CN107011412B - 一种蛋白制剂及在cik细胞培养方面的应用 - Google Patents

一种蛋白制剂及在cik细胞培养方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用，该蛋白制剂为树突状细胞的总蛋白，在提取树突状细胞的总蛋白之前，对树突状细胞进行高浓度CO2刺激，高浓度指CO2占空气体积分数＞5％。本发明提供的蛋白制剂可用于诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞，可用于替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，提高培养便捷性，降低成本。

Description

一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用
技术领域
本发明属于细胞免疫领域，涉及CIK细胞，具体涉及一种蛋白制剂及在CIK细胞培养方面的应用。
背景技术
肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell，CIK)是近年来发现的一种非常有前景的过继免疫细胞，具有增殖迅速、杀瘤活性广谱且高效、毒副作用微小等优点，已经成为肿瘤生物免疫治疗的主力军。CIK细胞的主要效应细胞为CD3+CD56+表型T淋巴细胞，兼有NK细胞和T细胞的特征。在功能上，CIK一方面拥有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，另一方面还拥有NK细胞非MHC限制性的杀伤肿瘤的特点，其增殖迅速、对正常造血影响轻微。
CIK细胞的增殖和细胞毒活性依赖于培养条件的刺激。培养高纯度CD3+CD56+细胞是提高CIK细胞毒活性、增强对肿瘤细胞杀伤的关键。
现有技术通常都是通过在培养基中添加多种外源性细胞因子进行诱导刺激。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白制剂，以替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，以诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞。
本发明通过如下技术方案得以实现：
一种蛋白制剂，为树突状细胞的总蛋白，在提取所述树突状细胞的总蛋白之前，对树突状细胞进行高浓度CO2刺激；所述高浓度指CO2占空气体积分数＞5％。
优选地，高浓度指CO2占空气体积分数25-45％。
优选地，高浓度CO2刺激时间为2-4小时。
上述蛋白制剂在培养扩增CIK细胞方面的应用。
本发明优点：
本发明提供的蛋白制剂可以用于诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞，可以用于替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，提高培养便捷性，降低成本。
附图说明
图1为各组CIK细胞对SMMC-7721细胞的杀伤率(A为效靶比10:1，B为效靶比20:1)。
具体实施方式
为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。
RPMI-1640培养基和胎牛血清均为Gibco产品。
实施例1：总蛋白的制备
1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃、5％CO2孵箱中孵育2h。
2、树突状细胞(DC细胞)的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d。
3、总蛋白提取：提取前3小时，将成熟DC置于37℃、35％CO2孵育箱中培养3小时。3小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：
(1)吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；
(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis Buffer中加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；
(3)在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；
(4)4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；
(5)BCA法测蛋白浓度。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
实施例2：总蛋白的制备
1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃、5％CO2孵箱中孵育2h。
2、树突状细胞(DC细胞)的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d。
3、总蛋白提取：提取前2小时，将成熟DC置于37℃、45％CO2孵育箱中培养2小时。2小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：
(1)吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；
(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis Buffer中加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；
(3)在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；
(4)4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；
(5)BCA法测蛋白浓度。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
实施例3：总蛋白的制备
1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃、5％CO2孵箱中孵育2h。
2、树突状细胞(DC细胞)的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在完全培养基(1640+10％FBS)中添加GM-CSF(1000U/mL)、IL-4(1000U/mL)诱导DC生成，于37℃、5％CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加TNF-α诱导DC成熟(100ng/mL)，连续培养7d。
3、总蛋白提取：提取前4小时，将成熟DC置于37℃、25％CO2孵育箱中培养4小时。4小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：
(1)吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；
(2)冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis Buffer中加入10μl磷酸酶抑制剂、1μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；
(3)在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；
(4)4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；
(5)BCA法测蛋白浓度。提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
实施例4：总蛋白的制备，与实施例1对比
与实施例1相比，除总蛋白提取之前不进行35％CO2孵育刺激外，其他完全相同。
实施例5：效果实施例，对CIK细胞杀瘤活性的影响
一、实验方法
1、CIK细胞的原代培养和分组
单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g，4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，1640培养基重悬细胞后置于37℃，5％CO2孵箱中孵育2h。
收集单核细胞中的悬浮细胞，分成5组：实验组A-C、对比组、阳性对照组。
实验组A：调整悬浮细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加实施例1制备的总蛋白(80μg/mL)，每2-3d进行换液，并补充等量的总蛋白和INF-γ。
实验组B：调整悬浮细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加实施例2制备的总蛋白(80μg/mL)，每2-3d进行换液，并补充等量的总蛋白和INF-γ。
实验组C：调整悬浮细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加实施例3制备的总蛋白(80μg/mL)，每2-3d进行换液，并补充等量的总蛋白和INF-γ。
对比组：调整悬浮细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加实施例4制备的总蛋白(80μg/mL)，每2-3d进行换液，并补充等量的总蛋白和INF-γ。
阳性对照组(现有技术)：调整悬浮细胞密度至1×106/ml，在完全培养基(1640+10％FBS)中加入INF-γ(1000U/mL)，并于24h后添加IL-2(300U/mL)、IL-1α(l00U/mL)和抗人CD3单抗(50μg/mL)。每2-3d进行换液，并补充等量细胞因子。
2、肿瘤细胞培养
在37℃、5％CO2的细胞培养箱中用RPMI-1640完全培养液(含10％胎牛血清和100mg/L青-链霉素溶液)培养SMMC-7721细胞。
3、肿瘤杀伤实验
在CIK细胞培养11d时，将培养至对数生长期的SMMC-7721细胞调整细胞密度为1×105个/mL，于96孔板中铺板每孔100μL细胞悬液，培养箱中培养24h。CIK培养至第12天进行CIK杀伤肿瘤细胞实验，弃去SMMC-7721旧的培养液，分别按n(效应细胞)/n(靶细胞)为10:1和20:1调整各组CIK细胞至相应数目加入SMMC-7721细胞孔中，每个比例3个复孔，同时设单独靶细胞和单独效应细胞对照组，于细胞培养箱中培养4h。4h后每孔加入10μL CCK-8溶液，细胞培养箱中孵育4h，酶标仪测定OD450值(A值)，按如下公式计算杀伤率：
杀伤率(％)＝[1-(实验组A值-单独效应细胞组A值)/单独靶细胞组A值]×100％。
二、实验结果
各组CIK细胞对SMMC-7721细胞的杀伤率见表1和图1。从表1和图1可以看出，实验组A-C所得CIK细胞具有与现有技术接近的杀瘤活性，且显著优于对比组。本发明提供的总蛋白制剂可以诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞。
表1各组CIK细胞对SMMC-7721细胞的杀伤率
Figure BDA0001300367140000051
上述实验证明，本发明提供的总蛋白制剂可以用于诱导制备具有高效杀瘤活性的CIK细胞，可以用于替代组合复杂、成本较高的外源性细胞因子，提高培养便捷性，降低成本。
上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

Claims (1)

1.一种蛋白制剂在体外培养扩增CIK细胞方面的应用，其特征在于，该蛋白制剂通过如下步骤制备得到：
步骤1、单个核细胞的分离：采集健康志愿者外周血20mL，预冷的PBS 1:1稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，650g、4℃离心20min，收集白色细胞层，分离单个核细胞，RPMI-1640培养基重悬细胞后置于37℃、5% CO2孵箱中孵育2h；
步骤2、DC细胞的培养：单个核细胞培养2h后收集贴壁细胞，在含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基中添加1000U/mL GM-CSF、1000U/mL IL-4诱导DC生成，于37℃、5% CO2孵育箱中培养，每2天半量换液一次，换液后补充GM-CSF、IL-4，于第6d在培养基中添加100ng/mLTNF-α诱导DC成熟，连续培养7d；
步骤3、总蛋白提取：提取前3小时，将成熟DC置于37℃、25%-45% CO2孵育箱中培养2-4小时；2-4小时后，按照如下方法提取总蛋白，分装后-70℃保存，避免反复冻融：
（1）吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，收集至离心管，1000rpm离心5分钟，洗涤后的细胞转移至洁净EP管；
（2）冰上操作，配制细胞裂解液，1mL Lysis Buffer中加入10μL磷酸酶抑制剂、1μL蛋白酶抑制剂、5μL 100mM的PMSF，混匀后冰上保存数分钟待用；
（3）在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1mL细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液，移液器反复吹打使细胞充分裂解；
（4）4℃摇床温和振摇15分钟，然后用4℃离心机14000rpm离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物；
（5）BCA法测蛋白浓度；提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
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