KR20080008060A - 자연살해세포의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 수준에서의 유전자 발현의 양적, 질적으로 분석하기 위해 고안된 전사체 (transcript)의 short sequence tag을 분석하여 유전자로부터의 거의 모든 전사체를 분석하여 대량의 유전자 정보의 분석이 가능한 serial analysis of gene expression (SAGE) 기술을 이용하여 얻은 결과를 바탕으로 조혈줄기세포로부터 자연살해세포의 분화 및 활성에 관여하는 Axl 수용체 타이로신 인산화효소 및 그 리간드인 Gas6을 클로닝하여 이들의 새로운 기능의 발견에 관한 것이다.

조혈줄기세포, Ax1 수용체 타이로신 인산화효소, Gas6, 자연살해세포

Description

자연살해세포의 제조 방법 {A method for production of natural killer cell}

도 1은 쥐의 골수로부터 조혈줄기세포의 분리와 자연살해세포로의 분화 유도과정을 나타낸 것이고,

도 2는 Self-inactivating Lenti 바이러스를 기초로한 벡터시스템 분석 결과를 나타낸 것이고,

도 3은 조혈줄기세포 (HSC)로부터 분리된 자연살해세포의 분화단계별 세포들 (pNK, mNK)의 순도를 나타낸 것이고,

도 4는 조혈줄기세포 및 자연살해세포 분화단계별 세포들에서 자연살해세포에 특이적인 유전자 발현을 나타낸 것이고,

도 5는 자연살해세포 전구세포와 OP9 stromal 세포의 공동배양에 의한 자연살해세포의 최종분화 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이고,

도 6은 SAGE에 의한 자연살해세포 분화단계별로 발현되는 특이 유전자 발굴을 위한 모식도를 나타낸 것이고,

도 7은 자연살해세포의 전구세포에서 유전자 발현과 SAGE 결과의 일치성을 나타낸 것이고,

도 8은 Axl 항체가 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 것이고,

도 9는 OP9 stromal 세포와 공동배양 없이 저농도의 IL-15와 Axl 항체에 의한 자연살해세포의 분화효과를 나타낸 것이고,

도 10은 생쥐 재조합 Gas6이 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 것이고,

도 11은 Vitamin K cycle에서 g-carboxylation 과정을 나타낸 것이고,

도 12는 Warfarin이 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 것이고,

도 13은 생쥐 Gas6 cDNA의 클로닝 결과를 나타낸 것이고,

도 14는 Gas6 발현벡터의 제조 결과를 나타낸 것이고,

도 15는 생쥐 Gas6 cDNA의 클로닝과 발현벡터의 제작 결과를 나타낸 것이고,

도 16은 생쥐 Gas6 stable transfectant 에서 Gas6 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이고,

도 17은 Gas6 transfectant가 자연살해세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 것이고,

도 18은 생쥐 Axl cDNA의 클로닝 및 retroviral 벡터 (pLXSN) 에서 클론된 Axl cDNA의 방향을 확인한 결과를 나타낸 것이고,

도 19는 생쥐 Axl-Fc 발현벡터의 제작 결과를 나타낸 것이고,

도 20은 Double-프로모터 siRNA 카세트와 siRNA template oligomer들의 구성을 나타낸 것이고,

도 21은 siRNA construct의 클로닝 결과를 나타낸 것이고,

도 22는 293T세포에서 pFIV-U6/H1-GFP virus의 감염정도를 분석한 결과를 나 타낸 것이고,

도 23은 조혈줄기세포와 자연살해세포의 전구세포에서 pFIV-U6/H1- GFP virus 감염정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

*본 발명은 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화와 활성을 조절할 수 있는 Axl 수용체 및 그 리간드 Gas6을 클로닝하고 분리정제 하는 방법과 그에 관한 새로운 기능의 발견으로 이를 암치료 분야에 이용할 수 있을 것이다.

현재의 암 치료법들인 외과적 수술요법, 약물요법, 방사선치료법 등은 일시적으로 치료효과를 나타낼 수 있으나 내성, 재발 또는 여러 가지 부작용이 발생하는 문제점이 있어 많은 선진국들에서 항암제나 진단시약을 개발하기 위해 면역반응을 조절할 수 있는 면역치료법을 이용하고자 하는 시도가 활발히 진행되고 있으나 암의 진단, 예방 및 치료법을 효율적으로 개발할 수 있는 면역세포치료법 개발은 아직 초기단계로 알려져 있다.

자연살해세포는 병원균, 암, allogeneic 세포 등을 제거하는 선천성면역 (innate immunity)에 관여하며, TNF-α, IFN-γ, IL-12등의 사이토카인을 분비하여 적응성면역 (adaptive immunity)을 매개함으로써 암에 특이적인 기억형성을 조절하는 기능을 가지고 있으며 여러 암들에서 자연살해세포의 기능 및 분화능력에 결함이 있는 것으로 보고되었다. 자연살해세포를 이용한 기존의 암 치료요법으로는 인터루킨-2로 자연살해세포를 활성화시켜 암세포에 대한 면역반응을 증진시키는 방법이 이용되어 왔는데 이러한 방법은 부작용과 함께 개인에 따른 치료효과의 지속성, 내성 및 치료효과의 차이 등 많은 문제점을 가지고 있다고 알려져 있다. 따라서 이러한 문제점들을 해결하기 위해 본 발명에서는 기존의 대부분의 연구들에서 이용한 성숙된 자연살해세포와는 달리, 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell, HSC)로부터 자연살해세포의 분화과정 (도 1)을 촉진시키는 유전자인 Axl을 발견하였다.

Axl 수용체 타이로신 인산화효소 (tyrosine kinase) (p140)는 Sky, Eyk 가족 (family)에 속하는 타이로신 수용체 인산화효소로써 Axl family에는 Rse (Sky, Brt, Tif, Dtk, Tyro3), Mer (Eyk, Nyk, Tyro12)가 있으며 Axl, Rse, Mer은 대부분의 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있으나 그 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. Axl의 리간드로는 Gas6이 알려져 있으며, 이는 비타민 K에 의존적인 세포성장인자 (vitamin K-dependent growth-potentiating factor)로 Axl의 독특한 구조상 세포의 이동, 성장, 분화에 관여할 것으로 추론되고 있다. Axl의 발현은 섬유아세포 (fibroblasts), myeloid 조상세포 (progenigor) 세포, 대식세포 (macrophages), 신경조직, 난포 (ovarian follicles), 골격근 (skeletal muscle) 등에서 발현되나 림프구 (lymphocytes)에서는 발현되지 않는다고 보고 된 바 있다.

본 발명에서는 유전자 수준에서의 유전자 발현의 양적, 질적으로 분석하기 위해 고안된 전사체 (transcript)의 short sequence tag을 분석하여 유전자로부터의 거의 모든 전사체를 분석하여 대량의 유전자 정보의 분석이 가능한 serial analysis of gene expression (SAGE) 기술을 이용하여 얻은 자연살해세포의 분화 및 활성에 관여하는 Axl 수용체 및 그 리간드인 Gas6을 클로닝하여 이들의 새로운 기능을 발견하였다.

상기의 목적을 위하여, 본 발명은 성체줄기세포를 Gas6로 처리하여 성체 NK 세포를 수득함을 특징으로 하는 성체 NK 세포의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 성체줄기세포를 IL-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 NK 전구세포로 분화시킨 후 NK 전구세포를 Gas6로 처리함을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 여기서, 상기의 세포는 Gas6와 함께 IL-15로 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 상기의 성체줄기세포는 사람 또는 제대혈로부터 유래된 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 상기의 Gas6는 감마-카르복실화된 재조합 Gas6이 바람직할 것이다.

본 발명의 다른 양태로는 재조합벡터 pcDNA3.1(+)-GAS6을 제공한다.

본 발명의 또 다른 재조합벡터 pcDNA3.1(+)-GAS6를 포함한 형질감염체를 제공하다. 여기서, 숙주가 마우스 OP9 세포주인 형질감염체가 바람직하다.

자연살해세포는 특정 미생물 감염 및 신생물의 인식 및 파괴를 포함한 다양한 생물학적 기능을 갖는 선천적 면역계에 연루된 백혈구 임파구이다 (Moretta, A., Bottino, C., Mingari, M.C., Biassoni, R. and Moretta, L., Nat. Immunol., 3, 6, 2002). 이들의 형태적 특징은 세포질내에 조밀하게 분홍-보라색의 염색 과립의 존재를 근거로 거대한 과립 임파구 (LGL)-유사 형태를 보여준다. 이들은 정상적인 말초혈 임파구에서 약 10 내지 20%, 간 임파구에서 15 내지 25%, 비장 임파구에서 1 내지 5%를 포함한다. 휴면 NK 세포는 혈중에 순환하나, 사이토카인에 의한 활성화 후 이들은 병원체-감염된 또는 악성 세포를 함유한 대부분의 조직내로 유출 및 침윤할 수 있다 (Colucci, F., Di Santo, J.P. and Leibson, P.J., Nat. Immunol., 3, 807, 2002; Kelly J. M., Darcy P. K., Markby J. L., Godfrey D. I., Takeda K., Yagita H., Smyth M. J., Nat. Immunol., 3, 83 , 2002; Shi F. D., Wang H. B., Li H., Hong S., Taniguchi M., Link H., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Nat. Immunol., 1, 245, 2000; Korsgren M., Persson C. G., Sundler F., Bjerke T., Hansson T., Chambers B. J., Hong S., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Korsgren O., J. Exp. Med., 189, 553, 1999). 일반적으로, NK 세포의 표현형은 CD56 및 CD16 (사람), NKR-P1C (마우스에서 NK1.1, 사람에서 CD161), DX5, Ly49 (마우스; 이들은 특정 마우스 스트레인으로 한정된다) 표면 항원의 발현 및 CD3의 결여로 특징지워진다. 사람 NK 세포의 대부분 (총 NK 세포중 90%)은 CD56의 저밀도 발현 (CD56 ^dim, 보다 더 세포독성을 나타냄)을 나타내고 고수준의 Fcγ 수용체 III (FcγRIII, CD16)를 발현하는 반면, 약 10%의 NK 세포는 CD56^brightCD16^dim 또는 CD56^brightCD16^- 이다(Schattner, A. and Duggan, D. B., Arthritis Rheum., 27, 1072, 1984).

NK 세포는 바이러스-감염된 세포, 종양 세포 및 일부 정상적인 동종 세포에서 사전 교육 없이 활성화 수용체와 이들의 리간드간의 상호작용을 통한 초기 숙주 방법에 핵심적인 역할을 한다. NK 세포는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 분자에 대해 특이적인 NK 억제 수용체를 통한 인식으로 인해 정상 세포와 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 분자의 발현이 없는 세포를 구별하는 능력을 갖고 있다. NK 세포의 기능은 표적 세포에서 MHC 부류 I 또는 MHC 부류 I-연관된 분자와 같은 리간드와 상호작용하는 활성화 수용체와 억제 수용체간의 균형에 의해 조절된다 (Rajaram, N., Tatake, R. J., Advani, S. H. and Gangal, S. G., Br. J. Cancer, 62, 205, 1990). 이들 수용체는 두 개의 구조적 과로 분류된다: 면역글로불린 상위과 (백혈구 억제 수용체, 살해세포 Ig-유사 수용체 (KIR, CD158) 및 C-유형 렉틴-유사 과 (NKG2D, CD94/NKG2, 임파구 항원 49 (LY49)).

NK 세포는 세포-표면 수용체와 이들의 리간드사이의 상호작용 후 인터페론-γ 및 종양-괴사 인자-α (TNF-α)와 같은 몇 가지 사이토카인을 생성한다 (Bryson, J. S. and Flanagan, D. L., J. Hematother. Stem Cell Res,. 9, 307, 2000). NK 세포의 작용기 기능은 인터루킨 (IL-2), IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 I형 인터페론 (IFN-αβ)를 포함한 사이토카인과 세포 표면 수용체의 차별적인 개입과 조합하여 자극할 수 있는 반면, 이들은 IFN-γ, IL-5, IL-10, IL-13, INF-α 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)와 같은 면역조절 사이토카인뿐만 아니라 NK 수용체와 이들의 리간드간의 상호작용 후 많은 케모카인을 생성한다 (Shi F. D., Wang H. B., Li H., Hong S., Taniguchi M., Link H., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Nat. Immunol., 1, 245, 2000). 사람의 경우, CD56^bright NK 세포 하위세트는 또한 IFN-g, TNF-a, TNF-b, IL-10 및 GM-CSF (Lian R. H., Maeda M., Lohwasser S., Delcommenne M., Nakano T., Vance R. E., Raulet D. H., Takei F., J. Immunol ., 168, 4980, 2002)를 포함한 몇 가지 사이토카인을 생성하지만, CD56^dim NK 세포 하위세트는 이들 사이토카인을 생성하지 않는다 (Colucci, F., Di Santo, J.P. and Leibson, P.J., Nat. Immunol., 3, 807, 2002; Shi F. D., Wang H. B., Li H., Hong S., Taniguchi M., Link H., Van Kaer L., Ljunggren H. G., Nat. Immunol., 1, 245, 2000). 비록 미성숙 NK 세포가 IL-5 및 IL-13과 같은 Th2 사이토카인을 생성할 수 있을지라도, Th2 사이토카인을 생성하는 능력은 최종 분화시 상실된다; 대신 성숙 NK 세포는 IFN-g를 생성하는 능력을 획득한다 (Van Beneden K., Stevenaert F., De Creus A., Debacker V., De Boever J., Plum J., Leclercq G., J . Immunol., 166, 4302, 2001).

NK 세포는 IL-15 ( Crosier, K. E. and Crosier, P. S., Pathology, 29, 131, 1997; Nakano, T., Kawamoto, K., Kishino, J., Nomura, K., Higashino, K. and Arita, H., J. Biochem., 323, 387, 1997; Fridell, Y. W., Villa, J., Jr, Attar, E. C. and Liu, E. T., J. Biol. Chem., 273, 7123, 1997) 또는 IL-2 (Goruppi, S., Ruaro, E. and Schneider, C., Oncogene, 12, 471, 1996)에 의해 부분적으로 조절되는 XCL1, CCL1, CCL3, CCL4, CCL5, CCL22, and CXCL8 (Lundwall, A., Dackowski, W., Cohen, E., Shaffer, M., Mahr, A., Dahlback, B., Stenclrclr, J. and Wydro, R., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986)를 포함한 많은 케모카인을 분비하고 반응한다. 이들 케모카인은 이차 임파구 조직에서 감염 및 신생 세포에 대한 NK 세포 홈밍에 중요한 역할을 하며 그 조직에서 IFN-g의 생성이 T 세포 반응을 직접적으로 조절하는 역할을 할 수 있다 (Lundwall, A., Dackowski, W., Cohen, E., Shaffer, M., Mahr, A., Dahlback, B., Stenclrclr, J. and Wydro, R., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986). 휴면 CD56^dim/CD16⁺ NK 세포 하위세트는 CXCR1, CXCR2, CXCR3 및 CXCR4를 발현하는 한편, CD56^bright/CD16^- NK 세포는 고수준의 CCR5 및 CCR7을 발현한다. NK 세포의 세포용해 활성은 CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL10 및 CXC3L1에 의해 자극된다.

NK 세포가 암세포를 죽이는 기전에는 다음의 두 가지가 있다. 세포 수용체를 이용한 방법으로 NK 세포는 세포 표면에 세 가지 종류의 TNF 단백질을 발현한다. 이는 FAS ligand (FASL), TNF 그리고 TNF related apoptosis inducing ligand (TRAIL)로 암세포에 있는 이들수용체와 결함하여 암세포의 세포사를 유도하는 것으로 알려진다 (Ashkenazi, A., Nature Rev. Cancer., 2, 420, 2002). NK세포가 암세포를 죽이는 또 다른 방법은 퍼로린이나 그랜자임과 같은 세포질성 과립물들을 통한 것이다. 이 물질들은 암세포의 세포막을 뚫어 암세포를 용해 시키며 결국에는 암세포를 죽게 만드는 작용을 하게 된다 (Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R. and Smyth, M. J., Curr. Opin. Immunol., 12, 323, 2000).

NK세포는 만능 조혈줄기세포로부터 유래한다는 것은 잘 알려져 있지만 아직 그것의 발생과정에 대해서는 잘 알려져 있지 않다 (Lian R. H., Maeda M., Lohwasser S., Delcommenne M., Nakano T., Vance R. E., Raulet D. H., Takei F., J. Immunol., 168, 4980, 2002). 조혈줄기세포는 (Lin^-CD34⁺ in human, Lin^- c-kit ⁺Sca2⁺ in mouse) 태아의 흉선, 태아의 간, 제대혈 그리고 성체 골수로부터 유도되어 질 수 있고 이들은 T/NK로 분화 할 수 있는 전구물질로 (Lian R. H., Kumar V., Semin. Immunol., 14, 453, 2002; Douagi I., Colucci F., Di Santo JP., Cumano A., Blood, 99, 473, 2002) 시험관 수준에서 IL-7, stem cell factor (SCF), 그리고 flt3L과 반응하여 배양하면 pNK로 분화 할 수 있는 능력을 가진다 (Williams N. S., Klem J., Puzanov I. J., Sivakumar P. V., Bennett M., Kumar V., J. Immunol,. 163, 2648, 1999). pNK세포는 골수, 태아의 흉선, 혈액, 비장 그리고 간 등에 고루 퍼져 있지만 IFN-γ 를 생산하지 못해 세포용해능력은 없지만 CD122 (IL-2/15Rβ⁺) 는 발현한다.

pNK (CD56^-CD122⁺CD34⁺ in human, CD122⁺ NK1.1^-DX5^- in mouse) 세포는 IL-15를 처리하여 배양시키면 immature NK (CD122⁺CD16^loCD56^-KIR^- in human, CD122⁺CD2⁺NK1.1⁺DX5^-Ly49^- in mouse)세포로 분화 할 수 있다 . pNK세포를 IL-15가 포함된 배지에서 지속적으로 배양을 하게 되면 pseudomature 세포용해성 NK(CD122⁺CD2⁺NK1.1⁺DX5⁺CD94/NKG2⁺Ly49^-) 세포로 분화 할 수 있지만 이들의 세포용해능력은 거의 없는 것으로 알려 진다. 간질(stromal)세포는 여러 종류의 사이토카인과 발달과정중의 NK세포 표면 수용체와 직접적으로 반응 할 수 있는 물질들을 분비 한다는 보고가 있다. 간질 세포가 분비하는 이러한 물질들은 mNK세포의 성숙과정에 필수적인 요소로 mNK 세포에 LyS49⁺가 발현되도록 해주는 기능을 가진다 (Iizuka K., Chaplin D. D., Wang Y., Wu Q., Pegg L. E., Yokoyama W. M., Fu Y. X., Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 6336, 1999; Briard D., Brouty-Boye D., Azzarone B., Jasmin C., J. Immunol., 168, 4326, 2002). 세포용해능을 가지는 Ly49⁺ mNK(CD56⁺KIR⁺CD3^- in human, CD122⁺CD2⁺NK1.1⁺DX5⁺CD94/NKG2⁺ Ly49⁺CD3^- in mouse) 세포는IL-15 존재 하에서 pNK 세포와 간질세포의 공동배양을 통해 분화 시킬 수 있다 (Williams N. S., Klem J., Puzanov I. J., Sivakumar P. V., Bennett M., Kumar V., J. Immunol,. 163, 2648, 1999). Nk 세포의 발달 단계 중 초기 발달 단계에는 CD94, NKG2A, NKG2C 과 Ly49B 가 발현이 되고 그 다음 단계에서는 Ly49G, Ly49C, Ly49I이 발현이 되고 마지막 단계에서는 Ly49A, D, E and F가 발현이 된다 (Williams N. S., Kubota A., Bennett M., Kumar V., Takei F., Eur. J. Immunol., 30, 2074, 2000).

pNK세포는 PU.1, GATA3, Id2, 그리고 Ets-1. 과 같은 전사 인자를 발현 한다 (Boggs S. S., Trevisan M., Patrene K., Geogopoulos K., Nat. Immunol., 16, 137, 1998).전사인자 ikaros, PU.1 (Colucci F., Samson S. I., DeKoter R. P., Lantz O., Singh H., Di Santo J. P., Blood, 97, 2625, 2001), 과 Id2 (Ikawa T., Fujimoto S., Kawamoto H., Katsura Y., Yokota Y., Proc. Natl. Acad. Sci,. 98, 5164, 2001)를 결핍시킨 마우스에서 pNK 세포수의 감소가 관찰된다. 조혈모세포는 myeloblastosis (myb) oncogene, forkhead-related transcription factor 1C, c-myc, 그리고 Oct 2b와 같은 전사 인자를 발현한다. 이들 인자들은 pNK 세포의 증식과 발달에 중요한 역할을 한다 (Bar-Ner M., Messing L. T., Segal S., Immunobiology, 185, 150, 1992; Melotti P., Calabretta B., Blood, 87, 2221, 1996). pNK 세포에서 Fc 수용체, RNF 수용체, IL-7 수용체와 케모카인 수용체 그리고 CD36 와 같은 면역 조절제들은 pNK 세포 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려 진다.

mNK세포에서 regulator of G protein signaling (RGS), lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, Fyn proto-oncogene, and mitogen activated protein kinase 1 와 같은 신호 전달 분자들은 NK 세포의 성숙에 관여하는 물질들이다 (Ikawa T., Fujimoto S., Kawamoto H., Katsura Y., Yokota Y., Proc. Natl. Acad. Sci,. 98, 5164, 2001; Ogasawara K., Hida S., Azimi N., Tagaya Y., Sato T., Yokochi-Fukuda T., Waldmann T. A., Taniguchi T., Taki S., Nature, 391, 700, 1998). mNK 세포에 IL-2 의 처리는 mNK 세포의 증식과 활성을 유도하는 것으로 알려진다.

수용체 티로신 키나아제는 세포의 증식, 세포의 발달, 세포의 생존 그리고 세포의 이동에 대한 세포외부 에서의 자극을 세포 안으로 신호 전달하는 트랜스멤 브레인 단백질로 구성 된다. (Ullrich, A., Schlessinger, J., Cell, 61, 203, 1990; Fantl, W. J., Johnson, D. E., Williams, L. T., Biochem., 62, 453, 1993; Heldin, C., Cell, 80, 213, 1995). 모든 수용체 티로신 키나아제는 공통적으로 세포질 키나아제 도메인을 가지고 있는데 여기에 성장 인자가 결합을 하게 되면 수용체 티로신 키나아제는 활성화가 된다. 수용체 티로신 키나아제의 활성은 자가-인산화와 티로신 인산화에 의해 이루어진다. Axl 수용체 티로신 키나아제는 (ARK 혹은, UFO, TYRO7 로도 불림) 가장 처음으로 발견된 수용체 티로신 키나아제의 슈퍼패밀리 중 하나이다. 수용체 티로신 키나아제는 다음과 같은 공통적인 구조를 가진다. 두 개의 면역글로불린과 관련된 도메인 그리고 여기에 연결되어 있는 두 개의 피브로넥틴 타입 III 반복 도메인 마지막으로 세포질 내제의 수용체 티로신 키나아제를 포함한 세포외 도메인으로 구성 된다 (O'Bryan, J. P., Frye, R. A., Cogswell, P.C., Neubauer, A., Kitch, B., Prokop, C., Espinosa, R. III, Lebeau, M. M., Earp, H. S., Liu, E. T., Mol. Cell. Biol., 11, 5016, 1991). Axl 은 가슴, 뼈대근육, 심장, 조혈조직, 정소, 난소 그리고 자궁 내막에서 발현된다 (Faust, M., Ebensperger C., Schulz, A. S., Schleithoff, L., Hameister, H., Bartram, C. R. and Janssen, J. W., Oncogene, 7, 1287, 1992; Graham, D. K., Bowman G. W., Dawson, T. L., Stanford W. L., Earp, H. S., and Snodgrass, H. R., Oncogen, 10, 2349, 1995; Neubauer, A., Fiebeler, A., Graham, D. K., O'Bryan, J. P., Schmidt, C. A., Barckow, P., Serke, S., Siegert, W., Snodgrass, H. R., Huhn, D., Blood, 84, 1931, 1994; Berclaz, G., Altermatt, H.J., Rohrbach, V., Kieffer, I., Dreffer, E. and Andres, A. C., Ann. Oncol., 12, 819, 2001; Wimmel, A., Glitz, D., Kraus, A., Roeder, J. and Schuermann, M., Eur. J. Cancer., 37, 2264, 2001; Sun, W. S., Misao, R., Iwagaki, S., Fujimoto, J. and Tamaya, T., Mol. Hum. Reprod., 8, 552, 2002). Axl 은 세포외 리간드 결합 도메인과 관련된 세포 접착 분자, 두 개의 면역글로불린과 비슷한 도메인 그리고 두 개의 피브로넥틴 타입 III 도메인으로 구성된 특징을 나타내고 있다 . 최근 연구에 의하면 Axl은 암형성, 신경과 조혈 조직의 발달과정에 관여한다는 보고가 있다 (Crosier, K. E. and Crosier, P. S., Pathology, 29, 131, 1997).

Gas6는 성장 정지 특이 유전자 6 단백질로 비타민 K 의존성 단백질 패밀리중 하나이다. 이들 패밀리는 Axl, Sky (Rse, Brt, Tif, Dtk, Etk-2 and Tyro3) 과 Mer (c-Eyk, Nyk and Tyro12)을 포함한 수용체 티로신 키나아제의 Axl/sky 패밀리에 대한 리간드로 알려져 있다. (Godowski, P. J., Mark, M. R., Chen, J., Sadick, M. D., Raab, H. and Hammonds R. G., Cell, 82, 355, 1995; Varnum, B. C., Young, C., Elliott, G., Garcia, A., Bartley, T. D., Fridell, Y. W., Hunt, R. W., Trail, G., Clogston, C., Toso, R. J., Nature, 373, 623, 1995; Chen, J., Carey, K. and Godowski, P. J., Oncogene, 14, 2033, 1997). Gas6는 혈액 응고 조절과 관련된 혈청 단백질인 protein S와 46% 의 동일한 아미노산 서열을 가지고 있고 protein S 와 비슷한 구조를 가진다 (Manconrftti, G., Brancolini, C., Avanzi, G. and Schneider, C., Mol. Cell. Biol., 13, 4976, 1993). Gas6 는 장, 고환, 폐의 내피, 자궁내막에서 발현이 되고 자궁내막 암에서도 많이 발현 된다 (Prieto, A. L., Weber, J. L., Tracy, S., Heeb, M. J. and Lai, C., Brain Res., 816, 646, 1999; Chan, M. C. W., Mather, J. P., Mccray, G. and Lee, W. M., J. Androl., 21, 291, 2000; Wimmel, A., Glitz, D., Kraus, A., Roeder, J. and Schuermann, M., Eur. J. Cancer., 37, 2264, 2001).

Gas6가 완벽한 생물학적 활성을 갖기 위해서는 비타민 K 의존성 γ-카복실레이션이 이루어 져야한다 ( Manconrftti, G., Brancolini, C., Avanzi, G. and Schneider, C., Mol. Cell. Biol., 13, 4976, 1993; Lundwall, A., Dackowski, W., Cohen, E., Shaffer, M., Mahr, A., Dahlback, B., Stenclrclr, J. and Wydro, R., Proc. Natl Acad. Sci., 83, 6716, 1986; Chen, J., Carey, K. and Godowski, P. J., Oncogene, 14, 2033, 1997). Gas6는 민무늬근육 세포에서 트롬빈에 의해 유도되는 세포 성장에 대한 인자로서 작용한다. (Nakano, T., Kawamoto, K., Kishino, J., Nomura, K., Higashino, K. and Arita, H., J. Biochem., 323, 387, 1997). 게다가, Gas6는 혈관의 민무늬근육 세포의 Axl 매게에 의한 세포 이동에 관여하는 화학유인분자로 알려진다 (Davis, J. E., Smyth, M. J. and Trapani, J. A., Eur. J. Immunol., 31, 39-47, 2001). 또한 Gas6는 혈청 결핍에 의한 NIH3T3 세포를 세포사로부터 보호해 주고 세포 주기가 계속 돌아 갈 수 있게 해 주는 역할을 한다 (Goruppi, S., Ruaro, E. and Schneider, C., Oncogene, 12, 471, 1996). 최근, Gas6는 포유류 세포에서 b-catenin의 안정화와 T-세포 인자의 전사활성을 유도한다는 보고도 있다 (Goruppi, S., Chiaruttini, C., Ruaro, M. E., Varnum, B. and Schneider, C., Mol. Cell. Biol., 21, 902, 2001).

단백질 S는 혈액응고를 막는 비타민-K 의존성 혈장 당단백질로서 응고인자 Va 및 VIIIa의 분해시 활성화된 단백질 C의 보조인자로 작용한다. 또한, 단백질 S는 distinct cell 유형에서 미토겐으로 작용하며 종양형성성 수용체 티로신 키나제의 Axl 과의 일원인 Tyro3의 리간드이다 (Wimmel A. et al., Cancer 1999 Jul 1;86(1):43-9). 수용체 단백질 S는 Gas6와 마찬가지로 수용체 티로신 키나제의 Axl/Sky 과의 일원을 자극하는 것으로 밝혀져 왔다. 단백질 S는 Gas6와 비슷한 구조( 아미노 말단 Gla 도메인, 4개의 EGF-like 도메인, 그리고 신호전달 분자돠 같은 G 도메인으로 구성)를 가지고 있으며 수용체 티로신 키나아제의 Axl/Sky 슈퍼 패밀리를 인산화 시킬 수 있는 기능을 가진다 (Evenas P., et al., Biol Chem. 2000 Mar; 381(3):199-209). 단백질 S는 유전자 재조합으로 제조할 수 있다 (Merel Van Wijnen, et al., Biochem. J. 330, 389-396).

본 발명에서 사용된 재조합 DNA 방법은 일반적으로 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 및/또는 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. (1994)]에 기술된 것이다. 예를 들면, 아래 예시적으로 기술된 바와 같이 재조합 발현 기술을 통해 Axl 또는 Gas6 단백질을 암호화한 핵산 서열을 적절한 벡터내로 삽입시킴으로써 목적하는 뉴클레오타이드 서열을 다량 생성할 수 있다. 그런 다음, 그 서열을 사용하여 검출 탐침 또는 증폭 프라이머를 생성할 수 있다. 또는, Axl 또는 Gas6 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 발현벡터내로 삽입하고, 생성된 발현 벡터를 적절한 숙주내로 도입하여 배양함으로써 단백질을 다량으로 생성할 수 있다. 핵산 서열을 수득하는 다른 방법으로는 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)이다. 역전사효소를 사용하여 폴리(A)+RNA 또는 전체 RNA로부터 cDNA를 준비한다. 전형적으로 Axl 또는 Gas6 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화한 cDNA(올리고뉴클레오타이드)의 두 개 개별 영역에 상보적인 두 프라이머를 Taq 폴리머라제와 같은 폴리머라제와 함께 cDNA에 첨가하고 폴리머라제가 두 프라이머사이의 cDNA 영역을 증폭한다. Axl 또는 Gas6 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 원핵, 효모, 곤충(baculovirus systems) 및/또는 진핵 숙주 세포에서 증폭/발현시킬 수 있다(Meth. Enz. vol. 185 D. V. Goeddel ed., Academic Press, Sna Diego Calif., 1990). 전형적으로 발현벡터는 플라스미드 유지 및 외래 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유한다. 이러한 서열로는 프로모터, 인핸서, 복제원, 전사종결서열, 분비리더서열, 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드의 암호화 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 및 선별 마커 등이 포함된다. 이러한 플랭킹 서열은 본 분야의 전문가에게는 잘 알려져 있으며 용이하게 선별적으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 Axl 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 어느 것이든 가능할 수 있다. Axl 항체는 Santa Cruz Biotech으로부터 구입할 수 있다. 또한 본 발명에서 사용되는 항체는 공지 방법에 따라 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원과 보조제를 동물에 수회 피하 도는 복강내 주사하여 획득한다. 면역화할 종에서 면역원성인 단백질 (예, 열쇠구멍삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 유도화제 (예, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스테르, N-하이드록시석신이미드, 글루타르알데하이드, 석신산 무수물, SOCl₂ 등)에 관련 항원을 결합시키는 유용할 수 있다. 동물은 항원, 면역원성 결합체 또는 유도체에 대하여 예를 들면 100 mug 또는 5 mug의 단백질 또는 결합체 (각각 토끼 또는 마우스의 경우)를 3회 용량의 프로인드 완전 부형제와 배합하고 용액을 여러 부위에 경피 주사함으로써 면역화한다. 1개월 후 동물을 프로인드 완전 부형제중 펩타이드 또는 결합체의 최초 량의 1/5 내지 1/10로 여러 부위에 피하 주사 접종한다. 7 내지 14일 후 동물로부터 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대해 검정한다. 역가 고저까지 동물을 접종한다. 바람직하게는, 동물을 동일한 항원의 결합체로 접종하지만, 다른 단백질 및/또는 다른 가교시약과 결합시키기도 한다. 또한 결합체는 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물에서 만들 수 있다. 또한 알룸과 같은 응고제가 면역반응을 증강시키는데 적절히 사용된다.

모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 군으로부터 수득된다. 즉, 그 군을 포함한 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 변형 모노클로날은 개개 항체의 혼합물이 아닌 것으로서 항체의 특성을 가리킨다. 예를들면, 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조하거나, 재조합 DNA 방법 (미국특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법 에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물 (예, 햄스터)이 상기된 바와 같이 면역화되어 면역화을 위해 사용된 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 다른 방법으로서, 림프구를 시험관에서 면역화할 수 있다. 그런 다음, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59 103 (Academic Press, 1986). 이에 따라 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 성장시킨다. 예를 들면, 모 골수종 세포가 하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없다면, 하이브리도의 배양 배지는 전형적으로 하이폭산틴, 아미놉테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이다. 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다. 바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 고수준 항체 생성을 지지하며, HAT와 같은 배지에 민감한 것이다. 이들 가운데, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 세포주, 예를 들면 미국 캘리포니아 샌디에고, Salk Institute Cell Distribution Center에서 입수할 수 있는 MOPC-21 및 PMC-11 마우스 종양 및 미국 ATCC로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포이다. 사람 골수종 및 마우스-사람 이종골수종 세포주가 또한 사람 모노클로날 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); and Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51 63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 항원에 대한 모노클로날 항체의 생성에 대해 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강 도는 시험관 결합검정 (예, 방사능면역검정 또는 효소-연결 면역흡착 검정)에 의해 결정한다. 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들면 문헌 (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980))의 Scatchard 분석으로 결정할 수 있다. 목적하는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 제한 희석 절차에 의해 아클로닝하여 클론을 얻고 표준 방법 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59 103 (Academic Press, 1986))으로 성장시킨다. 이 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에 복수 종양으로서 생체내에서 성장시킬 수 있다. 아클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 예를 들면 프로테인 A-세파로즈, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영도, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 항체 정제 절차에 의해 분리한다.

조혈모세포는 자체 재생능이 있고 개인의 일생동안 수임된 선조세포의 기원이다. 원시뿐만 아니라 보다 수임된 조혈모세포의 일반적인 특징은 항-CD34 모노클로날 항체를 이용한 FACS (형광-활성화 세포 분류기) 분석에 의해 검출될 수 있는 CD34 항원의 발현이다. 조혈모세포는 골수, 말초혈액, 제대혈 등으로부터 유래된다. 제대혈은 가장 풍부한 조혈모세포의 근원으로 알려져 있다. 분만 후 직접 태반으로부터 수득된 제대혈은 조혈모세포가 풍부하고 골수 및 말초혈로부터 얻은 세포 보다 높은 증식능을 갖는다. G-CSF와 같은 조혈성장 인자의 주입은 CD34(+) 세포의 가동화를 상당히 촉진할 수 있다 (Beyer J et al., Hematopoietic rescue after high-dose chemotherapy using autologous peripheral-blood progenitor cells or bone marrow: a randomized comparison. J Clin Oncol 1995;13:1328-1335; and Smith TJ et al., Economic analysis of a randomized clinical trial to compare filgrastim-mobilized peripheral-blood progenitor-cell trnasplantation and autologous bone marrow transplantation in patients with Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol 1997;15:5-10). G-CSF는 HSC의 채취 기간 동안에 일일 300-960 ug의 용량으로 피하 투여된다. 조혈모세포를 분리하거나 정제하는데 사용되는 전략은 많이 있다. 이 가운데 형광 (Preffer FI, et al., Lineage-negative side-population (SP) cells with restricted hematopoietic capacity circulate in normal human adult blood: immunophenotypic and functional characterization. STEM CELLS 2002; 20:417427) 또는 면역자기 기술 (Przyborski SA. Isolation of human embryonal carcinoma stem cells by immunomagnetic sorting. Stem Cells 2001; 19:500504)을 이용하여 특정 세포 표면 마커에 따라 세포를 분류하거나, 배양 플라스틱에서 줄기세포의 차등 평판 효율을 활용하거나 (Friedenstein AJ, et al., Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 1976; 4:267274), 컬럼-분리 기술 (Huss R. Isolation of primary and immortalized CD34 hematopoietic and Mesenchymal stem cells from various sources. STEMCELLS 2000; 18:19)이 포함된다.

성숙한 NK세포를 활성화하기 위해서 IL-2를 사용하는 것은 잘 알려져 있다. IL-2의 처리 방법은 두 가지가 제시되고 있다. 첫 번째 방법으로 IL-2를 직접 환자에 투여해서 투여된 IL-2에 의해서 생체내에서 NK 세포가 증식되고 활성화시키는 것이 있고, 두 번째 방법으로 환자로부터 채혈하여 혈액에서 성숙 NK세포를 분리하여 IL-2로 자극시켜 활성화시킨 후 활성화된 성숙 NK세포를 다시 환자에게 투여하는 방법이 있다. 이들은 모두 IL-2로 NK세포를 활성화시켜 활성화된 NK세포에 의해 암세포 파괴를 목적으로 하고 있다. 하지만 이러한 방법들은 고농도(약 150ng/ml)의 IL-2가 사용되어 이에 따른 부작용이 문제점으로 대두되고 있다. 이것에 대한 부작용으로는 강한 독성, 발열과 폐부종 그리고 쇼크의 유발이 있으며 이러한 효과는 IL-2가 T림프구로 하여금 TNF나 IFN-γ 와 같은 다른 사이토카인의 생산을 자극하여 이들 사이토카인이 혈관 내피와 다른 세포에 작용하기 때문이다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해 적은 농도의 IL-2 사용에 대한 연구들이 수행 중에 있지만 아직 만족할 만한 결과에 대해서는 보고되어 진 바가 없다 (M.J. Smyth, Y. Hayakawa, K. Takeda, H. Yagita, Nat Rev Cancer. 2,850, 2002; M. A. Caligiuri,et al.,J. Exp. Med. 171, 1509,1990).

본 발명에 따르면, 본 발명의 분화된 mNK 세포를 약 8 내지 15ng/ml의 저용량 IL-2로 처리하여도 mNK세포를 충분히 자극 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 IL-2의 사용량은 약 10 ng/ml이다. IL-2의 그러한 저용량은 활성화된 mNK가 독성을 유발하지 않는 것으로 보인다.

세포 보존은 몇 가지 방법이 사용되고 있는데, 가장 잘 알려진 것은 초저온 보존(cryopreservation)이다. 또한 HypoThermosol^TMBioLife Solutions Inc.) 계열 및 DMSO 용액(dimethyl sulfoxide)을 사용할 수 있다. 본 발명의 추가 관점으로서, NK 세포는 환자에게 투여 전후로 초저온보존될 수 있다. 초저온보존의 대표적인 방법이 미국특허 제60168991호에 기술되어 있다. 소규모 초저온보온의 경우 세포는 사전냉장된 5% 사람 혈청 알부민(HAS)중에 20 200x10⁶/ml로 재현탁시킬 수 있다. 이어서, 상기 HAS 용액중에 20% 디메틸설폭사이드 (DMSO)의 등량을 적가한다. 혼합물을 초저온바이알에 1 ml/바이알의 양으로 분취하고 초저온챔버 (Nalgene^TM)에서 -80℃로 밤새 동결시킨다. 대규모 초저온보존의 경우, 세포는 AIM V에 30 600x10⁶/ml로 재현탁할 수 있다. 그런 다음, 등량의 20% AIM V를 점증적으로 첨가한다. 혼합물은 속도제어 동결시스템 (Forma^TM)을 이용하여 20 ml/낭으로 동결용기 (Cryocyte, Baxter)에 동결시킨다.

활성화된 mNK 세포의 세포독성 유효량은 시험관 및 생체내 용도뿐만 아니라 이들 살해 세포의 궁극적인 표적이 되는 세포의 양 및 유형에 따라 다양할 수 있다. 또한 유효량은 환자의 건강 상태 및 중증에 따라 변할 수 있기 때문에, 전문의가 모든 변수를 적절히 고려하여 결정해야 한다. 일반적으로, 성인 암환자에게 투여하는 양은 회당 10⁶ 내지 10¹²개 세포, 바람직하게는, 회당 10⁸ 내지 10¹¹개 세포, 더욱 바람직하게는 회당 10⁹ 내지 10¹⁰개 세포이다. 본 발명의 방법에 따라 증식된 mNK세포는 약제학적으로 허용되는 담체 (예, 염수 용액)과 함께 치료를 위해 환자에게 피하, 근육내, 정맥내, intrathecal로 투여될 수 있다. 다양한 생체 재료(세포 전달체)의 사용은 NK 세포가 target 부위로 전달 되는 효율과 NK세포에 의한 암살상 능력의 효율을 높일 수 있다. 세포 전달체로는 polysaccharide 계열의 methylcellulose (M.C. Tate, D.A. Shear, S.W. Hoffman, D.G. Stein, M.C. LaPlaca, Biomaterials 22, 1113, 2001), chitosan (Suh JKF, Matthew HWT. Biomaterials, 21, 2589, 2000; Lahiji A, Sohrabi A, Hungerford DS, et al., J Biomed Mater Res, 51, 586, 2000), N-isopropylacrylamide copolymer 계열의 P(NIPAM-co-AA) (Y.H. Bae, B. Vernon, C.K. Han, S.W. Kim, J. Control. Release 53, 249,1998 H. Gappa, M. Baudys, J.J. Koh, S.W. Kim, Y.H. Bae, Tissue Eng. 7, 35, 2001) 등이 있으며 이외에도 Poly(ethylene oxide)/poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid) (B. Jeong, K.M. Lee, A. Gutowska, Y.H. An, Biomacromolecules 3, 865, 2002), P(PF-co-EG) (Suggs LJ, Mikos AG. Cell Trans, 8, 345, 1999), PEO/PEG (Mann BK, Gobin AS, Tsai AT, Schmedlen RH, West JL., Biomaterials, 22, 3045, 2001 Bryant SJ, Anseth KS. Biomaterials, 22, 619, 2001), PVA (Chih-Ta Lee, Po-Han Kung and Yu-Der Lee, Carbohydrate Polymers, 61, 348, 2005), collagen (Lee CR, Grodzinsky AJ, Spector M., Biomaterials 22, 3145, 2001), alginate (Bouhadir KH, Lee KY, Alsberg E, Damm KL, Anderson KW, Mooney DJ. Biotech Prog 17, 945, 2001 Smidsrd O, Skjak-Braek G., Trends Biotech, 8, 71, 1990) 등이 조직공학에 있어서 세포 치료에 대한 세포 전달체로써 사용되고 있다.

이하 본 발명은 하기 실시예로 예시하고자 한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 해석해서는 안 된다.

참조예 1. 쥐의 골수로부터 조혈줄기세포의 분리와 자연살해세포세포로의 분화유도

8-12 주령된 생쥐(C57BL/6)의 전체 뼈를 분리하여 골수세포 (bone marrow)를 얻은 다음 lysis buffer (0.2% NaCl, 1.6% NaCl)로 적혈구를 제거하여 세포를 2.4G2 supernatant와 10분간 ice에서 반응시키고 2mM EDTA가 함유된 인산염 완충용액 (buffer A)에 세척하였다. Buffer A에 세포를 현탁시켜 (1X108/500㎕) biotinylated antibody cocktail (Pharmingen, Mac-1, Gr-1, B220, 자연살해세포 1.1, CD2, TER-119)을 가하고 4℃에서 10분간 반응시킨 다음 세포를 buffer A로 세척하고, 1X108세포에 900㎕의 buffer A와 100㎕의 streptavidin-microbeads (Miltenyi Biotec)를 가하여 4℃에서 15분간 반응시킨다. 세포를 세척한 후, magnetic bead-activated cell sorter (MACS) buffer (2mM EDTA와 0.5% BSA가 함유된 인산염 완충용액)에 현탁시켜 Nylon mesh (70㎛)로 filter하여 준비하였다. Magnetic column (CS column, Miltenyi Biotech)을 Super MACS (magnetic bead cell sorter)에 장치하고 magnetic beads가 표지된 세포를 통과시켜 MACS buffer로 column을 충분히 세척한 다음 column을 통과한 액을 원심 분리하여 lineage 음성인 (Lin-) 세포를 얻었다. Lin-세포 (1X107)에 FITC conjugated anti-c-kit (Pharmingen)을 가하고 4℃에서 10분간 반응시킨 후, 세척하고 anti-FITC microbead (Miltenyi Biotec)와 다시 4℃에서 15분간 반응시켜 500㎕의 MACS buffer에 현탁하고 magnetic field내에서 MS column에 통과시켰다. Column을 충분히 세척하고 1ml의 MACS buffer를 가하여 flunger로 밀어내어 magnetic 양성인 세포 (c-kit+)를 얻어 조혈줄기세포로 사용하였다. 이렇게 분리된 조혈줄기 세포를 자연살해세포의 전구세포 (pre NK)로 분화시키기 위해 stem cell factor (30ng/ml), IL-7 (0.5 ng/ml), Flt-3 ligand (50ng/ml), indometacin (2㎍/ml), gentamycin (2㎍/ml)이 함유된 RPMI배지 (CM)로 3일마다 배지의 절반을 새롭게 갈아주면서 1X106/ml의 농도로 24 웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 6일 동안 이들 사이토카인들을 첨가하여 배양 후 CD122-FITC 항체와 multisort microbead를 첨가시켜 반응시키고 MACS를 수행함으로써 CD122+한 p자연살해세포 세포를 얻었다. 자연살해세포의 전구세포를 성숙한 자연살해세포로 분화시키기 위해서 다시 6일 동안 IL-15 (20ng/ml), Indometacin (2㎍/ml), Gentamycin (2㎍/ml)이 첨가된 RPMI-1640 배지를 이용하여 2가지 방법으로 분화시켰는데, OP9 stromal 세포와 공동배양 (co-culture) 하여 성숙한 자연살해세포 (mature NK-2)로 분화시키는 방법과 공동배양하지 않고 덜 성숙한 자연살해세포 (mature NK-1)로 분화시키는 방법을 수행하였으며 이들 세포를 수확하여 (harvest) 세포형광 분석기를 이용하여 자연살해세포 표면분자들의 발현을 분석하였다 (도 1).

참조예 2. 유세포형광분석기 (flow cytometry )에 의한 세포표면분자의 분석

조혈줄기세포로부터 성숙한 자연살해세포 까지 분화단계별 세포들의 특성을 여러 가지 세포표면 분자들에 대한 항체를 이용하여 면역염색하기 위하여 1x106 세포로 조정하여 염색 완충용액 (20mM HEPES, 3% 우태아혈청, 0.1% NaN3가 포함된 인산염 완충용액, pH 7.4)으로 1회 세척하였다. 이를 fluoresceinated isothiocyanate (FITC) 또는 phycoerythrin (PE) 형광물질이 결합된 자연살해세포 분화단계별 세포표식자들 (markers) 즉, 자연살해세포1.1, CD122, Ly49, NKG2 등의 항체를 세포시료에 가하여 0℃에서 30분간 반응시키고 염색 완충용액으로 2회 세척한 후 세포형광 분석기로 분석하였다.

참조예 3. 역전사 중합효소 연쇄반응 (Reverse transcriptase -polymerase chain reaction)에 의한 유전자 발현 분석

각각의 세포들로부터 전체 RNA를 얻기 위해 2 x 106의 LK1 세포를 인산염 완충용액으로 1회 세척한 후에 RNA 분리용액 (RNAzol B, TEL-TEST) 500㎕를 각 시료에 넣고 부드럽게 피펫팅 하여 세포를 깨고 50㎕의 클로로포름을 넣고 잘 섞은 후 얼음에서 5분간 방치하였다. 이를 12,000rpm, 15분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상청액을 취하고 동량의 이소프로필 알콜을 넣고 얼음에서 20분 동안 방치하였다. 다시 12,000rpm, 20분 동안 4℃에서 원심분리한 후 침전물을 80% 에탄올로 세척하고 건조시킨 후에 0.1% 디에틸 피로카보네이트 (diethyl pyrocarbonate)가 포함된 물을 20㎕ 넣고 잘 녹였다. 이와 같이 얻은 RNA로 부터 MMLV 역전사효소로 외가닥 cDNA를 합성하였고 각각의 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 그 반응 혼합물은 다음과 같다.

5 x 반응 완충용액 5㎕

dNTP (dATP, dCTP, dGTP, TTP 각 5μM) 2㎕

프라이머 1㎕

증류수 1㎕

전체 세포 RNA 10㎕

역전사 효소 1㎕ (200U)

총량 20㎕

이 혼합물을 42℃에서 30분간 반응시킨 후 90℃에서 5분간 반응을 정지시켰다. 이렇게 얻은 반응물에 다음과 같은 시료를 섞어 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

위의 반응물 20㎕

PCR 10 x 완충용액 8㎕

*5' 프라이머 1㎕ (20pmol)

3' 프라이머 1㎕ (20pmol)

증류수 69㎕

Taq 중합효소 1㎕ (2.5U)

총량 100㎕

위의 반응물을 95℃에서 5분간 방치하여 어떤 다른 효소활성을 저해시킨 후에 95℃에서 1분 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분 동안 반복하는 사이클을 30 여회 수행하고 마지막으로 95℃에서 1분 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 이렇게 얻은 반응물중에서 10㎕을 취하여 1% 아가로스 겔에서 30분간 100V에서 전기영동 하였다.

참조예 4. Gas6 transfectant 의 배양상청액과 Gas6 및 Axl 항체가 자연살해세포의 분화 및 활성에 미치는 효과

쥐의 골수로부터 얻은 Lin-, c-kit+인 조혈줄기세포를 stem cell factor (30ng/ml), IL-7 (0.5 ng/ml), Flt-3 ligand (50ng/ml), indometacin (2㎍/ml), gentamycin (2㎍/ml)이 함유된 RPMI배지 (CM)에 1X106/ml의 농도로 24 웰 배양 플레이트에서 배양한다. 37℃, 5% CO2에서 6일간 CM에 배양하여 얻은 자연살해세포 전구세포 (pre 자연살해세포)에 IL-15 (20ng/ml)과 함께 Gas6 transfectant를 24시간 동안 배양한 후 2,000rpm에서 10분간 원심분리하여 회수한 배양상등액 시료와 Gas6 및 Axl 항체를 6일간 더 배양하여 성숙한 자연살해세포로 분화시킨다. 이들 세포를 수확하여 (harvest) 세포형광 분석기를 이용하여 자연살해세포 표면분자들의 발현을 분석하였다. 이때 각 단계별 세포들의 순도는 세포형광 분석기를 이용하 여 분석한 결과 모두 약 95% 이상이었다.

참조예 5. Axl 수용체 타이로신 인산화효소의 siRNA

1) Self-inactivating Lenti virus-based 벡터시스템의 사용 목적

Retroviral 벡터는 외부유전자를 mammalian cell로 안정하고 효과적으로 운반하는 운반체로 널리 이용되고 있다. 여러 종류의 retroviral 벡터중에서 Lentiviral 벡터는 non-cycling과 post-mitotic cell에 외부 유전자를 효율적으로 운반하고 있고 특히, 외부유전자가 세포의 development 과정 동안에 silencing 되지 않고 in vivo에서 안정적으로 발현되는 장점을 가지고 있기 때문에 Lentivirus system을 이용하여 일반 세포주가 아닌 primary cell에서 많이 발현되고 있는 유전자의 기능을 그것의 발현을 silencing시키는 small interfering RNA (siRNA) 실험을 수행하였다. 또한 Lentiviral 벡터는 골수세포에서 유래된 조혈줄기세포에 감염하여 유전자 발현을 silencing 하는 것으로 알려져 있어 본 발명에서는 Lenti virus-based 벡터를 자연살해세포에서 Axl 수용체 타이로신 인산화효소 유전자를 silencing 하기 위한 벡터시스템으로 선택하였다 (도 2).

2) siRNA을 위한 oligonuclotide design

Silencing 하기 위한 표적 (target) 유전자인 Axl은 3가지 functional domain으로 구성이 되어 있다.

(1) immunoglobulin domain (GTCTCCCGTACTTCCTGGA)

(2) fibronectin type III domain (CTCACCCACTGCAACCTGC)

(3) tyrosine kinase catalytic domain (AGACCTACACAGTTTCCTC).

본 발명에서는 이들 각각의 functional domain을 선택적으로 silencing 하여 Axl 및 후보유전자의 기능을 억제시키기 위하여 다음과 같이 oligonuclotide를 디자인 하였다.

3) 클로닝

Sense oligonuclotide와 antisense oligonuclotide을 annealing 시킨 후 pSUPER 벡터의 BglII-HindIII site에 클로닝 한 후 이 클론들을 염기서열분석을 통해 확인하여 oligonuclotides를 포함하는 부위를 XhoI 과 XbaI을 이용하여 Lentiviral 벡터에 ligation하여 H1 promotor로부터 RNAi-inducing siRNA를 발현하는 벡터를 고안하였다.

4) Self-inactivating Lentivirus stock 준비

자연살해세포에 감염될 수 있는 Lenti virus를 만들기 위하여 siRNA를 발현하는 Lentiviral 벡터와 helper 벡터인 VSVG, RSV-REV, pMDL g/pRRE을 293T cells에 calcium phosphate transfection 방법으로 co-transfection 하였다. 36-48시간이 지난 후에 세포 상등액을 harvesting 하고 0.45um filter로 cell debris를 제거한 뒤, 25,000 rpm에서 90분간 원심분리 하여 얻은 침전물에 cold 인산염 완충용액 을 첨가하여 4℃에서 밤새 (overnight) 배양 후 virus 농축액을 얻었다.

5) Lentivirus siRNA 발현시스템 확립

본 발명에서는 일반 포유류세포에서 보다 상대적으로 transfection이 어려운 primary 세포들을 이용하기 때문에 이들 세포에서 transduction 효율이 높은 lentivirus 시스템을 이용하였다. Virus 입자를 얻기 위해 virus packaging 세포주인 293T 세포를 10cm² 배양접시에 약 5x105 cell을 가하고 약 24시간 후에 virus packaging plasmid 혼합물과 발현 construct를 각각 1.5㎍씩 Lipofectamine을 이용하여 transfection 한 후 약 4시간 후에 새로운 DMEM 배지로 갈아 준 다음 37℃, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 약 48시간 후에 pseudovirus를 포함하고 있는 배지를 3000rpm에서 5분간 원심분리 하여 cell debris를 제거 한 후 배양 상청액을 Millex-HV 0.45um PVDF 여과기로 여과하여 보관하였다. 이렇게 얻은 배양 상청액에서 virus 생산을 확인하기 위해서, 293T 세포를 1x105 세포씩 6 웰 플레이트에 가한 후 24시간이 지나면 virus 입자를 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DEME 배지와 1:1로 섞어서 293T 세포에 처리하였다. 이때 세포막에 psedoviral capsid가 결합하는 정도를 증가시켜 주기 위해서 polybrene을 8㎍/ml 농도로 첨가시켜 주었다. Virus에 24시간 동안 감염시킨 후 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM 배지로 갈아 준 후 다시 48동안 배양하여 형광 현미경과 유세포형광분석기를 통해 확인하였다.

실시예 1. 조혈줄기세포 및 자연살해세포 분화단계별 세포들의 분리

8마리의 8-12주령 된 생쥐 (C57BL/6)로부터 2×108 개의 전체 골수세포를 얻어서 MACS 수행 후 4×107 Lin- 세포를 얻었다. 이렇게 얻은 세포를 c-kit microbead와 반응시켜 다시 MACS를 수행하여 최종적으로 4×106 Lin-, c-kit+인 조혈줄기세포를 분리하였다. 이들 조혈줄기세포로부터 CD122+한 자연살해세포의 전구세포를 얻어 이들 세포를 IL-15 존재하에 OP9 stromal 세포와 공동배양 (+OP9) 또는 자연살해세포의 전구세포의 단독배양 (-OP9) 후 두 가지의 성숙한 자연살해세포를 분리하여 이들 각 분화단계별 세포의 순도 (purity)를 알아보기 위해, 조혈줄기세포는 c-kit과 lineage 표식자를 이용하였고 자연살해세포의 전구세포와 성숙한 자연살해세포는 CD122와 NK1.1 항체를 이용하여 세포형광 분석기로 분석한 결과, 약 95% 정도의 순도를 갖는 각 분화단계별 세포를 얻었다 (도 3).

기존에 자연살해세포에서 특이적으로 발현된다고 잘 알려진 유전자들의 발현을 이들 세포에서 역전사 중합효소 연쇄반응으로 분석한 결과, 이들 각 분화단계별 세포들은 기존의 연구에서 알려진 CD122와 perforin 유전자 발현양상과 일치하였다 (도 4).

특히 자연살해세포의 전구세포를 IL-15 존재 하에서 stromal 세포와 공동배양하지 않은 세포에 비하여 OP9 stromal 세포와 공동배양하여 분화시킨 성숙한 자연살해세포들은 NK1.1과 Ly49 세포 표면분자들을 발현하고 있어 stromal 세포는 자연살해세포의 최종 분화에 필수적인 역할 및 특이성이 있음을 확인하였다 (도 5).

실시예 2. 자연살해세포 분화단계에 따라 발현되는 특정 유전자의 발굴

실시예 1에서 분리한 조혈줄기세포, 자연살해세포의 전구세포 그리고 두 가지의 성숙한 자연살해세포로부터 각각의 분화단계에 따라 특이적으로 발현되는 유전자를 발굴하고자 SAGE를 수행하였다 (도 6). 그 결과, 자연살해세포의 전구세포에서만 발현되고 다른 분화단계에서는 발현되지 않는 유전자들 중 lysozyme, ferritin heavy chain, Axl, kit ligand, calgranulin B, IL-7 receptor, beta-2 microglobulin, Fc gamma receptor 등의 유전자들이 이들 세포에만 많은 copy수로 그리고 특이적으로 발현되고 있음을 알 수 있었다 (표 1).

표 1. 자연살해세포의 전구세포에서 특이적으로 발현되는 유전자들

자연살해세포의 전구세포에서 이들 유전자발현이 실제로 SAGE 결과와 일치하는지를 역전사 중합효소 연쇄반응으로 알아본 결과, SAGE tag의 수와 유전자의 발현 양상이 일치는 것으로 확인되었다 (도 7).

이들 결과를 토대로 자연살해세포의 전구세포에서 특이적으로 발현되는 여러 유전자들 중에서 Axl 수용체 인산화효소의 구조와 기능이 자연살해세포 세포의 분화 및 활성에 영향을 미칠 가능성이 가장 높을 것으로 판단되어 이에 대한 클로닝 및 기능을 밝히고자 하였다.

실시예 2. Axl 수용체 인산화효소가 자연살해세포의 분화에 미치는 영향

조혈줄기세포로부터 자연살해세포로 분화 과정 중 자연살해세포의 전구세포에 (7일째) 1㎍의 생쥐 Axl 항체를 처리하고 전술한 방법과 동일하게 다시 6일 동안 IL-15 (40ng/ml) 등이 첨가된 조건 하에서 OP9 stromal 세포와 공동배양을 수행하여 성숙한 자연살해세포로 분화시킨 후 분화정도를 NK1.1 항체와 자연살해세포에 특이적인 수용체들에 대한 항체들 (Ly49G2, Ly49A, Ly49C/F/I)로 염색한 후 유세포형광분석기로 분석한 결과, 염소항체 (goat Ig)를 처리한 대조군에 비해 Axl 항체를 처리한 세포들에서 완전히 성숙한 자연살해세포로의 분화전도가 약 2배가량 증가하여 Axl이 자연살해세포의 분화에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다 (도 8).

또 다른 조건하에서 Axl 항체에 의한 성숙한 자연살해세포로의 분화 효과를 확인하기 위하여, 자연살해세포의 전구세포를 OP9 stromal 세포와 공동배양하지 않고 보다 적은 농도의 IL-15 (25ng/ml)와 Axl 항체 (500ng/ml)를 직접 처리함과 동시에 배양 웰 플레이트에 붙여 immobilization 시킨 후 성숙된 자연살해세포로의 분화정도를 측정해 본 결과, OP9 stromal 세포가 없는 상태에서도 Axl 항체를 처리하지 않았을 때에 비하여 처리한 세포들에서 자연살해세포로의 분화유도가 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

실시예 3. Axl 과 Gas6 의 상호작용이 자연살해세포 분화에 미치는 효과

Gas6이 Axl의 리간드로써 생물학적 활성을 나타내기 위해서는 vitamin K에 의존적인 g-carboxylation 과정이 필요하다고 알려져 있다.

이 Gas6와 Axl의 결합에 의한 신호전달이 자연살해세포의 분화에 미치는 영향을 알아보고자 생쥐 재조합 Gas6을 분화과정 중에 처리한 결과, 자연살해세포의 분화에는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타나 (도 10), Gas6이 생물학적 활성을 나타내기 위해서는 g-carboxylation 과정이 필요한 것으로 판단되어 이후의 실험에서는 OP9 stromal 세포에서 발현되는 native Gas6을 이용하였다.

즉, Gas6은 vitamin K에 의존적인 carboxylase가 glutamic acid side chain에 이산화탄소를 붙이기 위하여 환원된 vitamin K와 산소를 이용해서 g-carboxylglutamates와 vitamin K 2, 3-epoxide를 만들게 되고 vitamin K epoxide reductase는 다시 vitamin K를 환원시키게 된다. 이 cycle에서 warfarin은 reductase를 억제하여 결국 vitamin K-dependent한 단백질들의 g-carboxylation을 방해하여 carboxylation 되지 않은 Gas6은 결국 생물학적 활성을 잃게 된다 (도 11).

따라서 Gas6이 자연살해세포의 전구세포에서 발현되는 Axl 수용체의 리간드로 작용하는 것을 억제하기 위해서 warfarin을 사용하여 Axl 수용체를 통한 신호전달에 미치는 영향을 조사하였다. 조혈줄기세포를 자연살해세포의 전구세포로 분화시킨 후 IL-15 (25ng/ml)와 warfarin을 1㎍/ml, 2.5㎍/ml, 5㎍/ml의 농도로 각각 처리하고 7일 동안 OP9 stromal 세포 (2x104)와 공동배양 한 후 자연살해세포의 전구세포가 성숙한 자연살해세포로 분화되는 정도를 유세포형광분석기로 분석하였다. 그 결과, NK1.1 뿐만 아니라 자연살해세포에서 특이적으로 발현되는 NKG2A/C/E, LY49C/F/H/I와 같은 수용체들 또한 농도 의존적으로 감소되는 것으로 나타났다 (도 12). 이 결과로부터 Axl 수용체와 그 리간드인 Gas6의 상호작용은 자연살해세포의 전구세포로부터 성숙한 자연살해세포로 분화하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 생쥐 Gas6 발현벡터 및 retroviral 벡터 제조

앞서 설명한 바와 같이 재조합 Gas6은 생물학적으로 불활성하기 때문에 Axl 수용체를 활성화시키지 못하는 것으로 밝혀져, 활성을 갖고 있는 native Gas6을 얻기 위하여 생쥐 stromal 세포주인 OP9 세포에서 분리한 RNA와 Gas6 프라이머 (sense; 5'-ggcctcgagcatgccgccaccgcccgggc, antisense; ggcgaattccggtctagggggtggcatgc)로 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 Gas6 cDNA를 증폭한 후 pCR4-TOPO (Invitrogen Co.)에 클로닝 하였다 (도 13).

클로닝 된 클론들 중에서 염기서열분석 결과 reference 염기서열 (gene ID; AK086187)과 동일한 클론의 cDNA를 Gas6 발현벡터 제조 및 retroviral 벡터 제조에 사용하였다. Retroviral 벡터 pLXSN을 EcoRI과 CIP 효소를 처리한 후, pCR4-Gas6 #8에 EcoRI 제한효소를 처리하여 분리한 Gas6 cDNA를 첨가하고 T4 DNA ligase로 ligation하여 재조합된 pLXSN-Gas6을 제조하였으며 (도 14, 왼쪽), pcDNA3.1(+)을 EcoRI과 calf intestinal alkaline phosphatase (CIP) 효소를 처리한 후, pCR4-Gas6 #8에 EcoRI 제한효소를 처리하여 분리한 Gas6 cDNA를 첨가하고 T4 DNA ligase 로 ligation하여 재조합된 pcDNA3.1-Gas6을 제조하였다 (도 14, 오른쪽).

제조된 이들 발현벡터에서 Gas6 cDNA의 viral 및 CMV 프로모터에 대한 방향 (orientation)은 제한효소 XhoI을 이용하여 각각 확인하고 프로모터에 정방향과 역방향의 클론을 각각 pLXSN-Gas6/F, pLXSN-Gas6/R 그리고 pcDNA3.1-Gas6/F, pcDNA3.1-Gas6/R이라 명명하였다 (도 15).

실시예 5. Gas6 stable transfectant 제조

Gas6 유전자를 발현하지 않는 Swiss3T3 세포주에 pcDNA3.1(+), pcDNA3.1-Gas6/F, pcDNA3.1-Gas6/R을 각각 transfection하고 G418 항생제 함유배지에서 stable transfectant 들을 각각 선별한 후 limiting dilution으로 Gas6 유전자를 과잉으로 발현하는 클론들을 얻었다. 한편, Gas6 발현 retrovirus 제조를 위해 Gas6 retroviral 벡터 pLXSN-Gas6/F, pLXSN-Gas6/R을 viral packaging 세포주인 PT67에 transfection하고 G418 함유배지에서 선별하여 limiting dilution 수행 후 각각의 클론들에서 생성된 retrovirus의 감염 세포주 Swiss 3T3 세포에서 Gas6 발현 정도를 역전사 중합효소 연쇄반응 (A)과 Western blot (B) 으로 확인하였다 (도 16).

실시예 6. Native Gas6 이 자연살해세포의 분화에 미치는 효과

Gas6 transfectant로부터 분비되는 native Gas6이 자연살해세포의 전구세포에서 발현되는 Axl과 결합하여 성숙한 자연살해세포로 분화하는데 영향을 미치는지 알아보기 위해, 자연살해세포의 전구세포를 정상적인Swiss 3T3 세포 대조군과 vector를 transfection 시킨 mock 대조군, 그리고 Gas6을 과잉발현 하는 transfectant와 각각 공동배양 또는 이들의 배양상청액에 의한 자연살해세포의 분화 능력을 분석 하였다. 그 결과, Gas6 transfectant와 공동배양한 자연살해세포의 전구세포는 대조군들에 비해 성숙한 자연살해세포로 분화가 촉진됨을 알 수 있었다 (약 14%에서 47%로 증가) (도 17). 따라서 조혈 줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화 과정 중에 Axl 수용체 타이로신 인산화효소는 Gas6과 결합에 의한 신호전달을 통해 자연살해세포의 분화에 큰 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.

실시예 7. 생쥐 Axl 발현시스템 구축

Axl이 높게 발현되는 생쥐 RAW264.7 대식세포주로부터 분리한 전체 RNA와 Axl 프라이머 (sense; 5'-ggtgcccatcaacttcggaa, antisense; 5'-ggatgtcccaggtggaagatt)로 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 2,750 bp의 Axl cDNA를 pCR4-TOPO에 클로닝 하였다 (도 18). 또한 retroviral 벡터 pLXSN을 EcoRI과 CIP 효소를 처리한 후 pCR4-Axl #4에 EcoR I 제한효소를 처리하여 분리한 Axl cDNA를 첨가하고 T4 DNA ligase로 ligation하여 재조합된 pLXSN-Axl을 제조하였다. Retroviral vectors에서 Gas6 cDNA의 viral 프로모터에 대한 방향은 클로닝부위의 downstream에 있는 프라이머와 Axl의 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응과 염기서열 분석으로 확인하고 프로모터에 정방향과 역방향의 클론을 각각 pLXSN-Axl/F, pLXSN-Axl/R이라 명명하였다.

실시예 8. 생쥐 Axl - IgG 융합단백질 (fusion protein) 제조

Gas6 발현 retrovirus 제조와 동일한 방법으로 PT67 세포주에 transfection하여 stable transfectant 및 Axl-IgG 융합단백질 발현 세포주를 제조하기 위해, 생쥐 IgG1 Fc (constant fragment) 부위의 5‘에 BamHI과 3’에 Xho I linker를 첨가하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭하고 pCR4-TOPO에 클로닝 (pCR4-Fc) 하였다. 또한 Axl 유전자의 세포 밖 도메인 (extracellular domain, ECD)의 3‘에 BamHI linker를 첨가하여 증폭한 후 pCR4-TOPO에 클로닝 (pCR4-Axl/ECD) 하였다. 그리고 pCR4-Fc에 Xho I과 BamHI을 처리하여 약 820 bp Fc region을 분리하였으며 pCR4-Axl/ECD에 EcoRI과 BamHI을 처리하여 약 1350 bp Axl/ ECD를 pcDNA3.1 EcoRI-XhoI site에 Fc와 Axl/ECD 절편을 클로닝하고 BamHI, BamHI/XhoI 제한효소로 DNA 클론들을 제작하였다 (도 19). 최종적으로 pcDNA3.1/Axl-Fc plasmid를 293T 세포에 transfection하여 G418 함유배지에서 transfectant를 선별하고 limiting dilution으로 Axl-IgG 융합단백질을 과량으로 발현하는 클론을 얻었다.

*실시예 9. Axl 발현 억제에 의한 자연살해세포의 분화

siRNA (Post gene transcriptional gene silencing and RNA interference)는 상보적인 double strand RNA에 의한 특정 유전자의 억제를 이용하여 유전자의 기능을 밝히는데 유용하며, 19bp-21bp의 double stranded RNA를 이용하여 표적 mRNA 염 기서열을 특이적으로 분해시켜 세포에서 유전자의 silencing을 유도 할 수 있는 기술이다.

(1) siRNA construct 제작

Axl 유전자의 표적 염기서열로써 gtctcccgtacttcctgga (#1), ctcacccactg caacctgc (#2), agacctacacagtttcctc (#3) 세 가지를 선정한 후 각각의 염기서열이 sense 프라이머로써 5'site에 aaag overhangs 염기서열을 포함한 프라이머와 그 것에 상보적인 염기서열인 antisense 프라이머에 aaaa overhangs를 5‘ site에 첨부하여 oligomer를 제작하였다. 이들 각각의 oligomer를 95℃에서 annealing 하여 double strand로 준비하고 double 프로모터 pFIV-H1/U6 siRNA-GFP 발현벡터는 BbsI 으로 분해한 후 정제하여 클로닝 하였다 (도 20).

클로닝 수행 후 tranformation 하여 얻은 클론 중에서 siRNA template inserts를 포함하고 있는 클론들을 찾기 위해, U6 중합효소 연쇄반응 프라이머와 anti-sense strand siRNA oligonucleotide를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, siRNA template inserts가 포함되어 있는 클론에서 약 100bp에서 중합효소 연쇄반응 산물 (product)을 확인 할 수 있었다 (도 21).

(2) Lentivirus siRNA 발현시스템 확립

참조예에서 기술한 바와 같이 lentivirus siRNA 발현시스템을 이용하여 293T 세포를 virus에 24시간 동안 감염시킨 후 10% 우태아혈청이 포함되어 있는 DMEM 배 지로 갈아 준 다음 다시 48동안 배양하여 형광 현미경과 유세포형광분석기를 통해 감염 및 발현을 확인해본 결과, GFP가 tagging 되어 있는 Package된 pFIV 발현 construct는 효율적으로 transduction 되었음을 알 수 있었다 (도 22).

(3) 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화과정 중에 lentivirus 감염

생쥐의 골수세포로부터 조혈줄기세포를 분리하여 약 1x106 세포당 virus 입자를 첨가하고 24시간동안 감염시켜 IL-7, FLT3L, SCF를 첨가한 배지로 약 6일간 배양한 후 자연살해세포의 전구세포를 수확하여 유세포형광분석기로 분석을 통해 transduction의 유무를 확인한 결과, lentivirus가 잘 감염되어 GFP 발현이 증가되었고 Axl 억제에 의한 자연살해세포의 분화도 억제되는 것으로 나타났다 (도 23).

본 발명은 조혈줄기세포로부터 자연살해세포로의 분화와 활성을 조절할 수 있는 Axl 수용체 및 그 리간드 Gas6을 클로닝하고 분리정제 하여 암치료 분야에 이용할 수 있다.

Claims (8)

1. 성체줄기세포를 Gas6로 처리하여 성체 NK 세포를 수득함을 특징으로 하는 성체 NK 세포의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 성체줄기세포를 IL-7, SCF 및 Flt3L로 처리하여 NK 전구세포로 분화시킨 후 NK 전구세포를 Gas6로 처리함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포를 Gas6와 함께 IL-15로 처리함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 성체줄기세포가 사람으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 성체줄기세포가 제대혈로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
6. 재조합벡터 pcDNA3.1(+)-GAS6.
7. 재조합벡터 pcDNA3.1(+)-GAS6를 포함한 형질감염체.
8. 제7항에 있어서, 숙주가 마우스 OP9 세포주인 형질감염체.

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