CN102727524A - 一种抗cd3/抗cd133双特异性抗体装载的cik细胞的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞的应用，涉及抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备治疗靶向杀伤高表达CD133的癌细胞的制剂中的应用；涉及抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备降低癌细胞中的S100P基因表达的药物中的应用；涉及抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备增加癌细胞中的STAT1基因表达的药物中的应用。

Description

一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞的应用

技术领域

本发明涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞的应用。

背景技术

越来越多的证据表明肿瘤干细胞在肿瘤免疫逃逸、抵抗放、化疗和复发转移中起到了至关重要作用，因此治疗肿瘤需要创建有效靶向杀灭肿瘤干细胞的新策略才有可能根治肿瘤，靶向肿瘤干细胞的免疫治疗在单克隆抗体和干细胞疫苗研究方面已经开展了积极的探索。到目前为止，所发现的肿瘤干细胞特异性标志物非常稀少，而CD133则是所发现肿瘤干细胞中最常见的标志物之一，在脑瘤、白血病、黑色素瘤、肾癌、大肠癌、胰腺癌、肺癌、肝癌和卵巢癌等多种肿瘤干细胞中存在，它的高表达与肿瘤病人的低生存率密切相关。

肿瘤过继免疫治疗中，细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）作为新一代细胞所兼具的T淋巴细胞强大的杀瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特征,在临床取得了很大的进展，但是治疗效果仍然有限，其原因是CIK细胞缺乏特异性靶向杀伤肿瘤干细胞的作用。

为了靶向消灭肿瘤干细胞，由此本发明选择CD133作为针对CD133阳性肿瘤干细胞治疗研究的新靶点，构建了靶向CD133靶点的抗CD3/抗CD133双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)，并且将所制备的抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载到CIK细胞表面，使其双抗体与CIK细胞融为一体发挥靶向杀伤CD133阳性肿瘤细胞的作用。

发明内容

本发明的目的在于提出装备抗CD3/抗CD133双特异性抗体的CIK细胞的应用。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备治疗靶向杀伤高表达CD133的癌细胞的制剂中的应用。

本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备治疗靶向杀伤高表达CD133的肿瘤干细胞的制剂中的应用。

本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备抑制肿瘤生长的制剂中的应用。

本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备降低癌细胞中的S100P基因表达的药物中的应用。

本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备增加癌细胞中的STAT1基因表达的药物中的应用。

其中，本发明中的癌细胞包括胰腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质瘤细胞、前列腺癌细胞、结直肠癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞。

本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备增加效应细胞IFN-γ细胞因子分泌的药物中的应用。

本发明的双抗及双抗装备的CIK细胞的制备方法为：

（1）取鼠抗人CD3单克隆抗体(1mg)溶于5倍摩尔浓度的交联剂Traut's试剂，15～25℃下作用1～2小时；用PD-10柱过滤，除去未交联的单克隆抗体；

（2）取鼠抗人CD133/1单克隆抗体(1mg)溶于4倍摩尔浓度的交联剂Sulfo-SMCC，15～25℃下作用1～2小时；用PD-10柱过滤，除去未交联的单克隆抗体；

（3）将步骤（1）步骤（2）得到的交联后的单克隆抗体混合，1～4℃下作用12～18小时。本发明还涉及一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞。

该抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）CIK细胞的培养：

取健康人外周静脉血10ml，肝素抗凝，用生理盐水1：1稀释后，加至淋巴细胞分离液上层，离心收集单个核细胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×10⁵个/ml，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养12～24h，然后加入rhIL-1α100U/ml、鼠抗人CD3McAb50ng/ml，rhIL-21000U/ml，每两天添加培养液和补充rhIL-21000U/ml，在培养第14天，检查CD3、CD4、CD8和CD56，收获CIK细胞；

（2）CIK细胞表型的检测：

调整培养0天和14天的CIK细胞浓度为5×10⁶个/ml，各取200μl加入离心管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四标抗体及同型对照IgG1单抗各5μl，混匀，在4℃暗室反应20～40min后，PBS洗涤1～3次，免疫荧光染色，流式细胞仪检测CIK细胞中CD3阳性细胞≥85%，CD3和CD8双阳性细胞≥60%，CD3和CD56双阳性细胞≥20%；

（3）抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载CIK细胞：

离心收集培养14天并经表型检测的CIK细胞，PBS洗涤1～3次，按1×10⁶CIK/50ng双抗浓度加入抗CD3/抗CD133双特异性抗体，混匀后室温静置40～80分钟，PBS洗涤1～3次。

下面对本发明的内容做进一步的解释和说明：

本发明提出并构建了一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体；并将所构建的抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载到CIK细胞表面，使其双抗体与CIK细胞融为一体发挥靶向杀伤作用，筛选出高表达CD133阳性细胞的人胰腺癌细胞株SW1990作为靶细胞，在体外和动物体内对靶向治疗高表达CD133人胰腺癌进行了实验，实验结果证实，与单纯CIK细胞的治疗比较，抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞能够更有效地杀伤高表达CD133阳性的人胰腺癌细胞。本发明所制备的装载了双抗的CIK细胞，通过双功能抗体的桥联和靶向结合作用，在肿瘤局部发挥抗体和CIK细胞的双重靶向杀伤作用，有可能消灭包括CD133阳性肿瘤干细胞在内的全部肿瘤细胞，从而有效地解决CIK细胞免疫治疗不能消灭具有复发转移种子-肿瘤干细胞的缺陷，本发明为高效靶向消灭肿瘤干细胞的新型免疫治疗提供了新的方案，为临床试验研究奠定了基础。

由于直接作用于肿瘤干细胞的CTL细胞治疗肿瘤的方法还没有问世，而单纯CIK细胞又不能靶向杀伤肿瘤干细胞，所以本发明利用单克隆抗体的靶向杀伤作用和CIK细胞所具有的非MHC限制性强大杀瘤活性的特性，成功构建了抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备CIK的新型抗肿瘤免疫效应细胞，在体外和动物体内开展了靶向治疗高表达CD133胰腺癌的研究。

通过用抗CD133抗体对10种人肿瘤细胞株的CD133抗原表达的筛查后，选择了两对配对肿瘤细胞株作为靶细胞：一对是高表达CD133人胰腺癌细胞株SW1990和低表达CD133的人胰腺癌细胞CAPAN-2配对，另一对是高表达CD133人肝癌细胞株Hep-3B和低表达CD133人肝癌细胞株HepG2配对，通过体外杀伤试验的比较发现，在同一个效靶比浓度下，抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备CIK细胞对高表达CD133靶细胞SW1990细胞和Hep-3B细胞的杀瘤效果要明显强于单纯CIK细胞组，p＜0.05。而在低表达CD133靶细胞Capan2和HepG2细胞，抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备CIK细胞与单纯CIK细胞之间杀瘤效果差异不显著。

通过用抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞治疗高表达CD133的胰腺癌细胞系SW1990制备的裸鼠皮下移植瘤，发现抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞比单纯CIK具有更强的抑制肿瘤生长的作用，p<0.05。

以上实验结果表明CIK细胞在装备了抗CD3/抗CD133双特异性抗体之后，CIK细胞不仅发挥广谱直接杀伤肿瘤细胞的治疗作用，而且利用双功能抗体的桥联作用将效应细胞和高表达CD133的肿瘤靶细胞有机的结合到一起，形成杀伤组合体，发挥了抗体靶向打击消灭CD133阳性的肿瘤干细胞的作用。双抗体不仅将效应细胞富集在肿瘤周围，而且可以模拟天然配体的作用，与细胞表面引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤细胞的靶向性的杀伤，由于抗体对抗原的识别不需要抗原提呈及MHC的表达，因此CIK装备特异性双抗的治疗方案不但能够有效地解决肿瘤干细胞对宿主免疫监视逃逸和耐药性等影响疗效的关键难题，而且能够修补CIK细胞免疫治疗不能消灭具有复发转移的种子—肿瘤干细胞的缺陷。

本发明的抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞不仅可以靶向治疗高表达CD133胰腺癌，还可以有效抑制高表达CD133的Hep3B肝癌细胞，该结果与应用CD133单抗结合细胞毒药物monomethyl auristatin F(MMAF)有效杀伤高表达CD133Hep3B肝癌细胞和KATO-III胃癌细胞的结果相一致。由此可知抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞不仅能够打击CD133高表达的胰腺癌细胞，而且有可能对各种肿瘤中的表达CD133的干细胞细胞亚群进行有效抑制。

发明人对加入双抗装备CIK或单纯CIK共同培养前后的高表达CD133胰腺癌细胞系SW1990的基因芯片表达谱进行分析。通过荧光定量PCR证实双抗装备的CIK细胞能够使SW1990癌细胞中的S100P基因明显下调和STAT1显著上调。结果表明这些基因表达的改变与双抗装备CIK细胞的增效作用密切相关。

本发明的双抗装备CIK细胞，在作用高表达CD133胰腺癌细胞SW199024小时后，该细胞中S100P基因表达明显下调，是未处理亲本肿瘤细胞的0.26倍，单纯CIK组的0.18倍（p<0.01）。由于该基因下调在单纯CIK细胞与装备了双抗CIK的细胞之间差异显著，因此抗CD3/抗CD133双特异性抗体的靶向杀伤作用与胰腺癌细胞中S100P基因水平显著下调密切相关。S100P基因是调控细胞增殖周期的基因，近年来关于S100P在肿瘤组织中的异常表达受到重视，S100P在多种肿瘤组织中均有明显的高表达水平，如胰腺癌、肺腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌等，并且与部分肿瘤的分期、预后、治疗等有一定的相关性。S100P在大约90%的胰腺肿瘤中均有表达，通过SiRNA敲除胰腺癌中S100P的表达之后，论证了S100P在体外有着促进肿瘤生长、延缓肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤迁移及侵袭的作用。用转染了S100P基因的胰腺癌细胞接种裸鼠，肿瘤生长5倍大于对照组；而敲除了S100P基因的肿瘤细胞接种裸鼠后，肿瘤体积不仅明显小于对照组，而且出现远处转移的几率也明显减少。这些研究证明了S100P与肿瘤细胞的生长、浸润及转移密切相关。本发明证明靶向CD133阳性胰腺癌细胞的双抗联合CIK免疫靶向治疗作用机理直接涉及到了与促进胰腺癌细胞生长、延缓凋亡、促进迁移及侵袭的关键基因S100P的分子机制，胰腺癌靶细胞中该基因的显著下调与该方案抗肿瘤效果直接关联。

本发明还发现双特异性抗体装备的CIK细胞对胰腺癌细胞的杀伤作用明显增强，伴有IFN-γ的分泌量增加，以双抗装备CIK组数值最高，三组间比较差异显著。免疫效应细胞通过分泌干扰素能够在抗肿瘤免疫反应中起到至关重要的作用，本发明发现双抗装备CIK细胞不但对高表达CD133的胰腺癌和肝癌细胞有更强大的靶向杀伤作用，同时，当BsAb-CIK效应细胞与肿瘤靶细胞相互作用时，免疫效应细胞能够分泌更多的IFN-γ，从而实现了BsAb-CIK免疫细胞强力打击肿瘤靶细胞的杀伤作用。

本发明还发现经BsAb-CIK效应细胞作用的肿瘤靶细胞自身的STAT1基因表达显著上调,经基因表达谱芯片分析和荧光定量PCR检测证实，胰腺癌细胞经单纯CIK处理后，STAT1基因表达显著上调为11.91倍，而双特异性抗体装备的CIK作用后的肿瘤细胞STAT1基因表达显著上调为17.11倍，两治疗组差异显著，p<0.05。信号转导和转录激活因子STATs是一个转录因子家族，是对细胞增殖、存活和分化所必须的关键调节细胞因子和生长因子的受体信号。STAT1在细胞内能够有效地阻止乳腺上皮的增殖和诱导细胞凋亡，对不同小鼠移植模型的研究验证，无论是在ErbB2/HER2阳性或阴性小鼠模型和STAT1-/-小鼠中都证实了STAT1具有抑制小鼠体内肿瘤形成的作用，而且在floxed stat1等位基因的小鼠进一步证实了STAT1抑制肿瘤形成的作用是通过细胞自治实现的。因此目前认为STAT1是一个通用型的肿瘤抑制基因或抗癌基因。研究发现丧失STAT1的肿瘤细胞会失去对干扰素介导的生长抑制反应，而且可能导致MHC表达下调，从而逃避CTL介导的肿瘤免疫监视。研究发现肿瘤患者细胞内STAT1激活的低水平与预后较差关系密切。而我们的发明证实了在BsAb-CIK的靶向杀伤作用是与肿瘤靶细胞自身STAT1基因表达显著上调是一致的。

本发明从免疫细胞治疗学的角度首次证实了anti-CD3/anti-CD133BsAb装备CIK细胞强大靶向杀伤作用与CD133高表达胰腺癌靶细胞自身所发生的恶性转化基因S100P基因明显下调和stat1抗癌基因的显著上调的作用机制密切相关，从而使该治疗得到更好的靶向治疗效果。该方法不但适用于CD133高表达的胰腺癌，而且也可能对其它高表达CD133的肿瘤靶细胞具有疗效，而且免疫效应细胞分泌IFN-γ细胞因子水平和肿瘤靶细胞内抗癌基因stat1和S100P基因变化规律也可能作为监测该项免疫细胞治疗的有效指标，值得进一步深入研究。

本发明研究表明通过Anti-CD133xAnti-CD3BsAb装备的CIK细胞能够在体内外有效的靶向杀伤高表达CD133的肿瘤细胞，为创建高效靶向消灭CD133阳性肿瘤干细胞的新型免疫治疗策略与方案提供了重要科学论据，为深入探讨增效杀瘤作用机制奠定了基础。

附图说明：

图1为抗CD3/抗CD133双特异性抗体产物8%非还原变性SDS-聚丙烯胺凝胶电泳图；

图2为FACS检测CIK细胞表型结果图，培养第1天；

图3为FACS检测CIK细胞表型结果图，培养第14天；

图4为抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备CIK细胞荧光显微镜检测结果；

图5为正常人的双抗装备的CIK细胞对SW1990细胞杀伤实验结果图；

图6为肿瘤病人的双抗装备的CIK细胞对SW1990细胞杀伤实验结果图；

图7为正常人的双抗装备的CIK细胞对Capan-2杀伤实验结果图；

图8为正常人的双抗装备的CIK细胞对Hep3B杀伤实验结果图；

图9为正常人的双抗装备的CIK细胞对HepG2杀伤实验结果图；

图10细胞杀伤实验的细胞培养上清液IFN-gamma分泌的结果图；

图11为双抗装备的CIK细胞治疗裸鼠皮下移植瘤实验的结果统计图；

图12为双抗装备的CIK细胞治疗对基因S100P、STAT1的荧光定量RT-PCR分析的结果图。

本发明的具体实施方式仅限于对本发明进行进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

主要试剂及仪器

RPMI1640购自GIBCO公司(Grand Island，NY)；

胎牛血清购单克隆抗体购于Ortho Biotech公司，Tokyo，Japan

鼠抗人CD133/1(AC133)单克隆抗体购于Miltenyi Biotech公司，Bergisch Gladbach,Germany；

鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四标抗体及同型对照IgG1购自BDpharmingen公司；

鼠抗人CD133-PE抗体购自Miltenyi Biotec公司；

人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；

细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）购于DOJINDO，W公司；

人IFN-γELISA试剂盒购自R＆D pharmingen；

流式细胞仪购自R＆D pharmingen。

实施例1：双特异性抗体的制备

1.取鼠抗人CD3单克隆抗体—OKT3抗体(1mg)溶于5倍摩尔浓度的交联剂Traut's试剂(2-iminothiolane HCl;Pierce,Rockford,IL)500μl，室温下作用1小时；用PD-10柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)过滤，移除未交联的单克隆抗体;

2.取鼠抗人CD133/1单克隆抗体(1mg)溶于4倍摩尔浓度的交联剂Sulfo-SMCC（sulfosuccinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate）500μl，室温下作用1小时后，用PD-10柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)过滤，移除未交联的单克隆抗体；

3.将已交联的OKT3和鼠抗人CD133/1单抗混合后4℃过夜，制备得到抗CD3/抗CD133双特异性抗体。

抗CD3/抗CD133双抗体蛋白产物通过8%非还原、变性SDS-聚丙烯胺凝胶电泳图，考马斯亮蓝染色检测。实验结果如图1所示；其中第1电泳带为蛋白marker，2为10ug的OKT3单克隆抗体，3为10ug的CD133/1单克隆抗体，4为30ug的抗CD3/抗CD133双特异性抗体。通过蛋白电泳检测，证实抗CD3/抗CD133两种抗体交联的双体蛋白条带为300KD,而单体为150KD。

蛋白定量用BCA(Pierce)试剂盒，按说明书要求操作，检测双抗的蛋白含量。

实施例2：抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备CIK细胞

1.CIK细胞的培养

取健康志愿者外周静脉血10ml，肝素抗凝，用生理盐水1∶1稀释后，加至淋巴细胞分离液上层，离心收集单个核细胞（PBMC），用含5%胎牛血清的RPMI1640培养液调整细胞密度为2×10⁵个/ml，并加入IFN-γ终浓度为1,000单位/mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，加入rhIL-1α终浓度为1000U/ml、鼠抗人CD3McAb终浓度为50ng/ml，rhIL-2终浓度为1000U/ml，每2d加液补充rhIL-2，在培养第14天，流式细胞仪检查培养细胞CD3、CD4、CD8和CD56表型，收获CIK细胞。

2.CIK细胞表型的检测

将培养1天和14天的CIK细胞调整浓度为5×10⁶个/ml，各取200μl加入Falcon管中，加入鼠抗人CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、CD56-APC四标抗体及同型对照IgG1单抗各5μl，混匀，在4℃暗室反应30min后，PBS洗涤2次，上流式细胞仪检测。实验结果如图2、图3所示。

3.特异性抗体抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备CIK细胞

离心收集培养14天并经表型检测的CIK细胞，PBS洗涤两次，按1×10⁶CIK/50ng双抗浓度加入实施例1制备的抗CD3/抗CD133双特异性抗体，混匀后室温静置60分钟，PBS洗涤CIK细胞没有结合上的游离抗体，离心后经荧光显微镜检测双特异性抗体装载CIK细胞的状态。

4.荧光显微镜检测荧光抗体标记的双抗装备CIK细胞

双标记法：将抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞PBS洗涤离心后加入抗小鼠FITC-IgG2a单克隆抗体（抗小鼠IgG2a单抗针对Anti-CD3单抗，）和抗小鼠PE-IgG1单克隆抗体（抗小鼠IgG1单抗，针对Anti-CD133单抗）4℃避光孵育30分钟后，PBS洗涤两次，荧光显微镜下检查细胞荧光颜色。同时采用1×10⁶CIK细胞做对照。

实验结果如图4所示，在图B中，CD133抗体在荧光显微镜下呈现红色荧光；在图C中，CD3抗体在荧光显微镜下呈现绿色荧光；在图D中，双抗装载的细胞红绿颜色重合在荧光显微镜下呈现橙色荧光。

实施例3：检测双特异性抗体装备的CIK细胞对SW1990的细胞毒作用

以CIK细胞为效应细胞，以人胰腺癌细胞系SW1990作为靶细胞，检测对比抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞的杀伤作用。

分别取10份正常人和10份肿瘤病人的外周静脉血制备CIK细胞，并且将毎一例CIK细胞装载抗CD3/抗CD133双特异性抗体，分别对比检测CIK细胞和装载了抗CD3/抗CD133双特异性抗体的CIK细胞对SW1990细胞的杀伤实验。

实验步骤为：取对数生长期肿瘤细胞，5000个细胞/孔铺96孔细胞培养板，第二天分别加入CIK细胞、实施例2制备的抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞，50ng/1×10⁶CIK细胞，以效靶比2:1、10:1和50:1的浓度共同培养72h,每个浓度3个平行孔；弃上清液，PBS漂洗细胞两次后，加入Cell counting Kit CCK-8细胞计数试剂盒中应用液继续培养4小时，96孔细胞培养板放入酶联仪检测在450nm处吸光度OD值，按公式计算细胞杀伤率：

杀伤率(%)=[1-(实验组OD值)/CIK对照OD值+靶细胞对照OD值]×100%。

实验同时设单纯CIK细胞对照组、靶细胞对照组和空白组。

细胞毒作用的检测：对各实验组采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

正常人的CIK细胞杀伤实验结果图5所示；

病人的的CIK细胞杀伤实验结果如图6所示。

结果发现无论是在2:1、10：1和50：1的不同效靶比条件下，在同一个效靶比浓度下，抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞对胰腺癌靶细胞的杀伤作用均大于单纯CIK组。

经统计学分析表明无论是正常人的还是病人的CIK，经过双抗装备的CIK细胞对高表达CD133的胰腺癌细胞系SW1990的杀伤作用对明显大于单纯CIK组，p<0.05。CIK细胞和双抗装备的CIK细胞，杀伤靶细胞的作用与效应细胞的浓度呈正相关，浓度越大，杀瘤作用越强。

实施例4：检测双特异性抗体装备的CIK细胞对人胰腺癌细胞系Capan-2的细胞毒作用

以CIK细胞为效应细胞，以低表达CD133的人胰腺癌细胞系Capan-2作为靶细胞，检测对比装备了抗CD3/抗CD133双特异性抗体的CIK细胞的杀伤作用。

以正常人外周静脉血制备的CIK细胞分别对Capan-2杀伤实验做了10人次：

实验方法同实施例3：实验结果如图7所示。

结果发现无论是在2：1、10：1和50：1的不同效靶比条件下，在同一个效靶比浓度下，双抗装备的CIK对低表达D133的胰腺癌细胞系Capan2细胞杀伤作用均大于单纯CIK组，但是经统计学分析两组的杀伤作用差异不显著，p>0.05。

实验例5：检测双特异性抗体装备的CIK细胞对人肝癌细胞系Hep3B和HepG2的细胞毒作用

以CIK细胞为效应细胞，以人肝癌细胞系Hep3B和HepG2作为靶细胞，检测对比抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞的杀伤作用。

以正常人外周静脉血制备的CIK细胞分别对Hep3B和HepG2杀伤实验做了20人次；

实验方法同实施例3：实验结果如图8、9所示。

结果发现无论是在2:1、10：1和50：1的不同效靶比条件下，在同一个效靶比浓度下，双抗装备的CIK细胞对肝癌系靶细胞的杀伤作用均大于单纯CIK组。经过抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞对高表达CD133肝癌细胞系Hep3B具有更强的杀伤作用，与单纯CIK细胞相比有显著差异，p<0.05，而对低表达CD133肝癌细胞系HepG2的杀伤作用差异不显著，p>0.05。

CIK细胞和装备了抗CD3/抗CD133双特异性抗体的CIK细胞，其杀伤靶细胞的作用与效应细胞的浓度呈正相关，浓度大，杀瘤作用越强。

实验例6：细胞因子检测

取对数生长期人胰腺癌细胞系SW1990以5000个细胞/孔铺96孔，第二天加入CIK细胞或抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK，以效靶比2:1、10:1和50:1的浓度共同培养72小时，收集上清液，用ELISA Kit Human IFN-γ（R＆D pharmingen(San Diege，U.S.A)）检测细胞IFN-γ分泌水平，实验结果如图10所示。

双抗装备的CIK细胞与四种不同的靶细胞共同培养72小时后，检测细胞培养上清液，均伴有γ-干扰素分泌水平明显增高，与单纯CIK组比较差异显著，p<0.05。

同时还检测了TNF-a、IL-12、IL-4、IL-10和TGF-B的分泌水平，但是各组间与对照组无明显差异，无可见阳性试验结果。结果表明抗CD3/抗CD133双特异性抗体装备的CIK细胞对靶细胞的杀伤效应与INF-γ分泌水平密切相关。

实验例7：双抗装备的CIK细胞治疗裸鼠皮下移植瘤实验

取8周龄雌裸鼠33只，每只裸鼠右腋下皮下注射2×10⁶人胰腺癌细胞系SW1990细胞，10天后肿瘤长到0.3cm大小，随机分成3组：对照组，单纯CIK组和抗CD3/抗CD133装备的CIK组，单纯CIK组腹腔内注射CIK细胞1×10⁷次/周，每周2次；双抗装备CIK组腹腔内注射BsAb+CIK1×10⁷次/周，每周2次；对照组腹腔内注射生理盐水200ul次/周，每周2次。

40天处死小鼠，统计各组瘤重平均值与SD为：对照组0.4592±0.046克，CIK组0.2683±0.0733，双抗装备组0.1197±0.074，经统计学分析表明，与单纯CIK治疗组比较，经双抗装备的CIK细胞对小鼠高表达CD133SW1990细胞皮下移植瘤的生长抑制作用更加显著，对照组与CIK组比较p=0.01，对照组与双抗装备的CIK细胞组比较p=0.003，CIK组与双抗装备的CIK细胞组p=0.013。统计实验数据如图11所示。

实验结果显示，装备有双抗的CIK细胞对肿瘤的生长期到非常明显的抑制作用。

实验例8：荧光定量RT-PCR

人胰腺癌细胞系SW1990以2×10⁶个细胞种入培养瓶内，第二天分别加入2×10⁷CIK细胞或抗CD3/抗CD133装备的CIK（效靶比浓度10：1），留一瓶未处理的肿瘤细胞做空白对照，共同培养24小时，弃上清液，PBS漂洗细胞两次，加入TRIZOL1ml，收集细胞裂解液，用总RNA试剂盒提取总RNA，以总RNA为模板逆转录cDNA。

使用ABI-Prism7000Sequence Detector system做荧光定量PCR检测。

合成引物序列：

S100P上游引物：SEQ ID NO:1GCAGCACGCAGACCCTGACCAA；

S100P下游引物：SEQ ID NO:2GCAGCCACGAACACGATGAAC；

STAT1上游引物：SEQ ID NO:3GTTAGGCTATTCACAACCACTC；

STAT1下游引物：SEQ ID NO:4ACTTCACGAAACATCATCCAC；

β-actin上游引物：SEQ ID NO:5AGCGAGCATCCCCCAAAGTT；

β-actin下游引物：SEQ ID NO:6GGGCACGAAGGCTCATCATT；

上述引物序列由百维信生物invitrogen公司合成。

反应体系：10×Buffer1ul，dNTP(10mM)0.25ul，primer2ul，Taq酶0.1ul，SYBR GreenI0.5ul，模板cDNA1ul，ddH₂O5.15ul，总体积10ul。

反应程序：预变性95℃2mi，30个循环变性94℃，10sec，退火55℃，10sec延伸72℃，30sec。

数据处理：计算Folds=2-^△△Ct，△△Ct=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)，

Ct1：处理样品待测基因的Ct；Ct2：处理样品看家基因的Ct；Ct3：对照样品待测基因的Ct；

Ct4：对照样品。

统计学分析

实验数据以表示，应用SPSS11.5统计学软件进行方差分析、相关性分析和t检验，检验水准α＝0.05，以p﹤0.05为差异有统计学意义。分析结果如图12所示（^*p＜0.05，#p＜0.01），其中，左图为S100P、右图为STAT1。

Claims (7)

1.一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备治疗靶向杀伤高表达CD133的癌细胞的制剂中的应用。

2.一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备治疗靶向杀伤高表达CD133的肿瘤干细胞的制剂中的应用。

3.一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备抑制肿瘤生长的制剂中的应用。

4.一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备降低癌细胞中的S100P基因表达的药物中的应用。

5.一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备增加癌细胞中的STAT1基因表达的药物中的应用。

6.根据权利要求1～5任一权利要求所述的应用，其特征在于，所述的癌细胞包括胰腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、胶质瘤细胞、前列腺癌细胞、结直肠癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞。

7.一种抗CD3/抗CD133双特异性抗体装载的CIK细胞在制备增加效应细胞IFN-γ细胞因子分泌的药物中的应用。

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