KR20190111804A - 자연살해세포의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 NK(Natural Killer) 세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 CD3 양성 세포가 제거된 말초혈액 단핵구를 지지세포와 함께 증식시키고, 말초혈 단핵구가 특정 누적 분열 횟수에 도달하는 시점에 지지세포로 재자극하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 생물반응기를 이용하여 적절한 배양 조건 하에서 NK 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법은, 기존 방법에 비해 임상친화적인 방법으로 높은 세포 살해능 및 세포생존율을 갖는 NK 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, NK 세포치료제 생산성을 증대시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명은 또한, 생물반응기를 이용하여 적절한 배양 조건 하에서 NK 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 제조방법은, 기존 방법에 비해 임상친화적인 방법으로 높은 세포 살해능 및 세포생존율을 갖는 NK 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, NK 세포치료제 생산성을 증대시킬 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 NK(Natural Killer) 세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 CD3 양성 세포가 제거된 말초혈액 단핵구를 지지세포와 함께 증식시키고, 말초혈 단핵구가 특정 누적 분열 횟수에 도달하는 시점에 지지세포로 재자극하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 생물반응기를 이용하여 적절한 배양 조건 하에서 NK 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법에 대한 것이다.
NK 세포(자연살해세포)는 혈구세포의 약 10% 정도를 차지하고, 면역반응에 중요한 역할을 하는 림프구계 세포이다. NK 세포는 여러 기능을 수행하나, 특히 암세포나 외부에서 침입한 병원균에 감염된 세포 등을 죽이는 능력을 가지고 있어 종양화되거나 종양화가 진행되고 있는 비정상 세포를 제거하는 역할을 수행한다.
체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 정상상태에서 비활성화상태(inactivated state)로 존재하지만, 실제로 NK 세포를 치료용도로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에, 정상혈액으로부터 혹은 NK 세포가 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
체외에서 NK 세포를 활성화시키는 경우, NK 세포는 높은 세포독성(cytotoxicity)을 나타내는 것으로 확인되었고, 이는 NK 세포를 이용한 면역세포 치료 가능성을 확인시켜주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포를 다양한 암 종류, 특히 백혈병과 같은 혈액암(blood cancer) 환자를 대상으로 동종 골수이식 후에 투여하여 그 치료효과를 확인한 보고가 있다(Blood Cells Molecules & Disease, 33: p261-266, 2004).
한편, 상기와 같은 NK 세포의 치료제로서의 가능성에도 불구하고 체내에 존재하는 NK 세포의 수는 많지 않으므로, NK 세포를 치료용도로 사용할 수 있을 정도로 충분한 효능을 유지하면서 대량으로 생산하는 기술이 필수적이다. 그러나, NK 세포는 시험관 내에서(in-vitro) 대량 증식 및 배양이 제대로 이루어지지 않는다. 따라서 실제 유용한 수준으로 NK 세포를 증폭, 배양하는 기술에 대한 관심이 집중되고 있으며, 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직 임상에 적용 가능한 수준에는 미치지 못하고 있다.
NK 세포의 배양에는 기존 T 세포 증식/활성에 사용하였던 IL-2 뿐만 아니라 IL-15(J. Immunol., 167(6):p3129-3138, 2001; Blood, 106(1): p158-166, 2005, 대한민국공개특허공보 제2009-0121694호), LPS (J. Immunol.,165(1): p139-147, 2000), CD3을 자극하는 OKT-3 항체(Experimental Hematol., 29(1): p104-113, 2001)를 이용하는 연구가 진행되어 왔으나, 이러한 연구는 예전부터 사용되어 오던 IL-2 사용에 대한 변형 및 발전형태로 새로운 증식 물질을 찾은 것일뿐, 획기적인 증식 방법을 제시하지 못하고 있다. 일반적으로 IL-2 혹은 그 밖의 사이토카인 및 화합물(chemical)을 이용한 NK 세포 배양을 통해서는 초기 NK 세포에 비해 3~10 배 정도 밖에 세포수를 증가시키지 못하는 것으로 알려져 있다.
일부 연구자들은 종양 세포주를 지지세포(feeder cell)로 사용하여 NK 세포를 증폭시킨 사례도 보고한 바가 있다. 백혈병 세포주인 CTV-1을 지지세포로 사용하였으나 증식의 개선이 거의 없었으며(J. Immunol., 178(1): p85-94, 2007), EBV-LCL을 사용하여 21일간 배양한 경우, NK 세포가 490배 정도 증식된 것으로 보고된 바 있다(Cytotherapy,11(3): p341-355, 2009). 또한, K562 세포주에 4-1 BBL과 막 고정(membrane-bound) IL-15를 발현시킨 인공 항원제시세포(artificial APC(antigen presenting cell))를 사용하여 3주간 공배양한 결과, NK 세포의 증식이 277배 정도 증가되었다(Cancer Res.,69(9): p4010-4017, 2009). 최근에는 MICA, 4-1BBL, 및 IL-15를 K562 세포주에 발현시켜 3 주간 공배양하여 NK 세포를 평균 350배 증식시켰다는 보고도 있었으며(Tissue Antigens, 76(6): p467-475, 2010), K562 세포주에 막 고정된 IL-21을 발현시켜 7일 간격으로 재자극하며 2주간 배양하여 NK 세포를 평균 21,000배 증식시켰다는 최근 보고가 있었다. 그러나, 이러한 결과는 모두 NK 세포 증식에 암 세포주를 지지세포로 사용하는 등 임상 적용에 중요한 안전성을 보장하기에 적합하지 않은 방법을 사용하였고, 정상 세포가 아닌 특정 암 세포주를 지지세포로 사용하여 특정 암세포에 대한 프라이밍(priming) 특이성이 부여된 NK 세포를 생산한다는 한계를 가진다.
NK 세포의 분리를 거치지 않고 말초혈 백혈구 세포(peripheral blood leukocyte: PBL)로부터 NK 세포를 선택적으로 증폭시키는 방법으로 얻어진 세포군은 순수 NK 세포군에 비하여 세포 살해능이 떨어지고, 순수한 NK 세포뿐아니라, 자가 MHC 분자에 의하여 자기(self)와 비자기(non-self)를 인식하는 T-세포(T-cell)도 포함되어 있다. 따라서 T 세포를 제거하지 않는한 용도가 자가이식에 한정될 수밖에 없는 문제점이 있다.
최근에는 NK 세포만을 순수하게 분리한 다음, 지지세포(feeder cell)를 사용하면서 적절한 자극을 주어 NK 세포를 증폭하는 방법과 전체 PBL 또는 말초혈 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 이용하여 NK 세포를 선택적으로 증폭하는 방법 등이 개발되어 왔다. 또한, NK 세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지를 이용하여, 말초혈백혈구세포의 존재 하에 배양하는 공정을 포함하는, NK 세포의 배양방법이 개발되어 보고된 바도 있다(대한민국 공개특허공보 제2010-0011586호).
NK 세포를 동종에 적용하기 위한 일반적 증식 과정은 CD3+ T 세포를 자성으로 제거 (magnetic depletion)하고, CD56+ NK 세포를 증식시키는 2 단계 연속 공정에서 시작한다. NK 세포의 증식을 자극하기 위하여, PBMCs [Cytotherapy 12: 750-763, 2010] 또는 EBV-LCLs [Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell lines]과 같은 불활성화 지지세포 (irradiated feeder cells)가 종종 사용된다. 불활성화 지지세포는 체액성 인자 및 직접적인 세포간 접촉(direct cell-to-cell contact)을 통해 NK 세포를 자극한다(Blood 80: 2221-2229,1992).
본 발명자들은 NK 세포를 대량으로 증식 및 활성화하기 위하여, CD3+ T 세포를 자성 제거하는 단일 단계를 거친 후, T 세포가 제거된 PBMCs를 자극하고 OKT3 및 IL-2 존재 하에서 반복적으로 불활성화 지지세포와 함께 증식시켜, 고순도의 CD3-CD16+CD56+ NK 세포 집단을 제조한 바 있다(대한민국 등록특허 제1,644,984호). 그러나, 상기 방법도 고순도의 NK 세포를 대량으로 확보하는 데에는 한계가 있었다.
이에, 본 발명자들은 고순도의 높은 살상력을 갖는 NK 세포를 대량으로 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, CD3 양성 세포가 제거된 말초혈 단핵구를 지지세포와 함께 정치배양하여 자극시키고, 말초혈 단핵구의 누적 분열 횟수(aPDL)가 2 내지 6이 되는 시점에 지지세포로 재자극한 후, 현탁배양하는 경우, NK 세포의 세포성장이 증대되고, 세포 수득율이 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
또한, 본 발명자들은 배양 배지 내의 용존 산소 농도, 용존 이산화탄소 농도, pH 및 온도의 조절이 가능할 뿐 아니라, 적절한 교반이 수행될 수 있으며 배지의 연속적인 공급 등이 가능한 생물반응기를 이용하여 적절한 배양 조건 하에서 NK 세포를 배양할 경우, 수득되는 NK 세포의 양과 제조된 NK 세포의 살해능이 현저하게 향상되는 것을 최초로 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포 배양액 내 단핵구가 특정 누적 분열 횟수에 도달하는 시점에 지지세포로 재자극함으로써, NK 세포의 세포성장이 현저히 증대되고, NK 세포 수득율을 크게 향상시킬 수 있는 NK 세포의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물반응기를 이용하여 적절한 배양 조건을 유지하면서 NK 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) NK 세포를 포함하는 세포 배양액을 지지세포로 자극한 후 정치배양하는 단계;
(b) 상기 정치배양된 세포 배양액을 현탁배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양액 내 단핵구의 누적 분열 횟수가 3 내지 5가 되는 시점에 상기 현탁배양된 세포 배양액에 지지세포를 첨가하여 재자극시킨 후, 현탁배양하는 단계;
를 포함하는 NK 세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 교반형 생물반응기를 이용하여 적절한 배양 조건을 유지하면서 NK 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법을 통해 NK 세포를 제조할 경우, 기존 방법에 비해 임상친화적으로 높은 세포 살해능 및 세포생존율을 갖는 NK 세포를 고순도 및 고효율로 단기간에 생산할 수 있어, NK 세포치료제 생산성을 증대시킬 수 있다.
도 1은 정치배양 및 현탁배양에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타낸 것으로, 0 rpm은 세포해동 후 12일차까지 정치배양한 조건이고, 0→60 rpm은 세포해동 후 7일차까지 정치배양 후 60 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이며. 0→160 rpm은 세포해동 후 7일까지 정치배양 후 160 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 그리고 60 rpm은 세포해동 후 12일차까지 60 rpm의 교반속도에서 현탁배양한 조건이다.
(a)는 정치배양 및 현탁배양에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 정치배양 및 현탁배양에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 2는 현탁배양 전환 시점에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타낸 것으로, 0 rpm은 세포해동 후 12일차까지 정치배양한 조건이다. 0→80 rpm (3 days)은 세포해동 후 3일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 0→80 rpm (5 days)은 세포해동 후 5일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 그리고 0→80 rpm (7 days)은 세포해동 후 7일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다.
(a)는 현탁배양 전환시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 현탁배양 전환시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 3은 교반속도에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타내는 도면으로, 0 rpm은 세포해동 후 12일차까지 정치배양한 조건이다. 0→80 rpm (5 days)은 세포해동 후 5일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 그리고 0→160 rpm (5 days)은 세포해동 후 5일차까지 정치배양 후 160 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다.
(a)는 교반속도에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 교반속도에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 4는 지지세포의 재자극 시점에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타내는 도면이다. aPDL 2-3은 누적 분열횟수가 2-3회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건이고, aPDL 3-4는 누적 분열횟수가 3-4회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건이며, aPDL 4-5는 누적 분열횟수가 4-5회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건이고, aPDL 5-6은 누적 분열횟수가 5-6회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건으로, 총 5명의 공여자에게 받은 세포를 비교하였다.
(a)는 지지세포의 재자극 시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 지지세포의 재자극 시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 5는 공여자 및 지지세포의 재자극 시점에 대한 해동 후 12일차 누적 분열횟수의 예측 프로파일러를 나타낸 것이다.
도 6은 교반형 생물배양기의 교반속도에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타내는 도면으로, 단위부피당 교반력은 0.3 W/m3, 4.8 W/m3, 20.6 W/m3 및 54.6 W/m3이었으며 총 2명의 공여자에게 받은 세포를 비교하였다.
(a)는 교반형 생물배양기의 단위부피당 교반력에 따른 NK 세포성장을 배양 종료 시점의 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 교반형 생물배양기의 단위부피당 교반력에 따른 NK 세포성장을 배양 종료 시점의 성장배수로 도식화한 도면이며,
(c)는 교반형 생물배양기의 단위부피당 교반력에 따른 배양 종료 시점의 역가 (세포 살해능)를 도식화한 도면이다.
도 7은 교반형 생물배양기의 온도, pH, 접종 세포 농도 및 목표 세포 농도에 대한 누적 분열횟수, 배양 종료시점의 세포 농도, 역가 (10:1) 및 역가 (3:1)의 예측 프로파일러를 나타낸 것이다.
(a)는 정치배양 및 현탁배양에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 정치배양 및 현탁배양에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 2는 현탁배양 전환 시점에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타낸 것으로, 0 rpm은 세포해동 후 12일차까지 정치배양한 조건이다. 0→80 rpm (3 days)은 세포해동 후 3일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 0→80 rpm (5 days)은 세포해동 후 5일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 그리고 0→80 rpm (7 days)은 세포해동 후 7일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다.
(a)는 현탁배양 전환시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 현탁배양 전환시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 3은 교반속도에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타내는 도면으로, 0 rpm은 세포해동 후 12일차까지 정치배양한 조건이다. 0→80 rpm (5 days)은 세포해동 후 5일차까지 정치배양 후 80 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다. 그리고 0→160 rpm (5 days)은 세포해동 후 5일차까지 정치배양 후 160 rpm의 교반속도에서 12일차까지 현탁배양한 조건이다.
(a)는 교반속도에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 교반속도에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 4는 지지세포의 재자극 시점에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타내는 도면이다. aPDL 2-3은 누적 분열횟수가 2-3회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건이고, aPDL 3-4는 누적 분열횟수가 3-4회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건이며, aPDL 4-5는 누적 분열횟수가 4-5회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건이고, aPDL 5-6은 누적 분열횟수가 5-6회일 때 지지세포의 재자극을 수행한 조건으로, 총 5명의 공여자에게 받은 세포를 비교하였다.
(a)는 지지세포의 재자극 시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 지지세포의 재자극 시점에 따른 NK 세포성장을 해동 후 12일차 성장배수로 도식화한 도면이다.
도 5는 공여자 및 지지세포의 재자극 시점에 대한 해동 후 12일차 누적 분열횟수의 예측 프로파일러를 나타낸 것이다.
도 6은 교반형 생물배양기의 교반속도에 따른 NK 세포성장의 변화를 나타내는 도면으로, 단위부피당 교반력은 0.3 W/m3, 4.8 W/m3, 20.6 W/m3 및 54.6 W/m3이었으며 총 2명의 공여자에게 받은 세포를 비교하였다.
(a)는 교반형 생물배양기의 단위부피당 교반력에 따른 NK 세포성장을 배양 종료 시점의 누적 분열횟수로 도식화한 도면이고,
(b)는 교반형 생물배양기의 단위부피당 교반력에 따른 NK 세포성장을 배양 종료 시점의 성장배수로 도식화한 도면이며,
(c)는 교반형 생물배양기의 단위부피당 교반력에 따른 배양 종료 시점의 역가 (세포 살해능)를 도식화한 도면이다.
도 7은 교반형 생물배양기의 온도, pH, 접종 세포 농도 및 목표 세포 농도에 대한 누적 분열횟수, 배양 종료시점의 세포 농도, 역가 (10:1) 및 역가 (3:1)의 예측 프로파일러를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 기존의 고순도의 NK 세포 제조방법에 의해서는 NK 세포의 대규모 생산이 어려울 뿐 아니라, 제조된 NK 세포의 살해능이 저하되는 문제점을 해결하기 위한 새로운 NK 세포의 제조방법을 제공한다.
이에 따라 일 관점에서 본 발명은,
(a) NK 세포를 포함하는 세포 배양액을 지지세포로 자극한 후 정치배양하는 단계;
(b) 상기 정치배양된 세포 배양액을 현탁배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양액 내 단핵구의 누적 분열 횟수가 3 내지 5가 되는 시점에 상기 현탁배양된 세포 배양액에 지지세포를 첨가하여 재자극시킨 후, 현탁배양하는 단계;
를 포함하는 NK 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계 이후에, 추가적으로, (d) 배양된 NK 세포를 수득하는 단계가 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 현탁배양은 1 내지 30일, 구체적으로는 5 내지 21일간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 아울러, 상기 (b) 단계의 현탁배양은 상기 (a) 단계의 지지세포 자극 후 3 내지 7일 뒤에 개시할 수 있으며, 보다 구체적으로는 4 내지 6일 뒤에 개시할 수 있고, 가장 구체적으로는 5일 뒤에 개시할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서의 지지세포로 재자극하는 시점은, 누적 분열 횟수(aPDL)가 2 내지 6, 구체적으로는 3 내지 5, 보다 구체적으로는 4 내지 5, 더욱 구체적으로는 4.1 내지 4.6, 가장 구체적으로는 4.3이 되는 시점일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서의 현탁배양은 30~300 rpm, 구체적으로는 60~160 rpm의 교반 속도 하에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 70~90 rpm으로 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지지세포는 불활성화된 말초혈 단핵구 세포인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 지지세포(feeder cell)와 NK 세포를 포함하는 세포 배양액 내 단핵구 세포(seed cell)의 비율은 5:1 내지 1:15, 구체적으로는 2:1~1:10, 더욱 구체적으로는 1:1 내지 1:8, 가장 구체적으로는 1:4 내지 1:6이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 단계 (a)의 세포 배양액은 CD3 양성 세포가 제거된 말초혈 단핵구를 포함하는 배양액일 수 있으며, 이 경우 말초혈 단핵구가 원료세포(seed cell)가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 항-CD3 항체가 첨가된 배지에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항-CD3 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배양은 IL-2가 첨가된 배지에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 정치배양(stationary culture)은 배양기에서 교반(agitating) 또는 진탕(shaking) 없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 현탁배양(부유배양, suspension culture)이란 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다.
본 발명에서 정치배양을 위해 사용될 수 있는 반응기는 쉐이킹 플라스크, T-플리스크, 일회용 세포 배양 백(disposable cell culture bag) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서 현탁배양을 위해 사용될 수 있는 반응기는 쉐이킹 플라스크, 진탕 배양기, T-플라스크, 일회용 세포 배양 백 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성하기에 적합한 생물반응기로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 채택가능할 수 있는 어떠한 반응기라도 사용될 수 있다.
또한, 정치배양을 위한 반응기와 현탁배양(부유배양)을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치배양을 위한 반응기와 현탁배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 현탁배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 반응기를 사용할 경우에는 정치배양이 완료된 후 배양물을 현탁배양을 위한 반응기로 옮기고 현탁배양할 수 있다.
이러한 현탁배양을 위한 배양기의 예로서는 GE Healthcare사의 Wave 생물반응기(Wave Bioreactor), ThermoFisher사의 일회용 생물반응기(Single-Use Bioreactor, SUB), Xcellerex사의 일회용 XDR 생물반응기(Single-Use XDR Bioreactor), Sartorius사의 일회용 생물반응기(BIOSTAT STR®), Nipro사의 세포 배양 백, PBS Biotech.사의 PBS 시리즈 세포배양기(PBS Mini, PBS3, PBS15, PBS80, PBS500 등, WO 07/111677A, WO08/133845A, WO 09/132192A 등 참조), 후지모리공업(주)의 세포배양백(cell culture bag), Erlenmeyer사의 일회용 쉐이킹 플라스크(Disposable Shake Flasks) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 PBS Biotech사의 PBS 시리즈 세포 배양기를 사용할 수 있다
본 발명에서의 '지지세포(feeder cell, 배양보조세포라고도 한다)'는 분열증식하는 능력은 없지만 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 NK 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 지지세포로는 유전자가 도입된 동물세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-세포, B-세포(B-cell) 또는 다단핵구(monocyte) 등이 있으며, 구체적으로는 자기 말초혈 단핵구 세포가 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용가능한 것으로 알려진 다른 지지세포들도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한없이 사용가능함은 당연한 것이다.
상기 지지세포로 이용되는 자기 말초혈 단핵구 세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보할 수 있다 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법이 사용될 수 있다. 이와 같이 불활성화된 지지세포는 분리된 T-세포를 포함한다. 본 발명과 같이 지지 세포를 사용하는 증식 방법은 NK 세포를 순수 분리한 후 증식시키는 방법으로, 이후에도 계속 순수 NK 세포만 증식하게 된다는 장점이 있다.
본 발명에서의 항-CD3 항체란, T 세포 수용체(TCR)와 결합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 결합하는 항체로, CD3 분자는 TCR과 결합하여 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당한다.
본 발명에서 사용가능한 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한없이 이용가능하며, 예를 들어 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 구성된 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터루킨 류에서 선택된 하나 이상일 수 있는데, 인터루킨은 림프구나 단핵구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용가능한 인터루킨으로는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18) 및 인터루킨-21(IL-21)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 특히 IL-2를 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한없이 이용가능함은 자명하다.
본 발명의 정치배양 및 현탁배양을 위해 사용되는 항-CD3 항체의 배지 내 농도는 0.1~1,000 ng/ml, 구체적으로는 1~100 ng/ml, 더욱 구체적으로는 5~20 ng/ml이며, 사이토카인의 배지 내 농도는 10~2,000 IU, 구체적으로는 100~1,000 IU, 더욱 구체적으로는 약 200~700 IU이다.
본 발명에서의 '자극'이란 지지세포 등을 첨가하여 NK 세포의 증식을 유도하는 것을 의미하며, 항-CD3 항체가 함께 사용될 수도 있다.
본 발명에서의 '재자극'은 일정 배양 기간이 경과한 후, 배지에 지지세포 및/또는 항-CD3 항체를 다시 첨가하여 NK 세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 NK 세포의 제조를 위한 배지로는 CellGro 배지(Cellgenix), AIM-V 배지, RPMI1640 배지, XVIVO 20과 같은 통상의 동물세포 배양용 배지가 사용될 수 있다. 이러한 동물세포 배양용 배지에 필요에 따라 인간 말초혈로부터 분리한 NK 세포, 말초혈 단핵구 세포, 항-CD3 항체 및 인터루킨에서 선택된 하나 이상의 성분이 첨가되어 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 NK 세포 제조방법에 있어, 현탁배양시 세포 농도 및 사이토카인의 농도를 일정하게 유지하기 위하여, 일정 시간 간격으로 배지 내의 사이토카인 및 세포 농도를 측정하고 그 측정값에 따라 사이토카인이 포함된 배지를 세포 농도 및 사이토카인 농도에 맞추어 제공할 수 있다.
또한, 상기 배지에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양할 수도 있다.
배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 시판되는 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것일 수 있다. 예를 들어, 말초혈 단핵구 세포로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구 증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포를 적절한 부형제와 첨가제를 사용하여 치료용 조성물로 제공할 수 있다. 이러한 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 치료효과를 거둘 수 있다.
또한, NK 세포의 제조를 위해 세포 농도를 일정하게 유지시켜 주는 배양방법을 적용시킴으로써 세포의 과잉성장(over growth)을 방지할 수 있어 세포가 최적의 상태를 유지할 수 있다. 특히, 동결 후 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않고 높은 세포생존율과 세포 살해능을 유지할 수 있다. 따라서 추가적인 처리과정 없이도 액상 또는 동결 보관된 형태로 보관 및 공급이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포 및 이를 포함하는 조성물은 종양 및 감염성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK 세포는 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 종양에 적용이 가능하다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기(organ)에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다. 본 발명에 따른 NK 세포를 이용하여 치료가능한 종양은 특별한 제한은 없으며, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 등일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되는 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus:HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, NK 세포를 포함하는 세포 배양액을 생물반응기에 접종하는 단계를 포함하는 NK 세포의 제조방법에 대한 것이다.
본 발명에서 "생물반응기"는 용존 산소 농도, 용존 이산화탄소 농도, pH 및 온도 등 세포 배양에 영향을 미치는 일련의 조건의 연속적인 조절이 가능한 배양 장치를 의미한다.
구체적으로는, 본 발명에서 이용될 수 있는 생물반응기는 교반형 생물반응기이며, 일예로, bioreactor는 Storius사의 Biostat를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서의 "교반형 생물반응기"는 상술한 배양 조건의 연속적인 조절 외에도 적절한 교반, 즉 교반력의 조절이 이루어질 수 있는 생물 반응기를 의미하며, 구체적으로는 배지의 연속적인 공급도 가능한 생물반응기일 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 생물반응기는 보다 구체적으로는 배양기의 임펠러 등의 회전에 의해 배양 배지의 교반이 이루어지는 형태의 생물반응기일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 교반형 생물반응기를 이용하여, 적절한 배양 조건, 예를 들어 적절한, 또는 최적의 배양 배지의 용존 산소 농도, 용존 이산화탄소 농도 및 pH의 조절이 가능하고, 상기 생물반응기를 이용하여 배양 온도 범위 내에서, 특정 단위부피당 교반력 하에서 NK 세포를 제조할 경우, 수득되는 NK 세포의 양과 세포의 살해능이 현저하게 향상된다.
교반형 생물반응기를 이용한 NK 세포의 제조방법에 있어, 배양 조건 중에 pH는 6.5 내지 7.6, 구체적으로는 6.8 내지 7.2, 구체적으로는 6.9 내지 7.1, 가장 구체적으로는 7.0 내지 7.07의 범위이고, 배양 온도는 25 내지 40 ℃, 구체적으로는 33 내지 40 ℃, 더욱 구체적으로는 34 내지 38 ℃, 가장 구체적으로는 35 내지 37.5 ℃의 범위에서 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 단위부피당 교반력은 0.1 내지 100 W/m3, 구체적으로는 0.3 내지 80 W/m3, 더욱 구체적으로는 5 내지 60 W/m3, 가장 구체적으로는 10 내지 30 W/m3의 범위에서 이루어질 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
생물반응기에서의 NK 세포의 제조방법은 정치 배양 및 현탁배양을 순차적으로 수행하여 수득된 세포 배양액을 생물반응기에 접종하여, 이를 배양함으로써 이루어질 수 있다.
접종 직후의 생물반응기에서의 NK 세포의 농도, 즉 접종 시 생물반응기 내의 NK 세포 농도는 0.1 내지 2.0 x106 cells/mL, 구체적으로는 0.2 내지 1.5 x106 cells/mL, 더욱 구체적으로는 0.8 내지 1.2 x106 cells/mL, 가장 구체적으로는 0.9 내지 1.1 x106 cells/mL일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 기간동안 목표 세포농도(첨가물 첨가 후의 세포 농도, Feeding target cell density)는 0.4 내지 1.0 x 106 cells/mL, 구체적으로는 0.55 내지 0.85 x 106 cells/mL, 보다 구체적으로는 0.6 내지 0.8 x 106 cells/mL, 가장 구체적으로는 0.65 내지 0.75 x 106 cells/mL일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 목표 세포농도는 생물반응기에서의 NK 세포의 배양 과정 중에, 추가적인 배지 등의 첨가물이 배양 배지에 첨가되어 배양 배지의 부피가 증가하게 되며, 이에 의해 NK 세포 농도가 희석되어 감소하게 되는데, 이때 배양 배지 등의 첨가물의 첨가에 의한, 즉 첨가물 첨가 후의 배양 배지 중의 NK 세포의 농도를 의미한다.
구체적으로는 상기 생물반응기의 접종에 이용되는 세포 배양액은, 상술한 본 발명의 NK 세포 제조방법으로 제조된 NK 세포의 배양액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1.
현탁배양에
의한
NK
세포 성장 확인
(1)
NK 세포 배양
건강한 공여자로부터 채취한 말초혈 단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 CD3 양성 세포를 제거하고, 지지세포(PBMC)를 수득하기 위하여, 세포를 각각 5x107개씩 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 회수된 지지세포는 1x108개의 세포로 바이알에 분리하여 질소탱크에 동결보관 후 필요할 경우 해동하여 사용하였다.
CD3 양성 세포가 제거된 PBMC를 얻기 위하여 5x107개의 세포를 가지는 세포 펠렛에 400 μL의 MACS 러닝 버퍼 (running buffer, Miltenyi biotech, 한국)와 100 μL의 CD3 자기비드 (Miltenyi biotech, 한국)를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후, 20 mL의 MACS 런닝 버퍼를 넣어 세척한 뒤 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 다시 2 mL의 MACS 런닝 버퍼에 현탁하였다. 현탁된 세포 함유액을 VarioMACS (Miltenyi Biotech, 한국)에 CS 컬럼 (Miltenyi Biotech, 130-041-305)에 로딩하여 세포를 분리하고, 최종 20 mL이 될 때까지 컬럼을 세척하여 CD3 양성 세포가 제거된 PBMC 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 2x107개의 세포로 바이알에 분리하여 질소탱크에 동결보관 후 필요할 경우 해동하여 사용하였다.
동결되어 있는 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 37℃ 항온수조에서 해동한 후 세포 수를 측정하고 약 2x107개의 세포를 새로운 50 mL 튜브에 담아 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수득한 세포 펠렛을 10 mL의 2부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지(Cellgenix, USA) 10 mL에 현탁하였다.
동결되어 있는 지지세포를 37℃ 항온수조에서 해동한 후 세포 수를 측정하고 약 1x108개의 세포를 새로운 50 mL 튜브에 담아 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 2 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix, USA) 10 mL에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시켰다.
상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix, USA)를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 배양하였다.
상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix, USA) 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양(co-culture)하여 재자극하였다.
재자극하고 3일간 배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 배양하였다.
(2)
정치배양과 현탁배양의 NK 세포성장 확인
정치배양과 현탁배양에 따른 NK 세포 성장의 차이를 확인하기 위하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 NK 세포를 배양하였으며, 표 1에 나타낸 정치배양 및 현탁배양 조건에서 배양하였다.
조건 #1의 경우, 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 정치배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다.
재자극하고 3일간 정치상태로 배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 정치배양하였다.
조건 #2와 조건 #3의 경우, 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 정치배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다. 이때, 조건 #2의 경우는 교반속도 60 rpm으로 현탁배양하였으며, 조건 #3의 경우는 교반속도 160 rpm으로 현탁배양하였다.
재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #4의 경우 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후, 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 교반속도 60 rpm으로 현탁배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix, USA) 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 현탁배양하였다. 배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다.
재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #1~4의 총 배양기간은 12일이었다.
12일간 배양 후 세포의 성장성을 누적 분열 횟수 (accumulated population doubling level; aPDL) 및 성장 배수 (fold increase)로 비교하여, 도 1에 나타내었다. 세포의 누적 분열 횟수(aPDL)는 세포가 해동 후 몇 회 분열하였는지를 의미하며 성장 배수는 세포가 해동 후 몇 배 자랐는지를 의미한다. 12일간 정치배양한 결과(조건 #1)에 비하여 7일간 정치배양 후 7일차에 현탁배양으로 전환한 조건(조건 #2 및 #3)의 세포성장이 우수하였다. 하지만 해동 직후부터 현탁 배양한 조건(조건 #4)은 효과가 좋지 않았다. 7일간 정치배양 후 현탁배양한 조건도 교반속도에 따라 세포성장에 차이를 보였으며 160 rpm(조건#3)에서 가장 높은 세포성장을 나타냈다.
| 현탁배양 시점 및 교반 속도 조건 | ||||
| 조건# | 배양 용기 | 배양 환경 | 현탁배양 시점 | 교반 속도 (rpm) |
| 1 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 | - | 0 |
| 2 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 7일차 | 60 |
| 3 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 7일차 | 160 |
| 4 | 쉐이크 플라스크 | 현탁배양 | 해동 후 | 60 |
(3) 현탁배양 전환 시점 별 NK 세포성장 확인
현탁배양 전환 시점에 따른 NK 세포성장의 차이가 있는지 확인하기 위하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
현탁배양 전환 시점에 대한 배양 조건(조건 #1~4)은 표 2에 정리하였다. 세포를 해동한 후 각각 3일, 5일 및 7일간 정치배양을 하다가 현탁배양으로 변경하였으며, 현탁배양시 교반 속도는 모두 80 rpm에서 수행하였다.
배양은 다음과 같이 수행하였다.
조건 #1의 경우, 대조군으로 현탁배양을 수행하지 않았다. 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 정치배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다.
재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #2의 경우, 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 3일간 정치배양하였다.
배양 3일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 교반속도 80 rpm으로 4일간 현탁배양하였다.
그 후, 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다.
재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #3의 경우, 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 80 rpm에서 2일간 현탁배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다. 재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #4의 경우, 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 정치배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다. 이때, 교반속도 80 rpm으로 현탁배양하였다.
재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #1~4에서 배양은 총 12일간 수행하여 누적 분열 횟수 및 성장 배수를 비교하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 정치배양에 비하여 세포 해동 후 3일, 5일 및 7일 후에 현탁배양을 수행한 세포의 성장이 우수하였다. 지지세포 자극 5일 후가 가장 높은 세포 성장성을 보였지만 3-7일간의 편차는 크지 않았다.
| 현탁배양 시점 조건 | ||||
| 조건# | 배양 용기 | 배양 환경 | 현탁배양 시점 | 교반 속도 (rpm) |
| 1 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 | - | 0 |
| 2 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 3일차 | 80 |
| 3 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 5일차 | 80 |
| 4 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 7일차 | 80 |
(4) 교반속도에 대한 NK 세포성장 확인
현탁배양시의 교반속도에 따른 NK 세포의 성장성을 확인하기 위하여 37℃, 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
교반속도에 대한 배양 조건은 표 3에 정리하였다.
조건 #1의 경우, 대조군으로 현탁배양을 수행하지 않았다. 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 정치배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다.
재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
조건 #2 및 조건 #3의 경우, 동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 2일간 현탁배양하였으며, 조건 #2의 경우는 교반속도 80 rpm으로 현택배양하였고, 조건 #3의 경우는 교반속도 160 rpm으로 현탁배양 하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다. 재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하였다.
배양은 총 12일간 수행하여 누적 분열 횟수 및 성장 배수를 비교하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 1(2) 결과와 함께 분석하면 현탁배양시의 교반 속도가 60-160 rpm인 경우 정치배양 대비하여 높은 세포 성장을 보였으며, 80-160 rpm에서는 세포성장에 큰 차이를 보이지 않았다.
| 현탁배양시 shaker의 교반 속도 조건 | ||||
| 조건# | 배양 용기 | 배양 환경 | 현탁배양 시점 | 교반 속도 (rpm) |
| 1 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 | - | 0 |
| 2 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 5일차 | 80 |
| 3 | 쉐이크 플라스크 | 정치배양 → 현탁배양 | 해동 후 5일차 | 160 |
실시예
2. 지지세포를 이용한 반복 자극(재자극) 시점에 따른
NK
세포 성장성 평가
본 실시예는 NK 세포 배양에서 지지세포의 재자극 시점을 확인하기 위하여 하기와 같이 일정 누적 분열횟수에 도달했을 때 지지세포의 재자극을 수행하였다. 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였으며, 실시예 1(1)에서 배양 7일차에 수행하였던 지지세포의 재자극을 본 실시예에서는 누적 PDL((accumulated population doubling level; aPDL)이 각각 2-3회, 3-4회, 4-5회 그리고 5-6회에 도달한 시점으로 변경하였다 (표 4).
배양은 다음과 같이 수행하였다.
동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 160 rpm으로 현탁배양하였다.
세포수를 측정하여, 누적 PDL(accumulated population doubling level; aPDL)이 각각 2-3회, 3-4회, 4-5회 그리고 5-6회에 도달한 시점에, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다. 재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하고, 누적 분열 횟수 및 성장 배수를 비교하였다(표 4).
누적 분열횟수는 세포해동부터 특정 시점까지 몇회의 분열을 하였는지를 계산한 결과이고, 성장 배수는 세포 해동부터 특정시점까지 몇배의 성장을 하였는지 계산한 결과이다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 모든 공여자(donor A~E)에서 aPDL 4-5 시점에 지지세포의 재자극을 주는 것이 가장 높은 세포 성장을 하는 것을 보였으며 aPDL이 5-6에서 지지세포의 재자극을 주는 경우, aPDL이 4-5일 때에 재자극을 주는 것에 비해 세포 성장이 감소하는 것을 확인하였다.
공여자, 지지세포의 재자극 시점(누적 분열횟수 기준) 그리고 지지세포의 재자극 시점(누적 분열횟수 기준)의 제곱항을 입력 값으로 하여 회귀모델을 도출하였다. 회귀모델의 출력 값은 배양 12일차의 누적 분열횟수이며 도출에 사용한 통계 프로그램은 JMP13이다. 회귀모델의 R2 및 R2 adj은 각각 0.90 및 0.88로 모델로 적합하였고 P값이 0.001 이하로 통계적으로 유의한것을 확인하였다. 예측모델에 대한 지지세포의 재자극 시점 및 지지세포의 재자극 시점의 제곱항 역시 P 값이 모두 0.001 이하로 통계적으로 유의한 것을 확인하였다. 예측모델을 활용하여 프로파일러를 도 5와 같이 도출하였다. 도출된 결과를 보면 지지세포의 재자극 시점이 약 4.3을 기준으로 포물선을 그리고 있어 누적 분열횟수 기준으로 최적 지지세포의 재자극시점이 있음을 확인하였다.
| 지지세포를 이용한 반복 자극(재자극) 시점 | ||
| 조건# | 공여자 | 재자극 시점 (누적 PDL) |
| 1 | Donor A | 2-3 |
| 2 | 3-4 | |
| 3 | 4-5 | |
| 4 | Donor B | 2-3 |
| 5 | 3-4 | |
| 6 | 4-5 | |
| 7 | Donor C | 2-3 |
| 8 | 3-4 | |
| 9 | 4-5 | |
| 10 | Donor D | 3-4 |
| 11 | 4-5 | |
| 12 | 5-6 | |
| 13 | Donor E | 4-5 |
| 14 | 5-6 | |
실시예
3.
교반형
생물배양기 공정 및 특성 평가
본 실시예에서는 NK 세포를 균일한 환경에서 대량 배양할 수 있는 생물배양기 공정을 개발하고 그 특성을 분석하였다.
(1) 교반형 생물배양기의 교반속도에 따른 NK 세포성장 확인
약 12일간 배양된 NK 세포를 교반형 생물배양기에 접종하여 유가식 배양법을 사용하여 최대 21일까지 배양하였다.
배양방법은 다음과 같다.
동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 5일 간 정치배양을 하다가 현탁배양(교반속도 160 rpm)으로 변경하고, 배양하여 총 12일간 배양하였다.
동결보관된 지지세포와 동결보관된 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 해동 후 지지세포를 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 지지세포를 비활성화시킨 후, 상기 비활성화된 지지세포와 CD3 양성세포가 제거된 PBMC를 공배양하기 위하여, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 지지세포가 포함되어 있는 튜브에 첨가하고, 쉐이크 플라스크에 20 mL의 지지세포, 20 mL의 CD3 양성세포가 제거된 PBMC 및 20 mL의 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지를 첨가하여, 37℃ 배양기에서 5일간 정치배양하였다.
배양 5일차에 상기 쉐이크 플라스크에 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지 60 mL를 첨가하여 세포를 희석한 후 적절한 배양용기에 넣어 2일간 교반속도 160 rpm으로 현탁배양하였다.
배양 시작일로부터 7일째 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 세포농도가 2x105~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하였다. 지지세포 재자극을 위하여, 지지세포를 5 배수로 준비하여 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 약 2000 cGy로 조사하여 비활성화시키고, 500-1,000 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 첨가한 후, 준비된 두 세포(상기 7일째 공배양 중인 세포와 재자극을 위하여 준비한 지지세포)를 3일간 추가로 공배양하여 재자극하였다. 재자극하고 3일간 현탁배양한 후, 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500-1,000 IU의 IL-2와 1 부피% 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하고, 2일간 현탁배양하여, 총 12일간 배양하였다.
상기 12일간 배양된 NK 세포를 교반형 생물배양기에 접종하여 유가식 배양법을 사용하여 최대 21일까지 배양하였다.
교반형 생물배양기는 배양온도 37℃, pH 7.05, DO 50%로 설정하였으며 접종시 세포 농도는 0.5x106 cells/mL이었다. 접종 후 1~3일 간격으로 배지를 세포농도가 1.0x106 cells/mL이 되도록 첨가하여 주었다. 생물배양기의 교반속도는 P/V (power per volume) 기준으로 0.3 W/m3, 4.8 W/m3, 20.6 W/m3 및 54.6 W/m3으로 설정하였다. 8일간 배양 후 배양을 종료하였으며 배양 종료시 누적 분열 횟수 및 성장 배수를 도 6에서와 같이 비교하였다. 교반속도에 따라 세포성장에 차이가 나타났으며 20.6 W/m3에서 가장 높은 성장성을 보였다. 또한 배양 종료시점에 배양된 NK 세포의 역가(세포 살해능)를 하기 (2)의 방법으로 측정하였을 때 20.6 W/m3에서 가장 높은 측정값을 보이는 것을 확인하였다.
(2) 인-비트로 (in-vitro) 세포 살해능 측정
타겟 종양 세포주 (K562, ATCC CCL-243)를 회수하고 3x106 개의 세포를 15 mL 튜브에 담아 1,200 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리를 통해 수득한 세포 펠렛을 1x106 cells/mL의 농도로 RPMI 배지로 현탁한 뒤 1 mL의 종양 세포주를 새로운 15mL 튜브로 옮기고 1mM Calcein-AM (Molecular probe, C34852)을 30μL를 첨가하였다. 상기 15 mL 튜브를 은박지로 빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 1시간동안 염색하였다. Calcein-AM 염색이 끝난 종양 세포주는 10 mL의 RPMI 배지를 넣어 세척하고 1,200 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리한 뒤 세포 펠렛을 10 mL의 RPMI 배지로 현탁하여 세포농도가 1x105 cells/mL이 되도록 하였다.
NK 세포는 배양 후 동결된 세포를 해동한 뒤 15 mL 튜브에 담아 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 세포 펠렛을 타겟 종양 세포주에 대비하여 원하는 비율로 RPMI 배지에 현탁하였다. 준비된 타겟 종양 세포주와 NK 세포주를 둥근 바닥 96-웰 플레이트 (well plate)에 100 μL씩 섞어서 분주하였다. 각 웰을 3 개씩 (triplicate) 준비하여 평균값을 얻었다. 상기 플레이트에 빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 2,000 rpm에서 4℃에서 3 분간 원심분리하였다. 각 웰의 배양액 100 μL를 96-웰 블랙 플레이트(well black plate)로 옮긴 후 형광측정기에서 Excitation (485 nm)/Emission (535 nm), 0.1 초 조건에서 형광 값을 측정하였다.
(3) 교반형 생물배양기 공정의 최적화
교반형 생물배양기의 공정을 최적화하기 위해 실시예 3(1)의 배양 방법을 따라 약 12일간 NK 세포를 배양하였으며, 상기 12일간 배양된 NK 세포를 교반형 생물배양기에 접종하여 유가식 배양법을 사용하여 최대 22일까지 배양하였다.
본 실시예에 사용한 배양 조건은 표 5에 나타내었으며, 이 중 세포성장 및 NK 세포의 역가 (세포 살해능, 실시예 3(2)의 방법)에 영향을 주는 주요 요인인 온도, pH, 접종 세포 농도 및 첨가물 첨가 후의 목표 세포 농도를 변수로 하는 4개 파라미터를 사용하여 DOE 연구 (Definitive screening designs, 9 조건, 표 6)를 수행하였다. 배양 기간 동안 첨가물을 1~3일 간격으로 첨가하였으며 8~10일 배양 후 배양을 종료하였다.
| 생물배양기 공정 파라미터 | |||
| 파라미터 | 최소값 | 중간값 | 최대값 |
| 교반 속도 (rpm) | 260 | ||
| DO (%) | 50 | ||
| 온도 (℃) | 34 | 35.5 | 37 |
| pH | 6.8 | 7.0 | 7.2 |
| 접종 세포 농도 (x106 cells/mL) | 0.2 | 0.6 | 1.0 |
| 목표 세포 농도 (x106 cells/mL) | 0.4 | 0.7 | 1.0 |
| DOE 실험 조건 ( DSD , definitive screening designs) | ||||
| 조건# | 접종 세포 농도 (x106 cells/mL) |
목표 세포 농도 (x106 cells/mL) |
온도 (℃) |
pH |
| 1 | 0.6 | 1.0 | 37 | 7.2 |
| 2 | 0.6 | 0.4 | 34 | 6.8 |
| 3 | 1.0 | 0.7 | 37 | 6.8 |
| 4 | 0.2 | 0.7 | 34 | 7.2 |
| 5 | 1.0 | 0.4 | 35.5 | 7.2 |
| 6 | 0.2 | 1.0 | 35.5 | 6.8 |
| 7 | 1.0 | 1.0 | 34 | 7.0 |
| 8 | 0.2 | 0.4 | 37 | 7.0 |
| 9 | 0.6 | 0.7 | 35.5 | 7.0 |
실험을 완료한 후 누적 PDL, Harvest 시점의 세포농도 및 역가 (10:1 및 3:1)를 측정하였으며 JMP11 (P-value threshold (P = 0.25)로 분석하였다. R2 및 R2 adj이 각각 0.90 이상 및 0.80 이상으로 모델이 적합하였고 P value도 0.05 이하로 통계적으로 유의하였다.
분석 결과는 표 7에 나타내었고, P 값이 0.05 이하인 파라미터는 결과값 (누적 분열횟수 및 역가)에 통계적으로 유의한 영향을 준다는 의미이며 4개의 모든 공정 파라미터들 (온도, pH, 접종 세포 농도 및 목표 세포 농도)이 결과 값에 영향을 준다는 것을 확인할 수 있었다. 분석된 결과를 바탕으로 예측 profiler를 만들어, 도 7에 나타내었으며, 생물배양기 공정 파라미터들의 최적점을 확인하였다. 누적 분열횟수, 역가 (10:1) 및 역가 (3:1) 모두를 가장 높게 유지하기 위해서는 접종 세포 농도 1.0x106 cells/mL, 목표세포농도 0.7x106 cells/mL, 온도 36℃ 및 pH 7으로 배양하여야 한다.
| 성장 및 역가에 대한 생물배양기 공정 파라미터들의 유의성 확인 | |||
| 파라미터 | 누적 분열횟수 | 역가 (10:1, %) |
역가 (3:1, %) |
| R2 | 0.982 | 0.901 | 0.995 |
| R2 adj | 0.950 | 0.819 | 0.987 |
| P value | 0.003 | 0.006 | = 0.001 |
| Lack of fit (P value) | 0.339 | 0.981 | 0.275 |
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (16)
- 다음 단계를 포함하는 NK 세포의 제조방법:
(a) NK 세포를 포함하는 세포 배양액을 지지세포로 자극한 후 정치배양하는 단계;
(b) 상기 정치배양된 세포 배양액을 현탁배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양액 내 단핵구의 누적 분열 횟수가 3 내지 5가 되는 시점에 상기 현탁배양된 세포 배양액에 지지세포를 첨가하여 재자극시킨 후, 현탁배양하는 단계.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 현탁배양은 상기 (a) 단계의 지지세포 자극 후 3 내지 7일 뒤에 개시하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서, (c) 단계의 현탁배양은 30~300 rpm의 교반속도 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (a) 단계의 배양은 항-CD3 항체가 첨가된 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 항-CD3 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (a) 단계의 배양은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18) 및 인터루킨-21(IL-21)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 사이토카인이 첨가된 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 지지세포는 불활성화된 말초혈 단핵구 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)의 세포 배양액은 CD3 양성 세포가 제거된 말초혈 단핵구를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- NK 세포를 포함하는 세포 배양액을 생물반응기에 접종하는 단계를 포함하는 NK 세포의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 생물반응기는 pH를 6.5 내지 7.6, 배양 온도를 25 내지 40℃, 단위부피당 교반력을 0.1 내지 100 W/m3의 범위에서 조절하는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 세포 배양액은 정치배양 및 현탁배양을 순차적으로 수행하여 수득되는 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 접종시의 생물반응기 내 NK 세포 농도는 0.1 내지 2.0 x106 cells/mL 인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제9항에 있어서, NK 세포의 배양 기간 동안 목표 세포농도(첨가물 첨가 후의 세포 농도, Feeding target cell density)는 0.4 내지 1.0 x 106 cells/mL인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 세포 배양액은 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 NK 세포의 배양액인 것을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 NK 세포.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 NK 세포.
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