CN117660334A - 一种nk细胞高效扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种NK细胞高效扩增方法。在本发明中首次提供了一种NK细胞高效扩增培养基，所述培养基是利用细胞因子组合与NK细胞促增殖肽协同改善DMEM基础培养基对NK细胞的扩增效率，结果发现，在二者联合应用下，NK细胞的体外增殖活性明显得到改善，且存在协同效果。
Description
技术领域
本发明涉及细胞扩增的技术领域，特别涉及一种NK细胞高效扩增方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细。
由于NK细胞能够识别和裂解肿瘤细胞，以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域受到广泛关注。NK细胞的特点是它们具有通过不同机制杀死肿瘤细胞的潜力，而无需事先致敏，因此已成为癌症免疫治疗中的重要工具。但是其在外周血中的数量仅占淋巴细胞总量的5％左右，如何实现NK细胞体外扩增培养从而应用于治疗是关键的技术问题。
现有的NK细胞体外扩增手段主要包括在培养基中添加动物血清、细胞因子或与其它细胞共同培养来刺激NK细胞的生长。但是动物血清成分较复杂，易给细胞培养带来不安全因素；细胞因子的添加不当容易引起NK细胞激活受体和抑制受体表达变化；同时，异体的细胞也往往存在医学上的不安全性和伦理问题。因此，有必要开发一种高效、安全的NK细胞体外扩增方法从而为NK细胞的临床治疗应用提供有力的技术保障。因此，需要有一种能够提高扩增数量和纯度的NK细胞制备方法。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种NK细胞高效扩增方法。该方法是依托于NK细胞高效扩增培养基而实现高效率扩增的目的，所述培养基是利用细胞因子组合与NK细胞促增殖肽协同改善DMEM基础培养基对NK细胞的扩增效率，结果发现，在二者联合应用下，NK细胞的体外增殖活性明显得到改善，且存在协同效果。
本发明的目的之一在于提供了一种NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5-15ng/mL SCF、5-15ng/mL IL-3、5-15ng/mL G-CSF、5-15ng/mL IFN-γ、20-50ng/mL NK细胞促增殖肽。
优选地，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5ng/mLSCF、5ng/mL IL-3、5ng/mL G-CSF、5ng/mL IFN-γ、20ng/mL NK细胞促增殖肽。
优选地，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、10ng/mLSCF、10ng/mL IL-3、10ng/mL G-CSF、10ng/mL IFN-γ、30ng/mL NK细胞促增殖肽。
优选地，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、15ng/mLSCF、15ng/mL IL-3、15ng/mL G-CSF、15ng/mL IFN-γ、50ng/mL NK细胞促增殖肽。
优选地，所述NK细胞促增殖肽的氨基酸序列为
FCSGKIGANVWKDNPRGEKWAGLGPHVRKRRPGQSHCNRNGCQNWRH IAP(SEQ ID NO.1)。
本发明的目的之一在于提供了一种NK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)NK细胞分离；
2)采用所述的NK细胞高效扩增培养基培养步骤1)中的NK细胞。
优选地，步骤1)是采用NK细胞分离液分选NK细胞；
进一步优选地，步骤1)的详细步骤包括：抽取新鲜健康成人外周血15mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，用MACS缓冲液重悬细胞；依次加入NKcell Biotin-Antibody Cocktail和NK cell MicroBead Cocktail作细胞阳性分选，收集富含NK细胞的细胞悬液，用流式细胞术检测CD3-CD56+CD16+NK细胞纯度；
优选地，步骤2)是采用摇瓶培养收集NK细胞；
进一步优选地，步骤2)的详细步骤包括采用所述的NK细胞高效扩增培养基对步骤1)中的CD3-CD56+CD16+NK细胞重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，每间隔2天进行半量换液，连续培养1周后，收集NK细胞。
本发明的优点如下：本发明提供了一种NK细胞高效扩增培养基及其扩增方法，所述培养基是利用细胞因子组合与NK细胞促增殖肽协同改善DMEM基础培养基对NK细胞的扩增效率，结果发现，在二者联合应用下，NK细胞的体外增殖活性明显得到改善，且存在协同效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
一种NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5ng/mL SCF、5ng/mL IL-3、5ng/mL G-CSF、5ng/mL IFN-γ、20ng/mL NK细胞促增殖肽。
其中，NK细胞促增殖肽的氨基酸序列为
FCSGKIGANVWKDNPRGEKWAGLGPHVRKRRPGQSHCNRNGCQNWRH IAP(SEQ ID NO.1)。
实施例2
一种NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、10ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、10ng/mL G-CSF、10ng/mL IFN-γ、30ng/mL NK细胞促增殖肽。
其中，NK细胞促增殖肽的氨基酸序列为
FCSGKIGANVWKDNPRGEKWAGLGPHVRKRRPGQSHCNRNGCQNWRH IAP(SEQ ID NO.1)。
实施例3
一种NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、15ng/mL SCF、15ng/mL IL-3、15ng/mL G-CSF、15ng/mL IFN-γ、50ng/mL NK细胞促增殖肽。
其中，NK细胞促增殖肽的氨基酸序列为
FCSGKIGANVWKDNPRGEKWAGLGPHVRKRRPGQSHCNRNGCQNWRH IAP(SEQ ID NO.1)。
实施例4
一种NK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)NK细胞分离：抽取新鲜健康成人外周血15mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，用MACS缓冲液重悬细胞；依次加入NK cell Biotin-AntibodyCocktail和NK cell MicroBead Cocktail作细胞阳性分选，收集富含NK细胞的细胞悬液，用流式细胞术检测CD3-CD56+CD16+NK细胞纯度；
2)采用实施例1-3任一项所述的NK细胞高效扩增培养基对CD3-CD56+CD16+NK细胞重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，每间隔2天进行半量换液，连续培养1周后，收集NK细胞。
实施例5
NK细胞增殖活力测定：收集培养1周后的NK细胞接种于96孔板中，每孔培养基100μL，调整细胞密度为1×105个/孔。12h后，处理组1-3中分别加入实施例1-3所述的NK细胞高效扩增培养基，对照组1为单纯的DMEM基础培养基，对照组2为含有15ng/mL SCF、15ng/mLIL-3、15ng/mL G-CSF、15ng/mL IFN-γ的DMEM基础培养基，对照组3为含有50ng/mL NK细胞促增殖肽的DMEM基础培养基。每组8个复孔。37℃、5％CO2条件下培养48h后，每孔加入50μLCCK-8液，置于37℃、5％CO2条件下孵育4h后，测定490nm波长下各孔的吸光度(OD)值，根据公式计算细胞增殖率。
增殖率＝(处理组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。
表1 NK细胞增殖活性
| 增值率(％) | |
| 处理组1 | 485±5.36 |
| 处理组2 | 512±6.23 |
| 处理组3 | 550±3.64 |
| 对照组1 | 105±1.35 |
| 对照组2 | 150±2.98 |
| 对照组3 | 200±1.25 |
NK细胞增殖活性分析结果显示，如表1所示，处理组1-3的NK细胞增殖活性明显高于对照组1-3，且相比于DMEM基础培养基而言，细胞因子组合和NK细胞促增殖肽的加入均可有效提高NK细胞的促增殖效果，且二者联用后存在协同增效，能有效提高NK细胞的增殖活性。说明了本发明的NK细胞高效扩增培养基可以有效促进NK细胞增殖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (10)
1.一种NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5-15ng/mL SCF、5-15ng/mL IL-3、5-15ng/mL G-CSF、5-15ng/mL IFN-γ、20-50ng/mLNK细胞促增殖肽。
2.如权利要求1所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、5ng/mL SCF、5ng/mL IL-3、5ng/mL G-CSF、5ng/mL IFN-γ、20ng/mL NK细胞促增殖肽。
3.如权利要求1所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、10ng/mL SCF、10ng/mL IL-3、10ng/mL G-CSF、10ng/mLIFN-γ、30ng/mL NK细胞促增殖肽。
4.如权利要求1所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞高效扩增培养基包括如下组分：DMEM基础培养基、15ng/mL SCF、15ng/mL IL-3、15ng/mL G-CSF、15ng/mLIFN-γ、50ng/mL NK细胞促增殖肽。
5.如权利要求1-4任一项所述的NK细胞高效扩增培养基，其特征在于，所述NK细胞促增殖肽的氨基酸序列为FCSGKIGANVWKDNPRGEKWAGLGPHVRKRRPGQSHCNRNGCQNWRH IAP(SEQ IDNO.1)。
6.一种NK细胞高效扩增方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)NK细胞分离；
2)采用权利要求1-5任一项所述的NK细胞高效扩增培养基培养步骤1)中的NK细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)是采用NK细胞分离液分选NK细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)的详细步骤包括：抽取新鲜健康成人外周血15mL，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离得到外周血单个核细胞，用MACS缓冲液重悬细胞；依次加入NK cell Biotin-Antibody Cocktail和NK cell MicroBead Cocktail作细胞阳性分选，收集富含NK细胞的细胞悬液，用流式细胞术检测CD3-CD56+CD16+NK细胞纯度。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)是采用摇瓶培养收集NK细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2)的详细步骤包括采用所述的NK细胞高效扩增培养基对步骤1)中的CD3-CD56+CD16+NK细胞重悬制成细胞密度为1×105/mL的细胞悬浮液，接种于培养瓶中，在37℃、5％CO2条件下培养，每间隔2天进行半量换液，连续培养1周后，收集NK细胞。
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