CN103555666A - 一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法 - Google Patents
一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103555666A CN103555666A CN201310299928.XA CN201310299928A CN103555666A CN 103555666 A CN103555666 A CN 103555666A CN 201310299928 A CN201310299928 A CN 201310299928A CN 103555666 A CN103555666 A CN 103555666A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- tcrv
- induction
- day
- positive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞本发明方法诱导培养过程简单易行，周期短，成本低廉；诱导效率高，重复性好；诱导后得到的细胞活性增强，诱导培养后细胞数量和功能有望提高目前Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗肿瘤的疗效，具有很好的应用潜能。
Description
技术领域
本发明属于免疫学与与细胞生物学研究领域，涉及一种提高细胞扩增效率及活性的体外诱导培养方法，是应用细胞因子联合酪氨酸激酶抑制剂协同诱导Vγ9Vδ2T细胞生成的培养方法。
背景技术
γδT细胞是近年来倍受关注的具有独特的结构和生物学功能的T淋巴细胞亚群，虽然在外周血和淋巴器官中所占比例很小（1-5%），但其在机体抗感染和抗肿瘤等方面起着举足轻重的作用。Vγ9Vδ2T细胞是γδT细胞的重要亚群，占外周γδT细胞的50~70%。自从Kunzmann等首次发现Vγ9Vδ2T细胞能够大量扩增后，越多越多的学者开始致力于该类细胞群体的研究。已在体外实验和体内动物实验中已证实Vγ9Vδ2T细胞具有广泛的肿瘤杀伤潜能；与传统的αβT细胞不同，其杀伤肿瘤作用不受MHC限制，极大的拓宽了其应用。目前Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗已在多项实体瘤及血液系统恶性肿瘤等Ⅰ期和II期临床研究中初具疗效，安全性好，使很多患者从中受益。
细胞免疫抗肿瘤治疗需要有充足的细胞来源，虽然通过目前的方法，通过人工合成的磷酸化合物或氨基二碳磷酸盐化合物（Aminobisphosphonates，NBPs）类药物可在体外或体内对Vγ9Vδ2T细胞进行大量扩增。但为保证Vγ9Vδ2T细胞治疗理想的效靶比，仍有必要对目前的诱导方案进行优化。此外，目前诱导所得Vγ9Vδ2T细胞的杀伤肿瘤效率不尽如人意，制约了Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗疗效。通过联合药物提高目前Vγ9Vδ2T细胞的体外诱导扩增效率及活性是Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗研究的热点。如能克服目前面临的主要障碍，将使Vγ9Vδ2 T细胞肿瘤免疫治疗从真正意义上取得成功。
发明内容
本发明的目的是克服现有方案中Vγ9Vδ2T细胞诱导扩增效率及活性有限的缺点，提供一种提高细胞扩增效率及活性的培养方法，为进一步提高Vγ9Vδ2T细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗疗效提供支持。本发明通过以下步骤实现：
1、人单个核细胞制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培养液重悬细胞；
2、Vγ9Vδ2T细胞诱导：步骤1中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算，在第0天加入唑唻膦酸2.24umol/L及IL-2 250 IU/ml刺激Vγ9Vδ2T细胞扩增，在第1天加入达沙替尼10nmol/L，接着于第3、6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜IL-2及达沙替尼，浓度同前；
3、Vγ9Vδ2T细胞扩增效率检测：于第9、12、15、18天时检测Vγ9Vδ2T细胞的扩增效率（包括纯度及绝对数量检测）：收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的纯度，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞占外周血单个核细胞的百分含量；采用细胞计数仪检测活细胞密度，并根据以下公式计算Vγ9Vδ2T细胞的绝对数量：
Vγ9Vδ2T细胞绝对数量= Vγ9Vδ2T细胞纯度×活细胞密度×总体积；
4、诱导的Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子及死亡受体检测：于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子CD69、HLA-DR及死亡受体Fas分子表达的比例，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞CD69/HLA-DR/ Fas表达（%）= CD69/HLA-DR/Fas和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；
5、诱导的Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例检测：于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的功能亚型分布，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD27分子为区分效应型亚群的表型特征，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例（%）= CD27阴性TCRVδ2阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；
6、诱导的Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的的穿孔素、颗粒酶释放效应检测：于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞与急性髓系白血病（AML）细胞株K562共同孵育4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞对AML细胞刺激的穿孔素、颗粒酶释放效应，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD107a分子阳性作为穿孔素、颗粒酶释放效应的检测标记，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞穿孔素、颗粒酶释放效应（%）= CD107a和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；
7、诱导的Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ细胞因子分泌能力检测：于第18天收集步骤2中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞在PMA/离子霉素刺激4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞干扰素-γ（IFN-γ）细胞因子的分泌能力，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以胞内IFN-γ分子阳性作为Vγ9Vδ2T细胞分泌IFN-γ细胞因子的检测标记，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ分泌能力（%）=IFN-γ和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。
本发明的另一个目的是提供所述方法在体外诱导培养Vγ9Vδ2T细胞中的应用。
本发明通过应用IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼体外诱导Vγ9Vδ2T细胞的生成，得到了诱导效率更高及活性更高的Vγ9Vδ2T细胞。其具有如下特点：（1）诱导培养过程简单易行，周期短，成本低廉；（2）诱导效率高，重复性好；（3）诱导后得到的细胞活性增强，诱导培养后细胞数量和功能有望提高目前Vγ9Vδ2T细胞免疫治疗肿瘤的疗效，具有很好的应用潜能。
附图说明
图1是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组在诱导过程第9、12、15、18天Vγ9Vδ2T细胞纯度比较图。
图2是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组第18天Vγ9Vδ2T细胞纯度比较的统计分析图。
图3是 IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组在诱导过程第9、12、15、18天Vγ9Vδ2T细胞绝对数量比较图。
图4是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组第18天Vγ9Vδ2T细胞绝对数量比较的统计分析图，*表示P<0.05。
图5是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组活化分子CD69表达水平比较的统计分析图，*表示P<0.05。
图6是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组活化分子HLA-DR表达水平比较的统计分析图，*表示P<0.05。
图7是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组死亡受体Fas表达水平比较的统计分析图，*表示P<0.05。
图8是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组CD27阴性效应型亚群比例比较的统计分析图，*表示P<0.05。
图9是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组Vγ9Vδ2T细胞的穿孔素、颗粒酶释放效应比较的统计分析图，*表示P<0.05。
图10是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ细胞因子分泌能力比较的统计分析图，*表示P<0.05。
具体实施方式
本发明结合实施例和附图作进一步的说明。
本实验所用IL-2购自美国PeproTech公司，流式细胞术检测用单克隆荧光抗体购自BD、eBioscience公司，唑唻膦酸（商品名择泰）为诺华制药有限公司赠送，达沙替尼购自施贵宝公司。本实验所用外周血均来自商业血库。
本实验重复了5份血库的外周血标本，均取得了类似效果。
实施例1:人单个核细胞制备：
1.取外周血标本10ml，肝素抗凝；
2.在15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液；
3.将10 ml外周血与等量Hank's液充分混匀，按淋巴细胞分离液的两倍体积用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心600g×20分钟；
4.离心后见管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带；
5.用滴管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一15ml离心管中，加入5倍体积的Hank's液，300g×5分钟离心，洗涤细胞2次；
6.末次离心后，弃上清，加入含有10％胎牛血清和1%双抗的完全RPMI1640培养液，重悬细胞，调整细胞密度至4×106/ml。
实施例2：单个核细胞分组及Vγ9Vδ2T细胞诱导
将实施例1中所获得的细胞接种于12孔板，分为常规方法诱导组和改进方法诱导组，常规方法诱导组为单用白介素-2（IL-2）和唑来膦酸诱导，改进方法诱导组为IL-2、唑来膦酸联合10nmol/L达沙替尼协同诱导。各组分别设立3个复孔，每孔2ml，各孔于第0天加用IL-2和唑唻膦酸（制备单个核细胞接种当日按第0天计算），量及终浓度如表1所示；改进方法诱导组各孔于第1天加用达沙替尼，量如表1所示，终浓度为10nmol/L；接着于第3、6、9天两组细胞各孔均进行半量换液，每孔去除1ml培养液，再加入新鲜含10%胎牛血清的PRMI 1640完全培养液1ml，并加入IL-2，各孔IL-2量见表2。 各种试剂储存浓度：IL-2为10000U/ml，唑唻膦酸储存浓度为280umol/L，达沙替尼储存浓度为20umol/L。
实施例3：Vγ9Vδ2T细胞扩增效率检测
流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞纯度
1.分别收获常规方法诱导组和改进方法诱导组培养9、12、15、18天的细胞，每管106，每组一管，用1×磷酸盐缓冲液2ml洗涤二次，每次倾倒前离心300g×5分钟，倾倒后用滤纸吸干管口液体；
2.用1×磷酸盐缓冲液 95μl重悬细胞，加入抗TCRVδ2-PE单克隆抗体5μl，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；
3.1×磷酸盐缓冲液2 ml洗涤2次，每次洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体；
4.加入500μl 1×磷酸盐缓冲液；
5.流式细胞仪上机检测；应用CELL-QUEST软件每管获取10000个细胞，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞占外周血单个核细胞的百分含量。
检测结果发现IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，在诱导过程中Vγ9Vδ2T细胞占外周血单个核细胞的百分数有增加趋势，结果参见图1，图1是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组在诱导过程第9、12、15、18天Vγ9Vδ2T细胞纯度比较图；其中诱导第18天检测分别为81.67±10.18%和74.5±15.62% ，结果参见图2，图2 是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组第18天Vγ9Vδ2T细胞纯度比较的统计分析图。
γ9Vδ2T细胞的绝对数量检测
1.分别收获常规方法诱导组和改进方法诱导组培养9、12、15、18天的细胞悬液20ul；
2.与20ul台盼蓝溶液1:1混匀后，加入计数专用板中；
3.Cedex XS 细胞计数分析仪分析样本的活细胞密度；
4.计算方法：Vγ9Vδ2T细胞绝对数量= Vγ9Vδ2T细胞纯度×活细胞密度×总体积。
检测结果发现IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，在诱导过程中Vγ9Vδ2T细胞的绝对数量显著增加，结果参见图3，图3是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组在诱导过程第9、12、15、18天Vγ9Vδ2T细胞绝对数量比较图；其中在诱导第18天检测分别为70.32±29.52×105和44.6±23.77×105（P<0.05），结果参见图4，图4是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组第18天Vγ9Vδ2T细胞绝对数量比较的统计分析图。综合上述结果表明该改进方法诱导组可增强Vγ9Vδ2T细胞体外扩增效率。
实施例4：诱导的Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子、死亡受体检测
1.分别收获常规方法诱导组和改进方法诱导组培养18天的细胞，每管106，每组一管，用1×磷酸盐缓冲液2ml洗涤二次，每次倾倒前离心300g×5分钟，倾倒后用滤纸吸干管口液体；
2.用1×磷酸盐缓冲液 90μl重悬细胞，加入抗TCRVδ2-PE单克隆抗体5μl及CD69-FITC或HLA-DR-PEcy5或Fas-FITC单克隆抗体5ul，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；
3.1×磷酸盐缓冲液2 ml洗涤2次，每次洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体；
4.加入500μl 1×磷酸盐缓冲液；
5.流式细胞仪上机检测；应用CELL-QUEST软件每管获取10000个细胞，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞CD69/HLA-DR/ Fas表达（%）= CD69/HLA-DR/Fas和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。
检测结果发现，IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子CD69的表达明显增加，分别为49.63±11.33%和27.2±9.34%（P<0.05），结果参见图5，图5是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组活化分子CD69表达水平比较的统计分析图；HLA-DR的表达亦明显增加，分别为67.2±5.93%和40.57±7.9%（P<0.05），结果参见图6，图6是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组活化分子HLA-DR表达水平比较的统计分析图。上述结果表明该改进方法诱导组可增强Vγ9Vδ2T细胞的活性。
检测结果还发现，IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，Vγ9Vδ2T细胞死亡受体Fas的表达则显著下降，分别为48.95±14.13%和82.7±6.76%（P<0.05），结果参见图7，图7是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组死亡受体Fas表达水平比较的统计分析图。上述结果表明该改进方法诱导组可增强Vγ9Vδ2T细胞抵抗活化诱导的细胞凋亡的能力。
实施例5：诱导的Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例检测
1.分别收获常规方法诱导组和改进方法诱导组培养18天的细胞，每管106，每组一管，用1×磷酸盐缓冲液2ml洗涤二次，每次倾倒前离心300g×5分钟，倾倒后用滤纸吸干管口液体；
2.用1×磷酸盐缓冲液90μl重悬细胞，加入抗TCRVδ2-PE单克隆抗体5μl、CD27-FITC单克隆抗体5ul，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；
3.1×磷酸盐缓冲液2 ml洗涤2次，每次洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体；
4.加入500μl 1×磷酸盐缓冲液；
5.流式细胞仪上机检测；应用CELL-QUEST软件每管获取10000个细胞，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD27为区分效应型亚群的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例（%）= CD27阴性TCRVδ2阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。
检测结果发现，IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，Vγ9Vδ2T细胞内部CD27阴性效应型亚群的比例明显增加，分别为47.98±5.39%和31.48±6.27%（P<0.05），结果参见图8，图8是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组CD27阴性效应型亚群比例比较的统计分析图。上述结果表明该改进方法诱导组可诱导Vγ9Vδ2T细胞向更具有功能的效应亚型分化。
实施例6：诱导的Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的的穿孔素、颗粒酶释放效应
1.样本制备
（1）靶细胞的准备：收集AML细胞株K562，使用PBS洗涤细胞2次，300g，5min离心，弃上清。使用1640完全培养基重悬细胞为5×106 /mL，备用；
（2）效应细胞的准备：收集Vγ9Vδ2T细胞，使用PBS洗涤细胞2次，300g，5min离心，弃上清，使用1640完全培养基重悬细胞为5×106 /mL，备用；
（3）制备效靶细胞混合悬液：取聚苯乙烯5mL圆底无菌试管，加入100ul靶细胞及100ul效应细胞；
（4）加入CD107a流式抗体，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱避光孵育1h；
（5）加入莫能霉素，继续于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱避光孵育3h；
（6）加入TCRVδ2流式抗体，4℃，避光孵育30min。加入PBS洗涤细胞2遍，300g，5min，备流式上机检测。
2.阳性对照制备
（1）取聚苯乙烯5mL圆底无菌试管，加入100ul效应细胞及100ul 1640完全培养基；
（2）加入PMA/离子霉素刺激细胞；
（3）同前步骤4）~ 6）。
3.阴性对照制备
（1）取聚苯乙烯5mL圆底无菌试管，加入50ul效应细胞及50ul 1640完全培养基；
（2）同前步骤4）~ 6）。
4.Vγ9Vδ2T细胞脱颗粒效应检测与计算
（1） 流式细胞仪检测样本中CD107a及TCRVδ2的荧光强度，Flowjo7.6 软件分析数据；
（2）CD107a表达（%）=CD107a和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。
检测结果发现，IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的穿孔素、颗粒酶释放效应显著增强，分别为41.42±7.29%和23.58±1.7%（P<0.05），结果参见图9，图9是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组Vγ9Vδ2T细胞的穿孔素、颗粒酶释放效应比较的统计分析图。上述结果表明该改进方法诱导组可增强Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的直接杀伤潜能。
实施例7：诱导的Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ细胞因子分泌能力
1.样本制备
（1）收集Vγ9Vδ2T细胞，使用PBS洗涤细胞2次，300g，5min离心，弃上清，使用1640完全培养基重悬细胞为5×106 /mL，备用；
（2）取聚苯乙烯5mL圆底无菌试管，加入100ul细胞悬液;
（3）实验组加入PMA/离子霉素刺激细胞，阴性对照组不加，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育1h；
（4）加入莫能霉素，继续于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱避光孵育5h。
2.细胞表面分子抗体标记
加入TCRVδ2-PE单克隆抗体5ul，4℃，避光孵育30min。加入PBS洗涤细胞2遍，300g，5min，弃上清。
3.细胞内分子抗体标记
（1）固定破膜: 每管加入BD固定破膜液1ml, 4℃, 避光固定30 min，PBS洗涤2遍，250g，10min离心，弃上清。遂将细胞重悬于1ml 1×破膜洗涤液中，4℃, 避光固定30 min，250g，10min离心，弃上清；
（2）胞内分子抗体标记: 轻轻摇晃将细胞溶于剩余的残液中，加入IFN-γ-FITC单克隆抗体5ul至相应样品管中，4℃, 避光固定30 min，用B液洗涤2遍，250g，10min离心，弃上清。
4.检测与分析
（1）使用500ul PBS缓冲液重悬标记后的细胞，备流式上机检测。流式细胞仪检测样本中TCRVδ2及IFN-γ的荧光强度，Flowjo7.6 软件分析数据；
（2）Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ分泌能力（%）=IFN-γ和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。
检测结果发现，IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组相比，Vγ9Vδ2T细胞的IFN-γ细胞因子分泌能力显著增强，分别为65.63±15.91%和27±13.31%（P<0.05），结果参见图10，图10是IL-2、唑来膦酸联合酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼的改进方法诱导组和单用IL-2及唑来膦酸的常规方法诱导组Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ细胞因子分泌能力比较的统计分析图。上述结果表明该改进方法诱导组可增强Vγ9Vδ2T细胞分泌并释放抗肿瘤细胞因子的能力。
Claims (2)
1.一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）人单个核细胞制备：应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培养液重悬细胞；
（2）Vγ9Vδ2T细胞诱导：步骤（1）中所制备的单个核细胞接种当日按第0天计算，在第0天加入唑唻膦酸及IL-2，在第1天加入达沙替尼，接着于第3、6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜IL-2及达沙替尼；
（3）Vγ9Vδ2T细胞扩增效率检测：于第9、12、15、18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的纯度，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算Vγ9Vδ2T细胞占外周血单个核细胞的百分含量；采用细胞计数仪检测活细胞密度，并根据以下公式计算Vγ9Vδ2T细胞的绝对数量：
Vγ9Vδ2T细胞绝对数量= Vγ9Vδ2T细胞纯度×活细胞密度×总体积；
（4）诱导的Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子及死亡受体检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞表面活化分子CD69、HLA-DR及死亡受体Fas分子表达的比例，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞CD69/HLA-DR/ Fas表达（%）= CD69/HLA-DR/Fas和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；
（5）诱导的Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞的功能亚型分布，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD27分子为区分效应型亚群的表型特征，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞效应型亚群比例（%）= CD27阴性TCRVδ2阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；
（6）诱导的Vγ9Vδ2T细胞对肿瘤细胞的的穿孔素、颗粒酶释放效应检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞与急性髓系白血病细胞株K562共同孵育4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞对AML细胞刺激的穿孔素、颗粒酶释放效应，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以CD107a分子阳性作为穿孔素、颗粒酶释放效应的检测标记，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞穿孔素、颗粒酶释放效应（%）= CD107a和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100；
（7）诱导的Vγ9Vδ2T细胞干扰素-γ细胞因子分泌能力检测：于第18天收集步骤（2）中的细胞，采用流式细胞术检测Vγ9Vδ2T细胞在PMA/离子霉素刺激4个小时后检测Vγ9Vδ2T细胞干扰素-γ细胞因子的分泌能力，以TCRVδ2阳性作为Vγ9Vδ2T细胞的表型特征，以胞内干扰素-γ分子阳性作为Vγ9Vδ2T细胞分泌干扰素-γ细胞因子的检测标记，计算公式为：
Vγ9Vδ2T细胞IFN-γ分泌能力（%）=干扰素-γ和TCRVδ2双阳性细胞/ TCRVδ2单阳性细胞×100。
2.根据权利要求1所述的一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法在体外诱导培养Vγ9Vδ2T细胞中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310299928.XA CN103555666A (zh) | 2013-07-17 | 2013-07-17 | 一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310299928.XA CN103555666A (zh) | 2013-07-17 | 2013-07-17 | 一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103555666A true CN103555666A (zh) | 2014-02-05 |
Family
ID=50010026
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310299928.XA Pending CN103555666A (zh) | 2013-07-17 | 2013-07-17 | 一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103555666A (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106190972A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 广州复大医疗股份有限公司 | 一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法 |
| CN106399242A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 北京多赢时代转化医学研究院 | 联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法 |
| CN108070555A (zh) * | 2016-11-15 | 2018-05-25 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种用于体外扩增细胞毒性γδT淋巴细胞的药物组合及其扩增方法 |
| CN109852585A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-06-07 | 广东暨德康民生物科技有限责任公司 | 人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法 |
| CN109908184A (zh) * | 2017-12-12 | 2019-06-21 | 中山大学 | 脆弱拟杆菌在制备用于诱导γδT细胞增殖和/或积累的药物中的应用 |
| CN110184240A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-08-30 | 上海市肺科医院 | 一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法 |
| CN112345747A (zh) * | 2019-08-08 | 2021-02-09 | 上海赛比曼生物科技有限公司 | 一种用于检测人间充质干细胞抑制Th17细胞增殖功能的试剂盒 |
| GB2595372B (en) * | 2018-12-24 | 2023-11-08 | Guangdong GD Kongming Biotech LLC | HUMAN V(gamma)9V(delta)2T CELL PROLIFERATION CULTURE METHOD AND CULTURE MEDIUM |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008059052A1 (en) * | 2006-11-17 | 2008-05-22 | Innate Pharma | Improved methods of using phosphoantigen for the treatment of cancer |
| US7749760B2 (en) * | 2008-07-10 | 2010-07-06 | Hyogo College Of Medicine | Vγ9Vδ2 T cell proliferation agent, method for producing activated Vγ9Vδ2 T cells, and uses thereof |
| CN102168067B (zh) * | 2011-02-11 | 2012-08-29 | 浙江大学 | 一种调节性t细胞的诱导培养方法 |
| CN102994448A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-27 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外扩增γδT细胞的方法 |
-
2013
- 2013-07-17 CN CN201310299928.XA patent/CN103555666A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008059052A1 (en) * | 2006-11-17 | 2008-05-22 | Innate Pharma | Improved methods of using phosphoantigen for the treatment of cancer |
| US7749760B2 (en) * | 2008-07-10 | 2010-07-06 | Hyogo College Of Medicine | Vγ9Vδ2 T cell proliferation agent, method for producing activated Vγ9Vδ2 T cells, and uses thereof |
| CN102168067B (zh) * | 2011-02-11 | 2012-08-29 | 浙江大学 | 一种调节性t细胞的诱导培养方法 |
| CN102994448A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-03-27 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种体外扩增γδT细胞的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 胡朝英等: "γδ T细胞诱导与分化的初步研究-Ⅰ", 《中国免疫学杂志》, vol. 26, no. 04, 19 April 2010 (2010-04-19), pages 368 - 370 * |
| 邱建平等: "唑来膦酸刺激人外周血单个核细胞体外扩增γδT细胞及其在肝癌非特异性免疫中的作用", 《苏州大学学报(医学版)》, vol. 30, no. 04, 25 July 2010 (2010-07-25) * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106190972A (zh) * | 2015-04-30 | 2016-12-07 | 广州复大医疗股份有限公司 | 一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法 |
| CN106399242A (zh) * | 2016-09-13 | 2017-02-15 | 北京多赢时代转化医学研究院 | 联合制备CAR‑Vγ9Vδ2T细胞和CAR‑NKT细胞的方法 |
| CN106399242B (zh) * | 2016-09-13 | 2019-01-22 | 北京多赢时代转化医学研究院 | 联合制备CAR-Vγ9Vδ2T细胞和CAR-NKT细胞的方法 |
| CN108070555A (zh) * | 2016-11-15 | 2018-05-25 | 首都医科大学附属北京天坛医院 | 一种用于体外扩增细胞毒性γδT淋巴细胞的药物组合及其扩增方法 |
| CN109908184A (zh) * | 2017-12-12 | 2019-06-21 | 中山大学 | 脆弱拟杆菌在制备用于诱导γδT细胞增殖和/或积累的药物中的应用 |
| GB2595372B (en) * | 2018-12-24 | 2023-11-08 | Guangdong GD Kongming Biotech LLC | HUMAN V(gamma)9V(delta)2T CELL PROLIFERATION CULTURE METHOD AND CULTURE MEDIUM |
| CN109852585A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-06-07 | 广东暨德康民生物科技有限责任公司 | 人Vγ9Vδ2T细胞的扩增及预处理方法 |
| CN110184240A (zh) * | 2019-06-13 | 2019-08-30 | 上海市肺科医院 | 一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法 |
| CN110184240B (zh) * | 2019-06-13 | 2020-11-20 | 上海市肺科医院 | 一种高效扩增活化Vγ2Vδ2 T细胞增强其抗结核活性的方法 |
| CN112345747A (zh) * | 2019-08-08 | 2021-02-09 | 上海赛比曼生物科技有限公司 | 一种用于检测人间充质干细胞抑制Th17细胞增殖功能的试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103555666A (zh) | 一种提高Vγ9Vδ2T细胞扩增效率及活性的培养方法 | |
| de Masson et al. | CD24hiCD27+ and plasmablast-like regulatory B cells in human chronic graft-versus-host disease | |
| CN102268405B (zh) | 自体nk细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基 | |
| CN104593324B (zh) | 一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法 | |
| US20190112577A1 (en) | Ex vivo expansion method for cord blood nk cell, and kit and application thereof | |
| CN102168067B (zh) | 一种调节性t细胞的诱导培养方法 | |
| CN103756963A (zh) | 一种体外扩增nk细胞的方法 | |
| KR101948534B1 (ko) | 세포밀도 조절을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법 | |
| KR101298012B1 (ko) | 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 | |
| CN107083363A (zh) | 一种外周血nk细胞体外高效扩增方法 | |
| CN108588022B (zh) | 体外培养富集人cd4+和cd8+ tcm细胞的方法 | |
| CN103436493B (zh) | 雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法 | |
| CN108103020A (zh) | 一种高效扩增自然杀伤细胞的制备方法 | |
| CN105274053B (zh) | 一种高细胞毒活性的cik细胞的制备方法 | |
| CN103865874A (zh) | Cik细胞及其制备方法和应用 | |
| Sonoda | Human CD34-negative hematopoietic stem cells: The current understanding of their biological nature | |
| CN104894072B (zh) | 一种自体自然杀伤细胞增殖的制备方法及其应用 | |
| Jobin et al. | Heterogeneity of in vitro–cultured CD34+ cells isolated from peripheral blood | |
| CN109486758A (zh) | 一种外周血nk细胞体外高效扩增试剂及操作说明 | |
| CN104388386B (zh) | 一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法 | |
| CN107119015B (zh) | 外泌体、其制备方法及其在制备治疗肺癌的药物中的应用 | |
| CN106190972A (zh) | 一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法 | |
| CN108486055B (zh) | 培养基及其在中央记忆型t淋巴细胞培养中的应用 | |
| Nio et al. | Cytotoxic and cytostatic effects of the streptococcal preparation OK‐432 and its subcellular fractions on human ovarian tumor cells | |
| Jia et al. | An optimized method for obtaining clinical‐grade specific cell subpopulations from human umbilical cord‐derived mesenchymal stem cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140205 |