CN117660331A - 用于培养自然杀手细胞的组合物及使用其来生产自然杀手细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于培养自然杀手细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL‑2蛋白与CD80蛋白的融合蛋白，及使用其来生产自然杀手细胞的方法。具体地，本发明的用于培养自然杀手细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL‑2蛋白或其变体与CD80或其片段的融合蛋白，会促进自然杀手细胞的增殖、诱导CD16及NKp46的表达及增加颗粒酶B与穿透细胞膜蛋白质的表达与分泌，因此可用于生产具有优异抗癌免疫功能的自然杀手细胞。
Description
本申请是申请日为2020年11月19日、申请号为202080087831.0、发明名称为“用于培养自然杀手细胞的组合物及使用其来生产自然杀手细胞的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用于培养自然杀手细胞的组合物及使用其来生产自然杀手细胞的方法。
背景技术
发明背景
对于癌症的治疗，已经发展出各种的治疗法，如手术、放疗及化疗，但有许多的副作用报告，近年来已发展出使用患者的免疫功能的免疫疗法。特别是，研究使用可进行大规模生产及冷冻的自然杀手细胞的免疫疗法。
具体地，自然杀手细胞是一种分布在身体的骨髓、脾、周边淋巴结及外周血的淋巴细胞。其等约占外周血淋巴细胞的10％，且在先天性免疫反应中占重要角色(Ann RevImmunol.,24:257-286,2006))。此外，自然杀手细胞是CD56及CD16阳性，但CD3阴性。自然杀手细胞通过释放含有穿透细胞膜蛋白质及颗粒酶的细胞质颗粒来杀伤细胞。自然杀手细胞会分泌各种的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、GM-CSF及IL-10。
此外，自然杀手细胞的细胞表面上会表达数种受体，且此等受体牵涉细胞黏着、杀伤细胞能力的活化或杀伤细胞能力的抑制。然而，正常受试者体内大部分的自然杀手细胞处于非活化状态。因此需有活化的自然杀手细胞来消除癌症。此外，在癌症患者体内存在的自然杀手细胞方面，自然杀手细胞由于癌细胞的免疫回避机制而有功能缺陷。因此，活化自然杀手细胞，以便使用自然杀手细胞作为治疗剂非常重要。再者，因为体内存在的自然杀手细胞数量有限，因此必要开发出可大量增殖及冷冻从正常受试者或患者而来的血液中的自然杀手细胞的技术。
IL-2，亦称作T细胞生长因子(TCGF)，是一种球状糖蛋白，其在淋巴细胞的生成、存活及动态平衡中发挥核心的作用。IL-2具有15.5kDa至16kDa的蛋白大小且由133个氨基酸构成。IL-2通过与具有三个不同次单元的IL-2受体结合，介导各种免疫作用。
此外，CD80亦称作B7-1，是膜连型蛋白B7家族的成员，其通过与配体结合涉及免疫调节，因此传递共刺激反应及共抑制反应。CD80是一种表达在T细胞、B细胞、树状细胞及单核球表面上的透膜蛋白。CD80已知会与CD28、CTLA4(CD152)及PD-L1结合。
因此，自然杀手细胞对于抗癌治疗的重要性众所周知，但能放大自然杀手细胞以便有效地使用其等的具体方法仍不足。
发明内容
据此，研究大量制备活化的自然杀手细胞的结果，本发明人通过使用含有IL-2蛋白与CD80蛋白的融合蛋白二聚体制备自然杀手细胞。此外，本发明人确定因此制得的自然杀手细胞活性增强且表现出优异的抗癌作用，因此完成本发明。
为达到上述目的，根据一个示例性的实施方案，提供一种用于培养自然杀手细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体。
根据另一个示例性的实施方案，提供一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：i)从外周血单核细胞(PBMC)中分离出不会表达CD3的细胞；ii)从以上步骤中分离的不会表达CD3的细胞中，分离出会表达CD56的细胞；及iii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该分离的细胞。
根据又另一个示例性的实施方案，提供一种通过该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞。
根据再一个示例性的实施方案，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该自然杀手细胞作为活性成分。
根据又再另一个示例性的实施方案，提供一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：i)从PBMCs中分离出不会表达CD3的细胞；及ii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该分离的细胞。
根据另一个示例性的实施方案，提供一种通过该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞。
根据又另一个示例性的实施方案，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该自然杀手细胞作为活性成分。
根据再另一个示例性的实施方案，提供一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：i)从PBMCs中分离出会表达CD56的细胞；及iii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该分离的细胞。
根据又再另一个示例性的实施方案，提供一种通过该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞。
根据另一个示例性的实施方案，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该自然杀手细胞作为活性成分。
根据又另一个示例性的实施方案，提供一种用于促进PBMCs中自然杀手细胞的活化的方法，其包含在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下培养PBMCs。
根据又另一个示例性的实施方案，提供一种通过该用于促进PBMCs中自然杀手细胞的活化的方法制得的PBMCs。
根据再另一个示例性的实施方案，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该PBMCs作为活性成分。
本发明的用于培养自然杀手细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白，可促进自然杀手细胞的增殖、诱导CD16及NKp46的表达及增加颗粒酶B及穿透细胞膜蛋白质的表达与分泌，因此可用于生产具有优异抗癌免疫功能的自然杀手细胞。
附图说明
结合下列说明与附图可更详细地了解例示实施例，其中：
图1A是本发明中使用的融合蛋白二聚体的示意图；
图1B显示确定所获得的融合蛋白二聚体(GI-101)的SDS-PAGE影像；
图1C显示根据吸亮度的融合蛋白二聚体(GI-101)的含量；
图1D显示所获得的融合蛋白二聚体(GI-101)的尺寸排除色谱法(SEC)的分析结果；
图2A显示确定所获得的hCD80-Fc融合蛋白二聚体的SDS-PAGE影像；
图2B显示所获得的hCD80-Fc融合蛋白二聚体的尺寸排除色谱法(SEC)的分析结果；
图3A显示确定所获得的Fc-IL2v2融合蛋白二聚体的SDS-PAGE影像；
图3B显示所获得的Fc-IL2v2融合蛋白二聚体的尺寸排除色谱法(SEC)的分析结果；
图3C显示确定所获得的Fc-IL2wt融合蛋白二聚体的SDS-PAGE影像；
图3D显示所获得的Fc-IL2wt融合蛋白二聚体的尺寸排除色谱法(SEC)的分析结果；
图4A显示确定所获得的hCD80-Fc-IL2wt融合蛋白二聚体的SDS-PAGE影像；
图4B显示所获得的hCD80-Fc-IL2wt融合蛋白二聚体的尺寸排除色谱法(SEC)的分析结果；
图5A及5B显示在AIM-V(5％SR)条件下培养时NK细胞的数量；
图6A及6B显示在AIM-V(5％SR)条件下培养时NK细胞的存活力；
图7A及7B显示在AIM-V(5％hABS)条件下培养时NK细胞的数量；
图8A及8B显示在AIM-V(5％hABS)条件下培养时NK细胞的存活力；
图9A及9B显示在X-VIVO(5％hABS)条件下培养时NK细胞的数量；
图10A及10B显示在X-VIVO(5％hABS)条件下培养时NK细胞的存活力；
图11A及11B显示在NK MACS(5％hABS)条件下培养时NK细胞的数量；
图12A及12B显示在NK MACS(5％hABS)条件下培养时NK细胞的存活力；
图13显示FACS分析的结果，其确定培养在含有AIM-V(5％SR)培养基的组合物中的自然杀手细胞的纯度；
图14显示FACS分析的结果，其确定培养在含有AIM-V(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的纯度；
图15显示FACS分析的结果，其确定培养在含有X-VIVO15(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的纯度；
图16显示FACS分析的结果，其确定培在含有NK MACS(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的纯度；
图17显示培养在含有AIM-V(5％SR)培养基的组合物中的自然杀手细胞的活化性标记的分析结果；
图18显示培养在含有AIM-V(5％SR)培养基的组合物中的自然杀手细胞的抑制性标记的分析结果；
图19显示培养在含有AIM-V(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的活化性标记的分析结果；
图20显示培养在含有AIM-V(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的抑制性标记的分析结果；
图21显示培养在含有X-VIVO(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的活化性标记的分析结果；
图22显示培养在含有X-VIVO(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的抑制性标记的分析结果；
图23显示培养在含有NK MACS(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的活化性标记的分析结果；
图24显示培养在含有NK MACS(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的抑制性标记的分析结果；
图25显示培养在含有AIM-V(5％SR)培养基的组合物中的自然杀手细胞的细胞毒性标记的分析结果；
图26显示培养在含有AIM-V(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的细胞毒性标记的分析结果；
图27显示培养在含有X-VIVO15(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的细胞毒性标记的分析结果；
图28显示培养在含有NK MACS(5％hABS)培养基的组合物中的自然杀手细胞的细胞毒性标记的分析结果；
图29显示在AIM-V(5％hABS)培养基中含GI-101(50nM)、GI-101_wt(50nM)、CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2v2(50nM)或CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2wt(50nM)的组合物中培养21天的自然杀手细胞的去颗粒能力的分析结果；
图30显示在AIM-V(5％hABS)培养基中含GI-101(50nM)、GI-101_wt(50nM)、CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2v2(50nM)或CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2wt(50nM)的组合物中培养21天的自然杀手细胞的癌细胞杀伤作用的分析结果；
图31显示在X-VIVO15(5％hABS)培养基中含GI-101(50nM)、GI-101_wt(50nM)、CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2v2(50nM)或CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2wt(50nM)的组合物中培养21天的自然杀手细胞的去颗粒能力的分析结果；
图32显示在X-VIVO15(5％hABS)培养基中含GI-101(50nM)、GI-101_wt(50nM)、CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2v2(50nM)或CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2wt(50nM)的组合物中培养21天的自然杀手细胞的癌细胞杀伤作用的分析结果；
图33显示在NK MACS(5％hABS)培养基中含GI-101(50nM)、GI-101_wt(50nM)、CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2v2(50nM)或CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2wt(50nM)的组合物中培养21天的自然杀手细胞的去颗粒能力的分析结果；及
图34显示在NK MACS(5％hABS)培养基中含GI-101(50nM)、GI-101_wt(50nM)、CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2v2(50nM)或CD80-Fc(50nM)+Fc-IL2wt(50nM)的组合物中培养21天的自然杀手细胞的癌细胞杀伤作用的分析结果。
具体实施方式
用于NK细胞增殖的组合物及培养基
本发明的一个方面提供一种用于培养自然杀手(NK)细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体。此外，提供一种自然杀手细胞培养基，其包含所述融合蛋白二聚体作为活性成分。
该用于培养自然杀手细胞的组合物可进一步包含任一种选自于由培养基、血清、补充剂及其等的组合所构成的群组。
该NK细胞培养基可为于细胞培养基中添加含有IL-2蛋白与CD80蛋白的融合蛋白二聚体的培养基。在此情况下，所述细胞培养基可包括任一种选自于由氨基酸、糖、无机盐及维生素所构成的群组。优选地，所述细胞培养基可包括氨基酸、糖、无机盐及维生素中的全部。作为一个具体实施方案，该NK细胞培养基可包括至少一种以下表1至表4中的组分。
本文中使用的術語“细胞培养基”意指用于培养细胞，具体地NK细胞，更具体地CD3-CD56+细胞的培养基。此包括细胞于试管中的细胞生长及存活所需的组分，或包括帮助细胞生长及存活的组分。具体地，所述组分可为维生素、必需或非必需氨基酸及微量元素。该培养基可为用于培养细胞，优选地真核细胞，更佳地NK细胞的培养基。
根据本发明的细胞培养基可包括氨基酸组分、维生素组分、无机盐组分、其它组分及纯水，其中：
a)该氨基酸组分是选自于由下列所构成的群组中的至少一种氨基酸：甘胺酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-离氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、三碘甲状腺素、甲状腺素和二氧苯丙氨酸或其等的组合，优选地选自于由下列所构成的群组中的至少一种氨基酸：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-离氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸及L-缬氨酸或其等的组合；
b)该维生素是选自于由下列所构成的群组中的至少一种维生素：生物素、D-泛酸钙、叶酸、烟碱酰胺、盐酸吡多辛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、氯化胆碱、i-肌醇及抗坏血酸或其等的组合，优选地选自于由下列所构成的群组中的至少一种维生素：i-肌醇、盐酸硫胺素、烟碱酰胺及盐酸吡多辛或其等的组合；
c)该无机盐组分是选自于由下列所构成的群组中的至少一种无机盐：氯化钙(CaCl2)(无水)、硫酸铜五水合物(CuSO4-5H2O)、硫酸铁(III)七水合物(FeSO4-7H2O)、氯化镁(无水)、硫酸镁(MgSO4)(无水)、氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4-H2O)、硫酸锌七水合物(ZnSO4-7H2O)、硝酸铁(III)九水合物(Fe(NO3)3·9H2O)及碳酸氢钠(NaHCO3)或其等的组合，优选地选自于由下列所构成的群组中的至少一种无机盐：氯化钠(NaCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)(无水)及磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4-H2O)或其等的组合；
d)该其它组分是选自于由下列所构成的群组中的至少一种其它组分：D-葡萄糖(右旋糖)、丙酮酸钠、次黄嘌呤Na、胸苷、亚麻油酸、类脂酸、腺苷酸、胞苷、鸟苷、尿苷、2'-脱氧腺苷、2'-脱氧胞苷HCl及2'-脱氧鸟苷或其等的组合，优选地可为丙酮酸钠；及
e)纯水是用于溶解该氨基酸、维生素、无机盐及其它组分，且可通过一或多个蒸馏过程获得，或透过滤器纯化。
此外，根据本发明的细胞培养基可进一步包含生长因子或细胞因子。该生长因子可为IGF、bFGF、TGF、HGF、EGF、VEGF、PDGF等等单独或其中至少二种，但不限于此。该细胞因子可为IL-1、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-10、IL-15、IL-17、IL-21等等單独或其中至少二种，但不限于此。
此外，根据本发明的细胞培养基可进一步包含用于活化自然杀手细胞的抗体。该用于活化自然杀手细胞的抗体可为抗CD3抗體、抗CD2抗體、抗CD335抗體等等單独或其中至少二种，但不限于此。此外，可包括与该用于活化自然杀手细胞的抗体结合的珠。此外，可使用含有二或多种用于活化自然杀手细胞的抗体或其可变区片段的融合蛋白。
特别是，所述NK培养基可进一步包括选自于由下列所构成的群组中的任一个：IL-15、IL-21及其等的组合。
该IL-15及IL-21可为一种介白素(IL)，意指由免疫活性细胞如淋巴细胞或单核球及巨噬细胞生成的蛋白质生物活性物质。当使用单核细胞作为来源细胞培养自然杀手细胞时，可使用IL-15及IL-21促進自然杀手细胞的增殖，但当仅单独或组合使用其等之时，有低增殖率及纯度的问题(Biossel L.et al.,Biology of Blood and MarrowTransplantation,14,1031-1038,2008)。
具体地，所述培养基可为用于培养动物细胞的惯用培养基，如DMEM(Dulbecco氏改良Eagle氏培养基)、EDM(內皮分化培养基)、MEM(最小限度必需培养基)、BME(基本培养基)、RPMI 1640、F-10、F-12、a-MEM(a-最小限度必需培养基)、G-MEM(Glasgow氏最小限度必需培养基)、Iscove氏改良Dulbecco氏培养基、AIM-V培养基、X-VIVOTM15培养基、NK MACS培养基。在本发明的实施方案中，使用AIM-V培养基、X-VIVOTM15培养基及NK MACS作为培养基。
本发明中使用的術語“血清”意指在血液完全凝集後从血液中分离出的清澈上清液。此外，用于培养动物细胞的合成培养基中需要添加血清，通常是使用牛、马或人的血清。在牛源血清方面，可使用胎牛血清(FBS)、新生牛血清、小牛血清、牛血清等等，取决于采血时机。在人源血清方面，可使用AB血型供血者的人血清，人AB血清沒有对A与B血型抗原的抗体，所以可最小化免疫反应。此外，可使用CTS Immune Cell SR等等作为“血清”的替代物。在本发明的实施方案中，使用人AB血清或CTS Immune Cell SR。
可使用GLUTAMAXL-谷氨酸替代品作为补充剂，用以改善细胞培养期间的安全性及细胞活性。此外，所述补充剂可为NK MACS补充剂(Miltenyi Biotec,130-113-102)。
含有IL-2蛋白与CD80蛋白的融合蛋白二聚体
本文中使用的术语"IL-2"或"白介素-2"，除非有另外说明，否则意指从任何脊椎动物来源，包括哺乳动物，例如灵长类动物(如人)及啮齿动物(如小鼠及大鼠)获得的任何野生型IL-2。IL-2可从动物细胞获得，还包括从能够生成IL-2的重组细胞获得的IL-2。此外，IL-2可为野生型IL-2或其变体。
在本说明书中，IL-2或其变体可集体以术语"IL-2蛋白"或"IL-2多肽"表示。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽及IL-2变体会特异性地结合至例如IL-2受体。此特异性结合可用熟悉本领域普通技术人员已知的方法鉴定。
IL-2之一实施方案可具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在此，IL-2亦可为成熟形式。具体地，成熟IL-2可不含信号序列，且可具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在此，IL-2可在包含野生型IL-2的片段的概念下使用，其中野生型IL-2的N端或C端部分被截短。
此外，IL-2的片段可为从具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白的N端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的氨基酸的形式。此外，所述IL-2的片段可为从具有SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的氨基酸序列的蛋白的C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的氨基酸的形式。
本文中所使用的术语“IL-2变体”意指全长IL-2或上述IL-2的片段中一部分的氨基酸被取代的形式。即，IL-2变体可具有与野生型IL-2或其片段不同的氨基酸序列。然而，IL-2变体可具有与野生型IL-2相当或相似的活性。在此，"IL-2活性"可意指例如与IL-2受体特异性结合，所述特异性结合可用熟悉本领域普通技术人员已知的方法测量。
具体地，IL-2变体可通过取代野生型IL-2中一部分的氨基酸而获得。通过氨基酸取代而获得的IL-2变体的实施方案，可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的至少一个而获得。
具体地，所述IL-2变体可通过以另一氨基酸取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的至少一个而获得。此外，当IL-2为SEQID NO:35的氨基酸序列中N端的一部分被截短的形式时，可以另一氨基酸取代与SEQ IDNO:10的氨基酸序列中互补对应位置处的氨基酸。例如，当IL-2具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列时，其IL-2变体可通过以另一氨基酸取代SEQ ID NO:35氨基酸序列中第58个、第62个、第65个、第81个或第92个氨基酸中的至少一个而获得。此等氨基酸残基分别对应在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中的第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸残基。根据一个实施方案，可取代一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸，只要此IL-2变体能保持IL-2活性。根据另一个实施方案，可取代一至五个氨基酸。
在一个实施方案中，IL-2变体可为二个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第42个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第45个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个及第45个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第61个及第72个氨基酸而获得。
再者，IL-2变体可为三个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个及第45个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第61个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个、第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个、第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第45个、第61个及第72个氨基酸而获得。
此外，IL-2变体可为四个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个及第61个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第45个、第61个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第61个及第72个氨基酸而获得。此外，在一实施方案中，所述IL-2变体可通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸而获得。
再者，IL-2变体可为五个氨基酸被取代的形式。具体地，所述IL-2变体可通过以另一氨基酸取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中第38个、第42个、第45个、第61个及第72个氨基酸中的每一个而获得。
在此，通过取代而导入的"另一氨基酸"可为任一个选自于由下列所构成的群组：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸。然而，在所述IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第38个氨基酸不能以精氨酸取代、第42个氨基酸不能以苯丙氨酸取代、第45个氨基酸不能以酪氨酸取代、第61个氨基酸不能以谷氨酸取代及第72个氨基酸不能以亮氨酸取代。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第38个氨基酸，精氨酸，可以非精氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第38个氨基酸，精氨酸，可以丙氨酸取代(R38A)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第42个氨基酸，苯丙氨酸，可以非苯丙氨酸的氨基酸取代。优选地，在
IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第42个氨基酸，苯丙氨酸，可以丙氨酸取代(F42A)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第45个氨基酸，酪氨酸，可以非酪氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第45个氨基酸，酪氨酸，可以丙氨酸取代(Y45A)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第61个氨基酸，谷氨酸，可以非谷氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第61个氨基酸，谷氨酸，可以精氨酸取代(E61R)。
在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ ID NO:10的氨基酸序列中，第72个氨基酸，亮氨酸，可以非亮氨酸的氨基酸取代。优选地，在IL-2变体的氨基酸取代方面，在SEQ IDNO:10的氨基酸序列中，第72个氨基酸，亮氨酸，可以甘氨酸取代(L72G)。
具体地，IL-2变体可通过至少一个选自于由下列所构成的群组的取代而获得：SEQID NO:10的氨基酸序列中之R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。
具体地，IL-2变体可通过在选自于由R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G所构成的群组的位置中的二个、三个、四个或五个位置处的氨基酸取代而获得。
此外，IL-2变体可为二个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过R38A及F42A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A及Y45A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A及Y45A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过E61R及L72G的取代而获得。
此外，IL-2变体可为三个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过R38A、F42A及Y45A的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、Y45A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、Y45A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、Y45A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、Y45A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、E61R及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过Y45A、E61R及L72G的取代而获得。
此外，IL-2变体可为四个氨基酸被取代的形式。具体地，IL-2变体可通过R38A、F42A、Y45A及E61R的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A、Y45A及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、F42A、E61R及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过R38A、Y45A、E61R及L72G的取代而获得。此外，在一实施方案中，IL-2变体可通过F42A、Y45A、E61R及L72G的取代而获得。
此外，IL-2变体可通过R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G的取代而获得。
优选地，所述IL-2变体的实施方案可包含任一个选自于下列SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的取代组合(a)至(d)：
(a)R38A/F42A
(b)R38A/F42A/Y45A
(c)R38A/F42A/E61R
(d)R38A/F42A/L72G
在此，当IL-2具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列时，氨基酸取代可出现在与SEQ IDNO:10的氨基酸序列中互补对应位置处。此外，即使IL-2是SEQ ID NO:35的氨基酸序列的片段，氨基酸取代亦可出现在与SEQ ID NO:10的氨基酸序列中互补对应位置处。
具体地，IL-2变体可具有SEQ ID NO:6、22、23或24的氨基酸序列。
此外，IL-2变体可具有低活体内毒性的特征。在此，所述低活体内毒性可能为IL-2与IL-2受体α链(IL-2Rα)结合引起的副作用。已开发出各种可减少因IL-2与IL-2受体α结合所引起的副作用的IL-2变体，且此IL-2变体可为美国专利案第5,229,109号及韩国专利案第1667096号中所揭示的。特别是，本申请案中所述的IL-2变体对IL-2受体α链(IL-2Rα)具有低结合能力，因此具有比野生型IL-2低的活体内毒性。
本文中所使用的术语"CD80"亦称作"B7-1"，是一种存在树状细胞、活化B细胞及单核球中的膜蛋白。CD80提供T细胞的活化及存活必需的共刺激讯息。CD80已知为存在T细胞表面上二种不同的蛋白(即CD28及CTLA-4)的配体。CD80可由288个氨基酸构成，具体地可具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列。此外，本文中所使用的术语"CD80蛋白"意指CD80全长或CD80片段。
本文中所使用的术语"CD80片段"意指CD80的截短形式。此外，所述CD80片段可为CD80的胞外结构域。CD80片段的实施方案可通过删除CD80的N端第1个至第34个氨基酸(其是信号序列)而获得。具体地，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第288个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第242个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第232个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第35个至第139个氨基酸构成的蛋白。此外，CD80片段的实施方案可为由SEQ ID NO:11中第142个至第242个氨基酸构成的蛋白。在一实施方案中，CD80片段可具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
此外，所述IL-2蛋白与该CD80蛋白可透过接头或载体(carrier)彼此连接。具体地，所述IL-2或其变体与该CD80(B7-1)或其片段可透过接头或载体彼此连接。在本说明中，所述接头及该载体可交换使用。
该接头可连接二个蛋白。该接头的实施方案可包括1至50个氨基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白的Fc结构域等等。在此，免疫球蛋白的Fc结构域意指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)及重链恒定区3(CH3)，而不含免疫球蛋白的重及轻链可变区及轻链恒定区1(CH1)的蛋白。该免疫球蛋白可为IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，优选地可为IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4的Fc结构域可具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域可为Fc结构域变体及野生型Fc结构域。此外，在本文中使用的术语"Fc结构域变体"可意指在糖基化模式方面与野生型Fc结构域不同的形式，与野生型Fc结构域相比具高糖基化，或与野生型Fc结构域相比具低糖基化，或去糖基化的形式。此外，无糖基化Fc结构域包含于其中。通过宿主的培养条件或基因操作，可使该Fc结构域或其变体适应而具有调整数量的唾液酸、岩藻糖基化或糖基化。
此外，免疫球蛋白的Fc结构域的糖基化可通过常规的方法修饰，如化学方法、酵素方法及使用微生物的遗传工程方法。此外，所述Fc结构域变体可为免疫球蛋白、IgG、IgA、IgE、IgD及IgM各别的Fc区的混合形式。此外，所述Fc结构域变体可为该Fc结构域中的一些氨基酸经其它氨基酸取代的形式。该Fc结构域变体的实施方案可具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
该融合蛋白可具有使用Fc结构域作为接头(或载体)的结构，其中CD80蛋白与IL-2蛋白，或IL-2蛋白与CD80蛋白，分别连接至该接头或载体的N端及C端(图1A)。该Fc结构域的N端或C端与CD80或IL-2间的连接，可任择地通过一连接肽达成。
具体地，融合蛋白可由下列结构式(I)或(II)构成：
N'-X-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-Y-C'(I)
N'-Y-[接头(1)]n-Fc结构域-[接头(2)]m-X-C'(II)
在此，在结构式(I)及(II)中，
N'是该融合蛋白的N端，
C'是该融合蛋白的C端，
X是CD80蛋白，
Y是IL-2蛋白，
该接头(1)及(2)是肽接头，及
n及m各独立地为0或1。
优选地，所述融合蛋白可由结构式(I)构成。所述IL-2蛋白如上所述。此外，所述CD80蛋白如上所述。根据一个实施方案，所述IL-2蛋白可为与野生型IL-2相比具有一至五个氨基酸取代的IL-2变体。该CD80蛋白可为从野生型CD80的N端或C端截短高达约34个连续的氨基酸残基所获得的片段。或者，所述CD80蛋白可为具有与T细胞表面受体CTLA-4及CD28结合的活性的胞外免疫球蛋白样结构域。
具体地，所述融合蛋白可具有SEQ ID NO:9、26、28或30的氨基酸序列。根据另一个实施方案，所述融合蛋白包括与SEQ ID NO:9、26、28或30的氨基酸序列具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在此，所述同一性是例如同源百分比，且可透过同源性比对软件如NationalCenter of Biotechnology Information(NCBI)的BlastN软件测定。
该肽接头(1)可包含在该CD80蛋白与该Fc结构域之间。该肽接头(1)可由5至80个连续的氨基酸、20至60个连续的氨基酸、25至50个连续的氨基酸或30至40个连续的氨基酸构成。在一实施方案中，所述肽接头(1)可由30个氨基酸构成。此外，所述肽接头(1)可包含至少一个半胱氨酸。具体地，所述肽接头(1)可含有一个、二个或三个半胱氨酸。此外，所述肽接头(1)可源自免疫球蛋白的铰链。在一实施方案中，所述肽接头(1)可为由
SEQ ID NO:3的氨基酸序列构成的肽接头。
该肽接头(2)可由1至50个连续的氨基酸、3至30个连续的氨基酸或5至15个连续的氨基酸构成。在一实施方案中，所述肽接头(2)可为(G4S)n(其中n是1至10的整数)。在此，于(G4S)n中，n可为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一实施方案中，所述肽接头(2)可为由SEQ IDNO:5的氨基酸序列构成的肽接头。
在本发明的另一方面中，提供一种通过结合二个融合蛋白而获得的二聚体，其各含有IL-2蛋白与CD80蛋白。含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白如上所述。
在此，构成该二聚体的融合蛋白间的结合，可通过，但不限于，存在该接头中的半胱氨酸形成的双硫键达成。构成该二聚体的融合蛋白可为彼此相同或不同的融合蛋白。优选地，所述二聚体可为同型二聚体。构成该二聚体的融合蛋白的实施方案可为具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的蛋白。
NK细胞培养方法1
本发明的另一方面提供一种用于培养自然杀手细胞的方法：i)从外周血单核细胞(PBMC)中分离出不会表达CD3的细胞；ii)从以上步骤中分离的不会表达CD3的细胞中，分离出会表达CD56的细胞；及iii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该分离的细胞。
本发明中使用的术语“PBMC”意指外周血单核细胞。PBMC由淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀手细胞)及单核球构成，可利用Ficoll及离心从全血中分离出来。PBMC可从个体获得的全血中分离出来。
所述融合蛋白二聚体如对用于培养自然杀手细胞的组合物的详细说明。所述融合蛋白二聚体可以1nM至500nM的浓度处理。具体地，所述融合蛋白二聚体可以1nM至500nM、5nM至300nM或10nM至150nM的浓度处理。在本发明的实施方案中，所述融合蛋白二聚体以1.6nM或50nM的浓度处理。
用于培养该分离的细胞的方法可使用此技術領域中廣为人知的方法進行。具体地，培养该分离的细胞的步骤中的培养溫度可为27℃至40℃或30℃至37℃。在本发明的实施例中，培养在37℃之温度下進行。此外，在培养该分离的细胞的步骤中，培养期间的CO2浓度可为1％至10％，优选地，其可在5％
CO2条件下培养。
在培养该分离的细胞的步骤中，培养期可为5天至25天、6天至23天或7天至21天。在本发明的实施方案中，培养期为20天，从第5天开始出现显着的增殖差异。
所获得的NK细胞及其用途
本发明之另一方面提供由该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞。
该自然杀手细胞可具有增加表达的CD16及NKp46。该自然杀手细胞可具有增加表达的颗粒酶B及穿透细胞膜蛋白质。根据该用于培养自然杀手细胞的方法培养的自然杀手细胞可冷冻，且即使再次解冻亦不会损害功能。
由于活化受体如CD16及NKp46的高度表达，所述自然杀手细胞对癌细胞株表现出增强的杀伤能力及增加的颗粒酶B与穿透细胞膜蛋白质分泌，因此预期会有优异的抗癌作用。因此，可使用大量临床上适用的活化的自然杀手细胞，制备能有效治疗癌症的治疗剂。此外，所述自然杀手细胞可具有高度表达的NKp30或DNAM1。
本发明之另一方面提供一种用于預防或治疗癌症的药物组合物，其包含该自然杀手细胞作为活性成分。
此外，以所述药物组合物的总重量为基础，由该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞的数量可占10至95重量％。再者，除了该活性成分外，所述药物组合物可进一步包含至少一种表现出相同或相似功能的活性成分。
所述药物组合物的剂量可根据各种因素调整，包括疾病类型、疾病严重度、该组合物中所含的活性成分及其它成分的种类及含量、配方的种类及患者的年龄、体重、整体健康状况、性别及飲食、投药时间、投药途径及组合物的分泌率、治疗期间及同时使用的药物。
然而，在取得理想的效果方面，以活性成分自然杀手细胞为基础，所述药物组合物的剂量可为1Х102细胞/kg至1.0Х1013细胞/kg以及1Х107细胞/kg至1.5Х1011细胞/kg。在此情况下，所述剂量可一天给药一次，或可分成数次给药。
此外，所述药物组合物可通过此技术领域中已知的各种方法给药。给药途径可由熟悉本领域普通技术人员，考虑给药方法、体液体积、黏度等等适当地选择。
该癌症可选自于由下列所构成的群组中的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
使用所获得的NK细胞的治疗方法
本发明的另一方面提供一种用于治疗癌症的方法，其包括对患有癌症的个体给药该NK细胞。在此情况下，所述NK细胞及癌症如上所述。本发明的又另一方面提供该NK细胞用于治疗癌症的用途。
NK细胞培养方法2
本发明的另一方面提供一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：i)从PBMCs中分离出不会表达CD3的细胞；及ii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该分离的细胞。
本发明的另一方面提供由该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞。本发明的又另一方面提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该自然杀手细胞作为活性成分。本发明的又另一方面提供一种用于治疗癌症的方法，其包含对患有癌症的个体给药该NK细胞。在此情况下，所述NK细胞及癌症如上所述。本发明的又再另一方面提供该NK细胞用于治疗癌症的用途。
由于活化受体如CD16及NKp46的高度表达，所述自然杀手细胞对癌细胞株表现出增强的杀伤能力及增加的颗粒酶B与穿透细胞膜蛋白质分泌，因此预期会有优异的抗癌作用。因此，可使用大量临床上适用的活化的自然杀手细胞制备能有效治疗癌症的治疗剂。此外，所述自然杀手细胞可具有高度表达的NKp30或DNAM1。
该癌症可选自于由下列所构成的群组中的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
NK细胞培养方法3
本发明的另一方面提供一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：i)从PBMCs中分离出会表达CD56的细胞；及ii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该分离的细胞。
本发明的又另一方面提供一种由该用于培养自然杀手细胞的方法制得的自然杀手细胞。由于活化受体如CD16及NKp46的高度表达，所述自然杀手细胞对癌细胞株表现出增强的杀伤能力及增加的颗粒酶B与穿透细胞膜蛋白质分泌，因此预期会有優異的抗癌作用。因此，可使用大量临床上适用的活化的自然杀手细胞制备能有效治疗癌症的治疗剂。此外，所述自然杀手细胞可具有高度表达的NKp30或DNAM1。
本发明的又另一方面提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该自然杀手细胞作为活性成分。本发明的又另一方面提供一种用于治疗癌症的方法，其包含对患有癌症的个体给药该NK细胞。在此情况下，所述NK细胞及癌症如上所述。本发明的又再另一方面提供该NK细胞用于治疗癌症的用途。
该癌症可选自于由下列所构成的群组中的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
NK细胞培养方法4
本发明的另一方面提供一种用于增进PBMCs中自然杀手细胞的活性的方法，其包含在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养PBMCs。
本发明的又另一方面提供由该用于增进PBMCs中自然杀手细胞的活性的方法制得的PBMCs。该PBMC中的自然杀手细胞具有高度表达的活化受体如CD16及NKp46，从而增加抗癌细胞株的细胞杀伤能力及颗粒酶B与穿透细胞膜蛋白质的分泌，因此预期会有优异的抗癌作用。因此，可使用含有大量临床上适用的活化的自然杀手细胞的PBMCs制备能有效治疗癌症的治疗剂。此外，所述PBMCs中的自然杀手细胞可具有高度表达的NKp30或DNAM1。
本发明的又另一方面提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含该PBMCs作为活性成分。本发明的又再另一方面提供一种用于治疗癌症的方法，其包含对患有癌症的个体给药该NK细胞。在此情况下，NK细胞及癌症如上所述。本发明的又再另一方面提供该NK细胞用于治疗癌症的用途。
该癌症可选自于由下列所构成的群组中的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
在下文中，将通过下列实施例更详细的说明本发明。然而，下列实施例仅供例示说明本发明，而本发明的范畴不受其限制。
I.GI-101、自然杀手细胞及自然杀手细胞培养组合物的制备
制备实施例1，hCD80-Fc-IL-2变体(2M)：GI101的制备
为了生成含有人CD80片段、Fc结构域与IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成一个包含核苷酸序列(SEQID NO:8)的多核苷酸，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、接头结合的Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及具有二个氨基酸取代(R38A，F42A)的IL-2变体(2M)(SEQ ID NO:6)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:9的融合蛋白。导入该载体后，在37℃、125RPM及8％CO2的环境中培养该细胞7天，然后收集以纯化融合蛋白。将纯化的融合蛋白二聚体命名为"GI101"。
使用含MabSelect SuRe蛋白A树脂的色谱法进行纯化。该融合蛋白在25mM Tris、25mM NaCl及pH 7.4的条件下会结合于其上。然后，用100mM NaCl及100mM乙酸于pH 3下进行洗提。在将20％1M Tris-HCl，pH 9置于收集管中后，收集该融合蛋白。将收集的融合蛋白于PBS缓冲液中透析16个小时进行交换。
然后，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)的尺寸排除色谱法，测量在280nm波长下随着时间变化的吸亮度，获得高浓度的融合蛋白。此时，对分离纯化的融合蛋白进行在还原(R)或非还原(NR)条件下的SDS-PAGE处理，且用考马斯蓝(CoomassieBlue)染色，确定其纯度(图1B)。用NanoDrop检测，确定包含2.78mg/ml浓度的融合蛋白(图1C)。此外，使用尺寸排除色谱法分析的结果示于图1D中。
制备实施例2，Fc-IL-2变体(2M)二聚体：Fc-IL-2v2的制备
为了生成含有Fc结构域与IL-2变体的融合蛋白，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成一个包含核苷酸序列(SEQ ID NO:45)的多核苷酸，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、Ig铰链(SEQ ID NO:38)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及具有二个氨基酸取代(R38A，F42A)的IL-2变体(2M)(SEQ ID NO:6)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)中，用以表达SEQ ID NO:44的融合蛋白。导入该载体后，在37℃、125RPM及8％CO2的环境中培养该细胞7天，然后收集以纯化融合蛋白二聚体。将纯化的融合蛋白二聚体命名为“Fc-IL2v2”。
使用与制备实施例1中相同的方法进行该融合蛋白的纯化及收集。对分离纯化的融合蛋白进行在还原(R)或非还原(NR)条件下的SDS-PAGE处理，且用考马斯蓝染色，确定其纯度(图3A)。结果确定该融合蛋白形成二聚体。此外，使用尺寸排除色谱法分析的结果示于图3B中。
制备实施例3，Fc-IL-2二聚体：Fc-IL-2wt的制备
为了生成含有Fc结构域与野生型IL-2的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成一个包含核苷酸序列(SEQID NO:43)的多核苷酸，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、Ig铰链(SEQ ID NO:38)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及野生型IL-2(SEQ ID NO:10)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:42的融合蛋白。导入该载体后，在37℃、125RPM及8％CO2的环境中培养该细胞7天，然后收集以纯化融合蛋白二聚体。将纯化的融合蛋白二聚体命名为“Fc-IL2wt”。
使用与制备实施例1中相同的方法进行该融合蛋白的纯化及收集。对分离纯化的融合蛋白进行在还原(R)或非还原(NR)条件下的SDS-PAGE处理，且用考马斯蓝染色，确定其纯度(图3C)。结果确定该融合蛋白形成二聚体。此外，使用尺寸排除色谱法分析的结果示于圖3D中。
制备实施例4，hCD80-Fc-IL-2野生型二聚体：hCD80-Fc-IL-2wt的制备
为了生成含有人CD80片段、Fc结构域与IL-2野生型蛋白的融合蛋白，通过ThermoFisher Scientific的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成一个包含核苷酸序列(SEQ ID NO:41)的多核苷酸，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、接头结合的Ig铰链(SEQ ID NO:3)、Fc结构域(SEQ ID NO:4)、接头(SEQ ID NO:5)及IL-2野生型(SEQ ID NO:10)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体中。此外，将该载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:46的融合蛋白。导入该载体后，在37℃、125RPM及8％CO2浓度的环境中培养该细胞7天，然后收集以纯化融合蛋白二聚体。将纯化的融合蛋白二聚体命名为“hCD80-Fc-IL2wt”。
使用含MabSelect SuRe蛋白A树脂的色谱法进行纯化。该融合蛋白在25mM Tris、25mM NaCl及pH 7.4的条件下会结合于其上。然后，用100mM NaCl及100mM乙酸于pH 3下进行洗提。在将20％1M Tris-HCl，pH 9置于收集管中后，收集该融合蛋白。将收集的融合蛋白于PBS缓冲液中透析16个小时进行交换。
然后，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)的尺寸排除色谱法，测量在280nm波长下随着时间变化的吸亮度，获得高浓度的融合蛋白。此时，对分离纯化的融合蛋白进行在还原(R)或非还原(NR)条件下的SDS-PAGE处理，且用考马斯蓝染色，确定其纯度(图4A)。结果确定该融合蛋白形成二聚体。此外，使用尺寸排除色谱法分析的结果示于图4B中。
制备实施例5，hCD80-Fc二聚体：hCD80-Fc的制备
为了生成含有人CD80片段与Fc结构域的融合蛋白，通过ThermoFisherScientific的Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服务合成一个包含核苷酸序列的多核苷酸(SEQ ID NO:39)，其从N端依序编码含有信号肽(SEQ ID NO:1)、CD80片段(SEQ ID NO:2)、接头结合的Ig铰链(SEQ ID NO:3)及Fc结构域(SEQ ID NO:4)的融合蛋白，并克隆进入pcDNA3_4载体。此外，将该载体导入CHO细胞(Expi-CHOTM)中，用以表达具有SEQ ID NO:40的融合蛋白。导入该载体后，在37℃、125RPM及8％CO2的环境中培养该细胞7天，然后收集以纯化融合蛋白二聚体。将纯化的融合蛋白二聚体命名为"hCD80-Fc”。
使用含MabSelect SuRe蛋白A树脂的色谱法进行纯化。该融合蛋白在25mM Tris、25mM NaCl及pH 7.4的条件下会结合于其上。然后，用100mM NaCl及100mM乙酸在pH 3下进行洗提。在将20％1M Tris-HCl，pH 9置于收集管中后，收集该融合蛋白。将收集的融合蛋白于PBS缓冲液中透析16个小时进行交换。
然后，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)的尺寸排除色谱法，测量在280nm波长下随着时间变化的吸亮度，获得高浓度的融合蛋白。此时，对分离纯化的融合蛋白进行在还原(R)或非还原(NR)条件下的SDS-PAGE处理，且用考马斯蓝染色，确定其纯度(图2A)。结果确定该融合蛋白形成二聚体。此外，使用尺寸排除色谱法分析的结果示于图2B中。
制备实施例1，自然杀手细胞培养基的制备
在具有以下表1至表4的组成的各基本培养基中，分别添加对应于表5的添加条件1至4的物质，制备自然杀手细胞培养基组合物。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
/>
[表5]
实施例1，源自外周血液单核细胞(PBMC)的CD3(-)CD 56(+)
自然杀手细胞的制备
为了获得CD3(-)细胞，使用ADAM-MC2自动细胞计数器(NanoEnTek,purchasedfrom Cosmo Genetech Co.,Ltd.)计算PBMCs(外周血单核细胞，Zen-Bio.Inc,NC 27709,USA,Cat#:SER-PBMC-200-F)的数量。将PBMCs转移至新管中，然后在300×g、温度4℃下离心5分钟。将0.5％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)及EDTA以2mM的浓度包含于PBS中，制备MACS缓冲液(pH 7.2)。离心完成后，以每1×107细胞80μl的MACs缓冲液及20μl的CD3磁珠(Miltenyibiotech,130-050-101)处理细胞沈淀物至悬浮，然后在温度4℃下培育15分钟。加入10mlMACs进行清洗，且在300×g、温度4℃下离心10分钟，然后将细胞沈淀物再悬浮于0.5mlMACs缓冲液中。
先让2ml MACs缓冲液流进LD管柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,Cat#:130-042-901)中，然后接着细胞悬浮液。如此获得通过LD管柱的CD3(-)细胞。这时使2ml MACs缓冲液流过三次，获得CD3(-)细胞，如此能够充分地分开残留在LD管柱中的细胞。使用细胞计数器计数所获得的CD3(-)细胞，然后将其置于新管中，在300×g、温度4℃下离心5分钟。然后去除上清液，然后每1×107细胞添加80μl的MACs缓冲液及20μl的CD56磁珠(Miltenyi biotech,Cat#:130-050-401)，接着在温度4℃下培育15分钟。加入10ml MACs缓冲液进行清洗，且在300×g、温度4℃下离心10分钟，然后将细胞沈淀物重新悬浮于0.5ml MACs缓冲液中。
先让3ml MACs缓冲液流进LS管柱(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,Cat#:130-042-901)中，接着细胞悬浮液。这时使2ml MACs缓冲液流过三次，如此能够充分地分开残留在LD管柱中的细胞。将LS管柱与磁力架分开后，加入5mL MACs缓冲液，用活塞加压以获得CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞。将获得的CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞置于新的管中并在300×g、温度4℃下离心5分钟。移除上清液后，考虑培养条件将细胞悬浮于表1至表4中所示的基本培养基中。使用细胞计数器计数悬浮细胞的数量。
实施例2，源自外周血单核细胞(PBMC)的CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞的培养
将包含在NK细胞活化/扩张试剂盒(Cat#:130-112-968)(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)中的100μl的CD335(NKp46)-生物素及100μl的CD2-生物素置于1.5mL微管中并混合，然后加入500μl抗生物素MACSiBead粒子并混合。然后，加入300μlMACs缓冲液，及使用微管旋转器在2℃至8℃下混合2小时。考虑细胞数目，将每1x106细胞5μl的NK活化珠转移至新管中。加入1mL PBS并在300×g下离心5分钟。移除上清液后，按照每106NK细胞5μl添加待使用的NK MACs培养基(Cat#:130-094-483)(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)，使珠松开，接着接种至在实施例1中分离的CD(3)-CD56(+)自然杀手细胞中。
接着，将制得的CD3(-)CD56(+)自然杀手细胞悬浮在制备实施例1中所制得的含添加剂的培养基组合物中，使细胞总数为2.5x105，并将其种在48孔盘中，接着于37℃、5％CO2的条件下培养。然后，每2天测定细胞数，当细胞汇合占培养容器的80％以上(汇合度)时，依照48孔盘、24孔盘、12孔盘、6孔盘及25T培养瓶的顺序继代培养，最后在第21天收成所有的细胞。
实施例3，细胞数的计数及细胞存活力的比较
使用细胞计数器(ADAM-MC2)计数第5、9、11、13、15、17及21天的培养的自然杀手细胞的总细胞数及存活力。此时，当细胞达到80％汇合(其是继代培养的标准)时，计数以上这些天的细胞数，因为细胞的增殖速率随着处理的材料及培养基的种类而变。
在制备实施例1中制得的培养基组合物的条件下培养的CD3-CD56+细胞的总细胞数及存活力的比较结果，示于表6至13中及图5A至12B中。
结果确定，所有其中添加制备实施例1中制得的GI-101的培养基，具有自然杀手细胞的总数大于对照组(添加CD80-Fc+Fc-IL2v2或CD80-Fc+Fc-IL2WT)，无论在四个基本培养基条件下的处理浓度如何(表1至4)(图5A、5B、7A、7B、9A、9B、11A及11B)。
此外，即使是细胞存活力，当添加GI-101时，不管基本培养基及浓度如何，所有的培养基组合物表现出高存活力(图6A、6B、8A、8B、10A、10B、12A及12B)。
根据结果确定，与对照组(添加CD80-Fc+Fc-IL2v2或CD80-Fc+Fc-IL2WT)相比，不管基本培养基及浓度如何，GI-101在改善自然杀手细胞的增殖能力及存活力上扮演重要角色。
[表6]
[表7]
/>
[表8]
[表9]
[表10]
/>
[表11]
[表12]
/>
[表13]
II.使用自然杀手细胞培养组合物的自然杀手细胞的特征
实施例4，自然杀手细胞的纯度的测量
使从实施例2获得的CD3-CD56+自然杀手细胞分别于300×g下离心5分钟，除去上清液，加入1ml FACS缓冲液使沈淀物松开。然后，于PBS中添加3％(v/v)FBS、10mM EDTA、20mM HEPES、10μg/ml多黏菌素B、100U/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素及1mM丙酮酸钠，配制FACS缓冲液，然后添加1ml配制的FACS缓冲液以重新悬浮该细胞沈淀物。接着，用FACS缓冲液稀释至用细胞计数器计数得2×106细胞/ml。
将100μl稀释的细胞溶液加至各个5ml的FACS管中，进一步于其中加入100μl FACS缓冲液，接着用PerCP标志的抗人CD3抗体(PerCP人抗CD3(克隆UCHT1))及PE/cy7标志的抗人CD56抗体(PE/cy7人抗CD56(克隆B159))处理。然后，在4℃下培育20分钟后，加入200μlFACS缓冲液及在1,500rpm下离心3分钟。去除上清液，加入200μl FACS使悬浮，然后使用流式细胞仪(Aurora,Cytek,Fremont,CA,USA)判定细胞表型。
实验中使用的抗体的信息示于表14中。此外，测量在制备实施例1中制得的培养基组合物的条件下培养21天的CD3-CD56+自然杀手细胞的纯度，并示于图13至16中。
[表14]
实施例5，自然杀手细胞的活化性及抑制性标记的鉴定
使从实施例2获得的CD3-CD56+自然杀手细胞分别于300×g条件下离心5分钟，去除上清液，加入1ml FACS缓冲液使沈淀物松开。
于PBS中添加3％(v/v)FBS、10mM EDTA、20mM HEPES、10μg/ml多黏菌素B、100U/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素及1mM丙酮酸钠，制备FACS缓冲液，然后加入1ml制得的FACS缓冲液使细胞沈淀物再悬浮。然后，用FACS缓冲液稀释至使用细胞计数器计数得2×106细胞/ml。将100μl稀释的细胞溶液加至各个5ml的FACS管中，使用流式细胞仪，使用Pe-CF594标志的抗人CD16抗体(PE-CF594人抗CD16(克隆3G8))、APC标志的抗人DNAM1抗体(APC人抗DNAM1(克隆11A8))、BV605标志的抗人NKG2C抗体(BV605人抗NKG2C(克隆134591))、BV650标志的抗人NKG2D抗体(BV650人抗NKG2D(克隆1D11))、BB515标志的抗人NKp46抗体(BB515人抗NKp46(克隆9E2))、BV480标志的抗人NKp30抗体(BV480人抗NKp30(克隆p30-15))、PE标志的抗人PD-1抗体(PE人抗PD-1(克隆EH12.2H7))及APC标志的抗人NKG2A抗体(APC抗人NKG2A(克隆131411))确定。然后，在4℃下培育20分钟后，加入100μl FACS缓冲液并于1,500rpm下离心3分钟。
去除上清液，加入200μl FACS缓冲液使悬浮，然后使用流式细胞仪(Aurora,Cytek,Fremont,CA,USA)判定细胞表型。实验中使用的抗体的信息示于表15中。鉴定在制备实施例1中制得的培养基组合物的条件下培养21天的CD3-CD56+自然杀手细胞的活化性及抑制性标记，并示于图17至24中。
[表15]
实施例6，自然杀手细胞的颗粒酶B、穿透细胞膜蛋白质、干扰素γ分泌能力的测定
为了测定从实施例2获得的CD3-CD56+自然杀手细胞的颗粒酶及穿透细胞膜蛋白质分泌能力，利用胞内染色测量自然杀手细胞内颗粒酶B、穿透细胞膜蛋白质及干扰素γ的表达。使培养的自然杀手细胞在300×g条件下离心5分钟，去除上清液。然后，用各个培养组合物将其稀释至使用细胞计数器计数得2x106细胞/ml。
于96孔盘的各孔中分配200μl的制得的细胞，然后加入1％(v/v)刺激性鸡尾酒溶液(1X)(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)并于37℃、CO2条件下培育4小时。然后，使该盘在300×g条件下离心5分钟，去除上清液。接着，于PBS中添加3％(v/v)FBS、10mM EDTA、20mM HEPES、10μg/ml多黏菌素B、100U/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素及1mM丙酮酸钠，制备FACS缓冲液，然后加入100μl制得的FACS缓冲液使细胞沈淀物悬浮。去除上清液，加入100μlBD CYTOFIX/CYTOPERMTM缓冲液(通透/固定缓冲液，BD science)进行固定及通透，然后悬浮，接着在4℃下培育30分钟。进一步添加100μl FACS缓冲液，然后在1,500rpm下离心3分钟。
用PE/cy7标志的抗人颗粒酶B抗体(PE/cy7抗人颗粒酶B(克隆NGZB))、APC标志的抗人穿透细胞膜蛋白质抗体(APC抗人穿透细胞膜蛋白质(克隆B-D48))及BV421标志的抗人干扰素γ抗体(BV421抗人IFN-γ(克隆B27))处理。然后，在4℃下培育20分钟后，加入100μlFACS缓冲液并于1,500rpm下离心3分钟。去除上清液后，加入200μl FACS缓冲液(固定缓冲液)使悬浮，使用流式细胞仪测定细胞的表达。
实验中使用的抗体的信息示于表16中。鉴定在制备实施例1制得的培养基组合物的条件下培养21天的CD3-CD56+自然杀手细胞的标记，并示于图25至28中。
[表16]
III.根据培养组合物的自然杀手细胞的癌细胞杀伤能力的分析
实施例8，自然杀手细胞抗癌细胞的去颗粒能力及杀伤作用的确定
具体地，将K562癌细胞株(American Type Culture Collection,ATCC)于PBS中稀释至以下表17所示的细胞数，并分配于各孔中。
[表17]
| E：T | 1：1 | 1：5 | 1：10 |
| (E)NK细胞 | 2.5X105细胞 | 1X105细胞 | 1X105细胞 |
| (T)K562 | 2.5X105细胞 | 5X105细胞 | 1X106细胞 |
具体地，用各培养组合物将K562癌细胞株稀释至1×107细胞/ml，然后针对各孔根据上表具体指出的细胞数分配。然后，亦用各培养组合物将自然杀手细胞稀释至5×106细胞/ml，然后针对各孔根据上表具体指出的细胞数分配，在30×g条件下离心3分钟。接着，在37℃、5％CO2条件下培养4小时后，用BV421标志的抗人CD3抗体(BV421人抗CD3(克隆UCHT1))、PE标志的抗人CD16抗体(PE人抗CD16(克隆3G8))、PE/cy7标志的抗人CD56抗体(PE/cy7人抗CD56(克隆B159))及FITC标志的抗人CD107a抗体(FITC抗人CD107a抗体(克隆H4A3))处理，并在冰上培育20分钟。
然后，添加100μL FACS缓冲液，于1,300rpm、4℃条件下离心5分钟。去除上清液后，用7-AAD存活力染色溶液处理，避光室温下反应15分钟。然后，加入100μL FACS缓冲液，在1,300rpm、4℃条件下离心5分钟。再次加入200μL FACS缓冲液，在1,300rpm、4℃条件下离心5分钟。再重复一次以上方法后，去除上清液，加入400μL FACS缓冲液，接着使用流式细胞仪(Aurora,Cytek,Fremont,CA,USA)分析。
在表1至4的基本培养基中分别添加50nM表5的添加剂的组合物中培养21天的自然杀手细胞的去颗粒能力及杀伤作用，示于图29至34中。
更具体地，本申请提供下列各项：
1.一种用于培养自然杀手细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体。
2.如项1的组合物，其中所述IL-2变体是通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38个及第42个氨基酸而获得的。
3.如项1的组合物，其中所述IL-2变体由SEQ ID NO:6的氨基酸序列构成。
4.如项1的组合物，其中该CD80片段由SEQ ID NO:11的氨基酸序列中的第35个至第242个氨基酸构成。
5.如项1的组合物，其中该融合蛋白由SEQ ID NO:9的氨基酸序列构成。
6.一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：
i)从外周血单核细胞(PBMCs)中分离出不表达CD3的细胞；
ii)从以上步骤中所分离出的不表达CD3的细胞中分离出表达CD56的细胞；及
iii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该经分离的细胞。
7.如项6的方法，其中所述融合蛋白二聚体以1nM至500nM的浓度予以处理。
8.如项6的方法，其中在该培养步骤中的培养期为5天至25天。
9.一种自然杀手细胞，其是通过如项6的方法所制得的。
10.如项9的自然杀手细胞，其中在该自然杀手细胞中CD16及NKp46的表达是增加的。
11.如项9的自然杀手细胞，其中在该自然杀手细胞中颗粒酶B及穿透细胞膜蛋白质的表达是增加的。
12.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含如项9的自然杀手细胞作为活性成分。
13.如项9的药物组合物，其中该癌症是选自于由下列所构成的群组的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
14.一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：
i)从PBMCs中分离出不表达CD3的细胞；及
ii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该经分离的细胞。
15.一种自然杀手细胞，其是通过如项14的方法所制得的。
16.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含如项15的自然杀手细胞作为一活性成分。
17.如项16的药物组合物，其中该癌症是选自于由下列所构成的群组的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
18.一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：
i)从PBMCs中分离出表达CD56的细胞；及
iii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该经分离的细胞。
19.一种自然杀手细胞，其是通过如项18的方法所制得。
20.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含如项19的自然杀手细胞作为活性成分。
21.如项20的药物组合物，其中该癌症是选自于由下列所构成的群组的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
22.一种用于增进PBMCs中一自然杀手细胞的活性的方法，其包含在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养PBMCs。
23.一种外周血单核细胞，其是由如项22的方法所制得。
24.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含如项23的自然杀手细胞作为活性成分。
25.如项24的药物组合物，其中该癌症是选自于由下列所构成的群组的任一个：胃癌、肝癌、肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌、子宫颈癌、甲状腺癌、喉癌、急性淋巴母细胞白血病、脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、头颈癌、唾液腺癌及淋巴瘤。
Claims (10)
1.一种用于培养自然杀手细胞的组合物，其包含作为活性成分的含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体。
2.如权利要求1的组合物，其中所述IL-2变体是通过取代SEQ ID NO:10的氨基酸序列中的第38个及第42个氨基酸而获得的。
3.如权利要求1的组合物，其中所述IL-2变体由SEQ ID NO:6的氨基酸序列构成。
4.如权利要求1的组合物，其中该CD80片段由SEQ ID NO:11的氨基酸序列中的第35个至第242个氨基酸构成。
5.如权利要求1的组合物，其中该融合蛋白由SEQ ID NO:9的氨基酸序列构成。
6.一种用于培养自然杀手细胞的方法，其包含：
i)从外周血单核细胞(PBMCs)中分离出不表达CD3的细胞；
ii)从以上步骤中所分离出的不表达CD3的细胞中分离出表达CD56的细胞；及
iii)在含有IL-2或其变体与CD80或其片段的融合蛋白二聚体的存在下，培养该经分离的细胞。
7.如权利要求6的方法，其中所述融合蛋白二聚体以1nM至500nM的浓度予以处理。
8.如权利要求6的方法，其中在该培养步骤中的培养期为5天至25天。
9.一种自然杀手细胞，其是通过如权利要求6的方法所制得的。
10.如权利要求9的自然杀手细胞，其中在该自然杀手细胞中CD16及NKp46的表达是增加的。
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