CN103396991A - 一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法。其主要用于在短时间内高效快速扩增肿瘤浸润性淋巴细胞TIL(Tumor Infiltrating Lymphocytes)且基本不影响TIL表型发生变化。所述方法包括：肿瘤组织处理、培养液使用、IL-2和OKT3剂量及培养处理。肝癌标本从不同区域取下1-2mm³的组织于24孔板各孔，将孔板置于培养箱培养，隔天观察，培养5、6天对所有孔板培养液进行半量换液，根据TIL生长状况，每隔1-2天对孔板培养液进行半量换液，一旦24孔板内长满TIL，收集各孔内TIL，培养其成为年轻型TIL。然后对其进行体外快速扩增，扩增倍数够达4000倍以上。

Description

一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法，更具体地说，它涉及一种过继免疫治疗中细胞培养方法，

背景技术

肿瘤是目前威胁人类健康的重大疾病之一。目前，恶性肿瘤是全球第二大致命疾病，也是中国城乡居民第一位死亡原因，中国每年新发肿瘤患者总数约200万，新增肿瘤患者年增长率在10％左右。虽然手术、放化疗仍是肿瘤的主要治疗方法，但是，即使根治性手术也只能解决局部问题，不能避免全身转移。放、化疗存在的最大问题是其杀伤作用没有针对性，长期的化疗、放疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能，甚至诱发新的癌变。更为重要的是由于肿瘤细胞缺乏特异性的抗原、肿瘤细胞的抗原调变及MHC分子表达异常等因素导致肿瘤免疫逃逸，成为肿瘤治疗的一大难题。

由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多的目光投到肿瘤的生物治疗上。肿瘤生物治疗是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。生物治疗对放、化疗不敏感及无法耐受放、化疗的老年患者来说是一大福音，可以明显提高患者的生活质量。延长患者的生存期，受到越来越多的重视，肿瘤生物治疗必定成为21世纪振奋人心的焦点。

肝癌是一种恶性程度高、预后差的恶性肿瘤。目前许多治疗手段并不能从根本上改善肝癌患者的预后。免疫生物治疗为肝癌的治疗提供了一种新型的治疗方案。

自体免疫细胞治疗是生物治疗中过继性细胞治疗的一类，是将自体的免疫活性细胞经体外扩增后重新输入患者体内，以达到直接杀伤肿瘤细胞的作用，且能够调节和增强机体的免疫功能，解除机体免疫抑制，增强患者的免疫功能，降低复发率和转移率，延长肿瘤患者的生存期并提高其生活质量。包括自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)等。

肿瘤浸润性淋巴细胞是脱离血流后迁移至肿瘤组织的白细胞，主要由T细胞、B细胞和NK细胞组成。肿瘤浸润性淋巴细胞对和黑色素瘤患者进行过继细胞治疗取得了很好的效果。肿瘤浸润性淋巴细胞是从肿瘤组织中分离出的CD4⁺、CD8⁺T细胞群，在体外经白介素2的刺激、活化、扩增后可应用于临床肿瘤过继细胞治疗。为避免白介素2在扩增中的大量使用使得肿瘤浸润性淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺Treg数量增加所产生的免疫耐受现象、现在研究集中于改进肿瘤浸润性淋巴细胞的体外扩增方法；研究显示，“年轻型”TIL靶向肿瘤的特异性更高，故其是潜在的扩增对象。TIL的抗肿瘤机制主要包括以下三种途径：(1)TIL中的T细胞在TCR和CD28提供的双刺激信号下转变为效应T细胞，直接杀伤肿瘤细胞或者分泌干扰素等因子杀伤肿瘤细胞；(2)T细胞通过其表面的Fas与肿瘤细胞表面的FasL结合，通过细胞内信号转导诱导靶细胞凋亡；(3)在Ca²⁺存在下，靶细胞表面可形成多聚穿孔素“孔道”，通过渗透压改变或与颗粒酶协同作用，引发靶细胞溶解或凋亡。体外培养的TIL细胞主要分为两类，“年轻型”TIL和“标准型”TIL，其中“年轻型”TIL是指经24孔板独立传代培养获得的TIL，其制备时间短，不需要进行抗原特异性检测，且对肿瘤细胞具有高效靶向性；“标准型”TIL是指常规方法得到的、从肿瘤组织中分离的“标准”TIL，其制备时间长，需要进行抗原特异性检测。近期研究集中于扩增更多的“年轻型”TIL用于肿瘤治疗。同时研究发现，使用正常人PBMC作为饲养细胞与TIL共同培养扩增TIL，可将其扩增至10¹¹数量级，且饲养细胞与TIL的比值为50时，扩增效果最佳。使用这种方法能够快速高效扩增TIL，能够为解决TIL扩增的问题提供新的技术方法。

TIL的分离技术主要有组织块培养、胶原酶消化、用Medimachine进行机械解离、细针抽吸这4种方法可用于TIL分离，前两种方法是比较常用的。组织块培养法操作比较简单，只需将切除的肿瘤组织切成大小约为1mm³的小块，在24孔板内进行培养即可。胶原酶消化法步骤相对繁琐，除了消化外，通常还需进行Ficoll密度梯度离心将TIL与癌细胞、红细胞等分开，耗时长，成本高，对肿瘤组织大小也有一定要求。TIL使用的是以RPMI1640为主的完全培养基，需加入6000或3000IU/ml IL-2，有研究显示新分离获得的TIL产生IFN-γ的水平及其NK活性都很低，非常显著的低于经IL-2体外培养的TIL。从手术切除的肿瘤组织中新分离得到的TIL，其免疫功能处于抑制状态，这种状态可以通过加入IL-2解除。细胞毒性T淋巴细胞是TIL杀伤肿瘤细胞的主要执行者，在多种临床癌症中，CD8⁺T细胞大量浸润的往往预后良好。

肿瘤细胞通常缺失或下调HLA或Fas的表达，从而逃脱免疫系统的攻击。研究发现，肿瘤组织中TGF-β和IL-10等的含量通常比正常组织中高，同时IL-10通过上调TGF-β的表达限制TIL的免疫功能。IL-10下调与肿瘤细胞直接接触的T细胞表达IFN-γ；同时肿瘤细胞还可分泌促进T细胞凋亡的细胞因子。除肿瘤细胞的影响外，TIL自身存在某些缺陷，如TIL中存在大量CD4⁺CD25⁺Treg，可抑制T细胞增殖所需IL-2、IFN-γ等因子，其表面的CTLA-4可与APC表面的CD28-B7分子家族中的B7分子结合，阻断共刺激信号，抑制免疫反应；与此同时，肿瘤细胞本身也会表达CD28-B7分子家族中类似功能作用的分子，通过与T细胞表面的程序死亡配体PD-1结合，诱导T细胞凋亡。

提高TIL杀伤功能的方法有两种，一为转基因，二为遗传修士TCR。研究发现，克隆抗原特异性TCR基因，通过病毒转染使其在TIL表面高表达，可有效提高其识别和杀伤肿瘤细胞的能力。如将IFN-α基因转入TIL治疗黑色素瘤。或者通过遗传修饰TCR，将T细胞表面TCR改造成CAR。CAR上包括肿瘤抗原识别信号，抗原呈递细胞介导的共刺激信号以及T细胞增殖信号，这种CAR不仅能够高效靶向肿瘤细胞，还可以使其自身不断增殖，现在很多研究者使用病毒载体携带识别肿瘤抗原的TCR基因，如MARTl、NY-ESO-1等，或用抗体Fc段基因改造的CAR转染TIL，使其表达抗原特异性的TCR，高效特异性杀伤肿瘤细胞。CAR现在已有三代，第一代CAR并不能延长T细胞的生存时间；第二代CAR增加了共刺激信号如CD28，以刺激T细胞增殖，第三代CAR加入了更多共刺激信号，如4-1BB、OX40等。

研究发现，使用TIL过继治疗转移性黑色素瘤患者出现肿瘤消退现象。Tran等发现，将体外扩增的TIL回输至转移性黑色素瘤患者体内可产生51％的客观反应，而使用IL-2和达卡巴嗪治疗仅获得12％和15％的客观反应。研究发现，黑素瘤的TIL过继治疗的总体客观反应率达56％。Goff等研究发现，对恶性黑素瘤患者进行TIL治疗取得49％-72％的客观疗效。另一研究发现，对肝癌等其他肿瘤进行TIL过继细胞治疗效果并不明显，肝癌中肿瘤浸润CD8+T细胞表达PD-1，导致肝癌患者的预后差，并且PD-1表达与Foxp3+Treg浸润相关，高密度的Foxp3+Treg细胞是肝切除术后预后不良的指标。肿瘤组织中高表达的免疫抑制因子IL-10和TGF-β可作用于Treg的CTLA-4途径，产生免疫抑制。TIL过继治疗肿瘤存在一定的局限，应积极寻找方法以突破这一局限，使TIL更广泛地有效地应用于临床。

未来，TIL过继治疗与手术、放化疗等传统治疗方法联合，将成为肿瘤治疗的发展趋势，与此同时也要兼顾研发更有效的药物与之联合应用，如肿瘤疫苗、单克隆抗体等。FDA批准的第一个免疫细胞相关肿瘤疫苗Provenge的上市，其在前列腺癌治疗中获得了显著成效。TIL过继细胞治疗联合肿瘤疫苗治疗将成为新型的治疗方案，抗CD25、CTLA-4抗体和抗TNF-α受体的单克隆抗体可靶向清除Treg，解除免疫抑制作用。其中Ipilimumab是一种靶向CTLA-4的单克隆抗体，可解除Treg的免疫抑制作用，现已进入III期临床试验阶段。寻找更多的用于肿瘤免疫治疗的分子靶标，开发更多具有增强免疫作用的单克隆抗体对肿瘤免疫治疗具有重大意义，目前候选的分子靶标包括PD-1、4-1BB、X40和LAG-3。

肿瘤的TIL免疫治疗在一些恶性肿瘤中取得了显著成效，因其靶向性高、特异性强、毒性作用小、疗效显著等优势已成为一种有效的新型免疫治疗方法。同时，TIL免疫治疗与放化疗在肿瘤治疗中起到协同作用。另外，化疗除了用于晚期转移性肿瘤患者的治疗，也可治疗早期诊断的肿瘤患者。在临床应用过程中，应根据患者的具体情况来制定治疗方案。随着一些关键技术的突破，免疫治疗必将成为肿瘤治疗的重要组成部分。

发明内容

1.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可以有效刺激或扩增肝癌患者肿瘤组织中肿瘤浸润性淋巴细胞的方法，从而快速高效培养出临床治疗所需数量级的TIL。

2.本发明的目的通过以下技术方案实现。

3.除非另有说明，本发明所采用的百分数为体积百分数。

4.一种快速高效扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方案，包括以下步骤：“年轻型”TIL的获得

所述的“年轻型”TIL的获得是指肝癌原代标本经处理培养后从组织游离出来

(1)切除的肝癌标本在无菌条件下进行去除正常组织和去除坏死区域的处理，本专利所指标本来自肝癌患者手术切除后所得；

(2)按照步骤(1)的要求，从肝癌标本的不同区域取下大小为1-2mm³的小组织块，24孔板的每一孔放置一块。每孔加2ml含10％FBS的GT-T551完全培养基和3000IU/ml IL-2；

(3)在步骤(2)的基础上，将24孔板置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养；

(4)步骤(3)完成后，每隔一天进行观察，不论是否观察到有肿瘤浸润性淋巴细胞生长，从培养开始后的第5-6天后，对所有孔内培养基进行半量的换液；

(5)在步骤(4)根据肿瘤浸润性淋巴细胞的生长状况，每隔1-3天进行一次半量的换液；

(6)若孔板内长满了肿瘤浸润性淋巴细胞，并且所有的贴壁细胞已经去除，将各个长满孔的肿瘤浸润性淋巴细胞收集起来；

“年轻型”TIL的扩增

所述的“年轻型”TIL的扩增是指将“年轻型”TIL经转袋后培养后所得

(7)扩增的第0天，取1×106个TIL重悬浮于150ml含10％FBS的GT-T551完全培养基、30ng/mlOKT3抗体、经过辐照的feeder，这些feeder来源于3个不同健康人的外周血单核细胞PBMC，按照步骤(1)的要求本实验方案的培养基是完全培养基；

(8)本方案要求feeder与肿瘤浸润性淋巴细TIL的个数比为50-200∶1，T175培养瓶中培养液中IL-2的浓度为3000IU/ml，将培养瓶竖直起来培养细胞；

(9)细胞培养到第5天，将瓶内65％培养液更换为新的完全培养液，并且保持IL-2的浓度为3000IU/ml；

(10)培养到第7天，将2个T175培养瓶内的细胞悬液转移至细胞培养袋内，加300ml的完全培养基和3000IU/ml的IL-2；

(11)从转入袋子中培养那天起，每隔一天进行一次台盼蓝染色计数，通过调节完全培养基的体积控制袋子内的细胞密度为0.5×10⁶-2×10⁶/ml，并且始终保持IL-2的浓度为3000IU/ml；

(12)扩增后14天收集细胞，计数，并且对扩增后的TIL进行细胞表型检测；

附图说明

图1为从不同肝癌患者样本分离TIL的扩增数量

图2为IL-2的用量对TIL扩增数量的影响

图3为feeder：TIL比值对TIL扩增的影响

图4为不同IL-2、feeder：TIL比值对扩增后TIL的表型的影响

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并非是对本发明的限定。

实施例1

患者，女，33岁，肝脏肿瘤组织用生理盐水充分清洗，去除肝癌标本周围的正常组织和坏死区域。如需过夜再处理，则要将肝癌标本转至约含10ml完全培养基的50ml离心管中，于4℃存放。将肝癌标本放在无菌玻璃培养皿(Petri dish)中，加入少量生理盐水，用手术剪从标本四周的不同区域剪下大小约为1-2mm³的小组织块，数目一般不少于8块。取剪下的1小块肝癌组织置于24孔板的一个孔内，每孔含有2ml完全培养基和6000(或3000)IU/ml的IL-2，其他孔用相同方法操作。将24孔板放于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。每隔一天通过显微镜观察各个孔中组织块周围淋巴细胞的增殖情况。不论是否观察到有TIL生长，培养起始后的第5-6天给所有孔进行半量换液，即先小心吸掉孔内1ml上层液体，尽量避免吸走组织块，之后加入1ml含IL-2的完全培养基。第一次换液后，根据TIL生长情况，每隔1-2天进行一次半量换液，方法如前。在这种培养条件下，TIL通常会先裂解孔内的贴壁细胞，然后开始增殖和生长。培养约1-2周后，通常会观察到组织块周围会有致密的毯状淋巴细胞层形成。一旦孔内TIL长满(所有贴壁细胞已除去)，就将各个细胞长满孔收集起来。可以等分冻存(冻存液为90％FBS+10％DMSO)，最好将密度控制在2×10⁶-5×10⁷/ml之间，也可以调整细胞密度至0.7-1.5×10⁶/ml在完全培养基(含IL-2)中继续培养，直至达到实验或治疗所需的细胞数。将3个健康人的白细胞分别与生理盐水按1∶1的比例混匀。将白细胞与生理盐水混匀液按4∶3的比例缓慢加入含Ficoll的50ml离心管，避免破坏界面。2000rpm离心20min，用巴斯德管小心吸去上层液体，避免破坏梯度界面。吸取单个核细胞层至含20ml生理盐水的新50ml离心管。1500rpm离心8min，弃上清，20ml生理盐水重悬。1200rpm离心6min，弃上清，用无血清GT-T551培养液重悬。可将分离得到的单个核细胞收集在一起立即冻存，快速扩增前进行照射(40-50Gy)；也可合并后直接照射，用于TIL REP或冻存以备后用。扩增起始的当天(第0天)，1×10⁶个TIL重悬于含150ml完全培养基、30ng/ml OKT3、不小于200∶1(饲养细胞：TIL)的照射过的同种异基因的PBMCs和6000(或3000)IU/ml IL-2的T175培养瓶中。将培养瓶竖直放于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。培养至第5天，瓶内65％液体换为新的完全培养基和IL-2。培养至第7天，2个T175培养瓶内的细胞悬液转移至细胞培养袋内，加入300ml完全培养基和IL-2。从第6天开始，每隔1天进行一次台盼蓝染色计数，通过加入新的完全培养基和IL-2控制培养袋内细胞密度在0.5-2×106/ml之间。在扩增的第14天，将细胞收集起来，用于实验，也可检测后用于病人输注。

实施例2

患者，男，72岁，TIL培养方法与上述方法一致。

实施例3

患者，男，71岁，TIL培养方法与上述方法一致。

Claims (1)

1.一种高效快速扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法，由组织块、培养液、OKT3、feeder、IL-2、培养时间与处理方法组成。其特征包括：

所述的肿瘤浸润性淋巴细胞来源于肝癌原代标本；

所述的方法是一种细胞培养方法，包括培养液的使用，OKT3、

IL-2的剂量，feeder/TIL的比值，培养时间与处理手段

所述的方法从实验室操作的具体流程是：

(1)所述的TIL来自于肝癌组织经培养处理后浸润于培养液中；

(2)所述的feeder是来自三个不同健康成年人的外周血单核细胞PBMC经过辐射照射处理而来；

(3)所述的培养时间与处理手段主要包括“年轻型”TIL的获得与“年轻型”TIL的扩增；

(4)所述的“年轻型”TIL的获得是指肝癌原代标本经处理培养后从组织游离出来；

(5)所述的“年轻型”TIL的扩增是指将“年轻型”TIL经转袋后培养后所得；

所述的高效快速扩增肿瘤浸润性淋巴细胞的方法的具体流程包括：

(1)所述的肝癌标本经组织块破碎法放置于24孔板中培养以获得游离的肿瘤浸润性淋巴细胞；

(2)所述的“年轻型”TIL是将游离的肿瘤浸润性淋巴细胞收集所得；

(3)所述的“年轻型”TIL的扩增是指将“年轻型”TIL转袋培养获得并经流式细胞术检测细胞表面分子标记后所得。

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