KR20140123503A - 자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물 - Google Patents
자연살해세포의 제조방법, 이러한 방법에 의해 제조된 자연살해세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자연살해세포(Natural Killer Cell)를 제조하는 방법, 그러한 방법으로 수득된 NK 세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK 세포는 높은 세포살상능(cytotoxicity)과 세포생존율을 유지하여 종양 및 감염성 질환에 대한 높은 치료 효과를 나타내며, 고효율 및 고농도로 체외배양이 가능하다. 또한, NK 세포의 제조를 위해 세포 농도를 일정하게 유지시켜 주는 배양방법을 적용시킴으로써 세포의 과잉 성장(over growth)을 방지할 수 있어 세포가 최적의 상태를 유지할 수 있다. 특히, 동결 후 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않고 높은 세포생존율과 세포살상능을 유지할 수 있어 추가적인 처리과정 없이도 액상 또는 동결 보관된 형태로 보관 및 공급이 용이하다.
본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK 세포는 높은 세포살상능(cytotoxicity)과 세포생존율을 유지하여 종양 및 감염성 질환에 대한 높은 치료 효과를 나타내며, 고효율 및 고농도로 체외배양이 가능하다. 또한, NK 세포의 제조를 위해 세포 농도를 일정하게 유지시켜 주는 배양방법을 적용시킴으로써 세포의 과잉 성장(over growth)을 방지할 수 있어 세포가 최적의 상태를 유지할 수 있다. 특히, 동결 후 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않고 높은 세포생존율과 세포살상능을 유지할 수 있어 추가적인 처리과정 없이도 액상 또는 동결 보관된 형태로 보관 및 공급이 용이하다.
Description
본 발명은 자연살해세포(Natural Killer Cell, 이하 'NK 세포'라 한다)를 제조하는 방법, 이러한 방법으로 수득된 NK 세포 및 이를 포함하는 종양 및 감염성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
암 치료를 위해 수술, 방사선 치료, 화학요법 등의 다양한 치료법이 개발되어 사용되고 있으나, 암의 종류 및 환자의 상태에 따라서는 상기 치료법의 적용이 어려운 경우가 있으며, 재발 가능성이 높다는 단점이 있다.
이에 따라, 환자의 면역기능을 이용한 면역치료(immunotherapy)에 대한 관심이 높아지고 있는데, 면역치료는 다양한 기능을 가진 면역세포들의 복잡한 상호작용을 통해 종양을 제거하는 특성을 이용하는 것이다. 암세포를 직접 제거하는 면역세포로는 NK 세포와 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 등이 있으며, 이들 효력세포(effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세포(antigenpresenting cell)로는 수지상세포(dendritic cell, DC)나 B 세포가 있다. 그밖에 각종 사이토카인(cytokine)을 분비하는 보조 T 세포(Helper T cell, Th cell), 조절 T 세포(Regulatory T cell, Treg cell) 등이 함께 관여하게 된다. 이들 중 NK세포는 면역세포 치료법 중에서 가장 효과가 빠르고 효율적인 면역세포로 중요시되고 있다.
NK 세포는 혈구세포의 약 10% 정도를 차지하고 있으며, 면역반응에 중요한역할을 하는 림프구계 세포의 하나로서, 여러 기능이 있지만, 특히 암세포나 외부에서 침입한 병원균에 감염된 세포 등을 죽이는 능력을 가지고 있어 종양화되거나 종양화가 진행되는 이상 세포를 제거하는 역할을 수행한다.
정상 상태에서 체내에 존재하는 대부분의 NK 세포는 비활성화 상태(inactivated state)로 존재하지만, 실제로 NK 세포를 치료용도로 이용하기 위해서는 활성화된 NK 세포가 필요하기 때문에 정상혈액으로부터 혹은 비활성화된 환자 혈액으로부터 NK 세포를 활성화시키는 연구가 활발히 진행되고 있다.
체외에서 NK 세포를 활성화시킴으로써 달성된 NK 세포의 높은 세포독성(cytotoxicity)은 NK 세포의 면역세포 치료 가능성을 확인시켜주었다. 체외에서 활성화된 NK 세포는 다양한 암 종류, 특히 백혈병과 같은 혈액암(blood cancer)을 대상으로 동종 골수이식 후에 투여함으로써 그 치료효과를 확인한 보고(Blood Cells Molecules & Disease, 33: p261-266, 2004)가 있다. 그러나, 혈액암이 아닌 고형암(solid cancer)에 대해서는 NK 세포에 대하여 아직 임상적으로 뚜렷한 치료효과가 입증되지 않고 있다. 구체적으로, NK 세포를 종양이 생기기 전부터 투여하여 종양의 생착을 방해 할 수 있다는 보고가 있으나 (Cancer Immunol. Immunother., 56(11): p1733-1742, 2007), 적합한 치료모델이라고 보기 어렵다. 또한, 복강으로 NK 세포를 투여하여 유방암 세포의 성장을 저해한 동물 실험결과도 있으나, NK 세포에 의한 효과인지가 불분명하다(Breast Cancer Res. Treatment, 104(3): p267-275, 2007).
한편, 상기와 같은 NK 세포의 암이나 감염성 질환의 치료제로서의 가능성에도 불구하고 체내에 존재하는 NK 세포의 수는 많지 않으므로, NK 세포를 치료용도로 사용될 수 있을 정도로 충분한 효능을 유지하면서 대량으로 생산하는 기술이 필수적이다. 그러나, NK 세포는 시험관 내에서(in-vitro) 대량 증식 및 배양이 제대로 이루어지지 않는다. 따라서 실제 유용한 수준으로 NK 세포를 증폭, 배양하는 기술에 대한 관심이 집중되고 있으며, 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직 임상에 적용 가능한 수준에는 미치지 못하고 있다.
NK 세포의 배양에는 기존 T 세포 증식/활성에 사용하였던 IL-2 뿐만 아니라 IL-15(J. Immunol., 167(6): p3129-3138, 2001; Blood, 106(1): p158-166, 2005, 대한민국공개특허공보 제2009-0121694호), LPS (J. Immunol.,165(1): p139-147, 2000), CD3을 자극하는 OKT-3 항체(Experimental Hematol., 29(1): p104-113, 2001)를 이용하는 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 이는 예전부터 사용되어 오던 IL-2 사용에 대한 변형 및 발전의 형태로 새로운 증식 물질을 찾았을 뿐, 획기적인 증식 방법을 제시하지는 못하였다. 일반적으로 IL-2 혹은 그 밖의 사이토카인 및 화합물(chemical)을 이용한 NK 세포 배양을 통해서는 초기 NK 세포에 비해 3~10 배 정도 밖에 세포수를 증가시키지 못하는 것으로 알려져 있다.
일부 연구자들은 종양 세포주를 지지세포(feeder cell)로 사용하여 NK 세포를 증폭시킨 사례도 보고한 바가 있다. 백혈병 세포주인 CTV-1을 사용하였으나 증식의 개선이 거의 없었으며(J. Immunol., 178(1): p85-94, 2007), EBV-LCL을 사용하여 21일간 배양한 것으로 평균 490배 정도 증식된 것으로 보고된 바 있다(Cytotherapy, 11(3): p341-355, 2009). 또한, K562 세포주에 4-1 BBL과 막 고정된(membrane-bound) IL-15를 발현시킨 인공 항원제시세포(artificial APC(antigen presenting cell))를 사용하여 3주간 배양한 결과, 평균 277배를 증가시켰는데 in vitro와 in vivo에서 높은 세포독성을 보였지만 세포사멸에 의한 제한된 증식을 보였다(Cancer Res., 69(9): p4010-4017, 2009). 최근에는 MICA, 4-1BBL, 및 IL-15를 K562 세포주에 발현시켜 3 주간 배양하여 평균 350배 증식시켰다는 보고도 있었으며(Tissue Antigens, 76(6): p467-475, 2010), K562 세포주에 막 고정된 IL-21을 발현시켜 7일 간격으로 재자극하며 2주간 배양하여 평균 21,000배 증식시켰다는 최근 보고가 있었다. 그러나, 모두 암 세포주를 지지세포로 사용하는 등 임상 적용에 중요한 안전성을 보장하기에 적합하지 않은 방법을 사용하였고, 정상 세포가 아닌 특정 암 세포주를 지지세포로 사용함으로써 특정 암세포에 대한 프라이밍(priming) 특이성이 부여된 NK 세포라는 한계를 가진다.
NK 세포의 분리를 거치지 않고 말초혈 백혈구 세포(peripheral blood leukocyte: PBL)로부터 NK 세포를 선택적으로 증폭시키는 방법으로 얻어진 세포는 순수 NK 세포군에 비하여 세포 살해능이 떨어지고, 순수한 NK 세포만이 아닌 자가 MHC 분자에 의하여 자기(self)와 비자기(non-self)를 인식하는 T-세포(T-cell)도 존재한다. 따라서, T 세포를 제거하지 않는 한 자가 이식에 한정될 수 밖에 없는 문제점이 있다. 최근에는 NK 세포만을 순수하게 분리한 다음, 지지세포(feeder cell)을 사용하면서 적절한 자극을 주어 증폭하는 방법과 전체 PBL 또는 말초혈 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell : PBMC)를 이용하여 NK 세포를 선택적으로 증폭하는 방법 등이 개발되어 왔다. 또한, NK 세포를 항-CD3 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지를 이용하여, 말초혈 백혈구 세포의 존재 하에 배양하는 공정을 포함하는, NK 세포의 배양방법이 개발되어 보고된 바도 있다(대한민국공개특허공보 제2010-0011586호).
동종에 적용하기 위한 일반적 증식 과정은 CD3+ T 세포의 자성 제거 (magnetic depletion) 및 CD56+ NK 세포 증식이라는 2가지 연속적 단계에서 시작한다. NK 세포 증식을 자극하기 위하여, PBMCs [Cytotherapy 12: 750-763, 2010], EBV-LCLs [Epstein-Barr virus-transformed lymphoblastoid cell lines]과 같은 불활성화 지지세포 (irradiated feeder cells)가 종종 사용된다. 불활성화 지지세포는 체액성 인자 및 직접적인 세포간 접촉 (direct cell-to-cell contact)를 통해 NK 세포를 자극한다[Blood 80: 2221-2229,1992].
본 발명에서, 본 출원의 발명자들은 임상적 사용을 위해 건강한 지원자들로부터 수득한 NK 세포를 대량으로 증식 및 활성화하기 위한 간단하면서도 효율적인 방법을 수립하였다. CD3+ T 세포를 자성 제거하는 단일 단계를 거친 후, T 세포가 제거된 PBMCs를 자극하고 OKT3 및 IL-2 존재하에서 반복적으로 불활성화 지지세포와 함께 증식한 결과, 동종 목적을 위해 바람직한 고순도의 CD3-CD16+CD56+ NK 세포 집단을 제조하였다.
한편, 알부민은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로 자연상태에서 존재하는 단순 단백질 중 분자량이 가장 적다. 일반적으로 생물학적 제제의 보존제로 사용되는 경우는 있지만, NK 세포의 안정성을 높이기 위하여 사용된 보고는 전혀 없다.
이상 살핀 바와 같이 다양한 NK 세포 배양 방법 들이 개발되어 왔지만, 아직까지도 면역세포치료에 적용하기 충분한 숫자의 NK 세포를 임상 친화적인 방법으로 안전하고 안정적으로 배양, 증식할 수 있는 방법 및 생산된 NK 세포를 장기간 안정적으로 보관하여 필요한 시기에 공급할 수 있는 기술에 대한 수요는 절실한 상황이다. 특히 살아있는 NK 세포를 치료용으로 사용하기 위해서는 그 활성이 유지되는 기간, 즉 유효기간이 수일에 지나지 않는 단점을 해결해야 하는데, NK 세포를 배양하여 제조한 후, 동결 보관하여 필요한 시점에 해동하여 제공함으로써 면역세포의 활용을 획기적으로 개선할 수 있는 기술에 대한 수요 또한 절실한 상황이다.
본 발명의 목적은 NK 세포를 임상친화적으로 효율적이고 안전하게 배양, 증식함으로써 높은 세포 살상능을 가지는 NK 세포를 단기간 내에 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 장기 보관 안정성이 향상된 NK 세포를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 약제학적 제형을 제공하는 것이다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 동결된 형태로 제품화되어 제공될 수 있으며, 해동 시에도 높은 NK 세포의 세포생존율 및 세포살상능이 유지될 수 있다.
이와 같은 특성에 따라 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포 및 이를 포함하는 조성물은 종양 및 감염성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 (i) 인간 말초혈액으로부터 말초혈 백혈구 세포 및 NK 세포를 분리하는 단계;
(ii) 항-CD3 항체, 사이토카인 및 지지세포를 포함하는 배양액 중에서 NK 세포를 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하는 단계;
(iii) 상기 단계 (ii)에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 다시 정치배양하여 세포간 접촉을 유도하는 단계; 및
(iv) 정치배양이 완료된 후, 정치 또는 부유 배양을 위해 필요한 사이토카인 등을 포함하는 배지를 세포에 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 방법에 의해 제조된 NK 세포에 관한 것이다.
본 발명은 상기 NK 세포를 포함하는 암 또는 감염성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 액상 또는 동결된 형태의 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 NK 세포 배양기술, 즉 지지세포를 사용하여 반복적으로 자극하면서 항-CD3 항체 및 사이토카인을 포함하는 배지에서 정치배양한 후, 다시 부유배양하여 NK 세포를 제조할 경우, 기존 방법에 비해 임상친화적인 방법으로 고순도 및 높은 세포살상능 및 세포생존율을 갖는 NK 세포를 고효율로 단기간에 생산 가능하며, 본 발명에 따른 제조방법으로 수득된 NK 세포는 세포생존율과 세포살상능이 장기간 안정적으로 유지될 수 있어 장기 보관성이 우수하다는 장점이 있다.
특히, 본 발명의 방법에 의해 제조된 NK 세포를 포함하는 조성물에 알부민을 첨가함에 따라 NK 세포의 세포살상능 및 세포생존율이 크게 제고될 수 있었으며, 본 발명의 제조방법의 특성으로 인해 동결 후 다시 해동할 경우에도 NK 세포의 세포살상능, 즉 치료효능 및 세포생존율이 유지될 수 있어 추가적인 처리과정 없이도 액상 또는 동결 보관된 형태로 보관 및 공급이 용이하다는 장점이 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포는 생체 내에서도 안정적으로 효능을 발휘할 수 있어 이를 유효성분으로 포함하는 조성물은 종양 및 감염성 질환 치료에 유용하게 활용될 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 지지세포를 이용한 재자극에 따른 NK 세포의 증식율 변화를 나타내는 도면이다
(a) 재자극 회수에 따른 NK 세포의 증식율 차이를 나타내는 도면:
1회는 0일째 한번 자극을 준 경우;
2회는 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우;
3회는 0일째, 7일째 및 14일째 3번 자극을 준 경우
(b) 재자극을 주는 시기에 따른 NK 세포의 증식율 차이를 나타내는 도면:
D0은 0일째 한번 자극을 준 경우;
D0/D7은 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우;
D0/D10은 0일째 및 10일째 2번 자극을 준 경우
도 2는 지지세포로 재자극하여 배양된 NK 세포의 세포생존율의 변화를 나타내는 도면이다:
D0은 0일째 한번 자극을 준 경우;
D0/D7은 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우;
D0/D10은 0일째 및 10일째 2번 자극을 준 경우
도 3은 지지세포로 재자극하여 배양된 NK 세포의 세포살상능의 변화를 나타내는 도면이다:
D0은 0일째 한번 자극을 준 경우
D0/D7은 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우
D0/D10은 0일째 및 10일째 2번 자극을 준 경우
도 4는 지지세포로 재자극하여 배양된 NK 세포의 표현형을 FACS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
(a1 및 a2) NK 세포 표현형의 확인 및 순도;
(b1 및 b2) NK 세포 표현형의 활성인자;
(c1 및 c2) NK 세포 표현형의 억제인자
도 5는 NK 세포를 포함하는 조성물에 첨가된 알부민 농도에 따른 세포생존율 및 세포살상능의 변화를 나타내는 도면이다:
(a) NK 세포생존율의 변화;
(b) NK 세포살상능의 변화
도 6은 알부민 첨가에 따른 조성물 내에서의 NK 세포의 세포생존율, 세포살상능 및 표현형의 변화를 나타내는 도면이다:
(a) NK 세포생존율의 변화;
(b) NK 세포살상능의 변화;
(c) NK 세포 표현형의 변화
도 7은 동결에 따른 NK 세포의 변화를 나타내는 도면이다:
(a) 동결/해동 후의 세포생존율
(b) 동결/해동 후의 회수율
(c) 동결/해동 후의 세포살상능
(d) 동결/해동 후의 CD56+ 세포상에서 세포 표현형의 발현율
도 8은 림프종 동물 모델에서의 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) 실험 모델의 하지 마비 개선 효과
(b) 실험 모델의 생존율 개선 효과
도 9는 뇌종양 동물 모델에서의 두부 투여시 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) 조직검사를 통한 암세포 부피 관찰 결과;
(b) NK 세포 수에 따른 TUNEL 분석 결과;
(c) NK 세포 수에 따른 암세포 부피 변화
도 10은 뇌종양 동물 모델에서의 정맥 투여시 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) 조직검사를 통한 암세포 부피 관찰 결과;
(b) NK 세포 수에 따른 암세포 부피 변화
도 11은 항암제와의 병용 투여에 의한 뇌종양 동물 모델에서의 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다.
도 12는 난소암 동물 모델에서의 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) NK 세포에 의한 투여기간에 따른 암 세포 크기 변화 (생체 영상);
(b) NK 세포에 의한 암 세포 크기 변화 관찰 결과
도 13은 간암 동물 모델에서의 NK 세포의 항암 효과를 나타내는 도면이다.
도 14는 신경모세포종에서의 NK 세포의 항암 효과를 나타내는 도면이다.
도 15는 다양한 암세포주 및 바이러스 감염 세포주에 대한 NK 세포의 in vitro 효능을 나타내는 도면이다:
(a) K562세포주 (Leukemia)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분능;
(b) Raji 세포주 (Lymphoma)에 대한 세포살해능;
(c) SK-N-SH 세포주 (Neuroblastoma)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능;
(d) SNUOT-Rb1 세포주 (Retinoblastoma)에 대한 세포살해능;
(e) U87-MG 세포주 (Glioblastoma)에 대한 세포살해능;
(f) OVCAR-3 세포주 (Ovarian cancer)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능;
(g) Huh-7 세포주 (HCC, Hepatocellular carcinoma) 에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능
(h) SNU398 세포주 (HBV infected HCC)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능
(i) Huh-7.5 세포주 (HCV infected HCC) 에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능.
(a) 재자극 회수에 따른 NK 세포의 증식율 차이를 나타내는 도면:
1회는 0일째 한번 자극을 준 경우;
2회는 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우;
3회는 0일째, 7일째 및 14일째 3번 자극을 준 경우
(b) 재자극을 주는 시기에 따른 NK 세포의 증식율 차이를 나타내는 도면:
D0은 0일째 한번 자극을 준 경우;
D0/D7은 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우;
D0/D10은 0일째 및 10일째 2번 자극을 준 경우
도 2는 지지세포로 재자극하여 배양된 NK 세포의 세포생존율의 변화를 나타내는 도면이다:
D0은 0일째 한번 자극을 준 경우;
D0/D7은 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우;
D0/D10은 0일째 및 10일째 2번 자극을 준 경우
도 3은 지지세포로 재자극하여 배양된 NK 세포의 세포살상능의 변화를 나타내는 도면이다:
D0은 0일째 한번 자극을 준 경우
D0/D7은 0일째 및 7일째 2번 자극을 준 경우
D0/D10은 0일째 및 10일째 2번 자극을 준 경우
도 4는 지지세포로 재자극하여 배양된 NK 세포의 표현형을 FACS로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
(a1 및 a2) NK 세포 표현형의 확인 및 순도;
(b1 및 b2) NK 세포 표현형의 활성인자;
(c1 및 c2) NK 세포 표현형의 억제인자
도 5는 NK 세포를 포함하는 조성물에 첨가된 알부민 농도에 따른 세포생존율 및 세포살상능의 변화를 나타내는 도면이다:
(a) NK 세포생존율의 변화;
(b) NK 세포살상능의 변화
도 6은 알부민 첨가에 따른 조성물 내에서의 NK 세포의 세포생존율, 세포살상능 및 표현형의 변화를 나타내는 도면이다:
(a) NK 세포생존율의 변화;
(b) NK 세포살상능의 변화;
(c) NK 세포 표현형의 변화
도 7은 동결에 따른 NK 세포의 변화를 나타내는 도면이다:
(a) 동결/해동 후의 세포생존율
(b) 동결/해동 후의 회수율
(c) 동결/해동 후의 세포살상능
(d) 동결/해동 후의 CD56+ 세포상에서 세포 표현형의 발현율
도 8은 림프종 동물 모델에서의 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) 실험 모델의 하지 마비 개선 효과
(b) 실험 모델의 생존율 개선 효과
도 9는 뇌종양 동물 모델에서의 두부 투여시 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) 조직검사를 통한 암세포 부피 관찰 결과;
(b) NK 세포 수에 따른 TUNEL 분석 결과;
(c) NK 세포 수에 따른 암세포 부피 변화
도 10은 뇌종양 동물 모델에서의 정맥 투여시 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) 조직검사를 통한 암세포 부피 관찰 결과;
(b) NK 세포 수에 따른 암세포 부피 변화
도 11은 항암제와의 병용 투여에 의한 뇌종양 동물 모델에서의 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다.
도 12는 난소암 동물 모델에서의 NK 세포의 항암효과를 나타내는 도면이다:
(a) NK 세포에 의한 투여기간에 따른 암 세포 크기 변화 (생체 영상);
(b) NK 세포에 의한 암 세포 크기 변화 관찰 결과
도 13은 간암 동물 모델에서의 NK 세포의 항암 효과를 나타내는 도면이다.
도 14는 신경모세포종에서의 NK 세포의 항암 효과를 나타내는 도면이다.
도 15는 다양한 암세포주 및 바이러스 감염 세포주에 대한 NK 세포의 in vitro 효능을 나타내는 도면이다:
(a) K562세포주 (Leukemia)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분능;
(b) Raji 세포주 (Lymphoma)에 대한 세포살해능;
(c) SK-N-SH 세포주 (Neuroblastoma)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능;
(d) SNUOT-Rb1 세포주 (Retinoblastoma)에 대한 세포살해능;
(e) U87-MG 세포주 (Glioblastoma)에 대한 세포살해능;
(f) OVCAR-3 세포주 (Ovarian cancer)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능;
(g) Huh-7 세포주 (HCC, Hepatocellular carcinoma) 에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능
(h) SNU398 세포주 (HBV infected HCC)에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능
(i) Huh-7.5 세포주 (HCV infected HCC) 에 대한 세포살해능 및 싸이토카인 분비능.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에 따른 NK 세포의 제조방법은 T 세포가 제거된 단핵구 세포를 사이토카인을 포함하는 배지에서 항-CD3 항체와 지지세포를 이용하여 자극한 후 수일 동안 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 NK 세포를 반응기에서 정치 또는 부유배양하는 것을 포함한다.
증가된 함량의 NK 세포를 수득하기 위하여, 이후의 정치 또는 부유 배양 전에 자극 및 정치배양을 반복할 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK 세포는 높은 세포 생존율과 세포살상능을 유지하여 종양 및 감염성 질환에 대한 높은 치료효과를 나타내며, 고효율 및 고농도로 체외배양이 가능하다.
본 발명에서 최초 자극 후의 정치배양은 약 2~15일, 바람직하게는 5~10일간 이루어지는 것이 바람직하며, 재자극 후의 정치배양은 약 2~7일, 바람직하게는 3~5일 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 정치배양이 완료된 후 배양기에서는 사이토카인의 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 NK 세포의 제조방법은, 특별히 제한되지는 않지만 예를 들어, 하기와 같은 단계를 포함할 수 있다:
(i) 인간 말초혈액으로부터 말초혈 백혈구 세포 및 NK 세포를 분리하는 단계;
(ii) 분리된 NK 세포를 항-CD3 항체 및 사이토카인이 함유된 배지에 넣고, 지지세포를 첨가하여 NK 세포를 자극하고 세포간 접촉을 자극하도록 2~15일, 바람직하게는 5~10일간 정치배양하는 단계;
(iii) (ii) 단계에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 세포간 접촉을 자극하도록 2~7일, 바람직하게는 3~5일간 정치배양하는 단계;
(iv) 정치배양이 완료된 후, 정치 또는 부유 배양을 위해 필요한 사이토카인 등을 포함하는 배지를 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계.
NK 세포의 제조방법에 있어서, 단계 (iii)에 따른 세포를 재자극하여 반복 정치배양하는 단계는 1회 이상 반복하여 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 단계 (ii) 이전에 지지세포를 준비하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 정치배양(stationary culture)은 배양기에 교반(agitating) 또는 진탕(shaking) 없이 방치한 상태에서 배양하는 것을 의미하며, 부유배양 (suspension culture)이란 통기(aeration)나 교반 등을 통해 세포들이 반응기의 하부 또는 측면부에 부착되지 않고 현탁된 상태에서 배양하는 것을 의미한다.
본 발명에서 정치배양을 위해 사용될 수 있는 반응기는 플라스크, T-플라스크, 일회용 세포 배양 백 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서 부유배양을 위해 사용될 수 있는 반응기는 쉐이킹 플라스크, 진탕 배양기, 발효조, T-플라스크, 일회용 세포 배양 백(disposable cell culture bag) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적을 달성하기에 적합한 생물반응기로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 채택가능할 수 있는 어떠한 반응기라도 사용될 수 있다.
또한, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기는 동일한 것일 수도 있고, 상이한 것일 수도 있다. 예를 들어, 정치배양을 위한 반응기와 부유배양을 위한 반응기가 동일한 것인 경우에는 동일한 반응기에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인 등의 필요한 영양성분을 포함하는 배지를 추가적으로 공급하여 부유배양 방식으로 배양하는 것이 가능하며, 상이한 종류의 반응기를 사용할 경우에는 정치배양이 완료된 후 배양물을 부유배양을 위한 반응기로 옮기고 부유배양할 수 있다.
이러한 부유 반응을 위한 반응기의 예로서는 GE Healthcare사의 Wave 생물반응기(Wave Bioreactor), Thermo Fisher사의 일회용 생물반응기(Single-Use Bioreactor, SUB), Xcellerex사의 일회용 XDR 생물반응기(Single-Use XDR Bioreactor), Nipro사의 세포 배양 백, PBS Biotech. 사의 PBS 시리즈 세포배양기(WO 07/111677A, WO 08/133845A, WO 09/132192A 등 참조), 후지모리공업(주)의 세포배양백(cell culture bag), Erlenmeyer사의 일회용 쉐이킹 플라스크(Disposable Shake Flasks) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 특히 PBS Biotech사의 PBS 시리즈 세포 배양기가 바람직하다.
본 발명에서의 '지지세포(feeder cell, 배양보조세포라고도 한다)'는 분열증식하는 능력은 없지만 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 NK 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 지지세포로는 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-세포, B-세포(B-cell), 또는 다단핵구(monocyte) 등이 있으며, 바람직하게는 자기 말초혈 단핵구 세포가 사용될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용가능한 것으로 알려진 다른 지지세포들도 본 발명의 목적에 부합하는 제한 없이 사용가능함은 당연한 것이다.
상기 지지세포로 이용되는 자기 말초혈 단핵구 세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보할 수 있다 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법이 사용될 수 있다. 이와 같이 불활성화된 지지세포는 분리된 T-세포를 포함한다. 본 발명과 같이 지지 세포를 사용하는 증식 방법은 NK 세포를 순수 분리한 후 증식시키는 방법으로, 이후에도 계속 순수 NK 세포만 증식하게 된다는 장점이 있다.
본 발명에서의 항-CD3 항체란, T 세포 수용체(TCR)과 결합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 결합하는 항체로, CD3 분자는 TCR과 결합하여 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당한다. 본 발명에서 사용가능한 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한 없이 이용가능하며, OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 배지에 포함될 수 있는 사이토카인은 인터루킨 류에서 선택된하나 이상인 것이 바람직한데, 인터루킨은 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로 본 발명에서 사용가능한 인터루킨으로는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18) 및 인터루킨-21(IL-21)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 특히 IL-2를 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한없이 이용 가능함은 자명한 것이다.
본 발명의 정치배양 및 부유배양을 위해 사용되는 항-CD3 항체의 배지 내농도는 0.1~1,000 ng/ml, 바람직하게는 1~100 ng/ml, 더욱 바람직하게는 5~20 ng/ml이며, 사이토카인의 배지 내 농도는 10~2,000 IU, 바람직하게는, 100~1,000 IU, 더욱 바람직하게는 약 200~700 IU이다.
본 발명에서의 '자극'이란 지지세포 등을 첨가하여 NK 세포의 증식을 유도하는 것을 의미하며, 항-CD3 항체가 함께 사용될 수도 있다.
본 발명에서의 '재자극'은 일정 배양 시간이 경과한 후, 배지에 지지세포 및/또는 항-CD3 항체를 다시 첨가하여 NK 세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 NK 세포의 제조를 위한 배지로는 CellGro 배지(Cellgenix), AIM-V 배지, RPMI1640 배지, X-VIVO 20과 같은 통상의 동물세포 배양용 배지가 사용 될 수 있다. 이러한 동물세포 배양용 배지에 필요에 따라 인간 말초혈로부터 분리한 NK 세포, 말초혈 단핵구 세포, 항-CD3 항체 및 인터루킨에서 선택된 하나 이상의 성분이 첨가되어 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 NK 세포 제조 방법에 있어, 부유배양시 세포 농도 및 사이토카인의 농도를 일정하게 유지하기 위하여, 일정 시간 간격으로 배지 내의 사이토카인 및 세포 농도를 측정하고 그 측정값에 따라 사이토카인이 포함된 배지를 세포 농도 및 사이토카인 농도에 맞추어 제공할 수 있다.
또한, 상기 배지에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양할 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 시판되는 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간유래로서 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, 말초혈 단핵구 세포로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구 증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등 통상의 기술자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포를 적절한 부형제와 첨가제를 사용하여 치료용 조성물로 제공할 수 있다. 이러한 조성물을 치료가 필요한 환자에게 투여함으로써 치료효과를 거둘 수 있다.
특히, 본 발명의 방법에 의해 제조된 NK 세포를 포함하는 조성물에 알부민을 첨가함에 따라 NK 세포의 장기 보존 안정성 측면에서 세포살상능 및 세포생존율이 크게 제고될 수 있었다. 본 발명에 따른 조성물에 첨가되는 알부민의 양은 별다른 제한은 없으나, 전체 조성물 내에서 0.1 내지 5 중량%의 범위로 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 중량% 범위로 포함될 수 있다.
또한, NK 세포의 제조를 위해 세포 농도를 일정하게 유지시켜 주는 배양방법을 적용시킴으로써 세포의 과잉 성장(over growth)을 방지할 수 있어 세포가 최적의 상태를 유지할 수 있다. 특히, 동결 후 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않고 높은 세포생존율과 세포살상능을 유지할 수 있다. 따라서, 추가적인 처리과정 없이도 액상 또는 동결 보관된 형태로 보관 및 공급이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 NK 세포 및 이를 포함하는 조성물은 종양 및 감염성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 NK세포는 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 종양에 적용이 가능하다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기(organ)에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다. 본 발명에 따른 NK 세포를 이용하여 치료가능한 종양은 특별한 제한은 없으며, 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막모세포종, 두경부암, 침샘암, 림프종 등이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되는 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 지지세포를 이용한 반복 자극(재자극)을 통한 NK 세포 배양 및 특성 평가
(1) 지지세포를 이용한 반복 자극을 통한 NK 세포 배양
건강한 공여자로부터 채취한 말초혈 단핵구 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 1회 생산한 분량으로 소분하여 바이알(vial)에 담아 액체질소에 동결하여 둔다. 얼려둔 하나의 PBMC 바이알을 녹여 50 mL 튜브로 옮기고, 1 부피%의 FBS(fetal serum bovine) 또는 자기 혈장(autoplasma)를 포함하는 20 mL의 PBS(phosphate buffered saline)로 현탁하여 1200 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다.
PBMC 펠렛을 10 mL MACS 런닝 버퍼(running buffer)에 현탁하고, 트립판 블루로 염색하여 세포 수를 측정하였다. PBMC 피더(feeder) 준비와 CD3 제거(depletion)를 위해 각각 5x107씩 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 1200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다.
PBMC 피더는 펠렛을 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix) 10 mL에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 2000 cGy로 조사하여 준비하였다.
CD3이 제거된 NK 세포를 얻기 위하여 5x107의 세포 펠렛에 400 ㎕의 MACS 런닝 버퍼(running buffer)와 100 ㎕의 CD3 자기비드 (Miltenyi biotech)를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켰다. 20 mL의 MACS 런닝 버퍼를 넣어 세척한 뒤 1200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 다시 2 mL의 MACS 런닝 버퍼에 현탁하였다. VarioMACS (Miltenyi Biotech)에 CS 컬럼(column) (Miltenyi Biotech, 130-041-305)을 장착하여 세포를 분리하고, 최종 20 mL이 될 때까지 컬럼을 세척하여 세포를 회수하였다.
트립판 블루로 염색하여 세포수를 측정하고 1x107의 세포를 새로운 50 mL 튜브에 담아 1200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10 mL의 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지(Cellgenix) 10 mL에 현탁하였다.
백(bag) 배양 시 500 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 PBMC 피더가 들어있는 튜브에 넣었다. 니프로 350 백(Nipro 350 bag, Nipro 사)에 10 mL의 PBMC 피더, 10mL의 NK 세포, 10 mL의 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix)를 넣고 37℃ 인큐베이터에서 5일간 정치 배양하였다. 이때, 니프로 350 백을 가장자리로부터 위에서 6 cm, 아래서 5 cm되는 점을 접어서 면적이 약 70 cm2 이 되도록 하여 정치 배양한다. 플라스크 배양 시 상기 백에서의 배양과 동일한 조성을 사용하며 12-웰 플레이트(well plate)에 0.5 mL PBMC 피더, 0.5 mL NK 세포, 0.5 mL의 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지에서 동일한 조건으로 배양하였다. 이때, 12-웰 플레이트의 면적은 3.5 ~ 3.8 cm2 이다.
배양 5일째에 세포수를 측정하여 약 2x105 cells/mL이 되도록 500 IU의 IL-2(Proleukin)과 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix)로 희석하여 적절한 배양용기에 넣어 정치 배양하였다. 이때, 세포농도와 면적은 2 X 105 cells/mL/3.5 cm2 에 맞추어준다.
배양 시작일로부터 7일째, 10일째 또는 그리고 14 일째에 세포수를 측정하고, 배양 중인 세포를 기준으로 2~5x105 cells/mL이 되도록 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix)로 희석한다. 여기에 지지세포를 1~ 10 배수로 준비하여 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지 (Cellgenix)에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 2000 cGy로 조사하여 준비한다. 500 IU의 IL-2와 10 ng/mL의 OKT-3를 넣어주고 준비된 두 세포를 3 일간 공배양(co-culture)하였다.
지지세포로 재자극한 후 다시 3일간 정치 배양한 후, 이후 2~3일 간격으로 세포수를 측정하고 5~10x105 cells/mL이 되도록 500 IU의 IL-2와 1 부피% 자기 혈장이 포함된 CellGro 배지(Cellgenix)로 희석하며 21일까지 부유 배양하였다. 부유 배양 21일째 NK 세포를 수득하였다.
수득된 NK 세포를 1 중량% 알부민(녹십자)이 현탁된 하트만 용액(중외제약)에 1~5x107/mL로 NK 세포를 현탁하여 4℃에 보관한다.
지지 세포로 재자극을 한 결과 도 1(a)에서와 같이 1회만 자극을 준 경우보다 2회 또는 3회까지 지속적으로 자극함으로써, NK 세포 증식을 크게 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 기존 제조방법이 약 161배 NK 세포 증식을 보인 반면 지지세포를 2회 재자극 시 425배, 3회 재자극 시 1,320배까지 폭발적인 증식을 하는 것으로 관찰되었다. 또한, 도 1(b)에서 나타난 바와 같이 지지세포를 7일째 또는 10일째 추가로 재자극 하면 공여자에 따라 차이가 있지만 추가자극 없이 배양된 경우보다 높은 증식을 보였다. 따라서 배양 초기에 1회만 자극시키면서 세포수 중심이 아니라 배지량 중심으로 세포를 증식시키는 방법에 비해 지지세포로 추가 자극을 주고 일정한 세포수를 유지시키며 배지량을 조절해주는 새로운 배양방법이 NK 세포를 증식시키는데 매우 효과적임을 확인하였다.
(2) NK세포의 인-비트로(in-vitro) 세포생존율
인-비트로(in-vitro) 세포생존율을 비교, 평가하기 위하여 세포내 핵과 결합할 수 있는 PI 염색액을 사용하는 세포계수기(Cell counter) 방법 중에 하나인 NucleoCounter(케모매택) 시스템을 사용하였다.
재자극을 수행하지 않고 배양된 세포, 7일 및 10일째 재자극을 하여 배양된 세포를 PBS로 10배 희석한 후 뉴클레오카운터(NucleoCounter) 시스템을 사용하여 총 세포수(Total cell count)와 사멸 세포수(Dead cell count)를 각각 측정하였다. 10배 희석시킨 세포 100 ㎕를 용해 버퍼(lysis buffer)인 솔루션 A-100(Solution A-100, 케모매택) 100 ㎕와 섞은 후, 안정화 버퍼(stabilizing buffer)인 솔루션 B(Solution B, 케모매택) 100 ㎕를 추가한 후 뉴클레오카세트(NucleoCasette)의 피스톤을 이용하여 총 세포수를 측정하였다. 사멸 세포수는 10배 희석시킨 세포를 그대로 뉴클레오카세트의 피스톤을 이용하여 측정하였다.
측정된 총 세포수에서 사멸 세포수를 감하여 생존 세포수를 계산한 후 다음 식을 이용하여 세포생존율(Cell viability)을 계산하였다.
세포생존율 (%) = (생존 세포수/총 세포수 ) x 100
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 지지세포로 재자극을 하여 21일간 배양한 NK 세포는 재자극 없이 배양한 NK 세포보다 높은 증식율을 보임과 함께 약 90% 정도의 높은 세포생존율을 나타내었다.
(3) 인-비트로(in-vitro) 세포살상능
타깃 종양 세포주(K562 등)를 회수하고 3x106 개의 세포를 15 mL 튜브에 담아 원심 분리하였다. 세포 펠렛을 600 ㎕의 RPMI 배지로 현탁한 뒤 400 ㎕를 새로운 15 mL 튜브로 옮기고 calcain-AM(Molecular probe, C34852)을 50 nM의 농도로 넣은 다음 은박지로 빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 20분간 염색하였다. 한편, 나머지 세포 현탁액 200 ㎕에는 RPMI 배지 800 uL를 넣어 1x106 cells/mL의 농도로 준비하였다. Calcein-AM 염색이 끝난 종양 세포주는 15 mL의 RPMI 배지를 넣어 세척하고 원심 분리한 뒤 펠렛을 2 mL의 RPMI 배지로 현탁하여 1x106 cells/mL의 농도가 되도록 하였다.
NK 세포는 3x106 개를 15 mL 튜브에 담아 원심분리하고, 펠렛을 타깃 종양
세포주에 대비하여 원하는 비율로 RPMI 배지에 현탁하였다. 준비된 타깃 종양 세포주와 NK 세포주를 둥근 바닥 96-웰 플레이트(well plate)에 100 ㎕씩 섞어서 분주하였다. 각 웰을 2 개씩(duplicate) 준비하여 평균값을 얻었다. 빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응 시킨 후, 플레이트를 2000 rpm에서 3 분간 원심 분리하였다. 상층액을 덜어내고 FACS 버퍼(2.5 중량% FBS in PBS)를 100 ㎕/well씩 넣어서 세포를 현탁시킨 후, 7-AAD(BD, 559925)를 5 ㎕씩 미리 넣어 둔 FACS 튜브로 옮겼다. 상온에서 20분간 반응시킨 뒤 FACS 아리아(Aria) 장비를 이용하여 NK 세포의 종양 세포살상능을 다음과 같이 분석하였다.
세포 독성 = A값 - B값
A= NK 세포와 타깃 종양 세포를 함께 반응시켰을 때 살해되는 타깃 세포의 평균 비율(Calcein-AM, 7-AAD가 모두 염색된 죽은 타깃 종양 세포주의 평균값 -Calcein-AM만 염색된 컨트롤)
B= 타깃 종양 세포가 기본적으로 죽는 평균 비율(Calcein-AM, 7-AAD가 모두 염색된 죽은 타깃 종양 세포주- Calcein-AM만 염색된 컨트롤)
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 지지세포로 재자극하여 21일간 배양한 NK세포는 재자극 없이 배양한 NK 세포보다 높은 세포증식율을 보였음에 불구하고 E: T ratio = 3:1에서 약 90% 정도로 오히려 높은 세포살상능을 보여 주었다.
(4) 인-비트로(in-vitro) 세포 표면형 분석
실시예 1(1)에 따른 배양 방법에 따라 배양된 NK 세포의 배양 전과 후의 세포를 수거하여 1200 rpm으로 5분간 원심분리하고, 배양 용액을 흡입(suction)하여 제거하였다. 1 mL의 FACS 버퍼(2.5 % FBS가 포함된 PBS)로 희석하여 세포 수를 측정하고, 5x106 cells/mL이 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 mL FACS 튜브(Falcon, 352052)에 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 넣고, 다음과 같이 항체를 넣었다.
[표 1]
컨트롤 용도로 사용되는 튜브는 아래와 같이 준비하였다.
[표 2]
[표 1] 및 [표 2]의 튜브들을 30분간 냉장 온도에 방치하여 염색한 후, 염색이 끝난 세포에2 mL FACS 버퍼를 넣고, 1500 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 mL FACS 버퍼를 넣고 1500 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 300 ㎕ FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 이용하여 표면형을 분석하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 지지세포의 자극을 추가로 준 경우와 주지 않은 경우 확인 및 순도에 해당하는 표현형과 NK 세포의 활성 및 억제에 관련된 표현형에서 큰 차이를 보이지 않았다.
따라서, 상기와 같이 지지세포 재자극을 통한 개량된 배양법으로 생산된 NK세포는 기존 방식에 의해 배양된 NK 세포와 비교하여 높은 증식율을 보였음에 불구하고 세포생존율, 세포살상능, 세포 표현형 등에서 큰 차이가 없다.
실시예 2 : 알부민 첨가에 따른 인-비트로(in vitro) 안정성 (사용 중 안정성)
하트만 용액에 알부민 첨가 농도(2 중량%, 1 중량%, 0.5 중량%)에 따른 배양된 세포의 안정성을 평가하기 위하여 실시예 1(1)의 방법에 따라 최종 배양된 세포를 4℃에서 72시간 동안 보관하면서 24시간 단위로 인-비트로(in-vitro) 세포살상능과 인-비트로 세포생존율을 평가하였다.
최종 배양된 NK 세포를 원심분리하여 세포 펠렛을 만든 후, 상층액을 버린뒤 플라스크를 이용하여 배양한 세포는 하트만 용액 또는 2 중량%, 1 중량%, 0.5 중량% 사람 혈청 알부민이 포함된 하트만 용액으로 세포 펠렛을 풀어 세포 희석액을 만들었다. 이때 하트만 용액 또는 사람 혈청 알부민이 포함된 하트만 용액의 양을 조절하여 최종 세포희석액의 농도를 1.1 X 107 cell/ml로 맞춘 후 세포배양 백에 넣어 4℃에서 보관하였다. 24시간 후, 48시간 후, 72시간 후 각각 세포를 꺼내어 인-비트로 세포살상능(실시예 1(3) 참조)과 인-비트로 세포생존율(실시예 1(2) 참조)을 평가하였다.
그 결과, 도 5(a)에서 보는 바와 같이, 하트만 용액에서는 48시간까지 냉장보관 시 세포생존율이 65%로 떨어진다. 반면 1% 사람 알부민이 첨가된 경우 48시간까지 냉장 보관 시 또는 사용(in use) 시간을 고려하여 상온에서 2시간 보관한 경우에도 여전히 약90% 전후의 세포생존율을 유지하는 것을 확인할 수 있다.
도 5(b)는 보관시간에 따른 세포살상능을 비교한 도면으로, 하트만 용액에서 보관 시 24시간부터 세포살상능이 급격히 감소하여 48시간에는 E:T 비율(ratio) =3:1을 기준으로 할 때 10% 미만으로 세포살상능이 감소된 반면 1 중량% 사람 알부민이 첨가된 경우에는 48시간 냉장 보관 후에도 동일한 E:T 비율(ratio)에서 70 % 이상의 높은 세포살상능을 보이는 것으로 관찰되었다.
도 6은 하트만 용액과 1 중량% 사람 알부민-하트만 용액에 대한 누적 데이터를 비교한 도면이다. 도 6(a)에 도시된 바와 같이 1 중량% 알부민을 첨가한 경우 72시간까지도 80%이상의 높은 생존율을 유지한 반면 하트만 용액에서는 48시간에 이미 60% 수준으로 생존율이 급격히 감소하였다. 도 6(b)는 E:T 비율(ratio) = 3:1에서 세포독성을 비교한 도면으로, 1 중량% 알부민 첨가시 72시간까지 70%이상의 세포살상능을 유지하는 반면 하트만 용액의 경우 48시간에 이미 50%까지 세포살상능이 감소되었다. 도 6(c)는 상기 두 조건에서 NK 세포의 표현형의 변화를 관찰한 도면으로, 세포살상능과 직접적인 연관이 있는 NKp46이 1 중량% 알부민이 첨가된 조건에서 보다 높게 발현하는 것을 관찰하였고 나머지 표현형은 큰 차이가 없음을 확인하였다.
따라서, 최종 NK 세포치료제에 대한 1 중량% 사람 알부민의 첨가는 시간 변화에 따른 NK 세포의 세포생존율과 세포살상능을 잘 유지함으로써 안정성을 확보하는데 크게 기여함을 알 수 있다.
실시예 3: NK 세포 동결 및 해동 실험: 세포수, 수율, 표현형, 생존율, 살해능
실시예 1(1)의 방법에 의해 배양된 NK 세포간의 동결 안정성을 확인하였다.
배양된 NK 세포를 동결하기 위해 세포수를 2~8x107 cells/mL이 되도록 하고, 동결하고자 하는 세포를 별도의 튜브에 옮긴 후 1200 rpm, 10분, 4℃에서 원심분리하였다. 동결 백(Freezing bag, MEDIRUTION, 한국) 동결은 20 mL을 기준으로 하였다. 원심분리된 세포를 14 mL 사람 혈청 AB로 잘 현탁 하였다. 4 mL 덱스트란(Dextran) 40과 2mL DMSO을 미리 혼합하여 차갑게 한 후 준비된 세포 현탁액에 한 방울씩 떨어뜨리며 잘 섞어 주었다. 동결 백에 세포를 주입하고 기포를 최대한 제거하였다. 속도 제어된 냉동장치(CryoMed 냉동장치, Thermo Scientific)로 냉각시킨 후, 액체질소탱크에 보관하였다.
세포의 해동은 질소탱크로부터 동결 백을 꺼내고, 지퍼백 속에 동결 백(bag)을 집어넣고 37℃ 항온조에서 빠른 속도로 해동하였다. 완전히 녹으면 세포를 해당 튜브로 옮겨주고 10배 양의 1 중량%의 FBS를 포함하는 PBS 용액으로 천천히 현탁시켰다. 잘 섞어준 후 원심분리(1,200 rpm, 10 min, 4℃)하였다. 원심분리 후 세포들은 107cell/mL이 되도록 1 중량%의 FBS를 포함하는 PBS로 현탁한다. 10배 희석한 후 세포수와 생존율을 측정하였다 측정된 세포수를 기준으로 K562 세포주에 대한 살해능을 평가하며 이때 E:T ratio = 3:1에서 측정하였다. 세포 표현형은 CD16, NKG2A, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, CD25, CD62L, CD57 등에 대해 측정하였다. 최종적으로 동결 전과 동결 후의 세포수율, 생존율, 세포살상능, 세포표현형의 변화를 평가하였다.
그 결과, 배양한 NK 세포들이 동결 후 해동하였을 때 높은 세포생존율(도 7(a) 참조)과 회수율(도 7(b) 참조)을 유지하였고, 특별한 활성유도 없이도 K562 암세포주에 대한 높은 세포살상능을 보유하고 있으며(도 7(c) 참조), 세포 표현형(도 7(d) 참조)도 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 림프종 동물모델에서 자연살해세포의 항암효능 평가
(1) 림프종 동물모델 구축
1) Raji, SU-DHL-4 세포주 배양
Raji (인간 B 세포 림포마 세포주, ATCC, CCL-86) 및 SU-DHL-4 (인간 B 세포 림포마 세포주)(DSMZ, ACC 495) 세포주는 RPMI배지 (2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 10 중량% FBS, 0.055 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol), 100 U/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신)를 사용하며, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
2) 동물모델 제작
6~8주령 암컷 C.B-17 마우스를 7일간의 순화 기간을 거친 뒤 1 mL 주사기를 이용하여 Raji와 SU-DHL-4 세포주를 각각 1x105 cells/100 ㎕씩 꼬리 미정맥에 주입하였다.
(2) 자연살해세포 투여 및 항암효능 평가
1) 자연살해세포 투여
종양이식 후 무작위적으로 군을 분리하여 개체식별법에 따라 표시를 한 후 대조군에는 400 ㎕의 PBS를 꼬리 미정맥에 주입하였다. 실험군에는 1x107/400 ㎕개의 자연살해세포를 0일부터 2~3일 간격으로 꼬리 미정맥에 5회 투여하였다.
실험 실시 후 매일 마우스의 일반 상태의 변화, 운동성 및 하지 마비 발병과 생존율을 확인하였다.
잘 알려진 림프종 모델인 Raji, SU-DHL-4의 경우 마우스에 미정맥으로 투여하게 되면 척수 주변에 종양이 생기게 되어 하지 마비 증상을 보이게 되고, 2-3일 후 사망하게 된다. 따라서 하지마비의 발병 여부와 생존율을 함께 평가하여 항암효능의 지표로 판단하였다.
그 결과, PBS가 투여된 대조군은 하지마비 증세(도 8(a) 참조)와 생존율(도8(b) 참조)의 중앙값이 37일과 39일인데 비하여 NK 세포가 투여된 군에서는 중앙값 산정이 되지 않을 정도로 하지마비 증상이 뚜렷이 개선되고 생존율이 크게 향상되었다.
실시예 5: 뇌종양 (glioblastoma) 동물모델에서 자연살해세포의 항암효능 평가
(1) 뇌종양 동물모델 구축
BALB/C-nu/nu 마우스 6 주령을 사용하며, 한꺼번에 7 마리까지 동시에 종양을 심을 수 있는 자동화 장치인 세븐 프레임(seven frame)과 멀리-실린지 인젝터(multi-syringe injector)를 이용하여 2x105 cells/5 ㎕의 U-87MG (인간 글리오블라스토마(glioblastoma) 세포주)(ATCC HTB-14)를 대뇌에 주입하였다. 10분간 해밀턴 주사기(hamilton syringe)를 이용해 주입하고, 5분 쉬었다가 5분 동안 주사기의 바늘을 빼고 소독 후 봉합한다. 실험기간 동안에는 쥐의 상태와 무게를 관찰하여 실험 일정에 맞추어 희생(sacrifice)시켜 조직 분석을 실시하였다.
(2) 자연살해세포 투여
뇌종양 동물모델에서 NK 세포의 항 종양 효과를 알아보기 위해 U-87MG를 투여하고 1주째부터 1주일 간격으로 NK 세포를 3회 주입하였다. NK 세포는 뇌에 직접 주입하는 두부 투여(intracranial) 방식과 쥐의 꼬리 정맥에 주사하는 정맥 투여(intravenous) 방식을 사용한다. 두부 투여 방식을 이용할 경우 1x103, 1x104, 1x105개의 NK 세포를, 정맥 투여 방식을 이용할 경우 1x105, 1x106, 1x107개의 NK세포를 투여하였다. U-87MG를 투여하고 4주 후 희생시켜 항암효능을 평가하였다.
뇌종양 동물모델에서 NK 세포와 항암제의 병용 투여 및 투여 시기에 따른 항종양 효과를 알아보기 위해 아래의 표 1과 같이 다양한 시기에 1x107개의 NK 세포를 정맥 투여 방식으로 주입하였다. 병용치료제로 사용한 테모졸로마이드(temozolomide) (TMZ)는 2.5 mg/kg의 용량으로 U-87MG 투여 후 3주째부터 매일 총 5회를 복강 투여(intraperitoneal) 방식으로 주입하였다. U-87MG를 투여하고 4주 후 희생시켜 종양의 크기를 측정하였다.
[표 3] 그룹별 NK 및 항암제 조합 및 투여방법
(3) 항암효능 평가
종양의 크기를 측정하기 위해 헤마토실린(Hematoxylin), 에오신(Eosin) 염색법을 사용한다. 뇌를 적출하여 브레인 매트릭스(brain matrix)에 적출한 뇌를 놓고, 2 mm 간격으로 절편을 제작하였다. 버퍼된(Buffered) 10% 포르말린(formalin) 용액에 넣어 4℃에서 24시간 고정한 후, 파라핀 블록(paraffin block)을 제작한다. 파라핀 포맷된 조직은 4 ㎕으로 절편(section)하여 코팅된 슬라이드 글래스(slideglass)에 붙이고, 하룻밤 동안 건조시켰다. 조직은 자일렌(xylene)으로 탈-파라핀(de-paraffin)과정을 거치고, 알코올을 순차적으로 만들어(100 부피%, 95 부피%, 80 부피% 에탄올/증류수) 재수화(rehydration) 과정을 거친 후, Gill's 헤마토실린과 에오신으로 염색하여, 그 염색 정도를 확인한 후, 탈수과정과 봉입과정을 진행하였다. 이렇게 염색된 조직에서 종양의 길이와 너비를 구한 다음, 다음의 식으로 종양의 부피를 계산하였다.
종양의 부피 (mm3) = 종양의 길이 (mm) x 종양의 너비 (mm)2 x 0.5
두부 투여 방식(도 9)으로 1x104, 1x105 NK 세포를 투여하였을 경우와 정맥 투여 방식 (도 10)으로 1x106, 1x107의 NK 세포를 투여하였을 경우, 컨트롤에 비해 종양의 부피가 감소함을 확인할 수 있었다. NK 세포와 항암제의 병용 투여 및 투여시기에 따른 효과를 관찰한 경우 (도 11)에는 TMZ와 NK 세포 병용 투여 시 단독 투여시보다 종양의 부피가 작았으며, 종양투여 후 1주일 이내에 3회간 NK 세포를 주입 하였을 경우 종양의 부피가 가장 많이 감소하여 효과가 가장 큼을 알 수 있다.
세포의 사멸 정도를 분석하기 위해 터널 분석(TUNEL (terminal deoxynucleotidyl mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling) assay)을 수행하였다. 조직은 파라핀 절편 (4 mm)을 만들어서 코팅된 슬라이드 글래스에 올리고, 하룻밤 동안 건조시킨다. 조직은 자일렌으로 탈파라핀과정을 거치고, 알코올을 순차적으로 만들어(100 v%, 95 v%, 80 v% 에탄올/증류수) 재수화 과정을 거친 후 PBS(pH 7.5)로 수세하였다. 인비트로젠(Invitrogen)사의 터널키트를 사용하여 조직 내 세포 사멸 정도를 검사하였다. 염색된 슬라이드는 Gill's 헤마토실린에서 1분간 처리하여 카운터 염색(counterstain)을 시행한 후 봉입한다. 염색이 끝난 슬라이드는 현미경으로 종양 가장자리 주변을 기준으로 10장의 사진을 400배의 배율로 찍고 양성반응을 나타낸 세포를 기준으로 수를 세어 평균값을 계산하였다.
그 결과, 두부 투여 방식으로 1x104, 1x105의 NK 세포를 투여하였을 경우, 컨트롤에 비해 사멸세포수가 많아 효과가 있음을 알 수 있다(도 9c).
실시예 6: 난소암 동물모델에서 NK 세포의 항암효능 평가
(1) 난소암 동물모델 구축
1) OVCAR-3-Luc 세포주 제작
루시퍼라제(Luciferase) 유전자를 pGL3 벡터에 클로닝 하여 OVCAR-3 세포주에 일시 감염(transient transfection) 시켰다. 루시페린(Luciferin)에 의해 루시퍼라제가 발현되는 세포주를 1차 선별하고, 표현형과 NK 세포에 의한 세포 독성이 OVCAR-3와 동등한 세포주를 2차 선별하였다.
2) OVCAR-3-Luc 세포주 배양
OVCAR-3-Luc(인간 난소암 세포주, KTCC (한국세포주은행) 30162) 세포주는 RPMI 배지(2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 10 % FBS, 0.055 mM 2-머캅토 에탄올, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/mL G418) 조성 배지를 사용하며, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
3) 동물모델 제작
6~8주령 암컷 C.B-17 SCID 마우스를 7일간의 순화 기간을 거친 뒤 OVCAR-3-Luc 세포주 5x106 세포/100 ㎕를 복강에 주입하였다.
(2) NK 세포 투여 및 항암효능 평가
1) NK 세포 투여
종양 이식 후, 마우스 군을 무작위적으로 분리하여 표시하였다. 대조군에는 200 ㎕의 하트만 용액 (중외제약)을 복강에 주입하였다. NK 세포 투여군에는 1x107/200 ㎕개의 NK 세포를 종양 이식 1주일 후부터 2~3일 간격으로 복강에 5회 투여하였다.
2) 항암효능 평가
OVCAR-3-Luc 이식 후, 매일 마우스의 일반 상태와 운동성을 관찰하였다. 루시페린을 마우스에 복강 투여하고, 7일 간격으로 IVIS 영상 장비(Xenogen)를 이용하여 루시퍼라제 영상을 촬영하였다. 종양이식 8주 후에 모든 군의 마우스를 개복하여, 종양의 부피를 측정하였다.
종양세포가 투입된 직후에는 종양세포가 복강 전체에 퍼져 루시퍼라제 영상이 큰 것으로 보인다. 그러나, 7일 이후에는 종양이 생착됨에 따라 루시퍼라제 수치가 감소하였다. 7일 이후부터, NK 세포를 투여한 그룹에서 23일까지 지속적으로 루시퍼라제 수치가 감소하는 반면, 음성 대조군에서는 루시퍼라제 수치가 증가하였다(도 12 (a) 참조).
8주째, 마우스를 희생하여 종양을 적출하고, 종양의 크기와 무게를 측정하였다(도 12(b) 참조). 음성대조군 대비 NK 세포 투여군에서는 종양의 무게가 54.91%로 감소하였음을 확인하였다. 즉, 음성대조군에 비하여 NK 세포 투여군에서 종양의 부피가 현저히 감소하였다. 이는 NK 세포를 난소암 복강 전이모델에 복강으로 투여하면 종양의 성장을 억제할 수 있음을 제시한다.
실시예 7:간암 동물 모델에서 NK 세포의 항암 효능 평가
(1) 간암 동물 모델 구축
NK 세포의 간암에 대한 항암 효능을 평가하기 위하여, 인체 유래 간암 세포주인 SNU-354를 이식한 인간 종양 이식 모델(human tumor xenograft model)을 구축하고 NK 세포를 투여하였다. 인체 유래 간암 세포주인 SNU-354는 6X106 cells/mouse의 농도로 누드 마우스 측면에 피하 (s.c.) 이식하였다.
(2) NK세포 투여 및 항암 효과 평가
1) NK 세포의 투여
SNU-354 이식 2시간 후에 1 x 106 cells 또는 1 x 107 cells의 용량으로 NK 세포를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 200 ㎕로 투여하였다. 최초 투여 이후, 동일한 용량의 NK 세포를 1주 간격으로 3회 이상 투여하였다.
[표 4] 그룹별 NK 세포치료제 및 항암제 투여 방법
2) 항암 효능 평가
시험기간 동안 NK 세포에 의한 독성을 평가하기 위하여, 일반 증상을 매일 관찰하였고, 동물의 체중 및 종양 부피를 시험 종료시까지 11회 (0, 7, 9, 12, 14, 16, 19, 21, 23, 26 및 28일) 측정하였다. 28일 이후, 동물을 희생하여 추출한 종양의 무게를 측정하였다.
음성대조군과 비교하여, NK 세포 투여군의 종양 부피가 음성대조군에 비하여 37.7% (1 x 106 cells/mouse) 및 50.6% (1 x 107 cells/mouse) 감소하였음을 확인하였다 (도 13).
또한, 음성대조군과 비교하여 NK 세포 투여군의 종양 무게가 36.0% (1 x 106 cells/mouse) 및 50.2% (1 x 107 cells/mouse) 감소하였다.
따라서, NK 세포는 간암 치료에 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 8: 신경모세포종 동물모델에서 자연살해세포의 항암효능 평가
(1) 신경포세포종 동물모델 구축
1) NB-1691luc 세포주 배양
NB-1691(human neuroblastoma cell line, from St. Jude Children's Research Hospital)에 루시퍼라제 유전자를 형질감염시켜 제조된 NB-1691luc (Human Neuroblastoma) 세포주를 RPMI 배양액 (2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 10 % FBS, 0.055 mM 2-머캅토 에탄올, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍/mL G418) 조성 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
2) 동물 모델의 구축
7주령 암컷 C.B-17 SCID 마우스를 7일간의 순화 기간을 거친 뒤, NB-1691luc 세포주를 5x105 cells/100uL의 농도로 마우스 꼬리 미정맥에 주입하였다.
(2) 자연살해세포 투여 및 항암효능 평가
1) NK세포 투여
종양이식 후, 마우스를 무작위적으로 분류하고 표시하였다. 대조군에는 200 uL의 하트만용액 (중외제약, 한국)을 꼬리 미정맥에 주입하였다. NK 세포 처리군에는 종양을 이식한지 1주후부터 2~3일 간격으로 1x107 cells/200uL의 NK 세포를 꼬리 미정맥에 5회 주입하였다.
2) 항암효능 평가
NB-1691luc 이식 후, 마우스의 일반 상태 및 운동성을 매일 관찰하였다. 종양 생성을 확인하기 위하여, 루시퍼린을 마우스 복강에 투여하고, IVIS 영상 장비 (xenogen)를 이용하여 7일 간격으로 luciferase 영상을 촬영하였다.
시험하는 동안, 주 5회 사망 동물의 유무를 확인하였다. 그 결과, 대조군 및 NK세포 투여군에 대한 생존일수는 각각 49일 및 51일이었다. 다만, NK세포 투여군의 생존은 log-rand test 결과 유의하게 증가하였다 (도 14).
실시예 9 : 다양한 종양 세포주 및 바이러스 감염 세포주에 대한 NK 세포의 in vitro에서의 효능 평가
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 NK 세포를 사용하여, NK 세포의 살해능을 실시예 1(3)에 기재한 바와 같이 평가하였다.
NK 세포의 사이토카인 분비능을 다음과 같이 측정하였다:
5x106 cell/mL NK세포와 5x106 cell/mL 타킷 종양 세포주(K562등)를 준비하고, 준비된 NK 세포 및 타깃 종양 세포주를 둥근 바닥 96-웰 플레이트 넣었다. 세포내 축적된 사이토카인의 분비를 막기 위하여 GolgiStop (BD Pharmingen,554724)를 함께 넣어주었다.
웰1 : 현탁된 NK 세포 100 uL, RPMI 배지 100 uL, 항-인간 CD107a-APC (BD Pharmingen, 560664) 1 uL
웰 2 : 현탁된 NK 세포 100 uL, 현탁된 타깃 종양 세포주 100 uL, 항-인간 CD107a-APC (BD Pharmingen, 560664) 1 uL
웰 3 : 현탁된 NK 세포 100 uL, 현탁된 타깃 종양 세포주 100 uL, APC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤 (BD Pharmingen, 555751) 5 uL
96-웰 플레이트를 호일로 감싼 다음, 37℃ 인큐베이터에서 4시간을 두었다. 4시간 후, 96-웰 플레이트의 상층액을 제거하고, 100 uL FACS 버퍼, 7-AAD (BD, 559925) 5 uL, 항-인간 CD3-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, 45-0036-42) 1 uL, 및 항-인간 CD56-APC-eFluor780 (eBioscience, 47-0567-42) 1 uL 를 각 웰에 넣었다.
96-웰 플레이트를 30분간 4℃에 보관하여 염색한 후, 200 uL FACS 버퍼를 넣고 2000 rpm으로 3분간 원심 분리하였다(2회).
96-웰 플레이트의 상층액을 제거하고, Cytofix/Cytoperm (BD, 51-2090KZ)을 각 웰마다 200 uL 넣었다. 파이펫을 이용하여 각 웰의 혼합물을 잘 섞어준 후, 고정하기 위해 30분간 4℃에서 보관하였다
고정 후에, 증류수로 10배 희석된 200 uL의 Perm/Wash 버퍼(BD, 51-2090KZ)를 각 웰에 넣고 96-웰 플레이트를 2000 rpm으로 3분간 원심분리 하였다 (2회).
상층액을 제거하고, 아래 기재된 항체 세트를 상층액 제거 후에 넣었다.
웰 1, 2 : 희석된 Perm/Wash 100 uL, 항-인간 IFN-g-FITC (BD, 554700) 1 uL, 항-인간 TNF-a-PE-Cy7 (eBioscience, 25-7349-82) 1 uL
웰 3 : 희석된 Perm/Wash 100 uL, FITC 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤 (BD, 555748) 5 uL, PE-Cy7 마우스 IgG1 k 아이소타입 컨트롤 (BD, 557872) 5 uL
96웰 플레이트를 30분간 4℃에서 보관하여 사이토카인을 염색하였다. 염색 후, 증류수로 10배 희석된 200 uL의 Perm/Wash 버퍼(BD, 51-2090KZ)를 각 웰에 넣고 96웰 플레이트를 2000 rpm으로 3분간 원심분리 하였다 (2회).
최종적으로, 희석된 Perm/Wash 버퍼 (BD, 51-2090KZ) 200 uL를 넣어 현탁하고, 사이토카인 분비능을 FACSFortessa(BD)로 평가하였다.
도 15는 다음의 다양한 암세포주 및 바이러스 감염된 세포주에서 NK 세포의 in vitro 효능 (세포살상능 및 사이토카인 분비능)을 보여준다:
(a) K562 세포주 (Leukemia)
(b) Rajj 세포주 (Lymphoma)
(c) SK-N-SH 세포주 (Neuroblastoma)
(d) SNUOT-Rbl 세포주 (Retinoblastoma)
(e) U87-MG 세포주 (Glioblastoma)
(f) OYCAR-3 세포주 (ovarian cancer)
(g) Huh-7 세포주 (HCC, Hepatocellular carcinoma)
(h) SNU398 세포주 (HBY infected HCC)
(i) Huh-7.5 세포주 (HCY infected HCC)
NK 세포는 대부분의 암세포주에서 매우 높은 세포살상능을 보였다. 또한, NK 세포는 바이러스가 감염된 세포주에 대해서도 우수한 살상능을 보였다.
NK 세포의 사이토카인 분비능은 일부 세포주에서 관찰하였는데. 특히 NK 세포는 K562 세포주와 바이러스가 감염된 암세포주(HBY 및 HCY 감염 HCC 세포주)에 대하여 강한 사이토카인 분비능을 보여주었다.
결론적으로, 본 발명에 따라 제조된 NK 세포는 다양한 암세포주 및 바이러스 감염된 세포주에 대하여 우수한 효능 (세포살상능 및 사이토카인 분비능)을 나타냄을 확인하였다.
Claims (18)
- (i) 인간 말초혈액으로부터 말초혈 백혈구 세포 및 NK 세포를 분리하는 단계;
(ii) 항-CD3 항체, 사이토카인 및 지지세포를 포함하는 배양액 중에서 NK 세포를 정치배양하여 세포간 접촉을 자극하는 단계;
(iii) 상기 단계 (ii)에서 정치배양이 완료된 후, 사이토카인, 항-CD3 항체 및 지지세포를 첨가하여 재자극하고 다시 정치배양하여 세포간 접촉을 유도하는 단계; 및
(iv) 정치배양이 완료된 후, 정치 또는 부유 배양을 위해 필요한 사이토카인 등을 포함하는 배지를 세포에 추가하고, 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하면서 정치 또는 부유 배양하는 단계를 포함하는 NK 세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서, (iii) 단계에서 세포 재자극 및 정치배양을 2회 이상 반복하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (ii) 단계에서의 정치배양은 2 내지 15일간, (iii) 단계에서의 정치배양은 2 내지 7일간 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (iv) 단계에서의 부유배양은 쉐이킹 플라스크, 진탕 배양기, 발효조, T-플라스크, 일회용 세포 배양 백(disposable cell culture bag)으로 구성된 군으로부터 선택되는 반응기를 이용하여 수행됨을 특징으로 하는 NK 세포의 제조방법.
- 제1항에 있어서, (ii) 또는 (iii) 단계에서의 정치배양 및 (iv) 단계에서의 정치 또는 부유배양은 동일한 반응기 또는 상이한 반응기에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, (iv) 단계에서의 정치 또는 부유배양 중 배양액에서의 세포 농도 및 사이토카인 농도를 측정하고, 사이토카인을 포함하는 배지를 첨가하여 세포 농도 및 사이토카인 농도를 일정하게 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항-CD3 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상임을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 항-CD3 항체는 OKT-3 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상임을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 지지세포는 불활성화된 말초혈 단핵구 세포임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 NK 세포.
- 제12항에 따른 NK 세포를 포함하는 암 또는 감염성 질환 치료용 조성물.
- 제13항에 있어서, 추가적으로 알부민을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 알부민은 전체 조성물을 기준으로 0.1 내지 5 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 종양은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 감염성 질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 따른 조성물을 포함하는 액상 또는 동결된 형태의 제제.
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