CN109609451A - 体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法 - Google Patents

体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法。该方法包括：(1)将肾癌组织接种于第一细胞培养器皿中，使肿瘤浸润淋巴细胞在第一培养条件下从所述肾癌组织中释放；(2)将释放的肿瘤浸润淋巴细胞在第二培养条件下进行缓慢扩增培养；(3)将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞接种于第二细胞培养器皿中，并在第三培养条件下进行快速扩增培养，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞，其中，在步骤(3)中，所述缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于第二培养器皿底面积的接种密度为1.5～3*104/cm2。该方法实现了肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的快速释放和扩增，能够在短时间内获得足够数量的、可供临床应用的、具有显著肾癌肿瘤细胞杀伤力的肿瘤浸润淋巴细胞。

Description

体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法。
背景技术
肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，学术名词全称为肾细胞癌，又称肾腺癌，简称为肾癌。目前对局限性或局部进展性(早期或中期)肾癌患者采用以外科手术为主的治疗方式，对转移性肾癌(晚期)应采用以内科为主的综合治疗方式。但肾癌的生存率极低，Ⅳ期肾癌患者治疗后5年生存率仅为23％。
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)表型具有异质性。一般来说，TIL中绝大多数细胞CD3阳性。不同肿瘤来源的TIL细胞中，CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例有差异。大多数情况下以CD8+T细胞为主。新鲜分离的TIL中CD25+细胞百分率较低，随着体外加IL-2培养时间的延长，CD25+细胞百分率逐渐升高。NK细胞的标记(CD16，CD56)在TIL体外加IL-2培养过程中有先增高后降低的趋势。
TIL杀伤肿瘤作用具有特异性，同时副作用低。
因此，开发有效地体外扩增肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，以获得可供临床治疗应用的肿瘤浸润淋巴细胞，对肾癌的治疗具有重要意义。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
现有的分离和扩增肾癌肿瘤浸润的淋巴细胞的方法，存在细胞扩增速度慢，获得的淋巴细胞数量少的缺点，很难满足临床治疗时间紧迫以及所需数量巨大的要求。本申请的发明人在科研工作中，惊喜地发现了一种新的体外扩增肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，该方法可以实现肾癌肿瘤浸润淋巴细胞体外的迅速扩增，5天后就可以观察到肿瘤浸润的淋巴细胞从肾癌中释放出来，培养两周，一个肾癌肿瘤小块释放出的TILs至少可达到3x106，快速增长期2周可以迅速扩增至少1000倍，扩增的TILs分泌高水平的肿瘤细胞杀伤因子。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将肾癌组织接种于第一细胞培养器皿中，使肿瘤浸润淋巴细胞在第一培养条件下从所述肾癌组织中释放；(2)将释放的肿瘤浸润淋巴细胞在第二培养条件下进行缓慢扩增培养；(3)将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞接种于第二细胞培养器皿中，并在第三培养条件下进行快速扩增培养，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞，其中，在步骤(3)中，所述缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于第二细胞培养器皿底面积的接种密度为1.5～3*104/cm2。根据本发明实施例的方法实现了肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的快速释放和扩增，能够在短时间内获得足够数量的、可供临床应用的、具有显著肾癌肿瘤细胞杀伤力的肿瘤浸润淋巴细胞。同时，发明人发现，根据本发明实施例的方法特异性地适用于肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增，而并不适用于其他实体癌的肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增，因此，根据本发明实施例的方法是一种针对肾癌肿瘤浸润淋巴细胞体外迅速扩增的方法，对肾癌的及时、有效治疗具有重要意义。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，在步骤(3)中，所述缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于第二细胞培养器皿底面积的接种密度为1.5*104/cm2。发明人发现，缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞在上述接种密度下，肾癌肿瘤浸润淋巴细胞扩增速度进一步提高。
根据本发明的具体实施例，所述第二细胞培养器皿为孔板。
根据本发明的实施例，所述肾癌组织的体积相对于第一细胞培养器皿底面积的接种密度为0.5-1.5mm3/cm2。发明人发现，肾癌组织相对于第一细胞培养器皿的接种密度在上述范围内，可进一步提高肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的释放和扩增速度。
根据本发明的实施例，所述第一细胞培养器皿为24孔板，相对于24孔板，所述肾癌组织的接种大小为1～3mm3。根据本发明的实施例，手术切除后得到的肾癌肿瘤组织(医院运输到实验室的过程中4℃保存)，要小心仔细地去除组织中的坏死、血液部分，进而选取不同区域，剪成1-3mm3的肿瘤组织小块，进而接种到24孔板。发明人发现，现对于现有技术，将大小为1～3mm3肾癌组织小块接种到24孔板，肿瘤浸润淋巴细胞从肾癌组织中的释放地更加快速，大概5天即可观察到肿瘤浸润淋巴细胞的释放，大概两周一个肿瘤小块释放的肿瘤浸润淋巴细胞的数量即可达到至少3x106。
根据本发明的实施例，所述第一培养条件包括:含有6000U/mL rhIL-2的AIM-V培养基或者RPMI-1640培养基。根据本发明的具体实施例，所述AIM-V培养基包括10％的人AB血清和1％的青霉素-链霉素；所述RPMI-1640培养基包括2.5％的Hepes、1％的青霉素-链霉素、1％的L-Glutamine、1％的非必需氨基酸、1％的丙酮酸钠以及10％的人AB血清。其中，上述培养基中的百分含量表示体积体积比，即体积百分数。发明人发现，所述肿瘤组织小块在AIM-V培养基或者RPMI-1640培养基中培养，肿瘤浸润淋巴细胞的释放和扩增速度显著提高，选择RPMI-1640培养基中进行培养，可在不影响肿瘤浸润淋巴细胞释放和扩增速度的前提下，大大减少培养成本。
根据本发明的实施例，所述第二培养条件包括含有6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基。发明人发现，AIM-V培养基中含有6000U/mL rhIL-2，可显著提高释放出的肿瘤浸润淋巴细胞的扩增速度，而hIL-2联合rhIL-15或rhIL-2联合rhIL-21相较于单独使用rhIL-2，其扩增速度的提高效果反而降低。
根据本发明的实施例，所述缓慢扩增培养包括：当肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度达到1x106/mL时，将肿瘤浸润淋巴细胞进行传代处理，以便使肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度为5x105/mL的初始密度下进行继续缓慢扩增培养。进而，可保证肿瘤浸润淋巴细胞在孔板中密度不至于过大而影响肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增，当密度达到1x106/mL时，将肿瘤浸润淋巴细胞进行传代处理，将生长在一个孔中的肿瘤浸润淋巴细胞转移到两个孔中进行继续培养，使其在5x105/mL的初始密度下进行继续缓慢扩增培养，可稳定肿瘤浸润淋巴细胞的扩增速度，保持肿瘤浸润淋巴细胞良好的细胞状态。
根据本发明的实施例，第三培养条件包括：含有30ng/mL OKT3(Anti-CD3单抗，可用于激活T细胞)的所述AIM-V培养基和含有30ng/mL OKT3以及6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基。缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞在上述第三培养条件下进行进一步的快速扩增培养，可在两周内迅速扩增至少1000倍，同时分泌高水平的肿瘤细胞杀伤因子。发明人发现，AIM-V培养基中加入6000U/mL rhIL-2，可显著提高肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增速度，而hIL-2联合rhIL-15或rhIL-2联合rhIL-21相较于单独使用rhIL-2，其扩增速度的提高效果反而降低。
根据本发明的实施例，步骤(3)包括：将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞与辐射过的PBMC(作为饲养细胞)以1：200的细胞比例进行混合接种；将混合接种后的细胞在含有30ng/mL OKT3的所述AIM-V培养基中培养一天；将培养一天后的混合细胞在含有30ng/mLOKT3以及6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基中进行继续快速扩增培养，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞。
根据本发明的实施例，缓慢扩增培养后，快速扩增培养前，所述肿瘤浸润淋巴细胞的个数至少达到3x106。发明人发现，采用根据本发明实施例的上述培养方法，一个肿瘤组织小块中的释放和扩增的肾癌肿瘤浸润淋巴细胞在两周内即可达到3x106，进而，在将所述肿瘤浸润淋巴细胞进行快速扩增培养前，将释放和缓慢扩增期获得的肿瘤浸润淋巴细胞进行收集，并重新接种到新的孔板中进行快速扩增培养，可实现肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的进一步快速扩增。
根据本发明的实施例，所述快速扩增培养中，肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度控制在2-4x106/mL的范围内。进而，可保证肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的快速扩增以及良好的细胞状态。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将肾癌组织接种于孔板中，使肿瘤浸润淋巴细胞在含有6000U/mL rhIL-2的AIM-V培养基或者RPMI-1640培养基中从所述肾癌组织中释放，所述肾癌组织的体积相对于孔板底面积的接种密度为0.5-1.5mm3/cm2；(2)将释放的肿瘤浸润淋巴细胞在含有6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基中进行缓慢扩增培养，缓慢扩增培养后，所述肿瘤浸润淋巴细胞的个数至少达到3x106，其中，缓慢扩增培养过程包括：当肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度达到1x106/mL时，将肿瘤浸润淋巴细胞进行传代处理，以便使肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度为5x105/mL的初始密度下进行继续缓慢扩增培养；(3)将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞与辐射过的PBMC以1：200的细胞比例进行混合接种，缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于孔板底面积的接种密度为1.5～3*104/cm2；将混合接种后的细胞在含有30ng/mL OKT3的所述AIM-V培养基中培养一天；将培养一天后的混合细胞在含有30ng/mL OKT3以及6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基中进行继续快速扩增培养，肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度控制在2-4x106/mL的范围内，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞，其中，所述AIM-V培养基包括10％的人AB血清和1％的青霉素-链霉素；所述RPMI-1640培养基包括2.5％的Hepes、1％的青霉素-链霉素、1％的L-Glutamine、1％的非必需氨基酸、1％的丙酮酸钠以及10％的人AB血清。根据本发明实施例的体外扩增肾癌肿瘤浸润淋巴细胞的方法，可特异性地实现肾癌肿瘤浸润淋巴细胞体外的迅速扩增，5天后就可以观察到肿瘤浸润的淋巴细胞从肾癌中释放出来，培养两周，一个肾癌肿瘤小块释放出的TILs至少可达到3x106，快速增长期2周即可以迅速扩增至少1000倍，并且扩增的TILs分泌高水平的肿瘤细胞杀伤因子。为临床治疗肾癌提供了及时、有效的肿瘤浸润淋巴细胞，对日后临床治疗肾癌具有重要意义。
附图说明
图1是根据本发明实施例的不同肿瘤小块释放和体外扩增的TILs的数量随时间变化的曲线；
图2是根据本发明实施例的不同肿瘤小块所释放的肿瘤浸润淋巴细胞体外扩增随时间变化的曲线；
图3是根据本发明实施例的肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增培养中CD8+T细胞的比例；
图4是根据本发明实施例的肿瘤浸润淋巴细胞的表达的细胞杀伤因子；
图5是根据本发明实施例的rhIL-2联合rhIL-15，rhIL-2联合rhIL-21或rhIL-2对肾癌中TILs的扩增效率的影响的结果；以及
图6是根据本发明实施例的扩增获得肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
在本实施例中，发明人详细描述了体外迅速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法。首先，根据肿瘤浸润淋巴细胞的扩增速度，发明人人为地将肿瘤浸润淋巴细胞的扩增过程分为三个阶段：慢速释放期、缓慢扩增期和快速扩增期，下面将对这三个时期进行详细描述。
慢速释放期
1)手术切除后得到的肿瘤组织(医院运输到实验室的过程中4℃保存)，小心仔细的去除组织中的坏死、血液部分，选取不同区域，剪成1-3mm3的小块。
2)另消化部分组织进行肿瘤自身的肿瘤细胞培养。
3)准备24孔板，每孔加入2ml的包含6000U/ml rhIL-2的完全培养基,将选取并剪好的肿瘤小块放入孔中，每孔只放一个，放置24小块。在孔板上标记好患者姓名及处理日期。
3)标记好的24孔板放入37℃，5％的二氧化碳培养箱中，放置5天。
4)5天后开始观察到肿瘤浸润的淋巴细胞(tomor infiltrated lymphocytes，TILs)以及其他类型细胞从肿瘤小块中释放出来。
其中，完全培养为AIM-V培养基或者RPMI-1640培养基，所述AIM-V培养基包括10％的人AB血清(Gemini bio products，50-753-3010)和1％的青霉素-链霉素(corning-cellgro,30-002-CI)，所述RPMI-1640培养基包括2.5％的Hepes(solarbio,H1095-100)、1％的青霉素-链霉素(corning-cellgro,30-002-CI)、1％的L-Glutamine(Invitrogen,2.5030081E7)、1％的非必需氨基酸(Invitrogen,11140050)、1％的丙酮酸钠(invitrogen,11360070)以及10％的人AB血清(Gemini bio products,50-753-3010)。
缓慢扩增期
1)换半液：小心吸取孔中的1ml培养基并弃掉，尽量不去碰触底部的细胞，并小心加入包含6000U/ml rhIL-2的完全培养基。
2)每隔2天，显微镜下观察TILs的生长情况并换半液，每例患者选其中一个长势良好的肿瘤小块进行细胞计数，当培养的细胞数目达到1x106/mL，1：2分到两个孔中。每个肿瘤小块在培养过程中不能混淆到一起。
3)培养的第14天，当一个肿瘤小块释放出的TILs至少达到3x106时，收集所有的细胞并计数。
其中，不同肿瘤小块释放和体外扩增的TILs的数量随时间变化的曲线见图1。结果显示，TILs的释放和缓慢扩增期缩短(1个肿瘤小块2周内能得到至少3x106)。
快速扩增期
1)获取得到健康人的PBMC(至少三例健康人)，每1x106TILs需要200x106的经过50Gy辐照过的PBMC，混匀后接种到6孔板中，加入30ng/ml OKT3，放置到培养箱进行培养(每孔接种的细胞为1.5*105TILs+3*107irradiated PBMC(外周血单核细胞，采用γ射线辐射的量为50Gy))。
2)隔天加入6000U/ml rhIL-2，并设置rhIL-2+rhIL-15(100u/ml),rhIL-2+rhIL-21(100ng/ml)的分组，比较hIL-2单独使用的扩增效率。结果如图5所示，结果显示，rhIL-2联合rhIL-15，rhIL-2联合rhIL-21不能提高肾癌中TILs的扩增效率。
3)每隔三天进行换液，并转移到大的培养瓶，保持细胞浓度在2-4x106/ml，两周后收集细胞并计数。
其中，不同肿瘤小块所释放的肿瘤浸润淋巴细胞体外扩增随时间变化的曲线如图2所示。结果显示，TILs快速增长期在两周内能够扩增1000倍以上。
同时，发明人检测了不同肿瘤小块所释放的肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+T细胞的比例以及表达细胞杀伤因子水平，结果如图3和图4所示。结果显示，肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增培养中，CD8+T细胞的比例在缓慢扩增期不断增高，在快速扩增期处于稳定高水平，表达的细胞杀伤因子在缓慢扩增期不断增高，在快速扩增期处于稳定高水平。
实施例2
发明人收集实施例1获得的肿瘤浸润淋巴细胞，分别与自体肿瘤细胞或肿瘤细胞系(786-0)进行混合培养，效应细胞与靶细胞的比例分别设置为1:3、1:1、3:1以及10:1。检测实施例1获得的肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，结果如图6所示，结果显示扩增的TILs具有高效杀伤能力，对自身的肿瘤细胞和肿瘤细胞系杀伤性无显著差异。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，
(1)将肾癌组织接种于第一细胞培养器皿中，使肿瘤浸润淋巴细胞在第一培养条件下从所述肾癌组织中释放；
(2)将释放的肿瘤浸润淋巴细胞在第二培养条件下进行缓慢扩增培养；
(3)将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞接种于第二细胞培养器皿中，并在第三培养条件下进行快速扩增培养，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞，
其中，在步骤(3)中，所述缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于第二细胞培养器皿底面积的接种密度为1.5～3*104/cm2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于第二细胞培养器皿底面积的接种密度为1.5*104/cm2；
优选地，所述第二细胞培养器皿为孔板；
任选地，所述肾癌组织的体积相对于第一细胞培养器皿底面积的接种密度为0.5-1.5mm3/cm2；
优选地，所述第一细胞培养器皿为24孔板，相对于24孔板，所述肾癌组织的接种大小为1～3mm3。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一培养条件包括:含有6000U/mLrhIL-2的AIM-V培养基或者RPMI-1640培养基；
任选地，所述AIM-V培养基包括10％的人AB血清和1％的青霉素-链霉素；
任选地，所述RPMI-1640培养基包括2.5％的Hepes、1％的青霉素-链霉素、1％的L-Glutamine、1％的非必需氨基酸、1％的丙酮酸钠以及10％的人AB血清。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二培养条件包括含有6000U/mLrhIL-2的所述AIM-V培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缓慢扩增培养包括：当肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度达到1x106/mL时，将肿瘤浸润淋巴细胞进行传代处理，以便使肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度为5x105/mL的初始密度下进行继续缓慢扩增培养。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，第三培养条件包括：含有30ng/mL OKT3的所述AIM-V培养基和含有30ng/mL OKT3以及6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括：
将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞与辐射过的PBMC以1：200的细胞比例进行混合接种；
将混合接种后的细胞在含有30ng/mL OKT3的所述AIM-V培养基中培养一天；
将培养一天后的混合细胞在含有30ng/mL OKT3以及6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基中进行继续快速扩增培养，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，缓慢扩增培养后，快速扩增培养前，所述肿瘤浸润淋巴细胞的个数至少达到3x106。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述快速扩增培养中，肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度控制在2-4x106/mL的范围内。
10.一种体外快速扩增肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其特征在于，
(1)将肾癌组织接种于孔板中，使肿瘤浸润淋巴细胞在含有6000U/mL rhIL-2的AIM-V培养基或者RPMI-1640培养基中从所述肾癌组织中释放，所述肾癌组织的体积相对于孔板底面积的接种密度为0.5-1.5mm3/cm2；
(2)将释放的肿瘤浸润淋巴细胞在含有6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基中进行缓慢扩增培养，缓慢扩增培养后，所述肿瘤浸润淋巴细胞的个数至少达到3x106，其中，缓慢扩增培养过程包括：当肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度达到1x106/mL时，将肿瘤浸润淋巴细胞进行传代处理，以便使肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度为5x105/mL的初始密度下进行继续缓慢扩增培养；
(3)将缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞与辐照过的PBMC以1：200的细胞比例进行混合接种，缓慢扩增培养后的肿瘤浸润淋巴细胞的个数相对于孔板底面积的接种密度为1.5～3*104/cm2；
将混合接种后的细胞在含有30ng/mL OKT3的所述AIM-V培养基中培养一天；
将培养一天后的混合细胞在含有30ng/mL OKT3以及6000U/mL rhIL-2的所述AIM-V培养基中进行继续快速扩增培养，肿瘤浸润淋巴细胞在培养基中的密度控制在2-4x106/mL的范围内，以便获得临床用肾癌的肿瘤浸润淋巴细胞，
其中，所述AIM-V培养基包括10％的人AB血清和1％的青霉素-链霉素；
所述RPMI-1640培养基包括2.5％的Hepes、1％的青霉素-链霉素、1％的L-Glutamine、1％的非必需氨基酸、1％的丙酮酸钠以及10％的人AB血清。
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