CN110184240B - 一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法 - Google Patents

一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法。所述方法为：抽取健康人的外周血，分离淋巴细胞，在无血清培养基中用唑来膦酸和白细胞介素2，白细胞介素15联合刺激，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有细胞因子的新鲜培养基。在培养3‑15天后，加入白细胞介素12和细胞介素18联合刺激12‑72小时，能够有效扩增并增强Vγ2Vδ2 T细胞对胞内感染分枝杆菌的抑制或杀灭效果。该类细胞可以用于临床结核病及相关感染性疾病以及肿瘤的细胞免疫治疗。

Description

一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法。
背景技术
结核病tuberculosis(TB)是由结核分枝杆菌及其复合菌群感染引起的传染病。由于结核病的现有唯一预防性疫苗BCG的保护效果不理想，HIV与TB的共感染，以及耐多药结核病的出现等问题，使得目前结核病的防治依然面临严峻的挑战。耐多药结核病是指结核病人体内的病原菌对多种临床使用的抗结核药物产生了耐药性。目前，耐多药结核病是结核病治疗过程中面临最大的问题。现在所有的临床抗结核化学药物都发现了耐药菌株，耐多药结核病面临无药可用的地步。目前尚无新型抗结核化学药物问世，因此需要开发新型的治疗方法来治疗结核病。
结核分枝杆菌是胞内寄生菌，细胞免疫在抵抗结核菌感染过程中发挥重要作用。结核病的细胞免疫治疗可以诱发宿主特异性免疫应答，来杀死细胞内寄生的结核分枝杆菌。免疫治疗和化学药物的联合使用为结核病的治疗提供了新思路，尤其为耐药结核病的治疗开辟了新途径。
Vγ2Vδ2 T细胞又名Vγ9Vδ2 T细胞，占人体外周血细胞约1-10％、γδ T细胞的90％左右，在人体先天性免疫和后天免疫中发挥重要作用。我们前期的大量研究证明，Vγ2Vδ2 T细胞具有临床用于结核免疫治疗的潜力。Vγ2Vδ2 T细胞是唯一能够识别结核磷酸抗原的γδT细胞，只存在于人和非人灵长类，其它动物不存在这种抗原特异的γδT细胞。我们建立了体内靶向扩增Vγ2Vδ2 T细胞的方法，并证明Vγ2Vδ2 T细胞靶向免疫治疗对猴结核病有显著的治疗效果。但目前未见体外高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞用于TB治疗的报道。
期刊《郑州大学学报：医学版》2011年第4期刊出的文章“中国猕猴CD4+CD25+调节性T细胞对Vγ2Vδ2T细胞体外增殖的影响”，公开了IL-2联合HMBPP可体外预激活Vγ2Vδ2T细胞。专利文献CN103555666A，公开日2014.02.05，公开了一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞。但仍需要更高效的Vγ2Vδ2 T细胞扩增活化方法，尤其是提高Vγ2Vδ2 T细胞抗结核效应功能的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞，提高Vγ2Vδ2 T细胞抗结核效应功能的方法。
第一方面，本发明提供了高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞的方法，包括以下步骤：将新鲜分离的外周淋巴细胞使用含0.75-15μg/ml唑来膦酸、5-100ng/ml IL-2、10-200ng/mlIL-15的培养体系进行培养，其中，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
作为一个优选例，在使用所述培养体系培养3-15天后，向培养体系中加入50-200ng/ml IL-12和50-200ng/ml IL-18，继续培养12-72小时。
作为另一优选例，所述培养体系使用的培养基为X-VIVO 15免疫细胞无血清培养基或含10％胎牛血清的1640培养基。
作为另一优选例，培养后，还包括对Vγ2Vδ2 T细胞分离的步骤。
作为另一优选例，所述外周淋巴细胞是采用Ficoll分离方法获得的。
第二方面，本发明提供了如上任一所述方法获得的Vγ2Vδ2 T细胞。
第三方面，本发明提供了如上所述的Vγ2Vδ2 T细胞在制备细胞免疫药物或疫苗中的应用。
作为一个优选例，所述细胞免疫药物用于治疗感染性疾病或肿瘤。
更优选地，所述感染性疾病为结核病。
更优选地，所述肿瘤选自消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。
本发明优点在于：
1、本发明方法其Vγ2Vδ2 T细胞体外扩增效率高；
2、根据本发明方法获得的Vγ2Vδ2 T细胞具有显著的抗结核效应功能；
3、根据本发明方法获得的Vγ2Vδ2 T细胞可用于人体进行细胞免疫治疗，包括针对结核病及其它胞内菌感染的感染性疾病以及肿瘤的细胞免疫治疗。
附图说明
图1.IL-2和IL-15联合使用能够诱导更高比例的Vγ2Vδ2 T细胞。PBMC细胞采用不同的处理培养7天，各组处理条件如下：A.Medium，即培养基；B.ZOL，即采用唑来膦酸刺激；C.ZOL+IL-2，即采用唑来膦酸和IL-2共同刺激；D.ZOL+IL-2+IL-15，即采用唑来膦酸和IL-2+IL-15两种细胞因子共同刺激；E.ZOL+IL-15，即采用唑来膦酸和IL-15共同刺激。采用抗体进行表面染色后，进行流式分析，横坐标为Vγ2-FITC，纵坐标为Vδ2-APC。
图2.扩增后的Vγ2Vδ2 T细胞能够显著抑制巨噬细胞内感染的BCG的生长。实验处理：M组是只有培养基Medium；ZOL组是只加唑来膦酸处理组；ZOL+IL-2+IL-15是唑来膦酸和IL-2以及IL-15共同处理组；ZOL+IL-2是唑来膦酸和IL-2处理组；ZOL+IL-15是唑来膦酸和IL-15处理组。
图3.用IL-12+IL-18进行48小时刺激能够进一步增强Vγ2Vδ2 T细胞的杀菌功能。各组实验处理：Medium是指培养基处理组；ZOL+IL-2组是唑来膦酸和IL-2处理组；ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18是唑来膦酸和IL-2，IL-15，IL-12，IL-18共同处理组；ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18)是唑来膦酸和IL-2+IL-15处理5天后，再采用IL-12+IL-18刺激48小时。
图4.不同浓度的ZOL对Vγ2Vδ2 T细胞亚群刺激诱导效果的比较。PBMC刺激后，采用特异抗体进行染色进行流式分析，同时统计了相应细胞亚群的细胞数目。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、实验材料
X-VIVO 15培养基：购于LONZA公司，商品号04-418Q；
IL-2：购于R&D Systems公司，商品号202-IL-500；
IL-15：购于R&D Systems公司，商品号247-ILB-025；
IL-12：购于BIOLEGEND公司，商品号573002；
IL-18：购于BIOLEGEND公司，商品号592104。
二、实验方法
1.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸(zoledronic acid concentrated solution for injection，文中简称为ZOL)作用浓度为1.5微克/毫升(μg/ml)。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为10ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度都是100ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
2.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
收集待测细胞，按照我们已经建立的方法采用特异流式抗体与细胞混合孵育(Th17-related cytokines contribute to recall-like expansion/effector functionof HMBPP-specific Vγ2Vδ2T cells after Mycobacterium tuberculosis infectionor vaccination.Shen H,Wang Y,Chen CY,Frencher J,Huang D,Yang E,Ryan-PayseurB,Chen ZW.Eur J Immunol.2015Feb；45(2):442-51.doi:10.1002/eji.201444635.)，洗掉未结合的抗体，在流式细胞分析仪进行分析。
3.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
采用磁珠分选的方法，从刺激处理后的PBMC中分选Vγ2阳性细胞。分选后的Vγ2细胞与感染BCG的巨噬细胞按10:1的比例混合，共同培养3天后，采用SDS裂解细胞，按照一定比例稀释后，将裂解液涂到7H10平板上，在37℃条件下培养3-4周，进行菌落计数。
三、实验结果
1.IL-2和IL-15联合使用能够产生协同作用效果促进Vγ2Vδ2 T细胞功能性扩增
为了筛选最佳的诱导Vγ2Vδ2 T细胞的细胞因子组合，我们根据以往研究经验选择了IL-2和IL-15对被ZOL活化的PBMC细胞进行7天刺激，分别比较IL-2和IL-15联合组与IL-2以及IL-15单独使用组的作用效果。实验结果表明，IL-2和IL-15联合组(图1中D)与IL-2组(图1中C)以及IL-15组(图1中E)相比，能够诱导更高比例的Vγ2Vδ2 T细胞。研究结果证明，IL-2和IL-15能够协调作用，联合使用能够显著诱导Vγ2Vδ2 T细胞的扩增。
2.IL-2和IL-15联合使用能够促进ZOL活化的Vγ2Vδ2 T细胞的抑菌/杀菌作用效果
为了验证扩增后的Vγ2Vδ2 T细胞的抗结核作用效果，我们分选了Vγ2Vδ2T细胞，然后与感染了BCG的巨噬细胞THP-1以及人源巨噬细胞共同培养3天，进行细菌计数。结果表明，ZOL+IL-2+IL-15组的菌落数目最少，显著低于其他组(图2)。研究结果证明，采用细胞因子IL-2和IL-15共同刺激，能够提高Vγ2Vδ2 T细胞对巨噬细胞内感染的BCG的杀伤和抑制作用效果。
3.IL-12和IL-18进行48小时处理能够增强ZOL+IL-2+IL-15活化的Vγ2Vδ2T细胞的抑菌/杀菌作用效果
为了进一步增强Vγ2Vδ2 T细胞的抗结核效应功能，我们增加了IL-12和IL-18细胞因子进行刺激。我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激5天后，加入IL-12和IL-18再刺激48小时。分选Vγ2Vδ2 T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激5天后，再加入IL-12+IL-18刺激48小时实验组，细菌数目最低(图3，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，表明该处理组具有最佳的抑菌或杀菌效果。研究结果证实，PBMC细胞采用ZOL+IL-2+IL-15刺激5天后，再加入IL-12+IL-18刺激48小时能够进一步提高Vγ2Vδ2 T细胞的抗结核效应功能。
实施例2
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法
1.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸作用浓度为0.75μg/ml。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为80ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度分别为10ng/ml、200ng/ml、50ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
2.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
同实施例1。
3.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
同实施例1。
三、实验结果
我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激10天后，加入IL-12和IL-18再刺激12小时。分选Vγ2Vδ2T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激10天后，再加入IL-12+IL-18刺激12小时实验组，细菌数目最低(表1，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，表明该处理组具有最佳的抑菌或杀菌效果。研究结果证实，PBMC细胞采用ZOL+IL-2+IL-15刺激10天后，再加入IL-12+IL-18刺激12小时能够进一步提高Vγ2Vδ2 T细胞的抗结核效应功能。
表1各实验组菌落数
组别 菌落数(×2×10<sup>2</sup>CFU)
Media 96.4±10.3
ZOL+IL-2 73.3±8.6
ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18 70.8±9.2
ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18) 58.5±7.5**
注：ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18)与ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18两组相比较，**P<0.01。
实施例3
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法
1.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸作用浓度为15μg/ml。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为100ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度分别为200ng/ml、50ng/ml、200ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2、3天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
2.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
同实施例1。
3.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
同实施例1。
三、实验结果
我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激3天后，加入IL-12和IL-18再刺激72小时。分选Vγ2Vδ2 T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激3天后，再加入IL-12+IL-18刺激72小时实验组，细菌数目最低(表2，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，表明该处理组具有最佳的抑菌或杀菌效果。研究结果证实，PBMC细胞采用ZOL+IL-2+IL-15刺激3天后，再加入IL-12+IL-18刺激72小时能够进一步提高Vγ2Vδ2 T细胞的抗结核效应功能。
表2各实验组菌落数
组别 菌落数(×2×10<sup>2</sup>CFU)
Media 93.6±11.8
ZOL+IL-2 67.2±7.6
ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18 68.5±6.9
ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18) 53.9±5.9**
注：ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18)与ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18两组相比较，**P<0.01。
实施例4
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法
4.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸作用浓度为10μg/ml。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为5ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度分别为10ng/ml、150ng/ml、150ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
5.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
同实施例1。
6.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
同实施例1。
三、实验结果
我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激15天后，加入IL-12和IL-18再刺激48小时。分选Vγ2Vδ2T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激15天后，再加入IL-12+IL-18刺激48小时实验组，细菌数目最低(表3，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，表明该处理组具有最佳的抑菌或杀菌效果。研究结果证实，PBMC细胞采用ZOL+IL-2+IL-15刺激15天后，再加入IL-12+IL-18刺激48小时能够进一步提高Vγ2Vδ2 T细胞的抗结核效应功能。
表3各实验组菌落数
组别 菌落数(×2×10<sup>2</sup>CFU)
Media 98.4±11.4
ZOL+IL-2 77.5±8.2
ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18 70.0±7.8
ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18) 50.1±4.9**
注：ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18)与ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18两组相比较，**P<0.01。
实施例5
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法
7.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸作用浓度为15μg/ml。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为100ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度分别为200ng/ml、50ng/ml、200ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
8.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
同实施例1。
9.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
同实施例1。
三、实验结果
我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激2.5天后，加入IL-12和IL-18再刺激72小时。分选Vγ2Vδ2T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激2.5天后，再加入IL-12+IL-18刺激72小时实验组，细菌数目最低(表4，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，但与第一种方法的效果差异不显著。
表4各实验组菌落数
组别 菌落数(×2×10<sup>2</sup>CFU)
Media 97.0±10.2
ZOL+IL-2 65.3±6.4
ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18 67.9±7.1
ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18) 63.3±5.2
实施例6
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法
10.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸作用浓度为10μg/ml。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为5ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度分别为10ng/ml、150ng/ml、150ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
11.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
同实施例1。
12.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
同实施例1。
三、实验结果
我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激16天后，加入IL-12和IL-18再刺激48小时。分选Vγ2Vδ2T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激16天后，再加入IL-12+IL-18刺激48小时实验组，细菌数目最低(表5，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，但与第一种方法的效果差异不显著。
表5各实验组菌落数
组别 菌落数(×2×10<sup>2</sup>CFU)
Media 94.4±9.3
ZOL+IL-2 73.6±7.7
ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18 69.8±6.0
ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18) 66.5±5.7
实施例7
一、实验材料
同实施例1。
二、实验方法
13.外周淋巴细胞分离及刺激条件
采集实验人群外周血，用抗凝管收集。采用Ficoll分离方法，来分离外周淋巴细胞(PBMC)。细胞按照0.5million(百万单位)/孔的密度，在U型底的96孔板中进行培养，每孔加200μl培养基。培养基为可以用于临床细胞治疗用细胞培养的X-VIVO 15培养基，该培养基不含血清，培养过程中，也不再添加血清。
新鲜分离的PBMC细胞培养体系中，根据不同需要分别加入下列刺激物。唑来膦酸作用浓度为15μg/ml。各种白细胞介素(IL)作用浓度分别为：IL-2为100ng/ml；IL-15、IL-12、IL-18作用浓度分别为200ng/ml、50ng/ml、220ng/ml。细胞培养条件为37℃，5％CO2。其中，在使用含有IL-2、IL-15的培养体系培养期间，分别在刺激的第2、3天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基。
14.流式细胞分析方法检测特异细胞亚群的比例
同实施例1。
15.细胞对胞内结核菌的杀菌实验
同实施例1。
三、实验结果
我们采用两种方法，第一种是在刺激的初期就加入IL-12和IL-18，第二种是在刺激3天后，加入IL-12和IL-18再刺激72小时。分选Vγ2Vδ2 T细胞与感染了BCG的巨噬细胞共同培养3天后进行菌落计数，结果表明第二种方法即在PBMC用ZOL+IL-2+IL-15刺激3天后，再加入IL-12+IL-18刺激72小时实验组，细菌数目最低(表6，ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18))，但与第一种方法的效果差异不显著。
表6各实验组菌落数
组别 菌落数(×2×10<sup>2</sup>CFU)
Media 97.1±9.4
ZOL+IL-2 73.6±7.2
ZOL+IL-2+IL-15+IL-12+IL-18 70.2±6.6
ZOL+IL-2+IL-15(+IL-12+IL-18) 65.8±7.6
实施例8
不同浓度的ZOL的刺激效果比较：为了选择最优的ZOL刺激浓度，我们分别采用0-7.5μg/ml的ZOL在添加100ng/ml的IL-2的条件下，培养7天。采用流式分析的方法，测量了Vγ2Vδ2 T细胞亚群占CD3+T细胞的比例，以及细胞绝对数目。结果发现，在ZOL浓度为1.5μg/ml时，Vγ2Vδ2 T细胞亚群占CD3+T细胞的比例最高，接近80％。细胞数目也达最高，约4万个(图4)。当细胞浓度变低或增高时，Vγ2Vδ2 T细胞亚群占CD3+T细胞的比例以及细胞数目都会显著降低(图4)。因此，最优的ZOL刺激浓度为1.5μg/ml。
综上，通过系列研究，我们发明了一个在体外有效扩增Vγ2Vδ2 T细胞增强对分枝杆菌感染的免疫效应功能，包括结核分枝杆菌感染等的方法。该方法是，外周淋巴细胞PBMC在无血清培养基X-VIVO 15中用唑来膦酸(ZOL)和白细胞介素2，15(IL-2，IL-15)共同刺激，分别在开始刺激的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有细胞因子IL-2和IL-15的新鲜培养基。在3-15天后，加入白细胞介素12，18(IL-12，IL-18)联合刺激12-72小时，能够有效扩增并增强Vγ2Vδ2 T细胞对胞内感染分枝杆菌的抑制或杀灭效果。该方法获得的免疫细胞可以用于临床结核病及其它胞内菌感染的感染性疾病以及肿瘤的细胞免疫治疗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种高效扩增活化Vγ2Vδ2T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将新鲜分离的外周淋巴细胞使用含0.75-15μg/ml唑来膦酸、5-100ng/ml IL-2、10-200ng/ml IL-15的培养体系进行培养，其中，分别在刺激培养 的第2、3、5天去除50％培养基，补充含有相同浓度细胞因子的新鲜培养基；使用所述培养体系培养3-15天后，向培养体系中加入50-200ng/mlIL-12和50-200ng/ml IL-18，继续培养12-72小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养体系使用的培养基为X-VIVO 15免疫细胞无血清培养基或含10％胎牛血清的1640培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养后，还包括对Vγ2Vδ2T细胞分离的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外周淋巴细胞是采用Ficoll分离方法获得的。
5.根据权利要求1-4任一所述方法获得的Vγ2Vδ2T细胞。
6.权利要求5所述的Vγ2Vδ2T细胞在制备细胞免疫药物或疫苗中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞免疫药物用于治疗结核病。
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