JP2022065102A - ナチュラルキラー細胞の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】既存の方法に比べて臨床親和的な方法で、高い細胞殺害能及び細胞生存率を有するＮＫ細胞を高純度及び高効率に短期間で生産でき、ＮＫ細胞治療薬の生産性を向上させる、ＮＫ細胞の生産方法を提供する。【解決手段】ＮＫ細胞を含む細胞培養液を、単位体積当たり撹拌力が０．１～１００Ｗ／ｍ３の範囲で制御されたバイオリアクターを用いて適切な培養条件下で培養する方法とする。【選択図】図１Ａ
Description
本発明は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の生産（製造）方法に関し、より詳細には、ＣＤ３陽性細胞が除去された末梢血液単核細胞をフィーダー細胞と共に増殖させ、末梢血単核細胞が特定の累積分裂レベル（累積細胞集団倍加レベル：ａＰＤＬ：ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）に到達した時点にフィーダー細胞で再刺激することを特徴とするＮＫ細胞の生産方法に関する。
本発明はまた、バイオリアクターを用いて適切な培養条件下でＮＫ細胞を培養することを特徴とするＮＫ細胞の生産方法に関する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は血球細胞の約１０％を占め、免疫反応に重要な役割を果たすリンパ球系細胞である。ＮＫ細胞は様々な機能を担うが、特に、癌細胞や外部から侵入した病原菌に感染された細胞などを殺す能力を有しており、腫瘍化した或いは腫瘍化している異常細胞を除去する役割を担う。
体内に存在する大部分のＮＫ細胞は正常状態において不活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）で存在するが、実際にＮＫ細胞を治療用途に用いるためには活性化されたＮＫ細胞が必要なため、正常血液或いはＮＫ細胞が不活性化された患者の血液からＮＫ細胞の活性化に関する研究が活発に行われている。
体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でＮＫ細胞を活性化させることにより、ＮＫ細胞は高い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示すことが確認されている。ＮＫ細胞を用いた免疫細胞治療の可能性を示した。ｅｘ ｖｉｖｏで活性化されたＮＫ細胞を種々の癌、特に、白血病のような血液癌（ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）患者に同種骨髄移植後に投与するとその治療効果が確認されたという報告がある（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅ，３３：ｐ２６１－２６６，２００４）。
一方、ＮＫ細胞の治療剤としての可能性にもかかわらず体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）に存在するＮＫ細胞の数は多くなく、ＮＫ細胞を治療用途に用い得るような十分な効能を維持しながら大量に生産する技術が必須である。しかし、ＮＫ細胞は試験管内（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ）で十分に大量に増殖、培養されていない。このため、実際に有用なレベルでＮＫ細胞を増殖、培養する技術に関心が集中しており、多くの研究が進行されているが、まだ臨床に適用可能ではない。
ＮＫ細胞の培養には、既存のＴ細胞増殖／活性に使用したＩＬ－２だけでなく、ＩＬ－１５（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７（６）：ｐ３１２９－３１３８，２００１；Ｂｌｏｏｄ，１０６（１）：ｐ１５８－１６６，２００５、大韓民国公開特許公報第２００９－０１２１６９４号）、ＬＰＳ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５（１）：ｐ１３９－１４７，２０００）、およびＣＤ３を刺激するＯＫＴ－３抗体（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９（１）：ｐ１０４－１１３，２００１）を用いる研究が行われてきた。しかし、その研究は、以前から用いられてきたＩＬ－２使用に対する新しい増殖物質を見出したに過ぎず、画期的な増殖方法を示唆していない。一般に、ＩＬ－２或いはその他のサイトカイン及び化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いてＮＫ細胞が培養された場合、ＮＫ細胞は、初期数に比べて３～１０倍程度しか細胞数を増加しないことが知られている。
一部の研究者らは、腫瘍細胞株をフィーダー（支持）細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）として用いてＮＫ細胞を増殖させた事例も報告した。白血病細胞株であるＣＴＶ－１をフィーダー細胞として使用したが、増殖の改善が殆どなく（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８（１）：ｐ８５－９４，２００７）、ＥＢＶ－ＬＣＬを用いて２１日間培養した場合、ＮＫ細胞が平均で４９０倍程度増殖した例が報告された（Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１１（３）：ｐ３４１－３５５，２００９）。また、Ｋ５６２細胞株に４－１ ＢＢＬと膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ）ＩＬ－１５を発現させた人工抗原提示細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ））を用いて３週間共培養した結果、ＮＫ細胞数が約２７７倍に増加した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６９（９）：ｐ４０１０－４０１７，２００９）。最近ではＭＩＣＡ、４－１ＢＢＬ、及びＩＬ－１５をトランスフェクトしたＫ５６２細胞株とＮＫ細胞を３週間共培養すると、ＮＫ細胞が平均３５０倍増殖したという報告もあり（Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，７６（６）：ｐ４６７－４７５，２０１０）、Ｋ５６２細胞株に膜固定されたＩＬ－２１を発現させて７日間隔で再刺激しつつ２週間培養すると、ＮＫ細胞を平均２１，０００倍に増殖したという報告もあった。しかし、このような結果はいずれも、ＮＫ細胞増殖に癌細胞を使用するなど、臨床適用に重要である安全性を保障するに不適な方法を利用しており、また、正常細胞ではなく特定癌細胞株をフィーダー細胞として使用して特定癌細胞に対してプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）特異性を有するという限界があった。
ＮＫ細胞の分離無く末梢血白血球細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ：ＰＢＬ）からＮＫ細胞を選択的に濃縮させる方法によって得られた細胞群は、純粋ＮＫ細胞群に比べて細胞殺害能に劣り、純粋なＮＫ細胞だけでなく、自己ＭＨＣ分子によって自己（ｓｅｌｆ）および非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）を認識するＴ－細胞（Ｔ－ｃｅｌｌ）も含まれている。したがって、Ｔ細胞を除去しない限り、細胞の用途は自己移植に限定されるという問題点がある。
最近ではＮＫ細胞を分離し、フィーダー細胞を用いて適切な刺激を与えてＮＫ細胞を増幅する方法と、全ＰＢＬ又は末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）を用いてＮＫ細胞を選択的に増幅する方法などが開発されてきた。また、ＮＫ細胞を抗－ＣＤ３抗体及びインターロイキンタンパク質が含まれた培地を用いて、末梢血白血球細胞の存在下に培養する工程を含む、ＮＫ細胞の培養方法が報告されている（大韓民国公開特許公報第２０１０－００１１５８６号）。
ＮＫ細胞を同種に適用するための通常の増殖プロセスは、ＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気で除去（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）し、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を増殖させる２段階の連続した工程から始める。ＮＫ細胞の増殖を刺激するために、ＰＢＭＣｓ［Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １２：７５０－７６３，２０１０］又はＥＢＶ－ＬＣＬｓ［Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ］のような不活性化フィーダー細胞（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌｓ）がしばしば使用される。不活性化フィーダー細胞は、体液性因子及び直接的な細胞間接触（ｄｉｒｅｃｔ ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌ ｃｏｎｔａｃｔ）を通じてＮＫ細胞を刺激する（Ｂｌｏｏｄ ８０：２２２１－２２２９，１９９２）。
本発明者らはＮＫ細胞を大規模な増殖及び活性化するために、ＣＤ３＋Ｔ細胞を磁気を除去する単一ステップを経た後、Ｔ細胞が除去されたＰＢＭＣｓを刺激することにより、ＯＫＴ３及びＩＬ－２存在下で反復的に不活性化したフィーダー細胞と共に増殖させて高純度のＣＤ３－ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞集団を製造したことがある（大韓民国登録特許第１，６４４，９８４号）。しかし、上記方法は高純度のＮＫ細胞を大量に確保するには限界があった。
そこで、本発明者は高純度の高い殺傷力を持つＮＫ細胞を大量に生産する方法を開発しようと鋭意努力した結果、ＣＤ３陽性細胞が除去された末梢血単核細胞をフィーダー細胞と共に静置培養して刺激させ、末梢血単核細胞の累積分裂レベル（ａＰＤＬ）が２～６となる時点にフィーダー細胞で再刺激後、懸濁培養した場合、ＮＫ細胞の細胞成長が増大し、細胞収得率が向上することを確認し、本発明を完成するに至った。
また、本発明者は、培養液中の溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度、ｐＨ及び温度の調節が可能である他にも、適切な撹拌、培地の連続した供給などが可能な生物反応器を用いて適切な培養条件下でＮＫ細胞を培養する場合、得られるＮＫ細胞の量と生産されたＮＫ細胞の殺害能が有意に向上することを初めて確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、バイオリアクター（生物反応器）を用いて適切な培養条件を維持しながらＮＫ細胞を培養するＮＫ細胞の製造方法を提供することにある。
本発明は、ＮＫ細胞を含む細胞培養液を単位体積当たりの撹拌力が１０～３０ｗ／ｍ３の範囲で制御されたバイオリアクターに接種するステップを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の生産方法を提供する。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家にとって通常理解される意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常的に用いられている。
本発明は、既存の高純度のＮＫ細胞生産方法ではＮＫ細胞の大規模な生産が難しいだけでなく、製造されたＮＫ細胞の殺害能が低下する問題点を解決するための新しいＮＫ細胞の生産方法を提供する。
一態様において本発明は、
（ａ）ＮＫ細胞を含む細胞培養液をフィーダー細胞で刺激した後に静置培養するステップ；
（ｂ）前記静置培養された細胞培養液を懸濁（浮遊）培養するステップ；及び
（ｃ）前記細胞培養液中の単核細胞の累積分裂レベルが３～５に達した時点で、前記懸濁培養細胞培養液にフィーダー細胞を添加して再刺激させた後、懸濁培養するステップ；
を含むＮＫ細胞の生産方法に関する。
（ａ）ＮＫ細胞を含む細胞培養液をフィーダー細胞で刺激した後に静置培養するステップ；
（ｂ）前記静置培養された細胞培養液を懸濁（浮遊）培養するステップ；及び
（ｃ）前記細胞培養液中の単核細胞の累積分裂レベルが３～５に達した時点で、前記懸濁培養細胞培養液にフィーダー細胞を添加して再刺激させた後、懸濁培養するステップ；
を含むＮＫ細胞の生産方法に関する。
本発明において、さらには前記（ｃ）ステップ後に培養されたＮＫ細胞を得る（ｄ）ステップを含んでもよい。
本発明において、前記（ｃ）ステップの懸濁培養は、特に限定されないが、１～３０日間、具体的には５～２１日間行い得る。なお、前記（ｂ）ステップの懸濁培養は、前記（ａ）ステップのフィーダー細胞での刺激後３～７日後に開始でき、より具体的には４～６日後に開始でき、最も具体的には５日後に開始され得る。
また、本発明において、前記ステップ（ｃ）におけるフィーダー細胞で再刺激する時点は、累積分裂レベル（ａＰＤＬ）が２～６、具体的には３～５、より具体的には４～５、さらに具体的には４．１～４．６、最も具体的には４．３に到達した時点であり得るが、これに限定されない。
本発明において、前記ステップ（ｃ）における懸濁培養は、３０～３００ｒｐｍ、具体的には６０～１６０ｒｐｍの撹拌速度で行うことができ、例えば７０～９０ｒｐｍで行うことができる。
本発明において、前記フィーダー細胞は、不活性化された末梢血単核細胞であり、前記フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）とＮＫ細胞を含む細胞培養液中の単核細胞（種細胞：ｓｅｅｄ ｃｅｌｌ）の比率は５：１～１：１５、具体的には２：１～１：１０、より具体的には１：１～１：８、最も具体的には１：４～１：６であるが、これらに限定されない。
本発明において、前記ステップ（ａ）の細胞培養液は、ＣＤ３陽性細胞が除去された末梢血単核細胞を含む培養液であり得、この場合、末梢血単核細胞が種細胞であり得る。
本発明において、前記ステップ（ａ）の培養は抗ＣＤ３抗体が添加された培地で行い、前記抗－ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１及びＨＩＴ３ａからなる群から選ばれる一つ以上であり得る。また、本発明において、前記（ａ）ステップの培養は、ＩＬ－２が添加された培地で行ってもよい。
本発明において、静置培養（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）は、リアクターで撹拌（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）又は振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）無く放置した状態で培養することを意味し、懸濁培養（浮遊培養、ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）とは、通気（ａｅｒａｔｉｏｎ）や撹拌などによって細胞がリアクターの底部又は側面部に付着せずに懸濁された状態で培養することを意味する。
本発明において、静置培養のために使用可能なリアクターは、シェイキングフラスコ、Ｔフラスコ、使い捨て細胞培養バッグ（ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）などが挙げられるが、これに限定されない。
本発明において、懸濁培養のために使用可能なリアクターは、シェイキングフラスコ、振盪培養器、Ｔ－フラスコ、使い捨て細胞培養バッグなどが挙げられるが、これに限定されない。しかし、本発明の目的を達成するのに適したバイオリアクター（生物反応器）であれば、当業者の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に選択できる任意のリアクターも使用可能である。
また、静置培養のためのリアクターと懸濁培養（浮遊培養）のためのリアクターは同一であっても、異なってもよい。例えば、静置培養のためのリアクターと懸濁培養のためのリアクターが同一である場合には、同一のリアクターで静置培養完了後、サイトカインなどの必要な栄養成分を含む培地を追加供給して懸濁培養方式で培養することが可能であり、異なる種類のリアクターである場合には、静置培養が完了した後、培養物を懸濁培養のためのリアクターに移して懸濁培養することができる。
このような懸濁培養のためのリアクターの例としては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＷａｖｅバイオリアクター（Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社の使い捨てバイオリアクター（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，ＳＵＢ）、Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ社の使い捨てＸＤＲバイオリアクター（Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ ＸＤＲ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社の使い捨てバイオリアクター（ＢＩＯＳＴＡＴ ＳＴＲ）、Ｎｉｐｒｏ社の細胞培養バッグ、ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＰＢＳシリーズバイオリアクター（ＰＢＳ Ｍｉｎｉ、ＰＢＳ３、ＰＢＳ１５、ＰＢＳ８０、ＰＢＳ５００など、ＷＯ０７／１１１６７７Ａ、ＷＯ０８／１３３８４５Ａ、ＷＯ０９／１３２１９２Ａなど参照）、フジモリ工業（株）の細胞培養バッグ（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂａｇ）、Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ社の使い捨てシェイキングフラスコ（Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｓｈａｋｅ Ｆｌａｓｋｓ）などがあるが、これらに限定されない。例えば、ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＰＢＳシリーズバイオリアクターを使用してもよい。
本発明における‘フィーダー細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ、培養補助細胞ともいう。）’は、分裂増殖する能力はないが、代謝活性を有し、様々な代謝物質を生産して標的ＮＫ細胞の増殖を助ける細胞を指す。本発明で使用可能なフィーダー細胞としては、遺伝子が導入された動物細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）や各種サイトカインや化学物質で処理された末梢血白血球細胞（ＰＢＬ）、自己又は他の末梢血白血球細胞（ＰＢＬ）、Ｔ細胞、Ｂ細胞（Ｂ－ｃｅｌｌ）又は単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）などがあり、具体的には、自己末梢血単核細胞を使用できるが、これに限定されず、本発明の属する技術分野において通常使用可能なものと知られた他のフィーダー細胞も本発明の目的に符合すればいずれも使用可能であることは明らかである。
フィーダー細胞として用いられる自己末梢血単核細胞は、不活化させることによって安全性を確保することができる。不活化させる方法には、当業界に公知の通常の方法を利用でき、例えば、ガンマ線（ｇａｍｍａ－ｒａｙ）を照射する方法を用いることができる。不活性化されたフィーダー細胞は、単離されたＴ－細胞を含む。本発明によるフィーダー細胞を使用する増殖方法はＮＫ細胞を純粋に単離した後に増殖させる方法であり、純粋なＮＫ細胞だけを後増殖するという点で有利である。
本発明における抗－ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合して抗原認識複合体を形成する分子であるＣＤ３抗原に特異的に結合する抗体であり、ＣＤ３分子はＴＣＲと結合して抗原認識シグナルを細胞内に伝達する役割を担当する。
本発明で使用可能な抗－ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する特性を有するいかなる抗体も可能であり、例えば、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１及びＨＩＴ３ａからなる群から選択されるものを用いることができるが、これに限定されない。
本発明において、培地に含まれ得るサイトカインは、インターロイキンから選択される一つ以上であり得るが、インターロイキンは、リンパ球や単核細胞及びマクロファージ（大食細胞）などの免疫細胞が生産するタンパク質ベースの生物活性物質の総称であり、本発明で使用可能なインターロイキンには、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）及びインターロイキン－２１（ＩＬ－２１）からなる群から選ばれる一つ以上であり得、特にＩＬ－２を使用できるが、これに限定されない。本発明に属する技術分野における通常の知識を有する者にとって、本発明の目的に符合するものであれば、他のサイトカインも制限なく使用可能であることは明らかである。
本発明の静置培養及び懸濁培養のために用いられる抗－ＣＤ３抗体の培地中の濃度は０．１～１，０００ｎｇ／ｍｌ、具体的には１～１００ｎｇ／ｍｌ、より具体的には５～２０ｎｇ／ｍｌであり、培地中のサイトカインの濃度は１０～２，０００ＩＵ、具体的には１００～１，０００ＩＵ、より具体的には約２００～７００ＩＵである。
本発明において‘刺激’とは、フィーダー細胞などを添加することによってＮＫ細胞の増殖を誘導することを意味し、抗－ＣＤ３抗体を併用してもよい。
本発明において‘再刺激’とは、一定の培養期間が経過した後、培地にフィーダー細胞及び／又は抗－ＣＤ３抗体を添加してＮＫ細胞の増殖を再誘導することを意味する。
本発明に係るＮＫ細胞の生産のための培地としてはＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＸＶＩＶＯ ２０のような通常の動物細胞培養用培地を使用することができる。このような動物細胞培養用の培地に、必要に応じて、ヒト末梢血から単利されたＮＫ細胞、末梢血単核細胞、抗－ＣＤ３抗体及びインターロイキンから選択された一つまたは複数の成分を添加して使用してもよい。
特に、本発明のＮＫ細胞の生産方法において、懸濁培養時に細胞濃度及びサイトカインの濃度を一定に維持するために、一定の時間間隔で培地内のサイトカイン及び細胞濃度を測定することができ、その測定値によってサイトカインを含む培地を細胞濃度及びサイトカイン濃度に応じて提供してもよい。
また、前記培地には、血清又は血漿およびリンパ球の増殖を支持する追加の増殖因子が含まれ得る。
培地に添加する血清又は血漿の種類は、特に限定されず、様々な動物由来の市販のものを使用できるが、ヒト由来として自己由来のものであってもよい。例えば、末梢血単核細胞からリンパ球を増殖させるサイトカインの組合せ、又はリンパ球の増殖を刺激するレクチン類などを添加するなど、通常の技術者に周知の方法を用いることができる。
本発明に係る方法によって生産されたＮＫ細胞は、適切な賦形剤及び添加剤と共に治療用組成物として提供できる。このような組成物を治療が必要な患者に投与することによって治療効果を達成することができる。
また、ＮＫ細胞の生産のために細胞濃度を一定に維持させる培養方法を適用することによって細胞の異常増殖（ｏｖｅｒ ｇｒｏｗｔｈ）が防止でき、細胞を最適の状態で維持することができる。特に、凍結後に解凍した場合にも、高い細胞生存率と細胞殺害能を維持することができる。したがって、前記細胞は、追加の処理過程無しにも液体又は凍結状態で保存及び供給することができる。
本発明に係る方法によって生産されたＮＫ細胞及びこれを含む組成物は、腫瘍及び感染性疾患の治療に使用できる。本発明に係る方法で製造されたＮＫ細胞は、固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）及び血液癌を含む全てタイプの腫瘍に適用可能である。固形癌とは、血液癌とは違い、臓器（ｏｒｇａｎ）のしこりとして形成された癌を意味し、大部分の臓器で発生する癌がそれに含まれる。本発明に係るＮＫ細胞を用いて治療可能な腫瘍は特に限定はされず、胃癌、肝癌、肺癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌、リンパ腫などであるが、これらに限定されない。本発明において感染性疾患はウイルス又は病原菌の感染によって発生する疾患を意味し、呼吸器及び血液、皮膚接触などを通じて伝染して感染され得るすべての疾患を含む。このような感染性疾患の非制限的な例としては、Ｂ型及びＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）感染症、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザなどがあるが、これらに限定されない。
また、本発明は別の態様において、ＮＫ細胞を含む細胞培養液をバイオリアクターに接種するステップを含む、ＮＫ細胞の生産方法に関する。
本発明において“バイオリアクター”は、溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度、ｐＨ及び温度など、細胞培養に影響を及ぼす条件の連続した調節が可能な培養装置を指す。
具体的には、本発明で利用可能なバイオリアクターは撹拌型のバイオリアクターであり、例えば、Ｓｔｏｒｉｕｓ社のＢｉｏｓｔａｔを使用することができるが、これに限定されない。本発明における“撹拌型バイオリアクター”は、上記の培養条件の連続制御の他にも、適切な撹拌、すなわち撹拌力を制御できるバイオリアクターを意味し、具体的には、培地の連続供給も可能なバイオリアクターであり得る。より具体的には、本発明で利用可能なバイオリアクターは、培養器のインペラーなどの回転によって培養培地の撹拌がなされる形態のバイオリアクターであり得るが、これに限定されない。
前記撹拌型バイオリアクターを用いて、適切な培養条件、例えば適切な、又は最適の溶存酸素濃度、溶存二酸化炭素濃度及びｐＨの調節が可能であり、また、前記バイオリアクターを用いて培養温度範囲内で、特定の単位体積当たりの撹拌力下でＮＫ細胞を製造する場合、得られるＮＫ細胞の量と細胞の殺害能が有意に向上する。
撹拌型バイオリアクターを用いたＮＫ細胞の製造方法において、培養条件のうち、ｐＨは６．５～７．６、具体的には６．８～７．２、より具体的には６．９～７．１、最も具体的には７．０～７．０７の範囲であり、培養温度は２５～４０℃、具体的には３３～４０℃、より具体的には３４～３８℃、最も具体的には３５～３７．５℃の範囲であり得るが、これらに限定されない。
また、単位体積当たりの撹拌力は０．１～１００Ｗ／ｍ３、具体的には０．３～８０Ｗ／ｍ３、より具体的には５～６０Ｗ／ｍ３、最も具体的には１０～３０Ｗ／ｍ３の範囲であり得るが、これらに限定されない。
バイオリアクターを用いたＮＫ細胞の製造方法は、静置培養及び懸濁培養を順次に行って得られた細胞培養液をバイオリアクターに接種して、これを培養することによってなり得る。
接種直後のバイオリアクター内のＮＫ細胞の濃度、すなわち接種時にバイオリアクター内のＮＫ細胞濃度は０．１～２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、具体的には０．２～１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より具体的には０．８～１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、最も具体的には０．９～１．１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり得るが、これらに限定されない。
培養期間の間に標的（ターゲット）細胞濃度（添加物添加後の細胞濃度、Ｆｅｅｄｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）は、０．４～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、具体的には０．５５～０．８５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より具体的には０．６～０．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、最も具体的には０．６５～０．７５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり得るが、これらに限定されない。
バイオリアクターでのＮＫ細胞の培養中に、追加の培地などの添加物を培養培地に添加して培養培地の体積を増やすと、これによってＮＫ細胞濃度が希釈されて濃度が減少する。標的細胞濃度とは、添加物添加後の培養培地中のＮＫ細胞の濃度を意味する。
具体的には、前記バイオリアクターの接種に用いられる細胞培養液は、本発明のＮＫ細胞の製造方法で製造されたＮＫ細胞の培養液であり得るが、これに限定されるものではない。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
（実施例１）
懸濁培養によるＮＫ細胞成長確認
（１）ＮＫ細胞培養
懸濁培養によるＮＫ細胞成長確認
（１）ＮＫ細胞培養
健康なドナー（供与者）から採取した末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）からＣＤ３陽性細胞を除去し、フィーダー細胞（ＰＢＭＣ）を得るために、細胞をそれぞれ５×１０７個ずつ新しい５０ｍＬチューブに移し、１，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後、回収したフィーダー細胞は１×１０８個の細胞でバイアルに分離して、窒素タンクに凍結保管後、必要時に解凍して使用した。
ＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを得るために、５×１０７個の細胞を有する細胞ペレットに４００μＬのＭＡＣＳランニングバッファ（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ、韓国）と１００μＬのＣＤ３磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃｈ、韓国）を入れて４℃で２０分間反応させた。その後、２０ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファを入れて洗浄した後、１，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、再び２ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファに再度懸濁した。懸濁された細胞含有液をＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、韓国）にＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１３０－０４１－３０５）にローディングして細胞を分離し、最終的に２０ｍＬになるまでカラムを洗浄してＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ細胞を回収した。回収された細胞は２×１０７個の細胞でバイアルに分離して窒素タンクに凍結保管後、必要時に解凍して使用した。
凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを３７℃のウォーターバスで解凍した後に細胞数をカウントし、約２×１０７個の細胞を新しい５０ｍＬチューブに入れて１，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離によって得た細胞ペレットを、１０ｍＬの２体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，ＵＳＡ）１０ｍＬに懸濁した。
凍結されたフィーダー細胞を３７℃のウォーターバスで解凍した後に細胞数をカウントし、約１×１０８個の細胞を新しい５０ｍＬチューブに入れて１，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。細胞ペレットを２体積％の血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，ＵＳＡ）１０ｍＬに懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた。
前記不活性化フィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ、及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，ＵＳＡ）を添加し、３７℃の反応器（培養器）で５日間培養した。
前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，ＵＳＡ）を６０ｍＬ添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて培養した。
培養開始日から７日目に細胞数をカウントし、培養中の細胞を基準に細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（前記７日間共培養中である細胞及び再刺激のために準備したフィーダー細胞）を３日間さらに共培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）して再刺激した。
３日間培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間培養した。
（２）静置培養及び懸濁培養のＮＫ細胞の成長確認
静置培養及び懸濁培養によるＮＫ細胞成長の違いを確認するために３７℃、５％ＣＯ２条件の培養器でＮＫ細胞を培養し、表１に示す静置培養及び懸濁培養条件で培養した。
条件＃１の場合、凍結フィーダー細胞及びＣＤ３陽性細胞が除去された凍結ＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、前記不活性化フィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日目に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクター（ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅａｃｔｏｒ）に入れて静置培養した。
培養開始７日後に細胞数をカウントし、細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿が含まれたＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（前記７日間共培養中である細胞及び再刺激のために準備したフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。
再刺激し、３日間静置状態で培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間静置培養した。
条件＃２と条件＃３の場合、凍結フィーダー細胞及びＣＤ３陽性細胞が除去された凍結ＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、前記不活性化フィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を含むチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日後に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて静置培養した。
培養開始日から７日目に細胞数をカウントし、培養中の細胞を基準に細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。この時、条件＃２では撹拌速度６０ｒｐｍで懸濁培養し、条件＃３では撹拌速度１６０ｒｐｍで懸濁培養した。
３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃４の場合、凍結フィーダー細胞及びＣＤ３陽性細胞が除去された凍結ＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、前記不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間、撹拌速度６０ｒｐｍで懸濁培養した。
培養５日後に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ，ＵＳＡ）６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて懸濁培養した。培養開始７日後に細胞数をカウントし、細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のため調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。
３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃１～４の総培養期間は１２日であった。
１２日間培養後、細胞の成長性を累積分裂レベル（ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ；ａＰＤＬ）及び成長倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）で比較し、図１に示した。細胞の累積分裂レベル（ａＰＤＬ）は、解凍後の細胞分裂レベルを意味し、成長倍数は、細胞が解凍後に何倍に育った（ｇｒｅｗ）かを意味する。１２日間静置培養した結果（条件＃１）に比べて７日間静置培養後に懸濁培養した条件（条件＃２及び＃３）の細胞成長が優れた。しかし、解凍直後から懸濁培養した条件（条件＃４）では優れた効果を示さなかった。７日間静置培養後に懸濁培養した条件も撹拌速度によって細胞成長に差が見られ、１６０ｒｐｍ（条件＃３）で最高の細胞成長を示した。
（３）懸濁培養転換時間に応じたＮＫ細胞成長の確認
懸濁培養転換時点によるＮＫ細胞成長の差があるか確認するために３７℃、５％ＣＯ２条件下でのインキュベーターで培養した。
懸濁培養転換時点に対する培養条件（条件＃１～４）は表２にまとめた。細胞を解凍した後それぞれ３日間、５日間及び７日間静置培養をしてから懸濁培養した。懸濁培養時に撹拌速度はいずれも８０ｒｐｍとした。
培養は以下のように行った。
条件＃１（対照群）の場合、懸濁培養を行わなかった。凍結フィーダー細胞及びＣＤ３陽性細胞が除去された凍結ＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して、３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日後にシェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて静置培養した。
培養開始後７日目に細胞数をカウントし、培養中の細胞を基準に細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。
再刺激し、３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃２の場合、凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、前記不活性化フィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞をチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で３日間静置培養した。
培養３日後にシェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて撹拌速度８０ｒｐｍで４日間懸濁培養した。
その後、細胞数をカウントし、培養中の細胞を基準に細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。
３日間の懸濁培養後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃３の場合、凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日後にシェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて８０ｒｐｍで２日間懸濁培養した。
培養開始後７日目に細胞数をカウントし、細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃４の場合、凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日後に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を６０ｍＬ添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて静置培養した。
培養開始後７日目に細胞数をカウントし、培養中の細胞を基準に細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。この時、撹拌速度８０ｒｐｍで懸濁培養した。
３日間の懸濁培養後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃１～４において合計１２日間培養を行った後、累積分裂レベル及び成長倍数を比較した。
その結果、図２に示すように、静置培養に比べて細胞解凍後３日後、５日後及び７日後に懸濁培養された細胞では、優れた細胞成長を示した。フィーダー細胞による刺激の５日後に最高の細胞成長を示したが、刺激後３～７日間における有意差はなかった。
（４）撹拌速度に対するＮＫ細胞成長の調査
懸濁培養時の撹拌速度に応じたＮＫ細胞の成長を調べるために３７℃、５％ ＣＯ２条件のインキュベーターで培養した。
撹拌速度に対する培養条件は、表３にまとめた。
条件＃１の場合、対照群として懸濁培養を行わなかった。凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、前記不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日目に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を６０ｍＬ添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて静置培養した。
培養開始後７日目に細胞数をカウントし、培養中の細胞を基準に細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。
３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
条件＃２及び条件＃３の場合、凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を、フィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日後に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターで２日間懸濁培養し、条件＃２では、撹拌速度８０ｒｐｍで懸濁培養し、条件＃３では、撹拌速度１６０ｒｐｍで懸濁培養した。
培養開始後７日目に細胞数をカウントし、細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製したフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
合計１２日間に培養を行って累積分裂レベル及び成長倍数を比較し、その結果を図３に示した。
実施例１の（２）結果と合わせて、懸濁培養時の撹拌速度が６０～１６０ｒｐｍである場合、静置培養に比べて高い細胞成長を示し、８０～１６０ｒｐｍでは細胞成長に有意な変化は見られなかった。
（実施例２）
フィーダー細胞を用いた反復刺激（再刺激）時点によるＮＫ細胞成長の調査
フィーダー細胞を用いた反復刺激（再刺激）時点によるＮＫ細胞成長の調査
ＮＫ細胞培養においてフィーダー細胞の再刺激の開始時を調査するために、下記のように一定累積分裂レベルに到達した時に、フィーダー細胞の再刺激を行った。培養は、実施例１の（１）と同様に３７℃、５％ ＣＯ２条件の培養器で行ったが、フィーダー細胞の再刺激は、本実施例では培養開始７日後ではなく、累積ＰＤＬ（（ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ；ａＰＤＬ）がそれぞれ２～３回、３～４回、４～５回、及び５～６回に到達した時点に変更した（表４）。
培養は次のように行った。
凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３をフィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日後に前記シェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて１６０ｒｐｍで懸濁培養した。
細胞数をカウントして累積ＰＤＬ（ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ；ａＰＤＬ）がそれぞれ２～３回、３～４回、４～５回、そして５～６回に到達した時に、細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、準備した２つの細胞（共培養した細胞及び再刺激のために調製したフィーダー細胞）を３日間共培養して再刺激した。３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養し、累積分裂レベル及び成長倍数を比較した（表４）。
累積分裂レベルは、解凍後の細胞分裂レベルの尺度であり、成長倍数は、解凍から何倍成長したかを意味する。
図４に示すように、全てのドナー（ｄｏｎｏｒ Ａ～Ｅ）においてａＰＤＬ ４－５でフィーダー細胞の再刺激を与える場合に最高の細胞成長を示し、ａＰＤＬ ５－６においてフィーダー細胞を再刺激した場合、ａＰＤＬ ４－５で再刺激した場合と比べて細胞成長が減少することを確認した。
回帰モデルは、ドナー、フィーダー細胞の再刺激時点（累積分裂レベル基準）、及びフィーダー細胞の再刺激時点の二乗項（累積分裂レベル基準）を入力値として導出した。回帰モデルの出力値は、培養１２日目の累積分裂レベルであり、導出に用いた統計プログラムはＪＭＰ１３である。回帰モデルのＲ２及びＲ２
ａｄｊはそれぞれ０．９０及び０．８８であって、Ｐ値は０．００１以下と統計的に有意であることを確認した。フィーダー細胞の再刺激時点及びフィーダー細胞の再刺激時点の二乗項もＰ値がいずれも０．００１以下であり、統計的に有意であることを確認した。プロファイルを図５で示されるように予測モデルを活用して導出した。導出された結果を見ると、頂点が約４．３付近の放物線を描いており、累積分裂レベルの基準にフィーダー細胞の再刺激に最適な時間があることを確認した。
（実施例３）
撹拌型バイオリアクター工程の開発及び特性評価
撹拌型バイオリアクター工程の開発及び特性評価
本実施例では、ＮＫ細胞を均一な環境下で大量培養できるバイオリアクターを開発し、その特性を分析した。
（１）撹拌型バイオリアクターの撹拌速度によるＮＫ細胞成長の調査
約１２日間培養されたＮＫ細胞を撹拌型バイオリアクターに接種して流加式培養法を用いて最大２１日間培養した。
約１２日間培養されたＮＫ細胞を撹拌型バイオリアクターに接種して流加式培養法を用いて最大２１日間培養した。
培養方法は次の通りである。
凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後５日間静置培養してから懸濁培養（撹拌速度１６０ｒｐｍ）に変更して培養し、合計１２日間培養した。
凍結フィーダー細胞及び凍結されたＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを解凍後、フィーダー細胞をガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射してフィーダー細胞を不活性化させた後、不活性化されたフィーダー細胞とＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣを共培養するために、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３をフィーダー細胞を保持するチューブに添加し、シェイクフラスコに２０ｍＬのフィーダー細胞、２０ｍＬのＣＤ３陽性細胞が除去されたＰＢＭＣ及び２０ｍＬの１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地を添加して３７℃の培養器で５日間静置培養した。
培養５日目にシェイクフラスコに５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地６０ｍＬを添加して細胞を希釈した後、適切な培養リアクターに入れて２日間撹拌速度１６０ｒｐｍで懸濁培養した。
培養開始後７日目に細胞数をカウントし、細胞濃度が２×１０５～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈した。フィーダー細胞の再刺激のために、５倍のフィーダー細胞を１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地に懸濁した後、ガンマ線照射装置で約２０００ｃＧｙで照射して不活性化させ、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を添加した後、準備した２つの細胞（７日間共培養した細胞及び再刺激のために調製されたフィーダー細胞）を３日間さらに共培養して再刺激した。３日間懸濁培養した後、細胞数をカウントし、５～１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように、５００～１，０００ＩＵのＩＬ－２及び１体積％の血漿を含むＣｅｌｌＧｒｏ培地で希釈し、２日間懸濁培養した。
１２日間培養したＮＫ細胞を撹拌型バイオリアクターに接種して、最大２１日間流加式培養した。
撹拌型バイオリアクターは、培養温度３７℃、ｐＨ ７．０５、ＤＯ ５０％に設定し、接種した細胞濃度は０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。接種後１～３日間隔に培地を、細胞濃度が１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように添加した。バイオリアクターの撹拌速度はＰ／Ｖ（ｐｏｗｅｒ ｐｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）基準に０．３Ｗ／ｍ３、４．８Ｗ／ｍ３、２０．６Ｗ／ｍ３及び５４．６Ｗ／ｍ３に設定した。８日間培養後に培養を終了し、培養終了時に累積分裂レベル及び成長倍数を図６に示すように比較した。撹拌速度によって細胞成長に差が見られ、２０．６Ｗ／ｍ３で最高の成長性を示した。また、培養終了時点に、培養ＮＫ細胞の力価（細胞殺害能）を下記（２）の方法で測定したとき、最高の力価は２０．６Ｗ／ｍ３であることを確認した。
（２）ｉｎ－ｖｉｔｒｏでの細胞殺害能の測定
ターゲット腫瘍細胞株（Ｋ５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２４３）を回収し、３×１０６個の細胞を１５ｍＬチューブに入れて１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。遠心分離によって得た細胞ペレットを１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ培地に懸濁した後、１ｍＬの腫瘍細胞株を新しい１５ｍＬチューブに移し、１ｍＭ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ，Ｃ３４８５２）を３０μＬ添加した。前記１５ｍＬチューブをアルミホイルで遮光し、３７℃インキュベーターで１時間染色した。Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ染色が終わった腫瘍細胞株は１０ｍＬのＲＰＭＩ培地を入れて洗浄し、１，２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、細胞ペレットを１０ｍＬのＲＰＭＩ培地に細胞濃度が１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように懸濁した。
凍結ＮＫ細胞を解凍後に１５ｍＬチューブに移して１，２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、細胞ペレットをターゲット腫瘍細胞株に対して所望の比率でＲＰＭＩ培地に懸濁した。準備したターゲット腫瘍細胞株とＮＫ細胞株を丸底９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に１００μＬずつ混ぜて分注した。各ウェルを３個ずつ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）調製され、平均が取られた。前記プレートに光を遮断して３７℃のインキュベーターで４時間反応させた後、プレートを２，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離した。各ウェルの培養液１００μＬを９６ウェルブラックプレート（ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ ｐｌａｔｅ）に移した後、蛍光測定機でＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ（４８５ｎｍ）／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ（５３５ｎｍ）、０．１秒間蛍光値を測定した。
（３）撹拌型バイオリアクターの工程の最適化
撹拌型バイオリアクターの工程を最適化するために、実施例３の（１）の培養方法によって約１２日間ＮＫ細胞を培養し、１２日間培養したＮＫ細胞を撹拌型バイオリアクターに接種し、流加式培養法を用いて最大２２日間培養した。
本実施例に用いた培養条件は表５に示した。このうち、細胞成長及びＮＫ細胞の力価（細胞殺害能、実施例３の（２）の方法）に影響を与える主要要因である温度、ｐＨ、接種細胞濃度及び添加物添加後の標的細胞濃度を変数にする４つのパラメータを用いてＤＯＥ分析（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｄｅｓｉｇｎｓ、９つの条件、表６）を行った。培養期間中は添加物を１～３日間隔で添加し、８～１０日培養後に培養を終了した。
実験を完了した後、累積ＰＤＬ、収穫（Ｈａｒｖｅｓｔ）時の細胞濃度及び力価（１０：１及び３：１）を測定し、ＪＭＰ１１（Ｐ－ｖａｌｕｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｐ≧０．２５）で分析した。Ｒ２及びＲ２
ａｄｊがそれぞれ０．９０以上及び０．８０以上であって、Ｐ値も０．０５以下で統計的に有意であった。
分析結果は表７に示した。Ｐ値（Ｐ ｖａｌｕｅ）が０．０５以下のパラメータは結果値（累積分裂レベル及び力価）に統計的に有意な影響を与えることを意味する。４つのプロセス（工程）パラメータ（温度、ｐＨ、接種細胞濃度及び標的細胞濃度）すべてが結果に有意に影響を与えることが確認できた。図７に示すように、分析された結果に基づいて予測プロファイラがバイオリアクターのプロセスパラメータの最適点を確認した。累積分裂レベル、力価（１０：１）及び力価（３：１）をともに最高に維持するための培養条件は、接種細胞濃度１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、標的細胞濃度０．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、温度３６℃及びｐＨ７である。
以上、本発明の特定の態様を詳細に説明したが、当業者にとって、このような特定の説明は好ましい実施様態であるだけで、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかであろう。本発明の実質的な範囲は添付の請求項及びそれらの均等物に規定される。
本発明に係る方法によってＮＫ細胞を生産する場合、既存の方法に比べて臨床親和的に高い細胞殺害能及び細胞生存率を有するＮＫ細胞を高純度及び高効率に短期間で生産でき、ＮＫ細胞治療薬の生産性を増大させることができる。
Claims (5)
- ＮＫ細胞を含む細胞培養液を単位体積当たり撹拌力が０．１～１００Ｗ／ｍ３の範囲で制御されたバイオリアクターに接種するステップを含むＮＫ細胞の生産方法。
- 前記バイオリアクターは、ｐＨが６．５～７．６、培養温度が２５～４０℃の範囲で制御される、請求項１に記載のＮＫ細胞の生産方法。
- 前記細胞培養液は静置培養及び懸濁培養を順次に行って得られる、請求項１に記載のＮＫ細胞の生産方法。
- 前記接種時のバイオリアクター内ＮＫ細胞の濃度は、０．１～２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、請求項１に記載のＮＫ細胞の生産方法。
- ＮＫ細胞の培養期間の間に標的細胞濃度（添加物の添加後の細胞濃度、もしくは供給標的細胞濃度（Ｆｅｅｄｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ））は、０．４～１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬである、請求項１に記載のＮＫ細胞の生産方法。
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