내 1%의 파라포름알데히드를 사용하여 고정하였다. 이어서, FACSCalibur(Becton Dickinson)를 사용하여 세포들을 분석하였다. 데이터는 FlowJo software(Tree Star)로 분석하였다.
(Vγ9Vδ2 T 세포의 증식)
확장에 사용된 Vγ9Vδ2 T 세포는 FACSAria를 이용하여 CD3+ 및 Vγ9+ 세포를 말초혈액의 PBMCs로부터 분리하였다. 배양은 20 IU/mL의 IL-2(NOVARTIS)이 첨가된 완전 배양 배지에서 24-웰 플레이트(Nunc) 2 mL/well에서 수행되었다. Vγ9Vδ2 T 세포, 1×106 및 5×105개의 방사선 조사된(100 Gy) K80/4-1BBL/CD83 또는 K80/4-1BBL 또는 K80/CD83를 각 웰에 추가하였다. 그리고 나서, 37℃, 5% CO2의 조건에서 인큐베이션하였다.
성장하는 Vγ9Vδ2 T 세포를 3-4일 마다 수확하고, 카운팅하고 7-10일 간격으로 다시 자극시켰다. 1×106개의 Vγ9Vδ2 T 세포/웰에 5×105개의 방사선 조사된 인공 APCs를 추가하여 다시 플레이팅하고 나서, 완전 배양 배지 내 37℃, 5% CO2의 조건에서 로딩하였다.
10%의 불활성 FBS를 함유하는 1640 RPMI(Lonza)로 구성된 완전 배양 배지에서 5μM 졸레드론산(Novartis)로 PBMC를 자극하였다. IL-2(1000 IU/mL) 함유 배지를 3-4일 마다 첨가하고 배양물을 37℃, 5% CO2의 조건의 새로운 24-웰 플레이트로 옮겼다.
Vγ9Vδ2 T 세포를 Ficoll-paque density gradient에서 원심분리하여 죽은 Vγ9Vδ2 T 세포 및 남아 있는 인공 APCs를 제거하고 추가 이용 전까지 액체 질소에서 저온보존되었다.
(ELISA 분석)
Vγ9Vδ2 T 세포는 K80/4-1BBL/CD83 또는 K80/4-1BBL 또는 K80/83및 20 IU/mL의 IL-2가 로딩된 인공 APCs를 사용하여 완전 배지에서 37℃에서 72시간 동안 자극하였다. 상등액을 수집하고, 원심분리하여 세포 부스러기를 제거하고 나서 -20℃에서 저장하였다. IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-4, IL-10, TGF-β, 및 IL-17a의 농도는 ELISA(BioLegend)에 의해 제조업체의 설명서에 따라 상등액에서 측정되었다.
(역전사-PCR에 의한 RNA 발현 분석)
Vγ9Vδ2 T 세포는 K80/4-1BBL/CD83 또는 K80/4-1BBL 또는 K80/83 및 20 IU/mL의 IL-2가 로딩된 인공 APCs를 사용하여 완전 배지에서 37℃에서 7일 동안 자극하였다. Vγ9Vδ2 T 세포를 수확하고, RNeasy Mini kit(QIAGEN)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 역전사 반응에서 2.5 μM anchored-oligo(dT) 프라이머 및 Transcriptor Reverse Transcriptase(Roche)로 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit(Roche)를 사용하여 cDNA를 합성하고, 하기 프라이머들을 사용하여 PCR로 증폭하였다.
GAPDH forward, 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′';
GAPDH reverse, 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′';
perforin forward, 5'-GGCTGGACGTGACTCCTAAG-3′';
perforin reverse, 5'-CTGGGTGGAGGCGTTGAAG-3′';
granzyme A forward, 5'-GTGCTGGGGCTTTGATTGC-3′',
granzyme A reverse: 5'-GGGTCATAGCATGGATAGGGAAA-3′';
granzyme B forward, 5'-TGGGGGACCCAGAGATTAAAA-3′';
granzyme B reverse, 5'-TTTCGTCCATAGGAGACAATGC-3′',
FasL forward, 5'-GAACTCCGAGAGTCT ACCAGC-3′'; ,
FasL reverse, 5'-TTGCCTGTTAAATGGGCCACT-3′';
TNF-α forward, 5'-ATGAGCACTGAAAGCATGATCC-3′';
TNF-α reverse, 5-GAGGGCTGATTAGAGAGAGGTC-3′,
IFN-γ forward, 5-CTCTTGGCTGTTACTGCCAGG-3′;
IFN-γ reverse, 5-CTCCACACTCTTTTGGATGCT-3′;
BCL2 forward, 5'-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′';
BCL2 reverse, 5'- CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′';
BCL2A 1 forward, 5'-TTACAGGCTGGCTCAGGACT-3′';
BCL2A 1 reverse, 5'-CCCAGTTAATGATGCCGTCT-3′';
Bcl-xL forward, 5'-AGCCTTGGATCCAGGAGAAC-3′';
Bcl-xL reverse, 5'-AGCGGTTGAAGCGTTCCT-3′'.
상기 모든 프라이머들은 이미 기재되어 있다(DeBarros, A. et al. Eur J Immunol 2011. 41: 195-201; Dokouhaki, P. et al. Cancer Lett 2010. 297: 126-136).
각 표본에 대해, 20㎕의 반응 혼합물은 반응 버퍼, 1mM의 각 디옥시뉴클레오타이드 혼합물, 프로텍트 RNase 저해제 20U, 10pM의 각 프라이머, 10U의 트랜스트립터 리버스 트랜스크립타아제를 포함하였다. 써모사이클링 프로그램(thermocycling program)은 다음과 같다: 50℃에서 1시간, 83℃에서 10분 동안 cDNA 증폭. 하우스키핑 유전자 GAPDH를 정량화를 위한 참고 유전자로 사용하였다. 산물은 1.2% 아가로스 젤에서, 100 volts에서 25분 동안 분리하였다. mRNA는 Image Lab software(BIO-RAD)로 측정하였다.
(세포독성 분석)
Park, M. Y. et al. Eur J Immunol 2008. 38: 2106-2117에 기재되어 있는 표준 51Cr-방출 분석을 수행하였다. 간단히 말해, K562 및 Daudi 세포주를 100 mCi [51Cr] 소듐 크로메이트/1×106 개의 세포와 함께 37℃, 5% CO2의 조건에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 51Cr-표지된 표적 세포를 효과기 세포인 Vγ9Vδ2 T 세포와 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 상등액(100㎕)을 수확하고, 감마 카운터(Packard)에서 방사능을 카운팅하였다. 특이적 용해율은 100×[(실험적 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)]로 계산하였다. 자발적 방출 및 최대 방출은 각각 배지 및 2% 트리톤-X100의 존재 하에서 측정하였다.
(통계 분석)
모든 데이터는 통계 프로그램 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc.)에서 분석하였다. 값 사이의 차이는 Student's t-test를 사용하여 평가하였다. 유의값은 p < 0.05로 결정하였다.
<실험예 1> 배양보조세포를 이용한 γδT 세포의 증식
도 1은 γδT 세포의 인 비트로 증식을 위해 K562 세포주에 면역 자극 리간드를 포함하지 않는, 보조자극분자 CD83/4-1BBL/CD80을 발현하는 자극 세포를 확립하여, 인 비트로에서 인간 γδT 세포의 증식을 보여주는 도식도이다.
도 2에 나타난 바와 같이, K562 세포주에서 확립한 배양보조세포에서 보조자극분자, CD83, 4-1BBL 및 CD80의 발현을 확인하였다.
도 3은 배양보조세포에 의해 자극을 받은 γδT 세포의 인 비트로 증식 결과를 도시한 것으로, 공 배양 14일까지 γδT 세포의 증식이 확인되었다.
도 4는 다른 종류의 보조자극분자의 조합을 발현하는 배양보조세포에 의해 자극을 받은 γδT 세포의 증식 결과를 도시한 것으로, CD83, 4-1BBL 및 CD80를 발현하는 배양보조세포의 자극 시 γδT 세포의 증식율이 가장 높았다.
<실험예 2> 졸레드론산과 IL-2 자극 7일 후 배양보조세포를 이용한 γδT 세포의 증식 및 분화 마커 실험
도 5에 개시된 자극 과정도에 따라, 4종의 인간 말초혈액에서 졸레드론산과 IL-2(1000 IU/mL)를 7일간 처리하여 γδT 세포의 수를 증가시킨 후에, 7일 이후부터는 미세구체 또는 FACS 소팅 같은 별도의 정제 과정 없이 배양보조세포와 저 농도의 IL-2(20 IU/mL)를 사용하여 γδT 세포를 3주간 자극하였다.
도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 4종의 인간 말초혈액에서 졸레드론산과 고 농도의 IL-2 처리한 7일간 γδT 세포의 증식은 미비하였으나, 자극세포와 저 농도의 IL-2를 자극한 3주간 급격한 γδT 세포의 증식이 확인되었다.
또한, 4종의 인간 말초혈액에서 졸레드론산과 고 농도의 IL-2를 7일간 처리한 후 7일간 인 비트로 증식 시 분화 마커는 대부분 effector memory 형으로 확인 되었다(도 7).
그러나, 졸레드론산과 고 농도의 IL-2를 7일간 처리한 후 배양보조세포와 저 농도의 IL-2(20 IU/mL)를 사용하여 γδT 세포를 자극한 다음, γδT 세포의 아형을 분석한 결과, 졸레드론산만의 자극을 준 γδT 세포와 달리 중심기억세포의 아형이 존재하는 것으로 확인되었다(도 7).
<실험예 3> T 세포 수용체 자극을 이용한 γδT 세포의 증식 실험
졸레드론산과 IL-2(1000 IU/mL)를 7일간 처리하여 γδT 세포의 수를 증가시킨 후에, 7일 이후부터는 미세구체 또는 FACS 소팅 같은 별도의 정제 과정 없이 배양보조세포와 저 농도의 IL-2(20 IU/mL)를 사용하여 γδT 세포를 자극하고, 면역 자극 리간드인 항-CD3 항체의 유무에 따라 인 비트로에 증식된 γδT 세포의 아형 분석을 수행하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 항-CD3 항체를 사용하지 않았을 경우에 Vγ9+/Vδ2+ T 세포의 순도가 더 높은 것으로 확인되었다.
상술한 바와 같이, CD80, CD83 및 4-1BBL의 보조자극분자를 발현하는 배양보조세포의 자극을 이용한 γδT 세포의 인 비트로 증식은 장기간 증식이 가능하고, 인산항원에 의해 유도된 γδT 세포 보다 중심기억세포로의 분화가 더 오래 지속되며, 순도 높은 γδT 세포를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 4> 다양한 보조자극분자를 발현하는 배양보조세포를 이용한 γδT 세포 증식 효과
다양한 종류의 보조자극분자를 발현하는 배양보조세포를 이용하여 증식된 γδT 세포 중 4-1BBL/CD80/CD83를 모두 발현하는 배양보조세포로 증식한 γδT 세포가 가장 증식률이 좋았으며, 이러한 원인을 세포사멸억제 분자의 발현을 확인함으로써 증명하였다.
도 9는 세포사멸억제분자 BCLA2A1이 4-1BBL/CD80/CD83를 모두 발현하는 배양보조세포로 증식한 γδT 세포에서 발현하는 것을 RT-PCR 결과로 확인하였다.
도 10은 4-1BBL/CD80/CD83를 모두 발현하는 배양보조세포로 증식한 γδT 세포의 세포독성능을 Daudi, Raji 종양세포주에서 확인한 결과로, 4-1BBL/CD80/CD83를 모두 발현하는 배양보조세포로 증식한 γδT 세포가 향후, 동종의 종양세포를 사멸하는 세포로 사용할 수 있음을 확인하였다.
<실험예 5> 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포를 이용한 γδT 세포의 증식 및 분화 마커 실험
γδT 세포의 인 비트로 증식을 위해 K562 세포주에 면역 자극 리간드를 포함하지 않는, 보조자극분자 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포를 확립하였다(도 11A). 1종의 인간 말초혈액에서 졸레드론산과 IL-2(1000 IU/mL)를 7일간 처리하여 γδT 세포의 수를 증가시킨 후에, 7일 이후부터는 미세구체 또는 FACS 소팅 같은 별도의 정제 과정 없이 배양보조세포와 저 농도의 IL-2(20 IU/mL)를 사용하여 γδT 세포를 4주간 자극하였다. 증식률과 함께, 증식 14일과 28일째의 γδT 세포의 순도와 아형 분석을 수행하였다.
도 11B는 동일한 인간 말초혈액에서 졸레드론산과 고 농도의 IL-2(1000 IU/mL)을 이용한 증식 결과와, 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포를 이용한 증식 결과와, 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포에 의해 자극을 받은 γδT 세포의 28일까지의 인 비트로 증식 결과를 도시한 것이다.
졸레드론산을 이용한 경우와는 달리 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포를 이용한 경우 21일이 지나도록 증식률의 감소 없이 지속적으로 증식하였고, 증식률은 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포를 이용한 경우보다 약 16.5배 더 높았음을 알 수 있었다.
또한, 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포를 이용한 경우, 항-CD3로 T 세포 수용체 자극을 하지 않을 때 γδT 세포의 증식이 가능함을 확인하였다.
도 12는 증식 14일과 28일째의 γδT 세포의 순도 분석 결과를 도시한 것으로, 졸레드론산과 고 농도의 IL-2(1000 IU/mL)을 이용한 경우나, 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포를 이용한 경우보다 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포를 이용한 경우에 Vγ9+/Vδ2+ T 세포의 순도가 더 높은 것으로 확인되었다.
도 13은 증식 14일과 28일째의 γδT 세포의 아형 분석 결과를 도시한 것으로, 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포를 이용한 경우보다는 중심기억세포로의 분화 및 유지가 적지만, 졸레드론산과 고 농도의 IL-2(1000 IU/mL)을 이용한 경우보다는 중심기억세포로의 분화 및 유지가 잘되는 것을 확인할 수 있었다.
상술한 바와 같이, 4-1BBL/CD80/CD83/CD40L을 발현하는 배양보조세포의 자극을 이용한 γδT 세포의 인 비트로 증식은 장기간 증식이 가능하고, 인산항원 혹은 4-1BBL/CD80/CD83을 발현하는 배양보조세포의 자극에 의해 유도된 γδT 세포 보다 순도 높은 γδT 세포를 얻을 수 있음을 알 수 있었으며, 인산항원의 자극에 의해 유도된 γδT 세포 보다 중심기억세포로의 분화가 더 오래 지속됨을 알 수 있었다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel feeder cells and expansion method of gamma delta T cells using the same <130> P14U11C0792 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60 gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120 ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180 tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240 cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300 ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360 acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420 tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480 gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540 ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600 ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660 agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720 acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765 <210> 2 <211> 1734 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60 cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120 gaagtgaaag aagtggcaac gctgtcctgt ggtcacaatg tttctgttga agagctggca 180 caaactcgca tctactggca aaaggagaag aaaatggtgc tgactatgat gtctggggac 240 atgaatatat ggcccgagta caagaaccgg accatctttg atatcactaa taacctctcc 300 attgtgatcc tggctctgcg cccatctgac gagggcacat acgagtgtgt tgttctgaag 360 tatgaaaaag acgctttcaa gcgggaacac ctggctgaag tgacgttatc agtcaaagct 420 gacttcccta cacctagtat atctgacttt gaaattccaa cttctaatat tagaaggata 480 atttgctcaa cctctggagg ttttccagag cctcacctct cctggttgga aaatggagaa 540 gaattaaatg ccatcaacac aacagtttcc caagatcctg aaactgagct ctatgctgtt 600 agcagcaaac tggatttcaa tatgacaacc aaccacagct tcatgtgtct catcaagtat 660 ggacatttaa gagtgaatca gaccttcaac tggaatacaa ccaagcaaga gcattttcct 720 gataacctgc tcccatcctg ggccattacc ttaatctcag taaatggaat ttttgtgata 780 tgctgcctga cctactgctt tgccccaaga tgcagagaga gaaggaggaa tgagagattg 840 agaagggaaa gtgtacgccc tgtataaatg ggccacacac ggaggcaggg aacatcacca 900 tccaagtgtc catacctcaa tttctttcag ctcttggtgc tggctggtct ttctcacttc 960 tgttcaggtg ttatccacgt gaccaaggaa gtgaaagaag tggcaacgct gtcctgtggt 1020 cacaatgttt ctgttgaaga gctggcacaa actcgcatct actggcaaaa ggagaagaaa 1080 atggtgctga ctatgatgtc tggggacatg aatatatggc ccgagtacaa gaaccggacc 1140 atctttgata tcactaataa cctctccatt gtgatcctgg ctctgcgccc atctgacgag 1200 ggcacatacg agtgtgttgt tctgaagtat gaaaaagacg ctttcaagcg ggaacacctg 1260 gctgaagtga cgttatcagt caaagctgac ttccctacac ctagtatatc tgactttgaa 1320 attccaactt ctaatattag aaggataatt tgctcaacct ctggaggttt tccagagcct 1380 cacctctcct ggttggaaaa tggagaagaa ttaaatgcca tcaacacaac agtttcccaa 1440 gatcctgaaa ctgagctcta tgctgttagc agcaaactgg atttcaatat gacaaccaac 1500 cacagcttca tgtgtctcat caagtatgga catttaagag tgaatcagac cttcaactgg 1560 aatacaacca agcaagagca ttttcctgat aacctgctcc catcctgggc cattacctta 1620 atctcagtaa atggaatttt tgtgatatgc tgcctgacct actgctttgc cccaagatgc 1680 agagagagaa ggaggaatga gagattgaga agggaaagtg tacgccctgt ataa 1734 <210> 3 <211> 618 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgtcgcgcg gcctccagct tctgctcctg agctgcgcct acagcctggc tcccgcgacg 60 ccggaggtga aggtggcttg ctccgaagat gtggacttgc cctgcaccgc cccctgggat 120 ccgcaggttc cctacacggt ctcctgggtc aagttattgg agggtggtga agagaggatg 180 gagacacccc aggaagacca cctcagggga cagcactatc atcagaaggg gcaaaatggt 240 tctttcgacg cccccaatga aaggccctat tccctgaaga tccgaaacac taccagctgc 300 aactcgggga catacaggtg cactctgcag gacccggatg ggcagagaaa cctaagtggc 360 aaggtgatct tgagagtgac aggatgccct gcacagcgta aagaagagac ttttaagaaa 420 tacagagcgg agattgtcct gctgctggct ctggttattt tctacttaac actcatcatt 480 ttcacttgta agtttgcacg gctacagagt atcttcccag atttttctaa agctggcatg 540 gaacgagctt ttctcccagt tacctcccca aataagcatt tagggctagt gactcctcac 600 aagacagaac tggtatag 618 <210> 4 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360 caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420 gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480 ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540 cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600 ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660 caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720 gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780 ctctga 786

Claims (13)

  1. 4-1BBL, CD80 및 CD83으로 이루어진 보조자극분자군(costimulatory molecule group) 또는 4-1BBL, CD80, CD83 및 CD40L로 이루어진 보조자극분자군을 발현하고, HLA(human leukocyte antigen)를 발현하지 않으며, 감마 델타 T 세포(γδT cell) 자극능을 가진 것을 특징으로 하는 배양보조세포(feeder cells).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    배양보조세포는 CD32 및 CD64로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 Fc 수용체가 추가로 형질도입된 것인, 배양보조세포.
  4. 제1항에 있어서,
    배양보조세포는 K562 세포이거나, 인위적으로 HLA 유전자를 제거한 재조합 HEK 293T 세포에서 유래한 것인, 배양보조세포.
  5. 제1항에 있어서,
    배양보조세포는 사람 말초혈액단핵구에서 분리한 나이브 감마 델타 T 세포(naive γδT cell) 또는 사람 말초혈액단핵구를 졸레드론산으로 자극하여 얻은 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell) 중 어느 하나를 자극하는 것인, 배양보조세포.
  6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 배양보조세포를 포함하는 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    조성물은 IL-2를 더 포함하는, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    IL-2는 20 내지 100 IU/mL의 농도로 포함되는, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식용 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    조성물은 항-CD3 항체 및 항-감마 델타 TCR 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식용 조성물.
  10. T 세포 수용체 자극이 없는 조건에서 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 배양보조세포 및 감마 델타 T 세포를 인체 외에서 공동-배양하는 것을 포함하는 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    T 세포 수용체 자극은 항-CD3 항체 또는 항-감마 델타 TCR 항체 하에서 배양하는 것인, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식은 항-CD3 항체 또는 항-감마 델타 TCR 항체가 없는 조건에서 20 내지 100 IU/mL의 IL-2 하에서 감마 델타 T 세포 자극용 배양보조세포와 나이브 감마 델타 T 세포(naive γδT cell) 또는 순도가 증가된 감마 델타 T 세포(enriched γδT cell)를 공동-배양하여 수행되는 것인, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식 방법.
  13. 제10항에 있어서,
    공동-배양은 14일 내지 100일 동안 수행되는, 감마 델타 T 세포의 인 비트로 증식 방법.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110184240B (zh) * 2019-06-13 2020-11-20 上海市肺科医院 一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法
EP4110901A1 (en) * 2020-02-24 2023-01-04 immatics US, Inc. Methods for expanding t cells for the treatment of cancer and related malignancies
TW202309270A (zh) * 2021-04-19 2023-03-01 美商步行魚醫療公司 用於細胞療法的ｂ細胞擴增之方法
CN115678846B (zh) * 2022-09-01 2023-06-16 广东龄值生物科技有限公司 一种肿瘤特异性γδT细胞及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2017006408A (es) * 2014-11-17 2018-03-23 Adicet Bio Inc Linfocitos t gamma delta modificados geneticamente.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2016087871A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 King's College London Gammadelta t cell expansion procedure

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Clin Cancer Res. 2014, 20(22): 5708-5719.
J Vis Exp. 2011, (55).

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