CN104593324B - 一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法。本发明提供了包含无血清培养基、人血浆、IL‑2、IL‑21、IL‑15和OKT‑3的扩增培养自然杀伤细胞的培养基。本发明提供的培养基用于扩增培养NK细胞，可以避免外源血清带来的风险，扩增效率高且获得NK细胞纯度高。采用本发明提供的方法扩增NK细胞，能够使NK细胞的扩增较长时间的维持在对数期。且培养获得的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性良好。

Description

一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)，又称NK细胞，被认为是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒，颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早，在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。可见，NK细胞的培养具有十分重要的意义。

目前大部分NK细胞培养体系采用胎牛血清加基础培养基培养，但是采用胎牛血清培养会存在异源血清所带来的潜在危险。为此，也曾有报道用添加细胞因子IL-2或IL-15的无血清培养基培养NK细胞以避免异源血清带来的风险，但扩增NK的效果不明显，纯度相对较低；无法达到临床所需的细胞数量。

因此，进一步研究无异源血清的且能够大量扩增NK，并获得高纯度NK的培养基和培养方法十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法。以本发明提供的培养基及扩增培养方法培养自然杀伤细胞扩增效率高，纯度良好。

本发明提供的扩增培养自然杀伤细胞的培养基，包括：无血清培养基、人血浆、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3。

无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。无血清培养基的基本配方包括：胰岛素、转铁蛋白、纤粘连蛋白。

人血浆即人体血液中的液体成分，人的血细胞悬浮于其中。本发明采用人血浆，降低异源性血清存在的潜在危险。

IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(T cellgrowth factor，TCRF)。可促进NK细胞的增殖，维持NK细胞长期生长。

IL-21即白细胞介素-21(interleukin-21，IL-21)，参与调节T细胞的增殖。

IL-15即白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)，生物学作用与IL-2相似。

OKT-3为鼠源性抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体，目前未见OKT-3对NK细胞活性或增殖特性影响的相关专利。

在一些实施例中，IL-2的浓度为100U/mL～400U/mL。

在另一些实施例中，IL-2的浓度为200U/mL～300U/mL。

在一些实施例中，IL-21的浓度为5ng/mL～100ng/mL。

在另一些实施例中，IL-21的浓度为40ng/mL～60ng/mL。

在一些实施例中，IL-15的浓度为5ng/mL～100ng/mL。

在另一些实施例中，IL-15的浓度为40ng/mL～60ng/mL。

在一些实施例中，OKT-3的浓度为5ng/mL～100ng/mL。

在另一些实施例中，OKT-3的浓度为40g/mL～60g/mL。

在一些实施例中，人血浆的体积分数为5～15％。

在另一些实施例中，人血浆的体积分数为10％。

在一些实施例中，无血清培养基采用LONZA X-VIVO 15。

LONZA X-VIVO 15由LONZA公司生产，目前常用于培养人类单核细胞、巨噬细胞细胞、粒细胞或自然杀伤(NK)细胞，但对NK细胞的培养时，NK细胞扩增效果不佳。

本发明通过在无血清培养基中添加人血浆、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3，提高了NK细胞的扩增效率和扩增后的NK细胞纯度。与仅添加细胞因子IL-2和细胞因子IL-15的对照组相比，本发明提供的培养基对NK细胞的扩增效率也有显著的提高。

本发明还提供了一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，包括以下步骤：

步骤1：从人外周血中分离自然杀伤细胞；

步骤2：以本发明提供的培养基重悬自然杀伤细胞，37℃，CO₂体积分数为5％，培养。

在一些实施例中，培养为：每3天补充本发明提供的培养基使自然杀伤细胞的密度为0.5×10⁶个/mL～1.0×10⁶个/mL。

作为优选，培养为：每3天补充本发明提供的培养基使自然杀伤细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。

每3天补充本发明提供培养基可以保证自然杀伤细胞在培养基中的量不至于过高，从而避免NK细胞的增殖过早进入平稳期。采用本发明提供的方法，从第6天开始，NK细胞增殖即进入对数期，在培养了13天后NK细胞始终保持对数增长，在培养14天后，NK细胞仍保持对数增长，且纯度维持在95％以上。说明本发明提供的方法能够有效提高NK细胞的扩增效率，并能够使NK细胞的扩增较长时间的维持在对数期，且使细胞保持较高的纯度。

在一些实施例中，重悬的自然杀伤细胞的密度为0.5×10⁶个/mL～1.0×10⁶个/mL。

作为优选，重悬的自然杀伤细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。

在一些实施例中，自然杀伤细胞的纯度不低于90％。

作为优选，自然杀伤细胞的纯度为95％～96％。

在本发明的实施例中，步骤1具体包括：以Ficoll淋巴分离液分离人血细胞获得外周血单个核细胞，经分选获得自然杀伤细胞。

本发明提供了包含无血清培养基、人血浆、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3的扩增培养自然杀伤细胞的培养基。本发明提供的培养基用于扩增培养NK细胞，可以避免外源血清带来的风险，扩增效率高且获得NK细胞纯度高。采用本发明提供的方法扩增NK细胞，能够使NK细胞的扩增较长时间的维持在对数期。且培养获得的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性良好。

附图说明

图1示PBMC细胞和NK细胞的形态；其中，图1-a示PBMC形态(100倍)；图1-b示NK细胞形态(100倍)；

图2示分选前后细胞流式检测结果；其中，图2-a示分选前流式检测的结果；图2-b示分选后流式检测的结果；

图3示实施例6培养14天后的NK细胞的流式检测结果；

图4示实施例6获得的NK细胞对K562细胞的杀伤活性。

具体实施方式

本发明提供了一种自然杀伤细胞的培养基及自然杀伤细胞的扩增培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂和仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1本发明提供培养基的配制

将900mL LONZA的X-VIVO 15培养基、100mL人血浆、1.0×10⁵U的IL-2、5μg的IL-21、5μg的IL-15和5μg的OKT-3混合，过滤除菌。

实施例2本发明提供培养基的配制

将950mL LONZA的X-VIVO 15培养基、50mL人血浆、4.0×10⁵U的IL-2、100μg的IL-21、100μg的IL-15和100μg的OKT-3混合，过滤除菌。

实施例3本发明提供培养基的配制

将850mL LONZA的X-VIVO 15培养基、150mL人血浆、2.0×10⁵U的IL-2、40μg的IL-21、60μg的IL-15和40μg的OKT-3混合，过滤除菌。

实施例4本发明提供培养基的配制

将900mL LONZA的X-VIVO 15培养基、100mL人血浆、3.0×10⁵U的IL-2、60μg的IL-21、40μg的IL-15和60μg的OKT-3混合，过滤除菌。

实施例5NK细胞的获得

1、采集外周血20ml，将外周血转移到15mL离心管中，离心，将下层血细胞用生理盐水稀释，混合均匀。

2、另取一支新的50mL离心管，加入淋巴细胞分离液(血液稀释液：淋巴分离液＝2:1)，将稀释后的血液缓慢转移至淋巴细胞分离液的表面，使二者之间形成清晰的界面。用封口膜将离心管封口后转移至离心机，离心30min；

3、离心后用巴氏吸管将外周血单个核细胞(PBMC)层吸出，转移至另一支50mL离心管中。

4、加生理盐水洗涤PBMC两次，每次离心5min。

5、弃上清，按照NK细胞分选试剂盒操作。

PBMC细胞和NK细胞的形态如图1所示，图1-a示PBMC形态(100倍)；图1-b示NK细胞形态(100倍)。

图2示分选前后细胞流失检测结果；其中，图2-a示分选前流式检测的结果；图2-b示分选后流式检测的结果。

经检测，分选前NK细胞(CD3^-CD56⁺)的比例为11.2％，分选后NK细胞(CD3^-CD56⁺)的比例为95.4％。

实施例6本发明提供方法扩增培养NK细胞

取实施例5制备的NK细胞，以实施例1制备的培养基重悬，重悬后NK细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。置37℃、5％CO₂饱和温度培养箱中培养。每三天补充实施例1制备的培养基，使NK细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。连续培养14天，每天记录细胞数量。

实施例7本发明提供方法扩增培养NK细胞

取实施例5制备的NK细胞，以实施例2制备的培养基重悬，重悬后NK细胞的密度为1.0×10⁶个/mL。置37℃、5％CO₂饱和温度培养箱中培养。每三天补充实施例2制备的培养基，使NK细胞的密度为1.0×10⁶个/mL。连续培养14天，每天记录细胞数量。

实施例8本发明提供方法扩增培养NK细胞

取实施例5制备的NK细胞，以实施例3制备的培养基重悬，重悬后NK细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。置37℃、5％CO₂饱和温度培养箱中培养。每三天补充实施例3制备的培养基，使NK细胞的密度为1.0×10⁶个/mL。连续培养14天，每天记录细胞数量。

实施例9本发明提供方法扩增培养NK细胞

取实施例5制备的NK细胞，以实施例4制备的培养基重悬，重悬后NK细胞的密度为1.0×10⁶个/mL。置37℃、5％CO₂饱和温度培养箱中培养。每三天补充实施例4制备的培养基，使NK细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。连续培养14天，每天记录细胞数量。

对比例1现有培养基扩增NK细胞

1、培养基的配制：将950ml的1640培养基、50ml的胎牛血清、2.0×10⁵U的IL-2、20ug的IL-15混合，过滤除菌。

2、取实施例5制备的NK细胞，以对比例1制备的培养基重悬，重悬后NK细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。置37℃、5％CO₂饱和温度培养箱中培养。每三天补充对比例1制备的培养基，使NK细胞的密度为0.5×10⁶个/mL。连续培养14天，每天记录细胞数量。

对比例2现有方法扩增NK细胞

1、培养基的配制：将950ml的1640培养基、50ml人血浆、2.0×10⁵U的IL-2、20ug的IL-15混合，过滤除菌。

2、取实施例5制备的NK细胞，每天记录细胞数量。以对比例2制备的培养基重悬，重悬后NK细胞的密度为2×10⁶个/mL。置37℃、5％CO₂饱和温度培养箱中培养。每三天补充对比例2制备的培养基，使NK细胞的密度为2×10⁶个/mL。连续培养14天，每天记录细胞数量。

实施例10NK细胞扩增培养效率和纯度检测

对实施例6～9及对比例1～2扩增NK细胞14天中，每天的计数结果进行统计，结果如表1所示：

表1 NK细胞扩增培养效果

注：*示具有显著性差异(p＜0.05)；**示具有极显著差异(p＜0.01)

经检测，在培养14天期间，实施例6～9中的NK细胞增殖效果相似，一直保持良好的增长势头，从第4天开始，细胞生长进入对数期，培养13天后，细胞增长了将近一千倍。而对比例1～2中NK细胞的增殖则明显滞后。说明，本发明提供的培养基和方法能够显著提高NK细胞的增殖效率。

取对实施例6～9及对比例1～2培养14天后的NK细胞进行流式检测统计NK细胞的纯度。其中，对实施例6培养14天后的NK细胞的流式检测结果如图3所示，结果显示，培养14天后，NK细胞的纯度为97.2％。实施例7～9培养14天后的NK细胞流式检测结果与此相似。而对比例1的检测结果显示，经14天的培养，NK细胞的纯度为79.5％，对比例2经14天的培养，NK细胞的纯度为70.8％。

实施例11NK细胞对肿瘤细胞杀伤检测

以K562肿瘤细胞为对象，以本发明实施例6获得的NK细胞检测对肿瘤细胞的杀伤活性。以K562作为靶细胞，分别设置效靶比为40:1、20:1、10:1和5:1进行杀伤实验，结果如图4所示。结果显示，本发明实施例6扩增的NK细胞保持了良好的杀伤活性，活性随效靶比的增加而增加。本发明实施例7～9扩增获得的NK细胞对K562细胞的杀伤活性与此相似。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种扩增培养自然杀伤细胞的培养基，其特征在于，由无血清培养基、人血浆、IL-2、IL-21、IL-15和OKT-3组成；

所述IL-2的浓度为100U/mL～400U/mL；

所述IL-21的浓度为5ng/mL～100ng/mL；

所述IL-15的浓度为5ng/mL～100ng/mL；

所述OKT-3的浓度为5ng/mL～100ng/mL；

所述人血浆的体积分数为5％～15％。

2.一种自然杀伤细胞的扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：从人外周血中分离自然杀伤细胞；

步骤2：以权利要求1所述的培养基重悬所述自然杀伤细胞，37℃，CO₂体积分数为5％，培养。

3.根据权利要求2所述的扩增培养方法，其特征在于，所述培养为：每3天补充如权利要求1所述的培养基使自然杀伤细胞的密度为0.5×10⁶个/mL～1.0×10⁶个/mL。

4.根据权利要求2所述的扩增培养方法，其特征在于，所述重悬的自然杀伤细胞的密度为0.5×10⁶个/mL～1.0×10⁶个/mL。

5.根据权利要求2所述的扩增培养方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞的纯度不低于90％。