CN106399241A

CN106399241A - 体外扩增γδT细胞的培养基和方法

Info

Publication number: CN106399241A
Application number: CN201610814090.7A
Authority: CN
Inventors: 程民; 胡世莲; 陈稳; 沈干; 沈国栋; 徐婷娟
Original assignee: Anhui Provincial Hospital
Current assignee: Anhui Provincial Hospital
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2036-09-09
Also published as: CN106399241B

Abstract

本发明公开了体外扩增γδT细胞的培养基和方法。本发明公开的培养基含有L‑谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基，各组分在培养基中的浓度依次为1.45‑2.55mM、5.5‑9.5mg/L、5.5‑9.5mg/L、0.3‑0.5％(v/v)、1.0×10⁵‑3.0×10⁵IU/L、5.0‑15.0μg/L、0.5‑1.5mg/L、0.5‑1.5μmol/L。利用本发明的培养基培养的人γδT细胞，细胞生长速度快、数量多、纯度高、对肿瘤细胞的杀伤力强，活性稳定。

Description

体外扩增γδT细胞的培养基和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，体外扩增γδT细胞的培养基和方法。

背景技术

肿瘤是由于机体的免疫功能不足以战胜各种致病因素而造成的，其发生、发展与宿主的免疫状态有着密切的关系。近几十年来，手术、化疗及放疗已成为临床上治疗肿瘤的主要手段，并取得了一定的治疗效果，但目前肿瘤的复发率和死亡率仍然较高，主要与肿瘤细胞对化学药物或放射线形成耐受有关。新型的肿瘤细胞免疫治疗技术通过恢复和增强肿瘤患者的免疫监视能力和免疫杀伤功能，可以清除手术和放化疗后患者体内残存的肿瘤细胞，达到预防肿瘤复发、转移及根治肿瘤的目的，并且具有特异性强、毒副作用小等特点，被称为第四大肿瘤治疗模式。根据免疫细胞治疗的特点及抗肿瘤的机制，细胞免疫治疗可分为主动性免疫治疗和过继性细胞免疫治疗；又可分为特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗。国内外一些临床试验研究发现，特异性细胞治疗技术、基因修饰的T细胞技术、非特异性细胞治疗技术在临床肿瘤治疗中均取得了较为肯定的疗效。国际上已批准一些过继性细胞产品用于临床肿瘤的治疗，2010年美国FDA批准了首个个体化细胞治疗产品—前列腺癌治疗性疫苗(Provenge)应用于临床治疗，现在已有多个膀胱癌、结肠癌、黑色素瘤、肾细胞癌等的治疗性肿瘤疫苗在美国、法国、俄罗斯、荷兰等国上市销售，日本厚生省将肿瘤细胞免疫疗法(αβT细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞等)列为临床常规治疗方法，韩国FDA批准了Immuncell-LC(αβT细胞)产品用于临床治疗。目前，我国特异性细胞治疗仍处于技术研究阶段，非特异性细胞治疗技术虽在临床应用了近30年，但至今还没出现过一个真正意义上的肿瘤细胞免疫治疗产品。如何获得体外扩增能力强、杀瘤识别谱广、抗癌杀伤力高、毒副作用小的免疫细胞，并用于肿瘤患者的临床治疗，已成为肿瘤细胞免疫治疗领域的研究重点。

γδT细胞只表达γδTCR，与αβT细胞不同，是一群非经典的T细胞，γδT细胞杀伤肿瘤细胞不需要特异性肿瘤抗原的刺激并无MHC限制性，在体内和体外均有较好的抗肿瘤效应并具有多种生物学功能。γδT细胞在抗肿瘤免疫中为连接天然免疫和适应性免疫的桥梁，是肿瘤细胞免疫治疗强有力的工具。活化后的γδT细胞可以对多种肿瘤表现出细胞毒活性，作用机制包括穿孔素/颗粒酶，ADCC(CD16)、Fas配体，或肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)等细胞死亡诱导方式，并能产生大量的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-17F、IL-22等。已有临床研究表明，利用γδT细胞治疗淋巴系统的肿瘤、黑色素瘤及结肠癌等实体瘤取得了较好的治疗效果，体外扩增的γδT细胞具有稳定的抗肿瘤活性，对于体内γδT细胞数量极少或γδT细胞功能严重缺陷的肿瘤患者来说，使用体外扩增的γδT细胞进行治疗对控制病情具有重要意义。因此，体外扩增足够数量的γδT细胞并用于恶性肿瘤的临床治疗具有重要的科学和应用价值。建立规范的自体γδT细胞体外扩增、临床应用及质量控制体系等，将给肿瘤患者的根治疗带来新的希望，延长患者的生存期，提高患者的生存质量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何体外扩增人γδT细胞。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于体外扩增γδT细胞的培养基。

本发明所提供的用于体外扩增γδT细胞的培养基，为含有L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基。

上述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度分别可为1.45mM-2.55mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L-9.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L-9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％-0.5％(v/v)的所述血浆、1.0×10⁵IU/L-3.0×10⁵IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L-15.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L-1.5mg/L的植物血凝素、0.5μmol/L-1.5μmol/L的唑来膦酸。

上述培养基中，所述核糖核苷可为腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷。

上述培养基中，所述脱氧核糖核苷可为腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷。

上述培养基中，所述核糖核苷中腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷的质量比可为1：1：1：1。

上述培养基中，所述脱氧核糖核苷中腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷的质量可比为1：1：1：1。

上述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度可为下述1)或2)或3)：

1)2.0mM的L-谷氨酰胺、7.0mg/L的核糖核苷、7.0mg/L的脱氧核糖核苷、0.4％(体积百分比)所述血浆、2.0×10⁵IU/L的人白细胞介素2、10.0μg/L的人白细胞介素7、1.0mg/L的植物血凝素和1.0μmol/L的唑来膦酸；

2)1.45mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％(体积百分比)的所述血浆、1.0×10⁵IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L的植物血凝素和0.5μmol/L的唑来膦酸；

3)2.55mM的L-谷氨酰胺、9.5mg/L的核糖核苷、9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.5％(体积百分比)的所述血浆、3.0×10⁵IU/L的人白细胞介素2、15.0μg/L的人白细胞介素7、1.5mg/L的植物血凝素和1.5μmol/L的唑来膦酸。

上述培养基中，所述血浆与所述γδT细胞可来源于同一个动物个体。

上述培养基可为向GT-T551H3培养基中添加L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸得到的培养基。

为解决上述技术问题，本发明还提供了体外扩增γδT细胞的方法。

本发明所提供的体外扩增γδT细胞的方法，包括利用所述培养基培养血液中细胞，完成γδT细胞的扩增。

上述方法中，所述培养的温度可为36℃-37℃。

上述方法中，所述培养的空气中CO₂体积百分比含量可为4.0％-10.0％(如5.0％)。

上述方法中，所述培养的空气湿度可为饱和湿度。

上述方法中，所述培养的体系中细胞的浓度可为(1.5-3)×10⁶个/ml。所述培养的体系中细胞的浓度具体可为(1.5-2)×10⁶个/ml或(2-3)×10⁶个/ml。所述培养的体系中细胞的浓度具体是指γδT细胞的浓度，该细胞浓度可利用所述γδT细胞培养液进行调整。

上述方法中，所述血浆与所述血液中细胞均可来源于同一个动物个体。

上述方法中，所述血液中细胞可为外周血单个核细胞。

上述方法中，所述动物可为下述a1)或a2)：a1)哺乳动物；a2)人。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)或2)或3)：

1)体外扩增γδT细胞的产品，包括所述培养基和人外周血单个核细胞；

2)用于体外扩增γδT细胞的成套试剂，由GT-T551H3培养基、L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸中的至少两种组成；

3)治疗和/或预防肿瘤产品，其活性成分为所述体外扩增γδT细胞的方法制备的γδT细胞。

其中，所述人外周血单个核细胞与所述培养基中的所述血浆均可来源于同一动物个体。所述动物可为下述a1)或a2)：a1)哺乳动物；a2)人。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1)所述培养基在制备体外扩增γδT细胞产品中的应用；

X2)所述培养基在体外扩增γδT细胞中的应用；

X3)所述培养基在制备治疗和/或预防肿瘤产品中的应用；

X4)所述培养基在治疗和/或预防肿瘤中的应用；

X5)所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在制备体外扩增γδT细胞产品中的应用；

X6)所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在体外扩增γδT细胞中的应用；

X7)所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在制备治疗和/或预防肿瘤产品中的应用；

X8)所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在治疗和/或预防肿瘤中的应用；

X9)所述治疗和/或预防肿瘤产品在制备治疗和/或预防肿瘤产品中的应用；

X10)所述治疗和/或预防肿瘤产品在治疗和/或预防肿瘤中的应用。

本发明中，所述γδT细胞可为CD3⁺γδTCR⁺的T细胞(CD3⁺TCR⁺γδT细胞)。

本发明中，所述肿瘤可为白血病、肺癌或卵巢癌。所述白血病具体可为慢性骨髓性白血病，如K562细胞引发的慢性骨髓性白血病。所述肺癌具体可为肺鳞癌，如SK-MES-1细胞引发的肺鳞癌。所述卵巢癌具体可为Ho8910细胞引发的卵巢癌。

本发明中，所述GT-T551H3培养基具体可为宝日医生物技术(北京)有限公司产品。核糖核苷、脱氧核糖核苷均可为BioBASic公司产品。L-谷氨酰胺和植物血凝素均可为Sigma公司产品。人白细胞介素2可为重组人白细胞介素-2，具体可为上海华新生物高科技有限公司产品。人白细胞介素7可为重组人白细胞介素7，具体可为Peprotech公司产品。唑来膦酸可为四川海蓉药业有限公司产品。

本发明建立体外扩增γδT细胞的方法，利用本发明的用于体外扩增γδT细胞的培养基培养的人γδT细胞，细胞生长速度快、数量多、纯度高、对肿瘤细胞的杀伤力强，活性稳定：培养14-16天后，γδT细胞扩增倍数可达1000倍以上，细胞总数可达1.0×10¹⁰个以上，其中CD3⁺γδTCR⁺细胞占90％以上，并无细菌、真菌、支原体及病毒因子等的污染。利用杀伤实验，检测培养14-16天后的γδT细胞对Ho8910细胞、SK-MES-1细胞及K562细胞均具有较高的杀伤活性。本发明所建立的人γδT细胞的培养方法为γδT细胞进行临床肿瘤患者体内抗肿瘤治疗奠定了基础。本发明的体外扩增γδT细胞的方法具有易于操作、质量可控、产量高等特点。应用本发明所建立的工艺对γδT细胞进行体外扩增培养，细胞数量、表型、纯度、活性等均可保证达到临床应用，可用于多种恶性肿瘤的临床治疗。因此，本发明的细胞培养方法在治疗恶性肿瘤领域中有广泛的应用价值。

附图说明

图1为培养过程中γδT细胞总数随时间的变化。

图2为γδT细胞纯度的检测结果。

图3为γδT细胞杀伤活性的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的核糖核苷、脱氧核糖核苷均为BioBASic公司产品；L-谷氨酰胺和植物血凝素均为Sigma公司产品；人白细胞介素2为重组人白细胞介素-2，是上海华新生物高科技有限公司产品；人白细胞介素7为重组人白细胞介素7，是Peprotech公司产品；唑来膦酸为四川海蓉药业有限公司产品。

下述实施例中的人淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品，GT-T551H3培养基和GT-T610培养袋为宝日医生物技术(北京)有限公司产品；下述实施例中的培养箱为Thermo Forma公司产品；1640液体培养基、胎牛血清为Hyclone公司产品；流式细胞抗体为BD公司产品；CellTrace Far Red Cell Proliferation kit为Invitrogen公司产品；0.22μm孔径的无菌滤器为Millipore 公司产品；二甲基亚砜、胰蛋白酶为上海生工生物工程有限公司产品；微量移液器为法国Gilson公司产品；低温高速离心机为德国艾本德公司产品；超净工作台为上海智城分析仪器制造有限公司产品；ROTANTA 460R型离心机为德国Hettich公司产品；超低温冰箱为青岛海尔医用低温科技有限公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为BD公司产品；生物显微镜为日本奥林巴斯公司产品。

实施例1、人γδT细胞的扩增

一、外周血单个核细胞(PBMC细胞)的分离

1.外周血标本：取健康人或肿瘤患者的外周血50ml，肝素抗凝，均经供血者知情同意。

2.分离步骤：

(1)于800g，25℃离心外周血标本10分钟，吸取上清液(血浆)于50ml无菌离心管中，沉淀为外周血细胞，冰上放置，用于分离PBMC细胞。

(2)将步骤(1)中得到的上清液于56℃水浴中，孵育30分钟，灭活；然后800g，离心10分钟，吸取上清液于50ml无菌离心管中，即为自体血浆，-20℃保存，备用。

(3)使用无菌PBS溶液稀释步骤(1)得到的外周血细胞至60ml，得到外周血细胞悬浮液；向2支50ml灭菌离心管分别加入20ml人淋巴细胞分离液，然后轻轻加入外周血细胞悬浮液30ml至人淋巴细胞分离液的上层，然后800g，25℃，离心20分钟。

(4)吸取中界层面的单个核细胞，使用PBS溶液洗涤3遍，离心条件为1500rpm，10分钟，25℃；最后弃上清液，使用1.0ml GT-T551H3培养基重悬单个核细胞，计数，4℃放置，备用。

二、使用用于体外扩增γδT细胞的培养基进行体外扩增培养

一)用于体外扩增γδT细胞的培养基的配制

向GT-T551H3培养基中添加L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆(即步骤一中得到的自体血浆)、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸，得到用于体外扩增γδT细胞的培养基。本发明用到了三种用于体外扩增γδT细胞的培养基，其名称分别为γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III，γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度分别为如表1所示。这三种γδT细胞培养液中的血浆均为步骤一的血浆(即自体血浆)。

表1、γδT细胞培养液的配制

试剂	γδT细胞培养液I	γδT细胞培养液II	γδT细胞培养液III
				L-谷氨酰胺	2.0mM	1.45mM	2.55mM
核糖核苷	7.0mg/L	5.5mg/L	9.5mg/L
				脱氧核糖核苷	7.0mg/L	5.5mg/L	9.5mg/L
自体血浆(v/v)	0.4％	0.3％	0.5％
				人白细胞介素2	2.0×10⁵IU/L	1.0×10⁵IU/L	3.0×10⁵IU/L
人白细胞介素7	10.0μg/L	5.0μg/L	15.0μg/L
				植物血凝素	1.0mg/L	0.5mg/L	1.5mg/L
唑来膦酸	1.0μmol/L	0.5μmol/L	1.5μmol/L

二)γδT细胞的扩增培养

分别利用步骤一)的三种γδT细胞培养液扩增γδT细胞，实验重复三次，每次重复试验的具体步骤如下：

1.使用49mlγδT细胞培养液稀释步骤一的PBMC细胞，得到PBMC细胞悬浮液，PBMC细胞悬浮液中的细胞浓度为(0.6-1.2)×10⁶个/ml。

2.转移PBMC细胞悬浮液至175cm²培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5.0％(体积百分比)CO₂的培养箱中进行培养。

3.在培养第3-4天，根据细胞密度，加入γδT细胞培养液，使细胞密度保持在(1.5-2)×10⁶个/ml，继续置于饱和湿度、37℃、5.0％(体积百分比)CO₂的培养箱内培养。

4.在培养第6-7天，仔细观察细胞生长状态，用γδT细胞培养液将γδT细胞重悬到300ml，并将细胞转移入GT-T610培养袋培养，培养过程中将细胞密度控制在(1.5-2)×10⁶个/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养；同时抽样1ml于15ml离心管中，进行细菌、真菌检测。

5.在培养第8-10天，仔细观察细胞生长状态，根据细胞生长情况，向细胞培养袋中添加γδT细胞培养液，培养过程中将细胞密度控制在(1.5-2)×10⁶个/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养。

6.在培养第11-12天，仔细观察细胞生长状态，根据细胞生长情况，并将1/2的细胞转移入另一个GT-T610培养袋，向两个细胞培养袋中均添加γδT细胞培养液，培养过程中将细胞密度控制在(1.5-2)×10⁶个/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养。同时抽样1ml于15ml离心管中，进行细菌、真菌检测。

7.在培养第13-14天，仔细观察细胞生长状态，根据细胞生长情况，并向两个细胞培养袋中均添加γδT细胞培养液，培养过程中将细胞密度控制在(2-3)×10⁶个/ml，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO₂的培养箱内继续培养。

8.在培养第15-16天，根据细胞生长情况，收集γδT细胞，将培养袋中的细胞转移至250ml无菌离心杯中，800g，离心10min。

9.弃上清液，将离心杯里的细胞沉淀用100ml注射用无菌生理盐水重悬，洗涤2次，800g，离心10min。

10.弃上清液，使用注射用无菌生理盐水重悬细胞沉淀，并转移至250ml无菌离心杯中，体积为200ml，即得到γδT细胞，冰上放置，备用。同时抽样1ml于15ml离心管中，进行细菌、真菌检测。

三、γδT细胞的生物学特性及功能检测

1.γδT细胞增殖速度：

在培养过程中的不同时间点取样，检测γδT细胞生长状态，并用台盼兰染色法计数，结果显示γδT细胞生长状态良好，台盼兰染色着色细胞数均小于10％，表明本发明方法培养细胞的效果好。

期间统计γδT细胞的生长速度，制作细胞的生长曲线(γδT细胞培养液I扩增γδT细胞的生长曲线如图1)。结果表明，使用上述方法扩增γδT细胞时，细胞生长迅速，得到的细胞数量多(表2)。

表2、培养过程中γδT细胞总数的平均值

2.γδT细胞纯度：

取步骤二中步骤10得到的γδT细胞1×10⁶个置于离心管中，使用100μl 1×PBS溶液重悬细胞成单细胞悬液；每管加入mouse IgG(BD公司)溶液(0.1μg/μl)2μl，室温，封闭15～30min；向相应样品中管中加入BD公司荧光标记的抗体(PE-conjugated anti-γδTCR(clone B1)、APC-conjugated anti-CD3e(cloneUCHT1))，4℃，避光，标记30min；每管加入1.0ml 1×PBS溶液，混匀细胞，4℃，3000rpm，5min，离心，弃上清；重复洗涤2次；使用300μl1×PBS溶液重悬标记后的细胞，FACSCalibur仪器检测，FlowJo7.6软件分析所得数据。

结果显示，γδT细胞培养液I、II、III培养的γδT细胞中，CD3⁺γδTCR⁺的T细胞(CD3⁺TCR⁺γδT细胞)分别占总细胞的90.6％、93.5％、90.3％(图2)，说明本发明方法所培养的γδT细胞纯度均为90％以上。

3.γδT细胞致瘤性检测

3.1体外软琼脂克隆试验：

利用GENMED SCIENTIFICS公司的软琼脂克隆试剂盒进行实验，其中低养液、中养液和克隆液均为试剂盒中试剂，具体步骤如下：

用无菌生理盐水将步骤二中步骤10得到的γδT细胞浓度调整至2.5×10³个/ml，得到细胞悬液1；取3ml细胞悬液1于50ml无菌离心管中，800g 25℃离心10min后弃上清液，向沉淀中加入3.375ml中养液重悬细胞，并加入1.125ml的克隆液及25μl的刺激剂混合液(刺激剂混合液由溶质和溶剂组成，溶剂为无菌生理盐水，溶质为人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸)，混匀，得到细胞悬液2，细胞悬液2中的人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度与相应的扩增γδT细胞的γδT细胞培养液中的各试剂的浓度相同；将上述细胞悬液2加到已铺有凝胶的12孔板中，1.5ml/孔，轻轻混匀，室温放置2小时后，将12孔板放入孵箱，37℃、5.0％CO₂培养12小时后每孔加入含人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素、唑来膦酸的低养液0.5ml，37℃、5.0％CO₂培养，每72小时补加含人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素、唑来膦酸的低养液；培养14天后，观察12孔板中细胞克隆形成情况。

结果表明，经γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III培养得到的γδT细胞在按照上述方法经14天培养后各孔中均无细胞克隆形成。

3.2裸鼠致瘤性试验：

按照《中国药典》三部的要求检测本发明三种方法制备的γδT细胞对裸鼠的致瘤性。

用无菌生理盐水调整步骤二中步骤10得到的γδT细胞浓度后背部皮下注射裸鼠(SPF级)(上海斯莱克实验动物有限责任公司)，注射量为1.0×10⁷细胞/鼠，注射体积0.2ml；使用Hep2细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC)，产品目录号为CCL-23)作为阳性对照细胞，注射量为1.0×10⁶细胞/鼠，背部皮下注射，注射体积0.2ml；使用WI-38细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC)，产品目录号为CCL-75)作为阴性对照细胞，注射量为1.0×10⁷细胞/鼠，背部皮下注射，注射体积0.2ml。

接种后观察小鼠背部结节形成情况，接种后第3周，阳性组12只裸鼠背部均出现肿瘤结节，并进行性增大，阴性组及实验组各12只裸鼠直至接种后12周，背部均未出现结节。

接种细胞12周后将裸鼠处死，使用流式细胞术检测外周血中肿瘤细胞浸润情况，病理组织学检测肝、脾等脏器中肿瘤细胞浸润情况。结果表明，实验组小鼠外周血及各脏器中均未检测到γδT细胞浸润。实验经3次重复，结果一致。

以上结果表明，经γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III培养得到的γδT细胞不存在致瘤性。

4.γδT细胞对K562细胞、SK-MES-1细胞及Ho8910细胞的杀伤活性

检测本发明三种方法制备的γδT细胞对K562细胞、SK-MES-1细胞及Ho8910细胞的杀伤活性，实验方法如下：

使用红色荧光染料(CellTrace Far Red，Invitrogen公司)标记靶细胞，即K562细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC)，产品目录号为CCL-243)、SK-MES-1细胞(美国标准生物品收藏中心(ATCC)，产品目录号为HTB-58)及Ho8910细胞(中国科学院细胞库，产品目录号为TCHu 24)：将红色荧光染料与靶细胞于37℃，避光，水浴20分钟，每5～10分钟摇晃1次，混匀细胞。之后使用含10％胎牛血清的1640培养液洗涤细胞，3000rpm，10分钟，25℃，共3次。使用含10％胎牛血清的1640培养液将细胞浓度调整为1×10⁵个/ml，备用。4小时杀伤实验：在无菌FACs管中加入标记的靶细胞，每管加100μl。根据效应细胞与靶细胞的比例(效靶比)调整效应细胞(γδT细胞)的浓度，并向各管中加入γδT细胞悬液，体积为100μl/孔。对照靶细胞管不加效应细胞，只加100μl的含10％胎牛血清的1640培养液。每个实验设置四个重复。轻轻混匀，37℃，5.0％CO₂，培养4小时。流式细胞仪检测靶细胞的荧光强度，区分荧光阳性/阴性的靶细胞。杀伤活性的计算：用细胞毒性百分比表示：细胞毒性(％)＝[(对照管靶细胞数－实验管靶细胞数)/对照管靶细胞数]×100％。

γδT细胞培养液I培养的γδT细胞的杀伤结果如图3所示。γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III的结果如表3所示。

表3、γδT细胞的平均细胞毒性(％)

结果表明，经γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III培养得到的γδT细胞对K562细胞、SK-MES-1细胞及Ho8910细胞均有较强的杀伤活性。

5.细菌、真菌、病毒及支原体等外源性因子检测

按照《中国药典》三部要求，检测本发明三种方法制备的γδT细胞中细菌、真菌、病毒及支原体等外源性因子污染情况，具体检查方法如下：

5.1细菌、真菌检查：取γδT细胞培养上清液及γδT细胞悬液样品，按《中国药典》三部(2015年版)方法进行检测。使用硫乙醇酸盐流体培养基(细菌检测)、胰酪大豆胨液体培养基(细菌、真菌检测)进行培养，培养14天，观察细菌及真菌生长情况。

5.2支原体检查：取γδT细胞培养上清液，分别接种于支原体琼脂培养基、精氨酸支原体肉汤培养基、支原体半流体培养基中，按《中国药典》三部(2015年版)方法进行培养，培养21天，观察支原体污染情况。

5.3病毒因子检测

(1)取γδT细胞悬液样品2ml，接种于T175培养瓶中，并加入γδT细胞扩增培养液I48ml，维持培养14天后，将细胞悬液转移至50ml无菌离心管中，3000rpm，10min，20℃，离心细胞；

(2)将上清液转移至另一离心管中，-20℃保存，备用；原离心管中剩余1ml上清，重悬细胞并转移至1.5ml离心管中；

(3)将装有细胞溶液的1.5ml离心管置于液氮中反复冻融3次，3000rpm，10min，20℃，离心；取上清液进行病毒核酸抽提，之后使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)、人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒(巢式PCR-荧光法)、单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒、人巨细胞病毒核酸扩增荧光定量检测及丙型肝炎病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行DNA和RNA病毒的检测。

结果表明，γδT细胞培养液I、γδT细胞培养液II和γδT细胞培养液III培养得到的γδT细胞中细菌、真菌、病毒及支原体等外源性因子均为阴性。

以上各项结果表明本发明方法制备的γδT细胞用于治疗恶性肿瘤在安全性及有效性等方面均符合要求。

Claims

1.用于体外扩增γδT细胞的培养基，其特征在于：所述培养基为含有L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的哺乳动物细胞无血清培养基。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度分别为1.45mM-2.55mM的L-谷氨酰胺、5.5mg/L-9.5mg/L的核糖核苷、5.5mg/L-9.5mg/L的脱氧核糖核苷、0.3％-0.5％(v/v)的血浆、1.0×10⁵IU/L-3.0×10⁵IU/L的人白细胞介素2、5.0μg/L-15.0μg/L的人白细胞介素7、0.5mg/L-1.5mg/L的植物血凝素、0.5μmol/L-1.5μmol/L的唑来膦酸。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述核糖核苷为腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷；

和/或，所述脱氧核糖核苷为腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述核糖核苷中腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷的质量比为1：1：1：1；

和/或，所述脱氧核糖核苷中腺嘌呤脱氧核糖核苷、鸟嘌呤脱氧核糖核苷、胞嘧啶脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷的质量比为1：1：1：1。

5.根据权利要求1-4中任一所述的培养基，其特征在于：所述培养基中L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、所述血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸的浓度为下述1)或2)或3)：

6.根据权利要求1-4中任一所述的培养基，其特征在于：所述培养基为向GT-T551H3培养基中添加L-谷氨酰胺、核糖核苷、脱氧核糖核苷、血浆、人白细胞介素2、人白细胞介素7、植物血凝素和唑来膦酸得到的培养基。

7.体外扩增γδT细胞的方法，包括利用权利要求1-6中任一所述培养基培养血液中细胞，完成γδT细胞的扩增。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为36℃-37℃；

和/或，所述培养的空气中CO₂体积百分比含量为4.0％-10.0％；

和/或，所述培养的空气湿度为饱和湿度；

和/或，所述培养的体系中细胞的浓度为(1.5-3)×10⁶个/ml；

和/或，所述血浆与所述血液中细胞来源于同一个动物个体；

和/或，所述血液中细胞为外周血单个核细胞；

和/或，所述动物为下述a1)或a2)：a1)哺乳动物；a2)人。

9.下述1)或2)或3)：

1)体外扩增γδT细胞的产品，包括权利要求1-5中任一所述培养基和人外周血单个核细胞；

3)治疗和/或预防肿瘤产品，其活性成分为权利要求7或8所述方法制备的γδT细胞。

10.下述任一应用：

X1)权利要求1-5中任一所述培养基在制备体外扩增γδT细胞产品中的应用；

X2)权利要求1-5中任一所述培养基在体外扩增γδT细胞中的应用；

X3)权利要求1-5中任一所述培养基在制备治疗和/或预防肿瘤产品中的应用；

X4)权利要求1-5中任一所述培养基在治疗和/或预防肿瘤中的应用；

X5)权利要求9中所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在制备体外扩增γδT细胞产品中的应用；

X6)权利要求9中所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在体外扩增γδT细胞中的应用；

X7)权利要求9中所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在制备治疗和/或预防肿瘤产品中的应用；

X8)权利要求9中所述体外扩增γδT细胞的产品或所述成套试剂在治疗和/或预防肿瘤中的应用；

X9)权利要求9中所述治疗和/或预防肿瘤产品在制备治疗和/或预防肿瘤产品中的应用；

X10)权利要求9中所述治疗和/或预防肿瘤产品在治疗和/或预防肿瘤中的应用。