CN107636150A - 半静态细胞培养 - Google Patents
半静态细胞培养 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107636150A CN107636150A CN201680030693.6A CN201680030693A CN107636150A CN 107636150 A CN107636150 A CN 107636150A CN 201680030693 A CN201680030693 A CN 201680030693A CN 107636150 A CN107636150 A CN 107636150A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- culture
- method described
- static
- speed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 124
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 50
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 35
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 23
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 19
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims description 6
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 6
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 5
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 claims description 5
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 4
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims 2
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 claims 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 4
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 4
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 239000005030 aluminium foil Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000011810 insulating material Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000003568 cytokine secretion assay Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000011165 process development Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013022 venting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2321—Interleukin-21 (IL-21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration
Abstract
本发明涉及诸如柔性细胞袋生物反应器的生物反应器中的细胞培养。更具体地,本发明涉及用于使用于在细胞治疗中使用的临床相关的细胞产物的生产简化的方法。
Description
技术领域
本发明涉及诸如柔性细胞袋生物反应器的生物反应器中的细胞培养。更具体地,本发明涉及将自始至终使用单个非静态细胞培养平台来通过初始半静态培养而支持临床量表细胞产物的生成的过程。
背景技术
过继性T细胞治疗是最新的个人化药物,其显示对患者(主要地,肿瘤浸润的T细胞和转基因的T细胞)的治疗价值的标志。已知T细胞治疗具有取决于T细胞产物的类型而变化的独特的培养要求。
已知的关于临床相关的T细胞的扩增的方案要求初期的细胞间接触,其推动T细胞刺激和进一步的增殖。为了促进所要求的细胞间接触的相互作用,细胞悬浮液的最小限度的移动被视为必要,并且,使用放置于保温培养器中的瓶或静态培养袋来实现的静态培养典型地用于该过程阶段。在此背景下,萨默维尔(Somerville)和达德利(Dudley)(2012OncoImmunology(肿瘤免疫学);1(8):1435-1437)指出,诸如XuriTM(来自GE Healthcare(通用电气健康护理部门),先前被称为WaveTM)生物反应器的非静态生物反应器提出了对过程开发的挑战,过程开发包括该静态步骤,该静态步骤要求细胞依然处于持续的物理接触中。以类似的方式,鲁尼(Rooney)等人(J Immunother(免疫治疗杂志),2010年;4月:33(3):305-315)指出,抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对细胞间接触具有严格要求,并且,已证实难以始终适应于移动培养物,因为,在静态培养条件下,功能性细胞的生产最佳。
当T细胞上的T细胞受体(TCR)被抗原呈递细胞(APC)上的抗原-主要组织相容性复合体(MHC)连同第二共刺激信号接合时,使体内的T细胞活化且对其进行诱导以增殖。响应于活化,T细胞经历包括例如细胞大小增大和细胞因子分泌的物理、生物及表型变化。还能够通过使T细胞与共固定化的抗CD28和抗CD3单克隆抗体结合到珠或诸如培养瓶的底部的其他表面上,从而在体外仿效该免疫反应。还通过使T细胞群与表达刺激因子的工程哺乳动物细胞系接触,从而提供了增殖信号。可用于对T细胞进行抗原刺激以实现细胞培养的所有的各种方法的共同点是,需要T细胞与APC或抗体所递送的共刺激信号之间的接近性以及允许在1-5天的持续期内实现该相互作用的条件。
广泛地使用培养瓶和静态培养袋,并且,研究者在进行细胞治疗领域内的过程开发工作时,应用培养瓶和静态培养袋。这些简单的培养皿满足较低的工作容积范围内的要求,这能够应付小的细胞数,且要求标准的实验室设备。静态培养方法支持持续的物理细胞接触,这能够推动T细胞刺激和活化。随着细胞增殖,要求额外的培养皿,并且,皿的数量和细胞悬浮液体积随时间而增大,例如,有可能在30天内从50 ml变成高达≥20 L或更大。这样的工作流程要求高素质人才和时间,并且,由于需要操纵多个皿而繁琐。随着培养皿的数量增加,污染和人为误差的风险也随时间而提高。
当尝试使方案适应于用于监管的依从细胞免疫治疗的生产的更大程度地自动化且从容的过程时,可用于该应用的生物反应器系统的数量有限。若干个临床研究组对诸如摇摆平台的各种生物反应器系统进行了评价。这些系统被认为是支持细胞治疗临床生产过程的标准化和按比例增大(scale up),并且,能够促进将这些过程实现为第三期临床试验。虽然如此,这些生物反应器中的许多生物反应器不支持初始T细胞刺激步骤中所要求的临界的细胞间相互作用。
当为临床第一/二期研究作准备时,必须使方案工业化且按比例增大,以允许生成足以达到治疗剂量的材料,并且,还允许在优良制造规范(GMP)要求下,处置全部的10-20位患者。此外,为了允许在监管下依从地生成足够的产品材料且为更大得多的群体供给该材料(这将是第三期研究中的情况(数百或数千位患者)),生产过程往往需要强有力的对方案的操纵。
萨德西(Sadeghi)等人(2011 J Immunol Methods(免疫方法杂志)。364:94-100)报告称,能够不在方瓶中进行预先活化和扩增,就直接地在生物反应器系统中启动肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)的迅速扩增。从组织活检切片获得TIL,组织活检切片本身能够充当抗原,使得已经存在抗原。因此,与T细胞悬浮液相比,当以组织活检切片开始细胞培养时,对初始静态阶段的要求不同。然而,萨德西(Sadeghi)等人还注意到,为了成功地启动更高的容积中的TIL的迅速扩增,要求瓶或透气袋中的活化和预先扩增。
因此,期望改进的方法,这些方法用于生成细胞产物的临床量表,具体地,其中,细胞培养过程以要求单独的抗原刺激的细胞的悬浮液开始。
发明内容
在一个实施例中,本发明提供包含一种方法,其包含:
(i)将细胞接种至非静态生物反应器中;
(ii)将抗原刺激添加至上述的非静态生物反应器;
(iii)将至少细胞生长辅助因子添加至上述的非静态生物反应器;
(iv)使上述的细胞扩增,以导致临床相关的细胞产物;
其中,实行步骤(ii),其中,上述的非静态生物反应器保持于第一摇摆速率下;
且其中,实行步骤(iv),其中,上述的非静态生物反应器保持于第二摇摆速率下,第二摇摆速率比上述的第一摇摆速率更高。
一个显著的优点是,能够将生物反应器系统利用于培养过程的所有的方面,因为,细胞被容纳于单个皿中,这降低所要求的打开操纵的次数,且因此,降低产品的污染的可能性。
在另一实施例中,本发明涉及本发明的方法中的非静态生物反应器的使用。
在另一实施例中,本发明提供包含用于实行本发明的方法的说明的工具箱。
在下文中针对本发明的方法而限定的定义和具体的实施例同样地适用于本发明的使用及工具箱。
本发明表示一种优化程序,该优化程序自始至终使用非静态生物反应器,以用于由暴露于抗原刺激的细胞的悬浮液生成扩增的细胞培养物。本发明的方法排除对如在已知的方法中使用的多个开放式静态系统的要求。本发明的优点是,提供备选的半静态途径,该途径允许自动化封闭环境下的细胞培养过程的按比例增大。该途径还能够适应于在培养期的期间要求持续的静态接触步骤的各种细胞培养程序。
附图说明
图1显示用于直接地在XuriTM细胞扩增系统中生产抗原特异性的T细胞(AST)的常规工作流程。
图2显示在XuriTM生物反应器中生长的细胞的总细胞数(顶部)和存活率百分比(底部)。在XuriTM W25系统中,培养来自供体1的细胞,并且,在XuriTM W5系统中,培养来自供体2和供体3的细胞。
图3图示3个供体中的每个供体的XuriTM细胞扩增系统和组织培养瓶中的整个培养的期间的细胞数的成倍增加。
图4(顶部)显示代谢产物葡萄糖(g/L)、乳酸(mmol/L)和铵(mmol/L)的水平,并且,图4(底部)显示XuriTM系统中的培养的总容积和灌注速率(底部)。针对XuriTM W25系统中的来自供体1的培养而显示有代表性的数据。
图5图示XuriTM系统中的整个培养期中的外周血淋巴细胞群的频率。通过流式细胞技术(FACS Fortessa)而确定阳性细胞的数量。基于淋巴细胞的前部和侧面散射分布,给淋巴细胞设门。在淋巴细胞门内,显示% B细胞(CD19+)、CD3+T细胞、NK(CD56+CD3-)和NKT那样的细胞(CD3+CD56+)。
图6显示供体1的第0天和第18天的CD8+T细胞和CD4+T细胞的IFNγ分泌的有代表性的流式细胞技术图。单独地以PBMC(APC)(分泌T细胞的非特异性的IFNγ,负控制)或以APC+CMV肽混合物(对特异性的测试)刺激T细胞。
图7显示XuriTM系统中的整个培养的期间的CD8+T细胞和CD4+T细胞的IFNγ分泌。在图表上显示CD4+或CD8+T细胞的百分比,并且,在图表下方针对所有的供体而显示特异性的成倍增加。单独地以PBMC(分泌T细胞的非特异性的IFNγ)或以PBMC+CMV肽混合物(对特异性的测试)刺激T细胞。CMV特异性的T细胞=(T细胞+PBMC+CMV肽)–(T细胞+PBMC)。
具体实施方式
为了更清楚地且简明地描述并指出要求保护的本发明的主题,在下文中,提供在整个本说明书中和所有的权利要求以及本发明的示范性的实施例中使用的专用术语的定义。本文中的专用术语的任何范例都应当被认为是非限制性的示例。
如本文中所使用的术语“接种(inoculating)”是指,出于启动细胞培养的目的,将相对少量的细胞转移至细胞培养皿中。在一个实施例中,少量的细胞是细胞悬浮液。在一个实施例中,少量的细胞不是从诸如组织活检切片的一块组织导出的。术语“细胞培养皿”能够包括各类细胞培养瓶、袋、生物反应器或本领域技术人员所熟知的支架。在一个实施例中,为了培养T细胞而转移的细胞的量为大约1x106至2 x106个细胞/mL。在一个实施例中,能够在启动生物反应器的任何摇摆之前,实行接种步骤。在一个实施例中,能够以如本文中所限定的第一摇摆速率实行接种步骤。
本发明的背景下的术语“细胞”能够被理解为包含能够在细胞治疗应用中使用的任何细胞类型。这样的细胞有时被称为先进的治疗型医药产品(ATMP)。术语“细胞治疗应 用”意指典型地通过注射而将自体或异体细胞材料施用至患者中的任何治疗,并且,包括诸如过继性免疫治疗或者自体或异体移植的程序。在本发明的背景下,在施用之前,操纵细胞材料,使得细胞表达期望的表型。因此,例如,过继性免疫治疗(也被称为“过继性细胞治疗”)是用于帮助免疫系统抵御诸如癌症和由某些病毒引起的感染的疾病的处置。依据过继性免疫治疗的NCI(美国国家癌症研究所)定义,在实验室中,从患者收集T细胞,并且,使T细胞隔离且在体外扩增,这增大能够杀死癌细胞或抵御感染的T细胞的数量。这些T细胞被送回至患者,以帮助免疫系统抵御疾病。
本发明的背景下的“非静态生物反应器”是配置成使细胞培养物生长的装置或系统,其中,该装置对细胞培养物赋予移动,以促进其生长。合适地,移动的方法未对细胞造成损伤,例如,几乎不引起对细胞培养物的剪切力或磨削力。移动的非限制性的示例包括摇动、搅拌以及摇摆。在本发明的一个实施例中,移动为摇摆。市场上可买到的非静态生物反应器的示例包括XuriTM(GE Healthcare)、Biostat™ RM(德国赛多利斯公司)以及XRS 20生物反应器(美国颇尔公司)。图1显示用于在根据本发明的实施例的XuriTM细胞扩增系统中直接地生产抗原特异性的T细胞(AST)的常规工作流程。
“抗原刺激(antigen stimulus)”是引起白血细胞经历物理、生物及表型变化的因子。抗原刺激能够被理解为引起具有特定的表型/特异性的细胞的某一亚群成为细胞群的更具主导性的部分。非限制性的示例包括抗原肽或肿瘤裂解液,抗原肽或肿瘤裂解液能够由人工抗原呈递细胞(APC)处理,并且,在TCR接合的MHC或APC上呈递,从而在TCR的MHC复合体上呈递肽。后者的实施例的一个已知的示例为,以γ辐照自体EBV转化的类淋巴母细胞系(EBV-LCL)共同培养PBMC,从而获得EBV特异性的CTL。
术语“细胞生长辅助因子”是指推动细胞的扩增的因子。这些因子以溶解状态添加至非静态生物反应器,或粘附至诸如珠的固体表面。
在一个实施例中,细胞生长辅助因子的示例包括共固定化于珠或诸如培养瓶的底部的其他表面上或以溶解状态添加的抗CD28和/或抗CD3单克隆抗体,或者表达刺激因子的工程哺乳动物细胞系(诸如,表达CD28/CD3的K562细胞系)。EP1594958B1描述以具有结合的抗CD3和CD28的珠刺激T细胞的已知的方法。在一个实施例中,在本发明的方法中,在扩增步骤(iv)之前,以第一摇摆速率添加该实施例的细胞生长辅助因子。
在一个实施例中,细胞生长辅助因子是细胞因子或一大堆混合的细胞因子。细胞因子的非限制性的示例包括白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)和白细胞介素-21(IL-21)以及以上的细胞因子的混合物。在一个实施例中,一大堆混合的细胞因子可以包括IL-4和IL-7的混合物或IL-2和IL-7和/或IL-15和IL-21的混合物。在一个实施例中,在本发明的方法中,在扩增步骤(iv)之前,以第一摇摆速率添加该实施例的细胞生长辅助因子,且/或在本发明的方法的扩增步骤(iv)的期间,以第二摇摆速率添加该实施例的细胞生长辅助因子。
本发明的方法中的术语“扩增”是指增大细胞培养物中的细胞的数量的过程。在扩增步骤中,给细胞送料,并且,定期地更换培养基,在一个实施例中,根据送料计划而更换培养基。具体的送料计划中的所添加的培养基的具体的时机和量将取决于培养物中的代谢产物的细胞数和水平。
“临床相关的细胞产物”是能够在细胞治疗应用中使用的细胞产物。临床相关的细胞产物应当适合于临床应用。换句话说,临床相关的细胞产物应当满足如在国际和/或国家监管机构所作出的批准中定义的医药产品的具体要求,例如,产品应当无菌,且具有低于0.5 EU/kg的内毒素水平。术语“临床应用”是指由个别的受试者/患者使用药剂产品。术语“药剂产品”包含本发明的临床相关的细胞产物,并且,能够被理解为是指旨在对患者施用的药物活性物质的在药学上可接受的组成。临床应用能够被理解为包括第一期、第二期和第三期临床试验中的药剂产品的使用和临床实践中的患者中的产品的使用。在一个实施例中,临床相关的细胞产物适合于在临床试验中使用。应当生成足够多的细胞,以达到治疗剂量且实行质量控制分析,并且,能够针对一位患者而一次、并行地或交错地多次执行该生产过程。一批细胞产物中的107-1015个细胞的范围能够为合适的。在任何研究中,合适的方法都允许全都在优良制造规范(GMP)要求下生成足以达到研究中的每位患者的治疗剂量的材料。如本领域技术人员所熟知的,待处置的受试者的数量取决于研究阶段而变化。对于第三期研究,患者的数量可能达到数百或甚至数千。
在一个实施例中,本发明的方法能够被理解为分成两种操作模式:半静态培养和迅速扩增方案。术语“半静态培养”能够被理解为是指,在上述的细胞出现生理变化所必需的一段时间的期间,以上述的第一摇摆速率实行的本发明的方法的那些步骤,即,执行要求细胞相互作用的培养程序,推动非静态生物反应器中的上述的细胞的活化和生长。“迅速扩 增方案”包括当细胞间相互作用不那么临界时,继半静态培养操作模式之后,以上述的第二摇摆速率实行的那些步骤,即,使上述的细胞的生长优化且刺激上述的细胞的生长的送料计划。
“第一摇摆速率”是用于在已知的方法中,使用静态状态的该方法的那些步骤的移动的半静态速率。在一个实施例中,上述的第一摇摆速率是不大于4 rpm且处于不大于4度的角度的速度。在一个实施例中,第一摇摆速率属于2-4 rpm之间,且处于2-4度之间的角度。在一个实施例中,第一摇摆速率为2 rpm,且处于2度的角度。
由于有必要在上述的细胞与生长刺激因子之间极为接近,从而引起活化和扩增,因而推荐将起始细胞密度(细胞数/mL)保持于某一水平下。所推荐的细胞密度的非限制性的示例为≥106个活细胞/mL。通常,当在体外使人体细胞扩增时,起始群较小,因而要求初始的较低的培养容积,以允许所推荐的细胞密度。在2L细胞袋中,低起始容积的非限制性的示例为≥250 ml。
在一个实施例中,本发明的方法还包含具体地,在低培养容积的阶段,对废弃代谢产物的蒸发和/或冷凝和/或累积进行控制的手段(在下文中,也被称为“控制手段”)。在一个实施例中,在如上所述的半静态培养模式的期间,应用上述的控制手段。在一个实施例中,在本发明的方法的早期,例如,在步骤(i)-(ii)或步骤(i)-(iii),应用上述的控制手段。
在一个实施例中,上述的控制手段包含热绝缘。在一个实施例中,使用生物反应器的盖来实现热绝缘。在另一实施例中,通过将细胞袋包裹于合适的绝缘材料中,从而实现上述的热绝缘。在一个实施例中,上述的绝缘材料为铝箔。在使用XuriTM W5的一个实施例中,能够将板提升器插入系统的托盘中,以允许正确的温度读数。
在一个实施例中,上述的控制手段包含对气流速率进行控制。在一个实施例中,上述的气流速率被控制成0.05-0.1公升/分钟(LPM)。在一个实施例中,在最初的3-4天的期间,应用上述的气流速率控制。
在一个实施例中,上述的控制手段包含日常培养基添加。在一个实施例中,在最初的几天里,实行上述的日常培养基添加。在一个实施例中,上述的培养基添加导致第5天的总容积大于最大工作容积的40%,而不使细胞密度降低至低于所要求的最小每毫升数。在一个实施例中,缓慢地实行上述的日常培养基添加,以例如,自第2-3天起,将温度保持为高于临界水平;在一个实施例中,在起始容积为300 ml的培养物中,日常培养基注射能够为≤50-100 ml。在一个实施例中,能够执行培养基的添加,使得自设定点起,温度降为≤1°C。
在一个实施例中,上述的控制手段包含灌注,在早期的期间,添加该灌注,以避免低于1L的总容积下的高渗透压(200ml/天)。2L培养皿中的适当的容积的示例为400-500ml,并且,所推荐的最小细胞密度为≥0.8x106个细胞/ml。除了培养基添加之外,如果渗透压高,且废弃代谢产物累积于培养物中,则在早期的期间,还能够考虑灌注。主要是因为,废弃代谢产物的累积可能对培养物有害,且最终影响后期的培养物的增殖速率。灌注速率能够为≤200 ml/天(在XuriTM W5系统中,对于基于注射的灌注,为≤25 ml的注射剂量),以保持温度恒定,且促进温度控制。当在半静态培养的期间,细胞间相互作用不那么临界,且上述的细胞已活化或经历物理变化时,应用“迅速扩增方案”(REP)。应用第二摇摆速率,且气体流量增加,灌注计划不受限于温度,而是受限于细胞浓度和培养容积。进入生物反应器中的增加的气体流量的非限制性的示例为≥0.1-0.6 LPM。
当细胞扩增时,在本发明的方法的步骤(iv)的期间,使用“第二摇摆速率”。在整个扩增步骤(iv)中,第二摇摆速率可能随着细胞培养物中的细胞的量而变化,即,细胞越多,第二摇摆速率就可能越高。在一个实施例中,第二摇摆速率是大于4 rpm的速度,且处于大于4度的角度。在一个实施例中,上述的第二摇摆速率高达25 rpm,且处于高达15度的角度。在一个实施例中,上述的第二摇摆速率高达15 rpm,且处于高达15度的角度。在一个实施例中,上述的第二摇摆速率高达10 rpm,且处于高达10度的角度。在一个实施例中,对于细胞密度<26个细胞/ml且容积<1L的情况,第二摇摆速率为4-8 rpm,且角度为4-6度。在一个实施例中,对于>26个细胞/ml且容积>1L的情况,第二摇摆速率属于8-10 rpm之间,且角度为6度。在一个实施例中,对于细胞密度>156的情况,第二摇摆速率为10-15 rpm,且角度为6度。
本发明的方法提供与已知的过程相比而有用的开发,因为,该方法限制开放式处理,降低污染风险,且推动更高效的工作流程。
在一个实施例中,已开发自始至终使用XuriTM细胞扩增平台的程序,以用于生成抗原特异性的T细胞,并且,在示例1中,描述该程序。如将关于先前的方法而要求的,通过使来自常规的方案的一些关键步骤适应于XuriTM细胞扩增系统,从而该过程排除了使用多个开放式静态系统的要求。因此,将XuriTM细胞扩增系统应用于生成AST的计划提供备选的半静态途径,该途径允许自动化封闭环境下的AST培养过程的按比例增大。还能够使用半静态途径而使该平台适应于要求培养期的期间的持续的静态接触步骤的任何其他细胞培养程序。示例1表明,与传统的组织培养瓶(图2、图3和图5)相比,非静态生物反应器以细胞数的更高的增加倍数支持T细胞的生长。使用XuriTM细胞扩增系统,针对所有的供体而实现含有对CMV的高抗原特异性的T细胞培养物的扩增(特异性的增加倍数>35,对于CD4+T细胞和CD8+T细胞,增加倍数分别在从35.7至462.4和134.6至183.9的范围内变动;参见图7和图8)。
示例简述
示例1描述使用XuriTM平台来实现的临床相关的抗原特异性的T细胞的扩增。来自三个健康供体的新鲜的外周血单核细胞(PBMC)以HCMVA肽混合物(PM-IE1和PM-pp65)脉动,并且,以非常平缓的摇摆/角度直接地接种至XuriTM细胞扩增系统W5或W25上的细胞袋中。在7天之后,以辐照自体肽混合物脉动式PBMC再刺激细胞培养物。在第10/11天,增强摇摆,以推动扩增阶段。作为与半静态培养的比较,同时地在组织培养瓶中设置两个供体的细胞培养。
示例中所使用的缩略语的列表
CMV 巨细胞病毒
DMSO 二甲基亚砜
hr(s) (多个)小时
PBMC(s) (多个)外周血单核细胞
rpm 每分钟转数。
示例
示例1.使用Xuri
TM
平台来实现的临床相关的抗原特异性的T细胞的扩增。
材料&方法
使用淋巴细胞分离液培养基(GE Healthcare),使来自三个CMV血清反应阳性的健康供体的新鲜的外周血单核细胞(PBMC)隔离。保持一部分的PBMC,以启动培养,并且,剩余的细胞冷冻保存于90%热灭活的人体血清(TCSBiosciences)+10% DMSO(西格玛)中,以便随后用作自体送料器。
使起始细胞数的350E6细胞再悬浮于10ml的完全培养基中:以5%热灭活的人体血清、2mM GlutaMAX l-谷氨酰胺(美国生命技术公司)、100U/ml青霉素(美国生命技术公司)、100μg/ml链霉素(美国生命技术公司)以及300单位/ml IL-2(GE Healthcare)补充X-VIVO培养基(瑞士龙沙集团)。在37°C下,利用HCMVA肽混合物PM-IE1(JPT)和HCMVA肽混合物PM-pp65(JPT)来以10ng/15E6细胞使细胞脉动达2小时。
细胞袋TM生物反应器(GE Healthcare)放置于XuriTM细胞扩增系统W5或W25(GEHealthcare)上,以5% CO2填充,并且,连接容纳完全培养基和废弃袋的贮藏器。初始容积为200-250ml的完全培养基添加至细胞袋TM,并且,被允许平衡至37°C达2小时。
在2小时之后,考虑到总量为300 ml,每个细胞袋TM为1E6个细胞/ml,将300E6的肽脉动式细胞接种至细胞袋TM 和所添加的添加培养基中。在2次摇摆/分钟的半静态条件下,以2°的角度和0.05LPM的气流速率培养细胞。为了使半静态培养阶段的期间的培养基的蒸发降低至最低限度,将细胞袋TM包裹于铝箔中(对于XuriTM细胞扩增系统W5),或使用仪器的盖(对于XuriTM细胞扩增系统W25)。一旦启动,就使细胞袋TM中的培养物不被扰动达3天,以允许产生细胞间相互作用。
作为与半静态培养的比较,并行地设置传统的静态培养。使50E6细胞再悬浮于50ml(1E6/ml)中,并且,在保温培养器中,在37°C下,在瓶中培养50E6细胞。自第3天起,将新鲜的培养基添加至细胞袋TM,在第7天之前,达到400ml-500ml。执行日常采样,以实现细胞计数和生化分析(乳酸、铵、葡萄糖、pH)。以类似的成比例的容积分批给瓶送料。自第5-6天起,在第7天以前,摇摆次数/角度增加至4次摇摆/分钟和4度的角度。在添加送料器以实现再刺激之前的24小时的期间,灌注200ml的培养基,以控制乳酸、铵和葡萄糖水平。通过离心分离而对瓶手动地执行相同的灌注速率。
在第7天,以自体肽脉动式送料器再刺激培养物。使冷冻保存的自体PBMC融解于完全培养基中,以30Gy辐照,且以肽混合物(10ng/15E6细胞)脉动达2小时。以送料器与T细胞的1:1的比将细胞添加至细胞袋TM和瓶培养物。以2°的角度以2 rpm无干扰地对培养物进行保温培养达3天,自第10天起,分批给细胞袋TM送料,以维持至少1E6/ml,直到获得1L的最大容积为止。此后,根据代谢产物读数而调整每24小时200-700ml的灌注速率,以控制葡萄糖和废弃代谢产物乳酸以及铵(参见图4)。在瓶中执行相同的成比例的培养基添加,直到容积达到100ml为止,并且,自第10天起,每隔2天实行手动灌注。实行日常监测、细胞计数和生化分析。自第11天起,如果细胞为>20E6/ml,则摇摆次数/角度每天逐渐增加至4rpm/4°、8rpm/6°、10rpm/6°(2-20E6个细胞/ml)以及12rpm/6°。
表型分析
在第0天、第7天、第15天和第18天,采集流式细胞技术分析的样本,并且,将样本冷冻保存。以抗体群体使细胞融解且染色,其中,抗体群体检测淋巴细胞群的免疫表型标记。以CD3-PerCP™Cy™5.5(BD™Biosciences)、CD4-V500(BD™Biosciences)或–PE(BD™Biosciences)、CD8-Alexa Fluor™ 488(BD™Biosciences)连同CD56-PE(BD™Biosciences)和CD19-APC(BD™Biosciences)使1×106个细胞染色。
对于细胞因子表达的分析,细胞被分成负控制(细胞+PBMC)和对特异性的测试(细胞+PBMC+肽混合物)。在37°C下,对这些细胞进行保温培养达一整夜。根据制造指令(德国美天旎生物技术有限公司)而实行细胞因子分泌含量测定,从而使用MAC IFN分泌含量测定检测试剂盒来对抗原特异性进行测试。
根据制造商的指令(BD™Biosciences),使用FACSDiva™软件,在FACS Fortessa流式细胞仪上,对染色后的细胞进行分析。
Claims (30)
1.一种方法,包含:
(i)将细胞接种至非静态生物反应器中;
(ii)将抗原刺激添加至所述非静态生物反应器;
(iii)将至少细胞生长辅助因子添加至所述非静态生物反应器;
(iv)使所述细胞扩增,以导致临床相关的细胞产物;
其中,实行步骤(ii),其中,所述非静态生物反应器保持于第一摇摆速率下;
且其中,实行步骤(iv),其中,所述非静态生物反应器保持于第二摇摆速率下,该第二摇摆速率比所述第一摇摆速率更高。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在步骤(iv)的期间,将步骤(ii)和(iii)重复一次或更多次。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其特征在于,所述细胞为白细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述白细胞选自包含淋巴细胞、单核细胞或从单核细胞导出的细胞的组。
5.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述白细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法,其特征在于,在步骤(i)中,所述细胞为细胞悬浮液。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法,其特征在于,所述非静态生物反应器包含柔性细胞袋。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法,其特征在于,所述抗原刺激包含抗原肽或肿瘤裂解液。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法,其特征在于,使所述细胞扩增的所述步骤包含定期地更换培养基。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞生长辅助因子包含抗CD28和/或抗CD3单克隆抗体。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,在本发明的方法中,在所述扩增步骤(iv)之前,添加所述细胞生长辅助因子。
12.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述细胞生长辅助因子是细胞因子或一大堆混合的细胞因子。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于,所述细胞因子选自白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)以及白细胞介素-21(IL-21)。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的方法,其特征在于,在本发明的方法中,在所述扩增步骤(iv)之前,添加所述细胞生长辅助因子。
15.根据权利要求12-14中所述的方法,其特征在于,在所述扩增步骤(iv)的期间,定期的所述细胞生长辅助因子。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法,其特征在于,所述临床相关的细胞产物包含抗原特异性的T细胞、监管的T细胞或转基因的PBMC。
17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述临床相关的细胞产物包含抗原特异性的T细胞或转基因的PBMC。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法,其特征在于,所述抗原特异性的T细胞为细胞毒素病毒特异性的T细胞或肿瘤特异性的T细胞。
19.根据权利要求16或权利要求17所述的方法,其特征在于,所述转基因的PBMC为嵌合抗原受体(CAR)T和TCR转基因的T细胞。
20. 根据权利要求1-19中的任一项所述的方法,其特征在于,所述第一摇摆速率不大于4 rpm,且处于不大于4度的角度。
21. 根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述第一摇摆速率在2-4 rpm之间,且处于2-4度之间的角度。
22. 根据权利要求1-21中的任一项所述的方法,其特征在于,第二摇摆速率大于4rpm,且处于大于4度的角度。
23. 根据权利要求22所述的方法,其特征在于,所述第二摇摆速率高达25 rpm,且处于高达15度的角度。
24. 根据权利要求23所述的方法,其特征在于,所述第二摇摆速率高达15 rpm。
25.根据权利要求1-24中的任一项所述的方法,其特征在于,还包含对废弃代谢产物的蒸发和/或冷凝和/或累积进行控制的手段。
26.根据权利要求25所述的方法,其特征在于,所述控制手段包含热绝缘。
27.根据权利要求25所述的方法,其特征在于,所述控制手段包含对气流速率进行控制。
28.根据权利要求25所述的方法,其特征在于,所述控制手段包含日常培养基添加。
29.一种根据权利要求1-28中的任一项所述的方法中的非静态生物反应器的使用。
30.一种工具箱,包含用于实行根据权利要求1-28中的任一项所述的方法的说明。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1509202.6 | 2015-05-28 | ||
GBGB1509202.6A GB201509202D0 (en) | 2015-05-28 | 2015-05-28 | Semi-static cell culture |
PCT/EP2016/062081 WO2016189159A1 (en) | 2015-05-28 | 2016-05-27 | Semi-static cell culture |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107636150A true CN107636150A (zh) | 2018-01-26 |
Family
ID=53677371
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680030693.6A Pending CN107636150A (zh) | 2015-05-28 | 2016-05-27 | 半静态细胞培养 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10927344B2 (zh) |
EP (1) | EP3303569A1 (zh) |
JP (1) | JP6827425B2 (zh) |
CN (1) | CN107636150A (zh) |
GB (1) | GB201509202D0 (zh) |
WO (1) | WO2016189159A1 (zh) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010045659A1 (en) | 2008-10-17 | 2010-04-22 | American Gene Technologies International Inc. | Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules |
CN116064678A (zh) | 2016-01-15 | 2023-05-05 | 美国基因技术国际有限公司 | 用于活化γ-δT细胞的方法和组合物 |
US10137144B2 (en) | 2016-01-15 | 2018-11-27 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
US10888613B2 (en) | 2016-02-08 | 2021-01-12 | American Gene Technologies International Inc. | Method of producing cells resistant to HIV infection |
ES2911448T3 (es) | 2016-03-09 | 2022-05-19 | American Gene Tech Int Inc | Vectores combinados y métodos para el tratamiento del cáncer |
EP3468617A4 (en) | 2016-06-08 | 2020-01-22 | American Gene Technologies International Inc. | INTEGRATED VIRAL ADMINISTRATION SYSTEM AND RELATED METHODS |
IL300730A (en) | 2016-07-08 | 2023-04-01 | American Gene Tech Int Inc | Pre-HIV vaccine and immunotherapy |
US11583562B2 (en) | 2016-07-21 | 2023-02-21 | American Gene Technologies International Inc. | Viral vectors for treating Parkinson's disease |
US11820999B2 (en) | 2017-04-03 | 2023-11-21 | American Gene Technologies International Inc. | Compositions and methods for treating phenylketonuria |
NZ766453A (en) | 2018-02-01 | 2022-02-25 | Nkmax Co Ltd | Method of producing natural killer cells and composition for treating cancer |
US20210002599A1 (en) * | 2018-02-09 | 2021-01-07 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Bioprocessing methods for cell therapy |
EP3773622A4 (en) * | 2018-03-27 | 2021-12-01 | American Gene Technologies International Inc. | METHODS OF PREPARING GENETICALLY MODIFIED LYMPHOCYTES |
MX2022012990A (es) * | 2020-04-15 | 2023-01-11 | Amgen Inc | Proceso para generar células t autólogas modificadas genéticamente. |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040110290A1 (en) * | 2002-01-03 | 2004-06-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform |
CN101300340A (zh) * | 2005-11-01 | 2008-11-05 | 迈世耐特股份公司 | 细胞培养装置、细胞培养方法、细胞培养程序及细胞培养系统 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030235908A1 (en) | 2000-02-24 | 2003-12-25 | Xcyte Therapies, Inc. | Activation and expansion of cells |
US20030119185A1 (en) | 2000-02-24 | 2003-06-26 | Xcyte Therapies, Inc. | Activation and expansion of cells |
US6544788B2 (en) | 2001-02-15 | 2003-04-08 | Vijay Singh | Disposable perfusion bioreactor for cell culture |
JP2006524991A (ja) * | 2003-05-08 | 2006-11-09 | エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド | 抗原特異的t細胞の作製および単離の方法 |
DE102007033263A1 (de) * | 2007-07-17 | 2009-01-29 | Lear Corp., Southfield | Elektrischer Verbinder für einen Verdrahtungskabelbaum eines Fahrzeugs |
AU2009214980B2 (en) * | 2008-02-11 | 2013-10-31 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of obtaining antigen-specific T cell populations |
US20090233334A1 (en) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | Excellgene Sa | Cell cultivation and production of recombinant proteins by means of an orbital shake bioreactor system with disposable bags at the 1,500 liter scale |
KR101649189B1 (ko) | 2008-05-09 | 2016-08-18 | 애브비 인코포레이티드 | 최종 당화 산물의 수용체(rage)에 대한 항체 및 이의 용도 |
WO2010093848A1 (en) | 2009-02-13 | 2010-08-19 | Invitrx, Inc. | Skin cream |
MX2012000354A (es) | 2009-07-06 | 2012-02-01 | Genentech Inc | Metodo para cultivar celulas eucarionticas. |
GB201121308D0 (en) * | 2011-12-12 | 2012-01-25 | Cell Medica Ltd | Process |
-
2015
- 2015-05-28 GB GBGB1509202.6A patent/GB201509202D0/en not_active Ceased
-
2016
- 2016-05-27 JP JP2017559496A patent/JP6827425B2/ja active Active
- 2016-05-27 US US15/574,003 patent/US10927344B2/en active Active
- 2016-05-27 EP EP16729506.2A patent/EP3303569A1/en active Pending
- 2016-05-27 WO PCT/EP2016/062081 patent/WO2016189159A1/en active Application Filing
- 2016-05-27 CN CN201680030693.6A patent/CN107636150A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040110290A1 (en) * | 2002-01-03 | 2004-06-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform |
CN101300340A (zh) * | 2005-11-01 | 2008-11-05 | 迈世耐特股份公司 | 细胞培养装置、细胞培养方法、细胞培养程序及细胞培养系统 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ARIAN SADEGHI: "Large-scale bioreactor expansion of tumor-infiltrating lymphocytes", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 * |
R ISMAIL: "PRODUCTION OF T CELLS FOR ADOPTIVE CELLULAR IMMUNOTHERAPY USING THE XURI CELL EXPANSION SYSTEM W25", 《CELL BIOLOGY》 * |
X WANG: "Manufacture of tumor- and virus-specific T lymphocytes for adoptive cell therapies", 《CANCER GENE THERAPY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016189159A1 (en) | 2016-12-01 |
US10927344B2 (en) | 2021-02-23 |
JP2018515108A (ja) | 2018-06-14 |
EP3303569A1 (en) | 2018-04-11 |
US20180291341A1 (en) | 2018-10-11 |
JP6827425B2 (ja) | 2021-02-10 |
GB201509202D0 (en) | 2015-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107636150A (zh) | 半静态细胞培养 | |
Klapper et al. | Single-pass, closed-system rapid expansion of lymphocyte cultures for adoptive cell therapy | |
JP6010136B2 (ja) | ナチュラルキラー細胞の製造方法、その方法により製造されたナチュラルキラー細胞、並びにそれを含む腫瘍及び感染性疾患治療用組成物 | |
CN102597222B (zh) | 用于增殖抗原特异性t细胞的方法 | |
CN101918532B (zh) | 用于体外测试免疫原性和免疫功能的培养系统和方法 | |
AU2006288348B2 (en) | Method for activation treatment of antigen-presenting cell | |
ES2877108T3 (es) | Activación de linfocitos infiltrantes de médula en condiciones hipóxicas alternantes con normóxicas | |
CN109715788A (zh) | 用于免疫疗法的t细胞组合物 | |
CN105176927B (zh) | 一种细胞毒性增强的高效靶向杀伤nk/cik细胞的制备方法 | |
US20180171294A1 (en) | In vitro artificial lymph node method for sensitization and expansion of t cells for therapy and epitope mapping | |
CN1561388A (zh) | 从白细胞提取法产物产生用于临床应用的完全成熟并稳定的树突细胞 | |
JP2022065102A (ja) | ナチュラルキラー細胞の生産方法 | |
WO2015014291A1 (zh) | 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法 | |
JP4953403B2 (ja) | がん免疫療法用細胞の製造方法 | |
CN109957543A (zh) | 利用脐带血大量扩增脐血nk细胞的方法 | |
CN101321861B (zh) | 采用降低的温度产生树突细胞的方法 | |
US20230295566A1 (en) | Method for producing tumor-infiltrating t-lymphocytes (til) and their use as cellular therapeutics for the treatment of human tumors | |
Zhang et al. | Cancer Specific CTL Expansion with ZYX Bioreactor | |
CN107849537A (zh) | 诱发改善的或增加的抗肿瘤免疫应答的经最佳活化的树突细胞 | |
CN105219726A (zh) | 一种高效制备一型极化树突状细胞的方法及其应用 | |
CN106929473A (zh) | 用于hpv‑ctl细胞的体外培养试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: uppsala Applicant after: Stoivan Sweden Limited Address before: uppsala Applicant before: GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES AB |
|
CB02 | Change of applicant information |