CN105296422B

CN105296422B - 一种nk细胞培养组合物及其培养方法

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Publication number: CN105296422B
Application number: CN201510845109.XA
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 王飞; 王一飞; 葛啸虎; 李丽娟; 王小燕
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2018-09-11
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: CN105296422A

Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种NK细胞培养组合物及其培养方法。该组合物包括人工抗原递呈细胞、IL‑2、IL‑15、田七皂苷、血清和基础培养基。本发明NK细胞培养组合物可促进NK细胞的大量增殖，并且提高其细胞的杀伤活性，避免了外源性蛋白及病毒的污染，降低了生产成本，获得的NK细胞纯度较高。

Description

一种NK细胞培养组合物及其培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种NK细胞培养组合物及其培养方法。

背景技术

细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。治疗性的细胞包括：NK、γδT、CD3AK、DC-CIK等，其疗效、特异性、整体有效率、副作用反应等方面的情况逐步改善。

NK细胞(natural killer cell)也称自然杀伤细胞，属于淋巴细胞谱系细胞，含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞，对靶细胞的识别无MHC(主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex)限制，是重要的机体免疫细胞。NK细胞来源于骨髓，属于淋巴细胞谱系的大颗粒淋巴细胞，其占外周血淋巴细胞总数的5～10％，无特异性识别，不需经过抗原呈递及可直接杀伤肿瘤细胞，并且能分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，在肿瘤治疗、抗病毒感染和清除异己细胞中有着重要的作用。

NK细胞在癌症肿瘤治疗方面取得了较大进展，主要是采取与手术、放化疗相结合的治疗方式，与传统单纯的放化疗相比，结合NK细胞的治疗，增强了患者的免疫功能或直接杀死肿瘤细胞和病毒感染的细胞，这样辅助因放化疗造成身体虚弱、抵抗力低而造成的二次伤害、容易感染生病等。而且细胞治疗可以有效抑制肿瘤细胞的转移扩散，并且没有副作用。

目前，主要采用单纯的抗原递呈细胞与NK细胞共同培养的方法，来促进NK细胞的增殖。而这种采用单纯的细胞生长因子刺激NK细胞扩增的方法扩增得到的NK细胞纯度低，杀伤活力低。因此，急需提供一种扩增数量大、杀伤活性高的NK细胞培养方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种NK细胞培养组合物及其培养方法。该组合物可促进NK细胞的增殖，提高对肿瘤细胞的杀伤活力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种NK细胞培养组合物，包括人工抗原递呈细胞、IL-2、IL-15、田七皂苷、血清和基础培养基。

本发明组合物可促进NK细胞的增殖，并且有抑制肿瘤细胞的活性。将该组合物应用于NK细胞的培养中，培养过程相对简单，成本相对较低，得到的NK细胞扩增数量大，杀伤活性高。

作为优选，组合物中各组分用量为：

在本发明提供的一些实施例中，组合物中人工抗原递呈细胞的用量为(0.5～0.75)×10⁶个/mL。

在本发明提供的一些实施例中，组合物中各组分用量为：

在本发明提供的另一些实施例中，组合物中各组分用量为：

作为优选，基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

作为优选，血清为自体血清。

在本发明提供的一些实施例中，人工抗原递呈细胞为4-1BBL-mIL-15-K562细胞，其制备方法为：

将4-1BBL/PCR4TOPO质粒插入GlySer-EGFP(CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的NheI-Xho I位点，构建4-1BBL/pSBSO转座子；

将4-1BBL/pSBSO转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，获得4-1BBL-K562细胞；

将IL-15-Fc(CoOp)-pSBSO与转座酶SB11共转染4-1BBL-K562细胞，经放射线照射，获得4-1BBL-mIL-15-K562细胞。

本发明还提供了一种NK细胞的培养方法，包括如下步骤：

将PBMC与人工抗原递呈细胞混合，采用基础培养基重悬，加入IL-2、IL-15、田七皂苷和血清，进行细胞培养，每隔3天补液一次，培养至第5～7天时加入人工抗原递呈细胞，培养12～16天获得NK细胞。

作为优选，方法中各组分用量为：

在本发明提供的一些实施例中，组合物中各组分用量为：

在本发明提供的另一些实施例中，组合物中各组分用量为：

作为优选，基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

作为优选，血清为自体血清。

在本发明提供的一些实施例中，细胞培养的条件为37℃、浓度为5％的CO₂。

作为优选，PBMC的接种密度为(0.1～1)×10⁶个/mL。

优选地，PBMC的接种密度为(0.25～0.5)×10⁶个/mL。

作为优选，补液为：补加基础培养基、IL-2、IL-15、田七皂苷，IL-2终浓度为200～500U/mL，IL-15终浓度为20～100U/mL，田七皂苷终浓度为10～50mg/mL，补液后细胞密度在(0.5～1.0)×10⁶个/mL。

在本发明提供的一些实施例中，细胞培养的天数为14天。

本发明提供了一种NK细胞培养组合物及其培养方法。该组合物包括人工抗原递呈细胞、IL-2、IL-15、田七皂苷、血清和基础培养基。本发明至少具有如下优势之一：

1、本发明NK细胞培养组合物可促进NK细胞的大量增殖，并且提高其细胞的杀伤活性；

2、本发明采用自体血清来促进细胞的增殖，避免了外源性蛋白及病毒的污染；

3、本发明只需较低剂量的IL-2，大大降低了生产成本；

4、本发明培养方法培养出来的NK细胞纯度较高。

附图说明

图1是NK细胞的增殖曲线；

图2是本发明培养方法和传统培养方法培养的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种NK细胞培养组合物及其培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC)：指能摄取、加工处理抗原，并将抗原递呈给淋巴细胞的一类免疫细胞。此类细胞能辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并对抗原产生应答，又称辅助细胞(accessory cell),简称A细胞。

IL-2：即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子(T cellgrowth factor，TCRF)。主要由活化的CD4⁺Th1细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。可促进Th0和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。环孢素、他克莫司等免疫抑制剂可以抑制其活性和生成。

IL-15：即白细胞介素-15(interleukin-15，IL-15)，由多种细胞产生，生物学作用与IL-2相似。其细胞来源和靶细胞分布较IL-2广，故可能在不表达IL-2的部位发挥类似IL-2的效应。

田七皂苷：是从三七提取的三七皂苷，包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、三七皂苷R1等，能增加脑血管流量，扩张脑血管，改善血流动力学，降低脑缺血。

外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)：即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。

本发明提供的NK细胞培养组合物及其培养方法中所用质粒、载体、细胞、细胞因子、培养基、中药成分均可由市场购得。其中，4-1BBL/PCR4TOPO质粒购自Open Biosysems(Thermo Fisher Scientific,CO,USA)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1 NK细胞的扩增培养

1、抗原递呈细胞的制备：

将4-1BBL/PCR4TOPO质粒通过PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP(CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-Xho I位点，构建4-1BBL/pSBSO转座子。

将4-1BBL/pSBSO转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，用流式细胞仪分选，获得4-1BBL稳定表达的K562细胞(4-1BBL-K562)。

将IL-15-Fc(CoOp)-pSBSO与转座酶SB11共转染4-1BBL-K562细胞，流式细胞分选，建立4-1BBL-mIL-15-K562人工抗原递呈细胞。

用100Gy放射线辐照建立的4-1BBL-mIL-15-K562人工抗原递呈细胞。

2、外周血单个核细胞的分离

采集40～100mL的外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋巴细胞分离液上层，3000rpm离心20min；

离心后离心管的从上到下看，分别为血浆、白膜层(即单个核细胞层，PBMC)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取PBMC层，将收集到的PBMC用生理盐水洗涤重悬后，1500rpm离心10min，重复洗涤两次，收集到PBMC；

3、NK细胞的扩增培养

将收集到的PBMC与上述制备的抗原递呈细胞按1:1的比例混合培养，按1×10⁶的密度接种于培养瓶中，采用1640培养基培养，添加细胞生长因子IL-2和IL-15，终浓度分别为200U/mL、20U/mL；再添加总体积10％的自体血清，并加入田七皂苷，终浓度为10mg/mL；置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养。每隔3天补充新鲜培养基和补加IL-2、IL-15和田七皂苷，终浓度分别为200U/mL、20U/mL和10mg/mL。补液前细胞密度不大于3×10⁶个/mL，补液后细胞密度在0.5～1.0×10⁶个/mL。培养到第5天时再次添加抗原递呈细胞进行二次刺激，直至第14天收集细胞。

实施例2 NK细胞的扩增培养

1、抗原递呈细胞的制备：

用100Gy放射线辐照建立的4-1BBL-mIL-15-K562人工抗原递呈细胞。

2、外周血单个核细胞的分离

3、NK细胞的扩增培养

将收集到的PBMC与上述制备的抗原递呈细胞按1:3的比例混合培养，按1×10⁶的密度接种于培养瓶中，采用1640培养基培养，添加细胞生长因子IL-2和IL-15，终浓度分别为500U/mL、100U/mL；再添加总体积10％的自体血清，并加入田七皂苷，终浓度为50mg/mL；置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养。每隔3天补充新鲜培养基和补加IL-2、IL-15和田七皂苷，终浓度分别为500U/mL、100U/mL和50mg/mL。补液前细胞密度不大于3×10⁶个/mL，补液后细胞密度在0.5～1.0×10⁶个/mL。培养到第5天时再次添加抗原递呈细胞进行二次刺激，直至第14天收集细胞。

实施例3 NK细胞的扩增培养

1、抗原递呈细胞的制备：

用100Gy放射线辐照建立的4-1BBL-mIL-15-K562人工抗原递呈细胞。

2、外周血单个核细胞的分离

3、NK细胞的扩增培养

将收集到的PBMC与上述制备的抗原递呈细胞按1:2的比例混合培养，按1×10⁶的密度接种于培养瓶中，采用1640培养基培养，添加细胞生长因子IL-2和IL-15，终浓度分别为300U/mL、50U/mL；再添加总体积10％的自体血清，并加入田七皂苷，终浓度为30mg/mL；置于37℃，浓度为5％的CO₂培养箱中培养。每隔3天补充新鲜培养基和补加IL-2、IL-15和田七皂苷，终浓度分别为300U/mL、50U/mL和30mg/mL。补液前细胞密度不大于3×10⁶个/mL，补液后细胞密度在0.5～1.0×10⁶个/mL。培养到第5天时再次添加抗原递呈细胞进行二次刺激，直至第14天收集细胞。

实施例4 NK细胞指标检测

检测现有方法与本发明实施例1～3方法培养的NK细胞进行各项指标检测对比，试验组别设置如下：

实验组1：实施例1培养14天的NK细胞；

实验组2：实施例2培养14天的NK细胞；

实验组3：实施例3培养14天的NK细胞；

对照组：除不添加抗原递呈细胞和田七皂苷外，其它操作与本发明方法相同。

1、细胞的活率检测

将培养后的NK细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞活率，结果见下表1。

表1细胞活率检测结果

组别	细胞活率
		实验组1	98.6％
实验组2	98.5％
		实验组3	99.1％
对照组	97.1％

从上述结果可以看出实验组的细胞活率高，尤其是实验组3的结果最佳，并且实验组的细胞活率都高于对照组。

2、细胞的扩增数量的检测

将培养后的NK细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，结果见图1。

从图1可以看出各组培养后的细胞增殖数量，尤其是实验组3的结果最佳，并且实验组的增殖数量均高于对照组。

3、细胞培养后的杀伤活力检测

将培养后的NK细胞进行杀伤活性的检测，采用乳酸脱氢酶(LDH)法，以K562细胞为靶细胞，分别检测各组NK细胞的杀伤活力。效靶比分别为40:1、20:1、10:1、5:1的细胞数比例将效应细胞及靶细胞加入96孔板，靶细胞数为10⁴个/孔，每种效靶比设4个平行孔，每孔200μL。均采用RPMI 1640培养基重悬。于37℃，5％CO₂培养箱中孵育4h，然后用LDH-Cytotoxicity Colorimetric Assay Kit II(美国，BioVision，货号：K313-500)试剂盒进行检测，采用酶标仪检测波长在490nm时的吸光值(A)。杀伤活力的计算过程如下：

将所有实验孔、K562自发LDH释放孔和NK细胞自发LDH释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；

将K562最大LDH释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；

细胞杀伤活力％＝(OD_实验-OD_{NK细胞自发}-OD_K562自发)/(OD_K562最大-OD_K562自发)×100

结果见图2。

从图2的结果可以看出各组NK细胞对K562细胞的杀伤活随效靶比的增高而增强，各实验组的NK细胞杀伤活力无明显差异，实验组3的结果最佳，而对照组的NK细胞在不同的效靶比时杀伤活力均低于各实验组。

4、细胞培养后免疫表型(NK细胞的纯度)检测

将培养后收集的NK细胞用PBS重悬，密度调整为10⁶个/mL，加入FITC标记的CD16和PE标记的CD56抗体，室温避光孵育30min后，用流式细胞仪检测，检测具有相应免疫表型的细胞比例(％)检测结果见表2：

表2免疫表型检测结果

组别	CD16⁺CD56⁺
		实验组1	91.7±0.46
实验组2	91.1±0.37
		实验组3	93.3±0.43
对照组	72.4％±0.61

从表2的结果可以看出，各实验组NK细胞的纯度均高于对照组。

结论：

从上述各实验检测结果来看，实验组的结果都优于对照组，说明本发明的培养方法优于常规的培养方法。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种NK细胞培养组合物，其特征在于，由人工抗原递呈细胞、IL-2、IL-15、田七皂苷、血清和基础培养基组成；

所述组合物中各组分用量为：

所述基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述血清为自体血清。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞为4-1BBL-mIL-15-K562细胞，其制备方法为：

将4-1BBL/PCR4TOPO质粒插入GlySer-EGFP(CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI位点，构建4-1BBL/pSBSO转座子；

将所述4-1BBL/pSBSO转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，获得4-1BBL-K562细胞；

将IL-15-Fc(CoOp)-pSBSO与转座酶SB11共转染所述4-1BBL-K562细胞，经放射线照射，获得4-1BBL-mIL-15-K562细胞。

4.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将PBMC与人工抗原递呈细胞混合，采用基础培养基重悬，加入IL-2、IL-15、田七皂苷和血清，进行细胞培养，每隔3天补液一次，培养至第5～7天时加入人工抗原递呈细胞，培养12～16天获得NK细胞；

所述方法中各组分用量为：

所述基础培养基为RPMI-1640基础培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述细胞培养的条件为37℃、浓度为5％的CO₂。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PBMC的接种密度为(0.1～1)×10⁶个/mL。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述补液为：补加基础培养基、IL-2、IL-15、田七皂苷，IL-2终浓度为200～500U/mL，IL-15终浓度为20～100U/mL，田七皂苷终浓度为10～50mg/mL，补液后细胞密度在(0.5～1.0)×10⁶个/mL。