CN105176927A - 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，适用于外周血、脐血来源的NK/CIK和DC-NK/CIK细胞培养；包括血液采集及单个核细胞分离、采用悬浮的细胞培养NK/CIK细胞、采用贴壁的单核细胞培养DC细胞、将NK/CIK细胞和DC细胞和按照10：1按比例进行混合培养；本发明采用未经分选的单个核细胞进行培养，利用高效的细胞因子组合，培养14天后，在体系中产生NK/CIK混合效应细胞，细胞纯度近90％，其中52.4％的NK细胞和33.3％的CIK细胞，表达杀伤标志的细胞占80％以上，所有的NK细胞高表达活化标志CD161；诱导的DC-NK/CIK细胞具有显著的增殖能力和靶向杀伤肿瘤的能力，尤其针对NK细胞不敏感的肿瘤细胞，其杀伤能力显著提高，扩大了NK细胞临床治疗肿瘤的范围。

Description

一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及NK/CIK细胞的制备方法，具体为一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法。

背景技术

单个核细胞：指血液或者骨髓经Ficoll分离后得到的具有单个细胞核的白细胞。其主要分为两大群体，即单核细胞与淋巴细胞。

NK细胞(naturalkiller,NK)：是机体天然免疫的主要承担者，几乎参与了免疫系统的发生、发展及效应等重要环节的调节过程，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关。NK细胞主要分布于外周血中，占PBMC5-10％，淋巴结和骨髓中也有NK活性，但水平较外周血低。NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，称为自然杀伤活性。NK细胞在IL-2刺激下可发生增殖反应，活化NK细胞可产生IFN-γ。其杀伤介质主要有穿孔素、细胞毒因子和TNF等，以及ADCC作用。

CIK细胞(cytokine-inducedkiller)：是多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞同时表达CD3⁺和CD56⁺两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。

DC细胞：又称树突状细胞(Dendriticcells,DC)，是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原。未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。DC与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。

肿瘤的传统治疗方法常用的有手术、放疗和化疗三种，但这三种方法均不能彻底清除体内的瘤细胞，而免疫治疗借助于调节肿瘤细胞和宿主免疫反应，来刺激免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞。其中，体内回输免疫活性细胞的过继免疫疗法具有一定的抗肿瘤效果。与其它的抗肿瘤药物相比，对机体免疫系统的结构和功能不产生损伤，可以直接杀伤肿瘤细胞，并且调节和增强机体的免疫功能，因而成为治疗肿瘤的重要辅助手段，为预防肿瘤复发，改善晚期患者的生存质量提供了新途径。

过继性免疫治疗是指将有免疫活性的自体或者同种异体的免疫细胞输给患者，为患者提供现成的免疫力，以达到治疗目的的治疗方法。为了达到更好的抗肿瘤效果，用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的细胞毒活性和增殖能力。

目前应用IL-2为主要刺激因子扩增了自然杀伤细胞(NK)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、CD3活化杀伤细胞(CD3AK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)等多种细胞毒效应细胞用于过继免疫治疗，临床试验结果显示具有较好的应用前景，这些效应细胞是以NK为主或富含NK样细胞。

NK细胞在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。NK细胞可选择性地杀伤病毒感染的靶细胞。有NK细胞产生的IFN可协同其抗病毒作用，而对正常细胞有保护作用。NK细胞在免疫监视、杀伤突变的肿瘤细胞可能比T细胞具有更重要的作用。此外，NK细胞参与骨髓移植后移植物抗白血病效应，在体外NK细胞可杀伤某些淋巴样和髓样白血病细胞。NK细胞作用及效应机制：(1)自然杀伤活性；(2)杀伤介质主要有穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等；(3)抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；(4)NK细胞产生的细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。

CIK细胞是细胞因子诱导的一群异质性细胞，以CD3⁺和CD56⁺细胞为主，兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。CIK细胞大体可通过四种途径杀伤肿瘤细胞：(1)自然杀伤；(2)诱导肿瘤细胞凋亡；(3)炎性细胞因子作用；(4)分泌细胞因子增强T细胞功能。

现有技术中NK细胞体外扩增方法一般采用以下的技术方案：

(1)、将采集的血液以密度梯度离心法分离，收集单个核细胞。

(2)、应用CD3磁珠分选，收集CD3^-淋巴细胞，然后二次CD56磁珠分选获得CD3^-CD56⁺NK细胞；洗涤，收集细胞；

(3)、细胞沉淀用NK细胞培养基重悬，调节细胞浓度1～2×10⁶/mL，并加入终浓度为500～1000IU/mL的细胞因子IL-2，于37℃,5％CO₂培养箱中孵育；

(4)、每2～3天半量新鲜培养基换液，并补充细胞因子，维持细胞密度为1～2×10⁶/mL；

(5)、第14～21天收集扩增培养的NK细胞。

采用这种技术中的缺点是：

一、应用磁珠分选获得NK细胞的方法，在临床应用和生产中增加了环节，增加了人源性污染的机会，而且使用二次磁珠分选的方法，机械性地损伤NK细胞，影响细胞的质量和有效细胞数量；

二、采用这种体外扩增方法，获得的NK细胞增殖能力较差，需要大量的血液采集来满足临床治疗对于免疫细胞数量的需要；

三、采用这种体外扩增方法得到的NK细胞具有广谱的抗肿瘤作用，但是对NK细胞不敏感的肿瘤细胞无杀伤能力。

成功发展肿瘤过继免疫治疗的关键是如何获得足够数量的高效细胞毒效应细胞。NK细胞具高效细胞毒活性，但NK细胞在人外周血中的数量远少于T、B淋巴细胞，而且其体外扩增效率不高导致难以获得临床级别的细胞数量，成为限制其临床应用的重要因素之一。因此建立一种简单高效的NK细胞体外扩增方法具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中NK细胞培养时需要磁珠分选，获得的NK细胞增殖能力较差，对NK细胞不敏感的肿瘤细胞无杀伤能力的缺陷，提供一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，包括以下几个步骤：

一、血液采集及单个核细胞分离

(1)、采集外周血或者脐血50～80mL，收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，迅速摇匀，避免发生凝血；

(2)、将采血袋和生物冰袋一起放入保温箱，保持温度为4～8℃；12小时内运送至实验室；

(3)、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，使稀释的血液与淋巴细胞液的体积比为3:2，注意保持液层分界清晰；

(4)、将离心管在900g、20℃的条件下离心25min，离心完毕后，可观察到离心管中液面分层，将单个核细胞层的液体，移入新的离心管中；

(5)、用2倍于单个核细胞层的液体体积的生理盐水稀释单个核细胞层液体，在400g、4℃下离心5min进行洗涤；洗涤两次后去除上清；

(6)、用无血清培养液重悬单个核细胞，调节细胞密度为3×10⁶/mL，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中孵育1小时，分别收集悬浮细胞和贴壁的单核细胞；

二、DC细胞培养

(1)、用DC细胞完全培养液重悬步骤一的(6)中得到的贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃、5％体积分数的CO₂培养箱中培养；优选的DC细胞完全培养为含1％质量分数的人血白蛋白的X-VIVO无血清培养液；

(2)、培养第3天，半量补充新鲜的DC细胞完全培养液培养液和细胞因子GM-CSF和IL-4，并向每mL的细胞培养液中加入100～200μg的肿瘤细胞裂解液，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；

(3)、加入促熟细胞因子组合，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；优选的，促熟细胞因子组合为每mL的细胞培养液中加入10～20μg的poly(IC)、5～10μg的LPS、500～1000IU的IFN-γ，10～20ng的TNF-α；

(4)、收集成熟DC细胞；

三、NK/CIK细胞培养

(1)、收集步骤一的(6)中得到悬浮细胞，离心后，用NK/CIK细胞完全培养液重悬细胞，调节细胞密度为3～5×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加细胞因子200-500U的IL-2、50-100ng的OKT3和20-50μg的PHA，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中培养3～5天，收集细胞，1500rpm下离心，去除上清，生理盐水洗涤一次；优选的，NK/CIK细胞完全培养液为含1～5％质量分数的人AB血清的X-VIVO无血清培养基。

(2)用新鲜的完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加200-500U的细胞因子IL-2和5-20ng的IL-15继续培养；

(3)、在培养第5天，将得到的NK/CIK细胞和步骤二的(4)中得到DC细胞按照10：1比例进行混合培养；每2-3天添加新鲜培养基，并向每mL的细胞液中添加细胞因子200～500U的IL-2和5～20ng的IL-15，维持细胞密度为1～2×10⁶/mL；

(4)、培养第14天，收集细胞，流式细胞仪检测表型以及进行细胞计数，计算增殖能力。

本发明的一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，适用于外周血、脐血来源的NK/CIK和DC-NK/CIK细胞培养，可以进行自体和异体的免疫细胞抗肿瘤治疗，与现有技术相比，具有以下有益效果：

一、本发明采用未经分选的单个核细胞进行培养，避免了磁珠分选过程，减少了分选过程对细胞的损伤，同时节约了成本、人员和时间、空间占有率；在体系中产生NK/CIK混合效应细胞，细胞纯度近90％，其中52.4％的NK细胞和33.3％的CIK细胞，表达杀伤标志的细胞占80％以上，所有的NK细胞高表达活化标志CD161；

二、本发明采用高效的细胞因子组合，维持培养时间为14天，同时提高了细胞纯度和有效生物学活性，避免了长时间的体外细胞培养增加污染的机会，同时细胞会趋于衰老，生物学活性降低的缺陷；

三、本发明中应用不同的细胞因子组合，联合肿瘤抗原负载的DC细胞共培养，诱导的DC-NK/CIK细胞具有显著的增殖能力和靶向杀伤肿瘤的能力，尤其针对NK细胞不敏感的肿瘤细胞，其杀伤能力显著提高，扩大了NK细胞临床治疗肿瘤的范围。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是单个核细胞分离图例；

图2是抗原负载前后DC细胞状态；

图3是肿瘤抗原负载后成熟DC细胞流式检测图；

图4是不同培养时间的NK/CIK细胞形态图；

图5是NK/CIK细胞的流式细胞仪表型检测；

图6是NK/CIK细胞的肿瘤杀伤标志检测；

图7是NK/CIK细胞的增殖能力；

图8是NK/CIK细胞的肿瘤细胞杀伤实验图；

图9是NK/CIK细胞体外杀伤肿瘤细胞；

图10是NK/CIK细胞抑制肿瘤体内生长。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，包括以下几个步骤：

一、血液采集及单个核细胞分离

(1)、采集外周血或者脐血50～80mL，收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，迅速摇匀，避免发生凝血；

(2)、将采血袋和生物冰袋一起放入保温箱，保持温度为4～8℃；12小时内运送至实验室；

(3)、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，使稀释的血液与淋巴细胞液的体积比为3:2，注意保持液层分界清晰；

(4)、将离心管在900g、20℃的条件下离心25min，离心完毕后，可观察到离心管中液面分层，结果如图1所示，将单个核细胞层的液体，移入新的离心管中；

(5)、用2倍于单个核细胞层的液体体积的生理盐水稀释单个核细胞层液体，在400g、4℃下离心5min进行洗涤；洗涤两次后去除上清；

(6)、用无血清培养液重悬单个核细胞，调节细胞密度为3×10⁶/mL，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中孵育1小时，分别收集悬浮细胞和贴壁的单核细胞；

二、DC细胞培养

(1)、用含1％质量分数的人血白蛋白的X-VIVO无血清培养液重悬步骤一的(6)中得到的贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃、5％体积分数的CO₂培养箱中培养；

(2)、培养第3天，半量补充新鲜的DC细胞完全培养液培养液和细胞因子GM-CSF和IL-4，并向每mL的细胞培养液中加入100～200μg的肿瘤细胞裂解液，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；

(3)、加入促熟细胞因子组合，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；所述的促熟细胞因子组合为每mL的细胞培养液中加入10～20μg的poly(IC)、5～10μg的LPS、500～1000IU的IFN-γ和10～20ng的TNF-α；

(4)、收集成熟DC细胞；观察细胞形态变化和流式细胞仪检测表型。结果如图2和图3所示。

图2是抗原负载前后DC细胞状态，由图2可见，在肿瘤抗原负载和促熟细胞因子添加前后，DC细胞形态发生明显改变。抗原负载前DC细胞有明显的针状突起，呈放射状。抗原负载后的DC细胞体积稍大，细胞颗粒增多，表面针状突起变为球形突起。

图3是肿瘤抗原负载后成熟DC细胞流式检测图，由图3可见，成熟的DC细胞表面CD11c⁺HLA-DR⁺和CD11c⁺CD86⁺、CD11c⁺CD80⁺的表达量明显增高(>80％)，表现出明显的抗原呈递的特征和能力。

三、NK/CIK细胞培养

(1)、收集步骤一的(6)中得到悬浮细胞，离心后，用NK/CIK细胞完全培养液重悬细胞，调节细胞密度为3～5×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加细胞因子200-500U的IL-2、50-100ng的OKT3和20-50μg的PHA，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中培养3～5天，收集细胞，1500rpm下离心，去除上清，生理盐水洗涤一次；NK/CIK细胞完全培养液为含1～5％质量分数的人AB血清的X-VIVO无血清培养基。

(2)用新鲜的完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加200-500U的细胞因子IL-2和5-20ng的IL-15继续培养；观察细胞形态，图4是不同培养时间的NK/CIK细胞形态图，由图4可见，随着培养时间的延长，细胞形态逐步发生改变。在培养第三天，可见细胞聚集成团，增殖期开始，随后细胞团逐渐散开，细胞形状从圆形变成不规则形状。

(3)、在培养第5天，将得到的NK/CIK细胞和步骤二的(4)中得到DC细胞按照10：1比例进行混合培养；每2-3天添加新鲜培养基，向每mL的细胞液中添加细胞因子200～500U的IL-2和5～20ng的IL-15，维持细胞密度为1～2×10⁶/mL；

(4)、培养第14天，收集细胞，流式细胞仪检测表型以及进行细胞计数，计算增殖能力。

图5是NK/CIK细胞的流式细胞仪表型检测。由图5可以看出，在本发明的细胞培养体系中，包含52.4％的NK细胞(CD3^-CD56⁺)和33.3％的CIK细胞(CD3⁺CD56⁺)。其中NK细胞群中包含69.4％的具有ADCC作用的NK细胞(CD3^-CD56⁺CD16⁺)，其余为具有细胞因子分泌能力的NK细胞(CD3^-CD56⁺CD16^-)，且所有的NK细胞高表达活化标志CD161。

图6是NK/CIK细胞的肿瘤杀伤标志检测。由图6可见，NKG2D⁺细胞占培养体系的81.1％，即所生成的NK/CIK细胞中，80％以上的细胞具有识别杀伤肿瘤细胞的能力，其中48.3％为NK细胞(CD3^-CD56⁺)，32.8％为CIK细胞(CD3⁺CD56⁺)。此外，联合肿瘤抗原负载的DC细胞共培养后的NK/CIK细胞，表达更强的NKG2D信号。

图7是NK/CIK细胞的增殖能力。由图7可见，与单纯的NK/CIK培养相比，联合肿瘤抗原负载DC细胞共培养的NK/CIK细胞具有更强的增殖能力，其扩增能力增加近2倍，由此可以获得大量的肿瘤特异性效应免疫细胞，取得更好的临床疗效。

NK/CIK细胞对肿瘤的体外杀伤性试验

用CCK-8(CellCountingKit-8)试剂测定NK/CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤性。CCK-8试剂中含有WST–8(水溶性四唑盐)，它能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

首先，将收获的NK/CIK或者DC-NK/CIK细胞作为效应细胞，用新鲜培养液重悬，调节细胞浓度为1×10⁶/mL，作为效应细胞；

然后将对数生长期的K562细胞(人白血病细胞，NK细胞敏感)和MCF-7细胞(人乳腺癌细胞，NK细胞抵抗)作为靶细胞，调节细胞浓度为1×10⁵/mL；

在96孔平底培养板中，设置如下:

空白对照孔：培养液200μL。

杀伤试验孔：加效应细胞、靶细胞各100μL。

靶细胞对照孔：加靶细胞、培养液各100μL；

效应细胞对照孔：加效应细胞、培养液各100μL。

各种孔设6个平行孔，96孔平底培养板的周边孔用PBS液填充。

将96孔平底培养板于37℃，5％体积浓度的CO₂培养箱中培养。

(1)当靶细胞为K562细胞，先孵育4小时后，各孔加入cck-8试剂20μL，于震荡器上混匀后置37℃，5％体积浓度的CO₂培养箱中培养中继续培养，于第2h开始测定OD值。

(2)当靶细胞为MCF-7细胞，先孵育8小时后，各孔加入cck-8试剂20μL，于震荡器上混匀后置37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，于第2h开始测定OD值。

OD值的使用用酶标仪在450nm波长处测定。求出各组平行孔的平均值，按下列方法计算效应细胞的细胞毒活性，以杀伤率表示。图8是NK/CIK细胞的肿瘤细胞杀伤实验图。由图8可明显观察到杀伤试验孔中肿瘤细胞聚集成团，并且周围有效应细胞紧密接触，一些肿瘤细胞形态开始扭曲，裂解。

杀伤率＝{1-[(杀伤试验孔OD值—效应细胞对照孔OD值)/(靶细胞对照孔OD值—空白对照孔OD值)]}×100％

图9NK/CIK细胞体外杀伤肿瘤细胞，由图9可以看出，对于K562肿瘤细胞而言，NK/CIK细胞具有很强的杀伤能力，DC-NK/CIK共培养的细胞能够增强这种作用。对于MCF-7肿瘤细胞而言，NK/CIK细胞的作用微弱，杀伤率低；DC-NK/CIK共培养的免疫细胞逆转NK细胞的耐受性，使肿瘤杀伤率达到近70％。

NK/CIK细胞对肿瘤的体内杀伤性试验

第1-4天NK/CIK细胞培养方式如下：

(1)、收集悬浮的单核细胞，离心后，用NK/CIK细胞完全培养液重悬细胞，调节细胞密度为3～5×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加细胞因子200-500U的IL-2、50-100ng的OKT3和20-50μg的PHA，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中培养3～5天，收集细胞，1500rpm下离心，去除上清，生理盐水洗涤一次；NK/CIK细胞完全培养液为含1～5％质量分数的人AB血清的X-VIVO无血清培养基。

(2)用新鲜的完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加200-500U的细胞因子IL-2和5-20ng的IL-15继续培养；观察细胞形态；

第1-3天DC细胞培养方式如下：

(1)、用含1％质量分数的人血白蛋白的X-VIVO无血清培养液重悬步骤一的(6)中得到的贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃、5％体积分数的CO₂培养箱中培养；

(2)、培养第3天，半量补充新鲜的DC细胞完全培养液培养液和细胞因子GM-CSF(50-100ng/mL)和IL-4(15-50ng/ml)，并加入20～50μg的OVA蛋白质抗原，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；

(3)、培养第4天，加入促熟细胞因子组合，poly(IC)(10-20μg/mL)，LPS(5-10μg/mL)，IFN-γ(500-1000IU/mL)，TNF-α(10-20ng/mL)，于37℃,5％体积浓度的CO₂培养箱中孵育16～24小时。

(4)、培养第5天，收集成熟DC细胞，将DC细胞和NK/CIK细胞按照1：10比例进行混合培养。每2-3天添加新鲜培养基，补充细胞因子IL-2(200-500U/ml)和IL-15(5-20ng/ml)，维持细胞密度为1-2×10⁶/mL。

(5)、培养第14天，收集细胞，洗涤，冻存。

选取Nude小鼠作为实验鼠，125cGy铯源射线照射后，腹部皮下接种表达OVA抗原的黑色素瘤细胞，1×10⁶个细胞/只。

观察肿瘤生长状态，待肿瘤大小至100mm³时，开始进行治疗。每周尾静脉注射1-2×10⁷NK/CIK或者DC-NK/CIK细胞，连续治疗3次。观察肿瘤体积变化。

图10是NK/CIK细胞抑制肿瘤体内生长。由图10可明显观察到：

(1)应用NK/CIK细胞治疗后，与未经任何治疗的对照组相比，肿瘤生长受到抑制，有逐渐缩小的趋势。

(2)应用针对OVA肿瘤抗原的DC-NK/CIK细胞治疗后，肿瘤体积明显缩小，与NK/CIK细胞治疗组相比，有消失的趋势。说明DC-NK/CIK细胞可诱导靶向性更强的抗肿瘤免疫反应。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

一、血液采集及单个核细胞分离

(1)、采集外周血或者脐血50～80mL，收集在含肝素钠抗凝剂的采血袋中，迅速摇匀，避免发生凝血；

(2)、将采血袋和生物冰袋一起放入保温箱，保持温度为4～8℃；12小时内运送至实验室；

(3)、将血液以等体积生理盐水稀释混匀，缓慢叠加于离心管中的淋巴细胞分离液之上，使稀释的血液与淋巴细胞液的体积比为3:2，注意保持液层分界清晰；

(4)、将离心管在900g、20℃的条件下离心25min，离心完毕后，可观察到离心管中液面分层，将单个核细胞层的液体，移入新的离心管中；

(5)、用2倍于单个核细胞层的液体体积的生理盐水稀释单个核细胞层液体，在400g、4℃下离心5min进行洗涤；洗涤两次后去除上清；

(6)、用无血清培养液重悬单个核细胞，调节细胞密度为3×10⁶/mL，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中孵育1小时，分别收集悬浮细胞和贴壁的单核细胞；

二、DC细胞培养

(1)、用DC细胞完全培养液重悬步骤一的(6)中得到的贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，并加入终浓度为50～100ng/mL的细胞因子GM-CSF和15～50ng/ml的细胞因子IL-4，于37℃、5％体积分数的CO₂培养箱中培养；

(2)、培养第3天，半量补充新鲜的DC细胞完全培养液培养液和细胞因子GM-CSF和IL-4，并向每mL的细胞培养液中加入100～200μg的肿瘤细胞裂解液，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；

(3)、加入促熟细胞因子组合，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中继续孵育16～24小时；

(4)、收集成熟DC细胞；

三、NK/CIK细胞培养

(1)、收集步骤一的(6)中得到悬浮细胞，离心后，用NK/CIK细胞完全培养液重悬细胞，调节细胞密度为3～5×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加细胞因子200-500U的IL-2、50-100ng的OKT3和20-50μg的PHA，于37℃、5％体积浓度的CO₂培养箱中培养3～5天，收集细胞，1500rpm下离心，去除上清，生理盐水洗涤一次；

(2)用新鲜的完全培养液重悬细胞，调整细胞密度为1～2×10⁶/mL，向每mL的细胞中添加200-500U的细胞因子IL-2和5-20ng的IL-15继续培养；

(3)、在培养第5天，将得到的NK/CIK细胞和步骤二的(4)中得到DC细胞和按照10：1比例进行混合培养；每2-3天添加新鲜培养基，向每mL的细胞液中添加细胞因子200～500U的IL-2和5～20ng的IL-15，维持细胞密度为1～2×10⁶/mL；

(4)、培养第14天，收集细胞，流式细胞仪检测表型以及进行细胞计数，计算增殖能力。

2.如权利要求1所述的一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤二的(1)中的DC细胞完全培养为含1％质量分数的人血白蛋白的X-VIVO无血清培养液。

3.如权利要求1所述的一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤三(1)中的NK/CIK细胞完全培养液为含1～5％质量分数的人AB血清的X-VIVO无血清培养基。

4.如权利要求1所述的一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤NK/CIK细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤二的(3)中所述的促熟细胞因子组合为每mL的细胞培养液中加入10～20μg的poly(IC)、5～10μg的LPS、500～1000IU的IFN-γ和10～20ng的TNF-α。