TWI812900B

TWI812900B - 用於培養t 細胞之組成物及使用其來培養t 細胞的方法

Info

Publication number: TWI812900B
Application number: TW109140811A
Authority: TW
Inventors: 張明浩; 洪天杓; 崔榮周; 李俊燮
Original assignee: 南韓商Ｇｉ細胞股份有限公司
Priority date: 2019-11-20
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2023-08-21
Also published as: EP4063492A1; CN114829585A; KR20210061956A; BR112022009521A2; MX2022005999A; CA3157613A1; IL292934A; JP2023503098A; US20230015408A1; TW202134428A; WO2021101271A1; EP4063492A4; AU2020389422A1

Abstract

本發明有關用於增殖T細胞之組成物，其包含含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白，及使用其來培養T細胞的方法。由本發明培養的T細胞可在不使用CD3/CD28抗體結合的磁珠之情況下增加T細胞的增殖及活性。此外，培養患者自身的周邊血液單核細胞，以增殖T細胞，從而不用害怕人的副作用，因此能廣泛的用作新的T細胞治療劑。再者，以上培養的CD8+ T細胞具有增加的活性，提供更有效的治療劑。

Description

用於培養T細胞之組成物及使用其來培養T細胞的方法

發明領域

本揭示有關用於培養T細胞之組成物，其包含一含有CD80蛋白與IL-2野生型或其變異體之融合蛋白，及使用其之T細胞培養方法。

發明背景

諾華的Kymriah(INN：替薩根微核(Tisagenlecleucel)，產品代碼：CTL019)，近來獲得美國食品藥物管理局(FDA)及歐洲藥品管理局(EMA)批准販售，是一種由基因改造自體T細胞構成的基因治療劑(美國專利案第9,499,629號)。該產品是由患者自身的T細胞，經過編碼人CD19之嵌合抗原受體(CAR)之慢病毒載體的轉導而產生。該T細胞之作用為抗原依賴性的，且以獨立於主要組織相容性複合體之方式專一性靶定與摧毀CD19陽性B細胞。

Kymriah之製程如下。通過兩個不同的過程增殖T細胞，用結合CD3與CD28抗體的磁珠刺激該增殖的T細胞，然後用CTL019 HIV-1轉導。之後，透過培養一段時間增殖表現CAR的自體T細胞，然後經過清洗過程除去雜質如結合CD3/CD28的珠。然而，近來確認DYNABEADS^®，一種在Kymriah的製程中用於T細胞增殖及活化的CD3/CD28抗體結合磁珠，有可能引起急性毒性。

此外，藥用產品中之複製型慢病毒(RCL)已知具有感染性，可經過人與人的接觸傳染。在對具有可能通過捐獻血液、器官、組織或細胞進行輸血或移植而傳播新的慢病毒之風險的患者投予Kymriah之後，可能會因原病毒與宿主基因組序列間的互補而通過載體的轉移形成RCL。因此，還有可能在之前是HIV陽性的患者中產生新的HIV病毒。如此，一般認為，理論上，此對環境的潛在影響是嚴重的，因為新的複製型慢病毒可能傳染並擴散至人群。

據此，越來越需要有一種無此副作用之新的自體T細胞治療劑。

本發明之詳細說明

本發明人密集地嘗試在不使用CD3/CD28抗體結合磁珠之情況下增加T細胞的增殖及活性，結果發現在含有CD80蛋白與IL-2野生型或其變異體之融合蛋白之存在下，於細胞培養基中培養周邊血液單核細胞，可增加T細胞的增殖及活性，並完成本發明。

為達到以上目的，根據一個例示實施例，提供一種用於培養T細胞之組成物或培養基，其包含作為活性成份之含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體。

根據另一例示實施例，提供一種T細胞培養方法，其使用含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體。

根據又另一例示實施例，提供一種藥學組成物，其包含作為活性成份之T細胞，其培養在包含含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體之培養基中。

通過根據本發明之用於培養T細胞的T細胞培養基組成物及使用其來培養T細胞之T細胞培養方法培養的T細胞，可在不使用CD3/CD28抗體結合磁珠之情況下增加T細胞的增殖及活性。因此，可更安全地製備T細胞，因為不會產生雜質如磁珠。此外，培養患者自身的周邊血液單核細胞來增殖T細胞，如此不用擔心人的副作用，因此將能廣泛地用作新的T細胞治療劑。

結合下列說明與所附的圖式可更詳細地了解例示實施例，其中：圖1是本發明中使用的融合蛋白之製備範例的示意圖；圖2顯示通過SDS-PAGE確認所獲得的融合蛋白(GI-101)；圖3顯示通過粒徑篩析層析法(SEC)確認所獲得的融合蛋白(GI-101)；圖4顯示通過SDS-PAGE確認所獲得的Fc-IL2v2融合蛋白；圖5顯示通過粒徑篩析層析法(SEC)確認所獲得的Fc-IL2v2融合蛋白；圖6顯示通過SDS-PAGE確認所獲得的Fc-IL2wt融合蛋白二聚體；圖7顯示通過粒徑篩析層析法(SEC)確認所獲得的Fc-IL2wt融合蛋白二聚體；圖8顯示通過SDS-PAGE確認所獲得的hCD80-Fc-IL2wt融合蛋白；圖9顯示通過粒徑篩析層析法(SEC)確認所獲得的hCD80-Fc-IL2wt融合蛋白；圖10顯示通過SDS-PAGE確認所獲得的hCD80-Fc融合蛋白；圖11顯示通過粒徑篩析層析法(SEC)確認所獲得的hCD80-Fc融合蛋白；圖12顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中培養時，CD4- PBMC細胞之總數；圖13顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中培養時，CD4- PBMC細胞之生存力；圖14顯示在含有表2之基本培養基的培養組成物中培養時，CD4- PBMC細胞之總數；圖15顯示在含有表2之基本培養基的培養組成物中培養時，CD4- PBMC細胞之生存力；圖16顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中，通過根據本發明之GI-101或之hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的CD4- PBMC細胞以流式細胞術進行細胞表面分析的結果；圖17是通過螢光活化細胞分選(FACS)分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行T細胞(CD3+CD19-細胞)總數的定量之圖表；圖18是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行CD8 T細胞數的定量之圖表；圖19是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行CD25+記憶T細胞數的定量之圖表；圖20是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行中央記憶T細胞數的定量之圖表；圖21顯示在含有表2之基本培養基的培養組成物中，通過本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的CD4- PBMC細胞以流式細胞分析術進行細胞表面分析的結果；圖22是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行T細胞(CD3+CD19-細胞)總數的定量之圖表；圖23是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101 或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行CD8 T細胞數的定量之圖表；圖24是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行CD25+記憶T細胞數的定量之圖表；圖25是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行中央記憶T細胞數的定量之圖表；圖26顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中，通過本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的CD4- PBMC細胞之胞內流式細胞分析術的結果；圖27是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行顆粒酶B+ CTL(細胞毒性T淋巴細胞)數的定量之圖表；圖28是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行IFN-γ CTL細胞數的定量之圖表；圖29是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行穿孔素+CTL細胞數的定量之圖表；圖30顯示在含有表2之基本培養基的培養組成物中，通過本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的CD4- PBMC細胞之胞內流式細胞分析術的結果；圖31是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101 或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行顆粒酶B+ CTL細胞數的定量之圖表；圖32是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行IFN-γ CTL細胞數的定量之圖表；圖33是通過FACS分析法，對在含有表2之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞進行穿孔素+CTL細胞數的定量之圖表；圖34顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中培養時，CD8+ PBMC細胞之總數；圖35顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中培養時，CD8+ PBMC細胞之生存力；圖36顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中，通過本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的CD8+ PBMC細胞之以流式細胞分析術進行細胞表面分析的結果；圖37是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞進行T細胞(CD3+CD19-細胞)總數的定量之圖表；圖38是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞進行CD8 T細胞數的定量之圖表；圖39是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞進行CD25+記憶T細胞數的定量之圖表；圖40是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞進行中央記憶T細胞數的定量之圖表；圖41顯示在含有表1之基本培養基的培養組成物中，通過本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的CD8+ PBMC細胞之胞內流式細胞分析術的結果；圖42是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞進行顆粒酶B+ CTL細胞數的定量之圖表；圖43是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞進行IFN-γ CTL細胞數的定量之圖表；圖44是通過FACS分析法，對在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101或hCD80-Fc與Fc-IL2v添加物處理的培養組成物中培養12天的CD8+PBMC細胞進行穿孔素+ CTL細胞數的定量之圖表；圖45顯示在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101添加物處理的培養組成物中培養的Her2蛋白辨識性T細胞，對BT-474(ATCC^® HTB-20TM)癌細胞之殺傷作用的分析結果；圖46顯示在含有表1之基本培養基且經本發明之GI-101添加物處理的培養組成物中培養的Her2蛋白辨識性T細胞，對CAMA-1(ATCC^® HTB-21^TM)癌細胞之殺傷作用的分析結果。

進行本發明之最佳模式 用於增殖T細胞的組成物及培養基

本發明之一個態樣提供一種用於增殖T細胞之組成物，其包含含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體。此外，提供一種用於增殖T細胞的培養基，其包含該融合蛋白二聚體作為活性成份。

該T細胞增殖培養基可為於T細胞培養基中添加該含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體之培養基。在此情況下，該細胞培養基可包括任一種選自於由胺基酸、糖、無機鹽及維生素所構成之群組。較佳地，該T細胞培養基可包括胺基酸、糖、無機鹽及維生素。此外，該培養基可進一步包括胎牛血清(FBS)、羥乙基哌

乙烷磺酸(HEPES)、蛋白質、碳水化合物、巰乙醇或生長因子。

本文中使用的術語“細胞培養基”意指用於培養細胞，具體地T細胞，之培養基，更具體地意指用於培養CD8+細胞之培養基。此包括細胞於活體外之細胞生長及存活所需的組份，或包括幫助細胞生長及存活的組份。具體地，該組份可為維生素、必需或非必需胺基酸及微量元素。

根據本發明之細胞培養基是由胺基酸組份、維生素組份、無機鹽組份、其它組份及純水構成，其中：a)該胺基酸組份是選自於由下列所構成之群組中之至少一種胺基酸：甘胺酸、L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸、L-蘇胺酸、L-絲胺酸、L-半胱胺酸、L-甲硫胺酸、L-天冬胺酸、L-天冬醯胺酸、L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-離胺酸、L-精胺酸、L-組胺酸、L-苯丙胺酸、L-酪胺酸、L-色胺酸、L-脯胺酸、β-丙胺酸、γ-胺基丁酸、鳥胺酸、瓜胺酸、高絲胺酸、三碘甲狀腺素、甲狀腺素及二氧苯丙胺酸或其等之組合，較佳地選自於由下列所構成之群組中之至少一種胺基酸：甘胺酸、L-丙胺酸、L-精胺酸、L-半胱胺酸、L-麩醯胺酸、L-組胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸及L-纈胺酸或其等之組合； b)該維生素是選自於由下列所構成之群組中之至少一種維生素：生物素、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡多辛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、氯化膽鹼、i-肌醇及抗壞血酸或其等之組合，較佳地選自於由下列所構成之群組中之至少一種維生素：i-肌醇、鹽酸硫胺素、菸鹼醯胺及鹽酸吡多辛或其等之組合；c)該無機鹽組份是選自於由下列所構成之群組中之至少一種無機鹽：氯化鈣(CaCl₂)(無水)、硫酸銅五水合物(CuSO₄-5H₂O)、硫酸鐵(II)七水合物(FeSO₄-7H₂O)、氯化鎂(無水)、硫酸鎂(MgSO₄)(無水)、氯化鉀(KCl)、氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)、磷酸二氫鈉一水合物(NaH₂PO₄-H₂O)、硫酸鋅七水合物(ZnSO₄-7H₂O)、硝酸鐵(III)九水合物(Fe(NO₃)₃．9H₂O)及碳酸氫鈉(NaHCO₃)或其等之組合，較佳地是選自於由下列所構成之群組中之至少一種無機鹽：氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO₃)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl₂)(無水)及磷酸二氫鈉一水合物(NaH₂PO₄-H₂O)或其等之組合；d)該其它組份是選自於由下列所構成之群組中之至少一種其它組份：D-葡萄糖(右旋糖)、丙酮酸鈉、次黃嘌呤Na、胸苷、亞麻油酸、類脂酸、腺苷酸、胞苷、鳥苷、尿苷、2'-去氧腺苷、2'-去氧胞苷HCl及2'-去氧鳥苷或其等之組合，且較佳地可為丙酮酸鈉；及e)純水是用於溶解該胺基酸、維生素、無機鹽及其它組份，且可通過一或多個蒸餾過程獲得，或透過濾器純化。

此外，根據本發明之細胞培養基可進一步包含生長因子或細胞激素。該生長因子可為IGF、bFGF、TGF、HGF、EGF、VEGF、PDGF等等單獨或其中至少二種，但不限於此。該細胞激素可為IL-1、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-10或IL-17等等單獨或其中至少二種，但不限於此。

本文中使用的術語"T細胞"意指負責抗原專一性適應性免疫之淋巴細胞之一。T細胞分類成還沒遇到抗原之初始T細胞、已遇到抗原之成熟T細胞及記憶T細胞。此時，成熟效應T細胞包括輔助型T細胞、細胞毒性T細胞及自然殺手T細胞。較佳地，該T細胞可為CD8+ T細胞。

本文中使用的術語"輔助型T細胞或Th細胞"意指可通過調節其它白血球的分化及活化來增進體液性免疫之細胞。亦稱作CD4+ T細胞，因為在該細胞表面上具有CD4蛋白。輔助型T細胞根據其等之細部功能可進一步分成Th1、Th2、Th17及Treg細胞。Th1細胞會分泌干擾素γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子β(TNF-β)，從而誘導巨噬細胞中的胞內體與溶酶體融合形成內溶酶體。而Th2細胞會分泌數種白介素(IL)，容許B細胞分化成漿細胞。Th17細胞會分泌白介素-17(IL-17)用於募集嗜中性白血球。

本文中使用的術語"調節性T細胞(Treg)”包括天然調節性T細胞(nTreg)或誘導型調節性T細胞(iTreg)。調節性T細胞在此包括CD4+CD25+ T細胞、CD4+CD25+CD127低/-T細胞或CD4+CD25+Foxp3+ T細胞。調節性T細胞可通過抑制免疫反應來維持免疫恆定及阻斷自體免疫反應等等。

本文中使用的術語"細胞毒性T細胞"意指通過分泌細胞毒性物質如顆粒酶或穿孔素來殺死病毒感染的細胞或腫瘤細胞之細胞。亦稱作CD8 T細胞，因為該細胞表面上具有CD8蛋白。與輔助型T細胞相反，其通過介導細胞性免疫消除病毒及癌細胞。

本文中使用的術語"自然殺手T細胞"意指效應T細胞之一，與輔助型T細胞及細胞毒性T細胞相比，其分佈比例較低。自然殺手T細胞之細胞表面上具有與T細胞相同的T細胞受體(TCR)，但還具有自然殺手細胞特有的分子如NK1.1。自然殺手T細胞會分泌γ干擾素、白介素-4等等，用於調節免疫反應。

本文中使用的術語"記憶T細胞”意指具有潛在能力的T細胞，當其辨識抗原並在分化與選擇過程後長期存活，之後當抗原再次侵犯時，很快地被活化而具有效應T細胞之功能。初始T細胞通過辨識抗原分化成活化的效應T細胞，而某些效應T細胞通過白介素-7與白介素-15的影響分化成長期存活記憶T細胞。

在此情況下，含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體在該培養基中之含量可為1nM至2,000nM。此外，該二聚體之含量可為1nM至1,000nM或1nM至500nM。再者，該二聚體之含量可為2nM至300nM、5nM至100nM、10nM至80nM、20nM至70nM或40nM至50nM。具體地，該融合蛋白二聚體在該培養基中之含量可為1nM、3.2nM、10nM或50nM。

含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體

本文中使用的術語"IL-2"或"白介素-2"，除非有另外說明，否則意指從任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，例如靈長類動物(如人)及囓齒動物(如小鼠及大鼠)獲得之任何野生型IL-2。IL-2可從動物細胞獲得，還包括從能夠產生IL-2之重組細胞獲得的IL-2。此外，IL-2可為野生型IL-2或其變異體。

在本說明書中，IL-2或其變異體可集體以術語"IL-2蛋白"或"IL-2多肽"表示。IL-2、IL-2蛋白、IL-2多肽及IL-2變異體會專一性地結合至例如IL-2受體。此專一性結合可用熟悉此技藝之人士已知的方法鑑定。

IL-2之一實施例可具有序列辨識編號：35或序列辨識編號：36之胺基酸序列。在此，IL-2亦可為成熟形式。具體地，成熟IL-2可不含訊息序列，且可具有序列辨識編號：10之胺基酸序列。在此，IL-2可在包含野生型IL-2之片段的概念下使用，其中野生型IL-2之N端或C端部分被截短。

此外，IL-2之片段可為從具有序列辨識編號：35或序列辨識編號：36之胺基酸序列之蛋白的N端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續的胺基酸之形式。此外，該IL-2之片段可為從具有序列辨識編號：35或序列辨識編號：36之胺基酸序列之蛋白的C端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個連續的胺基酸之形式。

本文中所使用的術語“IL-2變異體”意指全長IL-2或上述IL-2之片段中一部分的胺基酸被取代之形式。即，IL-2變異體可具有與野生型IL-2或其片段不同的胺基酸序列。然而，IL-2變異體可具有與野生型IL-2相當或相似的活性。在此，"IL-2活性"可意指例如與IL-2受體專一性結合，該專一性結合可用熟悉此技藝之人士已知的方法測量。

具體地，IL-2變異體可通過取代野生型IL-2中一部分的胺基酸而獲得。通過胺基酸取代而獲得的IL-2變異體之實施例，可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中的第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之至少一個而獲得。

具體地，該IL-2變異體可通過以另一胺基酸取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中的第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之至少一個而獲得。此外，當IL-2為序列辨識編號：35之胺基酸序列中N端的一部分被截短之形式時，可以另一胺基酸取代與序列辨識編號：10之胺基酸序列中互補對應位置處之胺基酸。例如，當IL-2具有序列辨識編號：35之胺基酸序列時，其IL-2變異體可通過以另一胺基酸取代序列辨識編號：35胺基酸序列中第58個、第62個、第65個、第81個或第92個胺基酸中之至少一個而獲得。此等胺基酸殘基分別對應於序列辨識編號：10之胺基酸序列中的第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸殘基。根據一個實施例，可取代一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸，只要此IL-2變異體能保持IL-2活性。根據另一個實施例，可取代一至五個胺基酸。

在一個實施例中，IL-2變異體可為二個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第42 個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第45個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個及第45個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第61個及第72個胺基酸而獲得。

再者，IL-2變異體可為三個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個及第45個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第61個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個、第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個、第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第45個、第61個及第72個胺基酸而獲得。

此外，IL-2變異體可為四個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第45個及第61個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第45個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第45個、第61個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第61個及第72個胺基酸而獲得。此外，在一實施例中，該IL-2變異體可通過取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸而獲得。

再者，IL-2變異體可為五個胺基酸被取代之形式。具體地，該IL-2變異體可通過以另一胺基酸取代序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個、第42個、第45個、第61個及第72個胺基酸中之每一個而獲得。

在此，通過取代而導入的"另一胺基酸"可為任一個選自於由下列所構成之群組：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。然而，在該IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第38個胺基酸不能以精胺酸取代、第42個胺基酸不能以苯丙胺酸取代、第45個胺基酸不能以酪胺酸取代、第61個胺基酸不能以麩胺酸取代及第72個胺基酸不能以白胺酸取代。

在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第38個胺基酸，精胺酸，可以非精胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第38個胺基酸，精胺酸，可以丙胺酸取代(R38A)。

在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第42個胺基酸，苯丙胺酸，可以非苯丙胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第42個胺基酸，苯丙胺酸，可以丙胺酸取代(F42A)。

在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第45個胺基酸，酪胺酸，可以非酪胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第45個胺基酸，酪胺酸，可以丙胺酸取代(Y45A)。

在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第61個胺基酸，麩胺酸，可以非麩胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第61個胺基酸，麩胺酸，可以精胺酸取代(E61R)。

在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第72個胺基酸，白胺酸，可以非白胺酸之胺基酸取代。較佳地，在IL-2變異體之胺基酸取代方面，於序列辨識編號：10之胺基酸序列中，第72個胺基酸，白胺酸，可以甘胺酸取代(L72G)。

具體地，IL-2變異體可通過至少一個選自於由下列所構成之群組之取代而獲得：序列辨識編號：10之胺基酸序列中之R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G。

具體地，該IL-2變異體可通過在選自於由R38A、F42A、Y45A、 E61R及L72G所構成之群組之位置中的二個、三個、四個或五個位置處之胺基酸取代而獲得。

此外，IL-2變異體可為二個胺基酸被取代之形式。具體地，IL-2變異體可通過R38A及F42A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A及Y45A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A及Y45A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過E61R及L72G之取代而獲得。

此外，IL-2變異體可為三個胺基酸被取代之形式。具體地，IL-2變異體可通過R38A、F42A及Y45A之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、F42A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、F42A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、Y45A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、Y45A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A、Y45A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A、Y45A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A、E61R及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。

此外，IL-2變異體可為四個胺基酸被取代之形式。具體地，IL-2變異體可通過R38A、F42A、Y45A及E61R之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、F42A、Y45A及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、F42A、E61R及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過R38A、Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。此外，在一實施例中，IL-2變異體可通過F42A、Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。

此外，IL-2變異體可通過R38A、F42A、Y45A、E61R及L72G之取代而獲得。

較佳地，該IL-2變異體之實施例可包含任一個選自於下列序列辨識編號：10之胺基酸序列中的取代組合(a)至(d)：

(a)R38A/F42A

(b)R38A/F42A/Y45A

(c)R38A/F42A/E61R

(d)R38A/F42A/L72G

在此，當IL-2具有序列辨識編號：35之胺基酸序列時，胺基酸取代可出現在與序列辨識編號：10之胺基酸序列中互補對應位置處。此外，即使IL-2是序列辨識編號：35之胺基酸序列的片段，胺基酸取代亦可出現在與序列辨識編號：10之胺基酸序列中互補對應位置處。

具體地，IL-2變異體可具有序列辨識編號：6、22、23或24之胺基酸序列。

此外，IL-2變異體可具有低活體內毒性之特徵。在此，該低活體內毒性可能為IL-2與IL-2受體α鏈(IL-2Rα)結合引起的副作用。已開發出各種可減少因IL-2與IL-2受體α結合所引起的副作用之IL-2變異體，且此IL-2變異體可為美國專利案第5,229,109號及韓國專利案第1667096號中所揭示的。特別是，本申請案中所述的IL-2變異體對IL-2受體α鏈(IL-2Rα)具有低結合親和力，因此具有比野生型IL-2低的活體內毒性。

本文中所使用的術語"CD80"亦稱作"B7-1"，是一種存在樹狀細胞、活化B細胞及單核球中之膜蛋白。CD80提供T細胞之活化及存活必需的共刺激訊息。CD80已知為存在T細胞表面上二種不同的蛋白，CD28及CTLA-4，之配體。CD80由288個胺基酸構成，具體地具有序列辨識編號：11之胺基酸序列。此外，本文中使用的術語"CD80蛋白"意指CD80全長或CD80片段。

本文中使用的術語"CD80片段"意指CD80之截短形式。此外，該CD80片段可為CD80之胞外結構域。CD80片段之實施例可通過刪除CD80之N端第1個至第34個胺基酸(其是訊息序列)而獲得。具體地，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第288個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第242個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第232個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第35個至第139個胺基酸構成之蛋白。此外，CD80片段之實施例可為由序列辨識編號：11中第142個至第242個胺基酸構成之蛋白。在一實施例中，CD80片段可具有序列辨識編號：2之胺基酸序列。

此外，該IL-2蛋白與該CD80蛋白可透過一連接子或一攜帶體彼此附接。具體地，該IL-2或其變異體與該CD80(B7-1)或其片段可透過一連接子或一攜帶體彼此附接。在本說明中，該連接子及該攜帶體可交換使用。

該連接子會連接二個蛋白。該連接子之實施例可包括1至50個胺基酸、白蛋白或其片段、免疫球蛋白之Fc結構域等等。在此，免疫球蛋白之Fc結構域意指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2(CH2)及重鏈恆定區3(CH3)，而不含免疫球蛋白之重及輕鏈可變區及輕鏈恆定區1(CH1)之蛋白。該免疫球蛋白可為IgG、IgA、IgE、IgD或IgM，較佳地可為IgG4。在此，野生型免疫球蛋白G4之Fc結構域可具有序列辨識編號：4之胺基酸序列。

此外，免疫球蛋白之Fc結構域可為Fc結構域變異體及野生型Fc結構域。此外，在本文中使用的術語"Fc結構域變異體"可意指在醣基化模式方面與野生型Fc結構域不同的形式，與野生型Fc結構域相比具高醣基化，與野生型Fc結構域相比具低醣基化，或具有去醣基化的形式。此外，無醣基化Fc結構域包含於其中。通過宿主的培養條件或基因操作，可使該Fc結構域或其變異體適應而具有調整數量的唾液酸、岩藻醣基化或醣基化。

此外，免疫球蛋白之Fc結構域的醣基化可通過習用的方法修飾，如化學方法、酵素方法及使用微生物之遺傳工程方法。此外，該Fc結構域變異體可為免疫球蛋白、IgG、IgA、IgE、IgD及IgM各別的Fc區之混合形式。此外，該Fc結構域變異體可為Fc結構域的一些胺基酸經其它胺基酸取代之形式。Fc結構域變異體之實施例可具有序列辨識編號：12之胺基酸序列。

該融合蛋白可具有使用Fc結構域作為連接子(或攜帶體)之結構，其中CD80蛋白與IL-2蛋白，或IL-2蛋白與CD80蛋白，分別連接至該連接子或攜帶體之N端及C端(圖1)。該Fc結構域之N端或C端與CD80或IL-2間之連接，可任擇地通過一連接肽達成。

具體地，融合蛋白可由下列結構式(I)或(II)構成：N'-X-[連接子(1)]_n-Fc結構域-[連接子(2)]_m-Y-C' (I)

N'-Y-[連接子(1)]_n-Fc結構域-[連接子(2)]_m-X-C' (II)

在此，於結構式(I)及(II)中，N'是該融合蛋白的N端，C'是該融合蛋白的C端，X是CD80蛋白，Y是IL-2蛋白，該連接子(1)及(2)是胜肽連接子，及n及m各獨立地為0或1。

較佳地，該融合蛋白可由結構式(I)構成。該IL-2蛋白如上所述。此外，該CD80蛋白如上所述。根據一個實施例，該IL-2蛋白可為與野生型IL-2相比具有一至五個胺基酸取代的IL-2變異體。該CD80蛋白可為從野生型CD80之N端或C端截短高達約34個連續的胺基酸殘基所獲得的片段。或者，該CD80蛋白可為具有與T細胞表面受體CTLA-4及CD28結合之活性的胞外免疫球蛋白樣結構域。

具體地，該融合蛋白可具有序列辨識編號：9、26、28或30之胺基酸序列。根據另一個實施例，該融合蛋白包括與序列辨識編號：9、26、28或30之胺基酸序列具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在此，該一致性是例如同源百分比，且可透過同源性比對軟體如National Center of Biotechnology Information(NCBI)的BlastN軟體測定。

該胜肽連接子(1)可包含在該CD80蛋白與該Fc結構域之間。該胜肽連接子(1)可由5至80個連續的胺基酸、20至60個連續的胺基酸、25至50個連續的胺基酸或30至40個連續的胺基酸構成。在一實施例中，該胜肽連接子(1)可由30個胺基酸構成。此外，該胜肽連接子(1)可包含至少一個半胱胺酸。具體地，該胜肽連接子(1)可含有一個、二個或三個半胱胺酸。此外，該胜肽連接子(1)可源自免疫球蛋白的鉸鏈。在一實施例中，該胜肽連接子(1)可為由序列辨識編號：3之胺基酸序列構成的胜肽連接子。

該胜肽連接子(2)可由1至50個連續的胺基酸、3至30個連續的胺基酸或5至15個連續的胺基酸構成。在一實施例中，該胜肽連接子(2)可為(G4S)_n(其中n是1至10之整數)。在此，於(G4S)_n中，n可為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一實施例中，該胜肽連接子(2)可為由序列辨識編號：5之胺基酸序列構成的胜肽連接子。

在本發明之另一態樣中，提供一種通過結合二個融合蛋白而獲得的二聚體，其各含有IL-2蛋白與CD80蛋白。含有IL-2或其變異體與CD80或其片段之融合蛋白如上所述。

在此，含有該二聚體之融合蛋白間的結合，可通過，但不限於，存在該連接子中之半胱胺酸形成的雙硫鍵達成。含有該二聚體之融合蛋白可為彼此相同或不同的融合蛋白。較佳地，該二聚體可為同型二聚體。含有該二聚體之融合蛋白的實施例可為具有序列辨識編號：9之胺基酸序列的蛋白。

T細胞培養方法

在另一態樣中，本發明有關一種用於培養T細胞的培養方法，其包含將細胞培養在用於增殖T細胞的培養組成物中。在本發明中，該細胞之特徵可為周邊血液單核細胞(PBMC)。此外，該細胞可為CD8+ T細胞或源自PBMCs的CD8+ T細胞。

在本發明中，用於培養T細胞的培養基組成物之特徵可為含有0.1nM至1,000,000nM之融合蛋白二聚體，更佳地1nM至1,000nM或1.6nM至100nM的融合蛋白。具體地，在該T細胞培養基中，該融合蛋白二聚體的含量為1nM、1.6nM、2nM、5nM、10nM、20nM、30nM或50nM。

在本發明之一個具體實施例中，使用包含1.6nM之含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體，或使用50nM之含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體的細胞培養基組成物來培養PBMCs。此外，當培養CD8+ T細胞時，使用包含1.6nM之含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體的細胞培養基組成物。

在本發明中，培養該細胞的步驟之特徵可為其進行7至21天。更具體地，培養該細胞的步驟可進行9至15天。

在本發明之一個具體實施例中，培養PBMCs的步驟進行14天。本文中使用的術語"PBMC"是周邊血液單核細胞(PBMC)，包括T細胞、B細胞、NK細胞及單核球。

本文中使用的術語"CD4-PBMC”意指不含表現分化簇4(CD4)醣蛋白的免疫細胞之細胞周邊血液單核細胞，較佳地意指不含CD4+輔助型T細胞之細胞。

本文中使用的術語“T細胞”包括CD4+或CD8+ T細胞。

本文中使用的術語"CD8+ T細胞”包括細胞毒性T細胞(CD8+)或記憶T細胞。

本文中使用的術語“記憶T細胞”包括效應記憶T細胞、中央記憶T細胞、組織駐留記憶T細胞、周邊記憶T細胞或CD25+記憶T細胞。

在本發明之一個實施例中，確定了與培養在含有Fc-IL2v2、Fc-IL2v3或rhIL-2的培養基組成物中之T細胞相比，通過培養在包含含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體的培養基組成物中的培養方法培養的T細胞，在細胞數及CD4+或CD8+ T細胞中分泌的IFN-γ數量方面，具有顯著的增加。

獲得的T細胞及其用途

本發明之另一態樣提供由該培養方法獲得的T細胞。此時，確定了與由其它培養方法獲得的CD8+ T相比，由該培養方法獲得的T細胞，較佳地CD8+ T細胞，顆粒酶B、IFN-γ及穿孔素分泌量增加。因此，確定CD8+ T細胞之殺癌能力增加(圖45及46)。

本發明之又另一態樣提供一種用於治療癌症的藥學組成物，其包括由上述方法獲得的T細胞作為活性成份。

該藥學組成物的劑量可根據各種因素調整，包括疾病類型、疾病嚴重度、組成物中所含的活性成份及其它成份的種類及含量、配方之種類及患者之年齡、體重、整體健康狀況、性別及飲食、投藥時間、投予途徑及組成物之分泌率、治療期間及同時使用的藥物。

此外，該藥學組成物可通過此技術領域中已知的各式方法投予。投予途徑可由熟悉此技藝之人士，考慮投予方法、體液體積、黏度等等適當地選擇。

該癌症可選自於由下列所構成之群組中之任一個：胃癌、肝癌、肺癌、結直腸癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、喉癌、急性淋巴母細胞白血病、腦瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、頭頸癌、唾液腺癌及淋巴瘤。

本發明之組成物可包括藥學上可接受的載劑和/或添加物等等。例如，其可包括無菌水、生理食鹽水、常規緩衝液(如，磷酸、檸檬酸及其它有機酸)、安定劑、鹽、抗氧化劑、界面活性劑、助懸劑、等張劑或防腐劑。再者，其可包括，但不限於此，有機物質如生物聚合物及無機物質如羥磷灰石，具體地，膠原蛋白基質、聚乳酸聚合物或其共聚物、聚乙二醇聚合物或其共聚物、其化學衍生物及其等之混合物。該安定劑的例子可包括右旋葡萄聚糖40、甲基纖維素、明膠、亞硫酸鈉、偏硫酸鈉等等。該抗氧化劑的例子可包括螯合劑如異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁羥甲氧苯、α-生育酚、生育酚醋酸酯、L-抗壞血酸及其鹽類、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊基、沒食子酸丙基或乙二胺四乙酸鈉(EDTA)、焦磷酸鈉及偏磷酸鈉。該助懸劑的例子可包括甲基纖維素、聚山梨醇酯80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠、羧甲基纖維素鈉及聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯。該等張劑的例子可包括D-甘露醇及山梨糖醇。該防腐劑的例子可包括對氧苯甲酸甲酯、對氧苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯-甲酚等等。

使用獲得的T細胞的治療方法

本發明之另一態樣提供一種用於治療癌症的方法，其包含對患有癌症之個體投予該T細胞。在此情況下，該癌症如上所述。

本發明之又另一態樣提供該T細胞用於治療癌症的用途。

T細胞活化組成物

本發明之另一態樣提供一種用於提高T細胞之抗原辨識效率的組成物，其包含作為活性成分之含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體。

本發明之又另一態樣提供一種用於提高T細胞之殺癌能力的組成物，其包含作為活性成分之含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體。

該含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體與上述的相同。包含該融合蛋白二聚體的組成物可協同誘導T細胞活性，從而提高T細胞辨識異體抗原之效力，最終有效地提高對標靶細胞、癌細胞之細胞殺傷能力，因此可應用於抗癌免疫療法。

使用癌抗原的T細胞活化方法

本發明之另一態樣提供一種用於離體活化及增殖CD8+ T細胞的方法，其包含在包含含有IL-2蛋白或其變異體與CD80蛋白或其片段之融合蛋白二聚體之培養基中同時培養周邊血液單核細胞(PBMC)或T細胞與癌抗原。此時，該T細胞可為CD8+ T細胞，如上所述。

本文中使用的術語"癌抗原”意指一種存在癌細胞表面上或從癌細胞分泌至血液中的癌細胞特異蛋白。此等癌抗原已應用於特定癌症的診斷或用於抗癌療法的抗癌疫苗。此癌抗原包括PSCA(前列腺幹細胞抗原)、HER-2(人表皮生長因子受體2)、MUC1(黏液素1)、CA15-3(癌抗原15-3)、CA19-9(癌抗原19-9)、CA27-29(癌抗原27-29)、CA125(癌抗原125)、CA195(癌抗原195)、PSA (前列腺特異抗原)、CA549(癌抗原549)、CEA(癌胚抗原)、ACTH(腎上腺皮質荷爾蒙)、AFP(α-胎兒蛋白)、bcl-2(B-細胞淋巴瘤2)、β-2微球蛋白、抑鈣素、組織蛋白酶D、染色顆粒素-A、EFGR(上皮生長因子受體)、胃泌素、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、α-hCG(hCG之α次單元)、β-hCG(hCG之β次單元)、LDH(乳酸脫氫酶)、NSE(神經元特異烯醇酶)、胰多肽、前胰島素C肽、甲狀腺球蛋白、TDT(末端去氧核苷酸轉移酶)、TPA(組織多肽抗原)、角蛋白19(KRT19)、ETA(上皮瘤抗原)、酪胺酸酶、MAGEA1(黑色素瘤相關抗原家族成員A1)、MAGEA2(黑色素瘤相關抗原家族成員A2)、MAGEA3(黑色素瘤相關抗原家族成員A3)、MAGEA4(黑色素瘤相關抗原家族成員A4)、MAGEA6(黑色素瘤相關抗原家族成員A6)、MAGEA9(黑色素瘤相關抗原家族成員A9)、MAGEA10(黑色素瘤相關抗原家族成員A10)、MAGEA11(黑色素瘤相關抗原家族成員A11)、MAGEA12(黑色素瘤相關抗原家族成員A12)、MAGEC1(黑色素瘤相關抗原家族成員C1)、MAGEC2(黑色素瘤相關抗原家族成員C2)、TRP-2(酪胺酸酶相關蛋白2)、EpCAM(上皮細胞黏附分子)、GPC3(甘聚糖3)、MSLN(間皮素)、BTA(膀胱腫瘤抗原)、ROR1(受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1)、細胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、CTAG2(癌/睪丸抗原2)、BAGE(B黑色素瘤抗原)、LRPAP1(LDL受體相關蛋白關聯蛋白1)、LY6K(淋巴細胞抗原6家族成員K)、SAGE1(肉瘤抗原1)、SPA17(精子表面蛋白17)、SSX-2(SSX家族成員2)、SSX-4(SSX家族成員4)、ALDH1A1(醛脫氫酶1家族成員A1)、CSAG2(軟骨肉瘤關聯基因家族成員2)、XAGE1B(X抗原家族成員1B)、CALCA(抑鈣素基因關聯肽1)、CD274(計劃性細胞死亡1配體1)、CD45(受體型酪胺酸蛋白磷酸酶C)、CPSF1(切割和聚腺苷酸化特異性因子次單元1)、DKK1(Dickkopf相關蛋白1)、ENAH(蛋白激活同源物)、EPHA3(Ephrin A型受體3)、EZH2(組織蛋白-離胺酸N-甲基轉移酶2)、FGF(纖維母細胞生長因子)、HEPACAM(肝細胞黏附因子)、HPN(絲胺酸蛋白酶 Hepsin)、IDO1(吲哚胺2)、IMP3(U3小核仁核糖核蛋白3)、IL13RA2(介白素13受體次單元α2)、CES2(羧酸酯酶2)、KLK4(微血管增滲素-4)、KIF20A(驅動蛋白樣蛋白KIF20A)、LGSN(Lengsin蛋白)、CSF1(巨噬細胞群落刺激因子1)、CSPG4(硫酸軟骨素蛋白多醣4)、MDK(Midkine)、MMP-2(基質金屬肽酶2)、MMP-7(基質金屬肽酶7)、MUC5AC(黏液素5AC)、MART1(T細胞識別的黑色素瘤抗原1)、BCL2L1(Bcl-2樣蛋白1)、Nectin-4、PLIN2(圍脂滴蛋白2)、PAX5(配對盒5)、PLAC1(胎盤特異性蛋白1)、ZNF395(鋅指蛋白395)、PRAME(腫瘤中優先表現的黑色素瘤抗原)、FOLH1(葉酸水解酶1)、RGS5(G蛋白傳訊調節子5)、RNF43(RING指蛋白43)、DCDC2(含雙皮質素結構域蛋白2)、SCRN1(Secernin-1)、SOX10(轉錄因子SOX-10)、SCGB2A2(分泌球蛋白家族2A成員2)、乳房珠蛋白-A、BIRC5(生存素；含桿狀病毒IAP重複序列5)、Surivin、NYESO1(纽約食道鳞狀细胞癌-1)、TROP2(滋養層細胞表面抗原2)、TERT(端粒酶逆轉錄酶)、TPBG(滋養層醣蛋白)、VEGF(血管內皮生長因子)、WT1(威爾姆氏腫瘤蛋白1)、WDR46(含WD重複蛋白46)、PMEL(前黑色素小體蛋白)、ANKRD30A(錨蛋白重複結構域30A)、GPR143(G蛋白偶聯受體143)、ACP3(前列腺酸性磷酸酶)、RAB38(Ras相關蛋白Rab-38)、α-TSH(α次單元甲狀腺刺激荷爾蒙)、c-Met(酪胺酸蛋白激酶Met)、CD133、KK-LC-1(Kita-Kyushu肺癌抗原-1)、CD70、GPNMB(醣蛋白Nmb)、MUC16(黏液素16)等等。除此之外，可使用各種突變蛋白，包括腫瘤抑制基因之特定的突變如，p53(磷蛋白53)，作為癌抗原。

進行本發明之模式

於下文中，將藉由下列範例更詳細的說明本發明。然而，下列範例僅供例示說明本發明，而本發明之範疇不受其限制。

製備範例1，hCD80-Fc-IL-2變異體(2M)：GI101之製備

為了產生含有人CD80片段、Fc結構域與IL-2變異體之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成一個包含核苷酸序列(序列辨識編號：8)之多核苷酸，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、CD80片段(序列辨識編號：2)、連接子結合的Ig鉸鏈(序列辨識編號：3)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子(序列辨識編號：5)及具有二個胺基酸取代(R38A，F42A)的IL-2變異體(2M)(序列辨識編號：6)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(Expi-CHO^TM)中，用以表現具序列辨識編號：9之融合蛋白。導入該載體後，使該等CHO細胞培養溶液在37℃、125RPM及8% CO₂之環境中培養7天，之後收集以純化融合蛋白。將純化的融合蛋白二聚體命名為"GI101"。

使用含MabSelect SuRe蛋白A樹脂之層析法進行純化。該融合蛋白在25mM Tris、25mM NaCl及pH 7.4之條件下會結合於其上。之後，用100mM NaCl及100mM乙酸於pH 3下進行洗提。將20% 1M Tris-HCl，pH 9置於收集管中，收集融合蛋白。將收集的融合蛋白於PBS緩衝液中透析16個小時進行交換。

之後，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)之粒徑篩析層析法，測量在280nm波長下隨著時間變化的吸光度，獲得高濃度的融合蛋白。此時，對分離純化的融合蛋白進行在還原(R)或非還原(NR)條件下之SDS-PAGE處理，且用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色，確定其純度(圖2)。用NanoDrop檢測，確定包含2.78mg/ml濃度的融合蛋白。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖3中。

製備範例2，Fc-IL-2變異體(2M)二聚體：Fc-IL-2v2之製備

為了產生含有Fc結構域與IL-2變異體之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成一個包含核苷酸序列(序列辨識編號：45)之多核苷酸，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、Ig鉸鏈(序列辨識編號：38)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子 (序列辨識編號：5)及具有二個胺基酸取代(R38A，E42A)之IL-2變異體(2M)(序列辨識編號：6)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(Expi-CHO^TM)中，用以表現具序列辨識編號：44之融合蛋白。導入該載體後，使該等CHO細胞在37℃、125RPM及8% CO₂之環境中培養7天，之後收集細胞以純化融合蛋白二聚體。將純化的融合蛋白二聚體命名為“Fc-IL2v2”。

使用與製備範例1中相同的方法進行該融合蛋白之純化及收集。對分離純化的融合蛋白進行在還原(R)或非還原(NR)條件下之SDS-PAGE處理，且用考馬斯藍染色，確定其純度(圖4)。結果確定該融合蛋白形成二聚體。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖5中。

製備範例3，Fc-IL-2二聚體：Fc-IL-2wt之製備

為了產生含有Fc結構域與野生型IL-2之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成一個包含核苷酸序列(序列辨識編號：43)之多核苷酸，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、Ig鉸鏈(序列辨識編號：38)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子(序列辨識編號：5)及野生型IL-2(序列辨識編號：10)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(Expi-CHO^TM)中，用以表現具序列辨識編號：42之融合蛋白。導入該載體後，使該等CHO細胞在37℃、125RPM及8% CO₂之環境中培養7天，之後收集用以純化融合蛋白二聚體。將純化的融合蛋白二聚體命名為“Fc-IL2wt”。

使用與製備範例1中相同的方法進行該融合蛋白之純化及收集。對分離純化的融合蛋白進行在還原(R)或非還原(NR)條件下之SDS-PAGE處理，且用考馬斯藍染色，確定其純度(圖6)。結果確定該融合蛋白形成二聚體。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖7中。

製備範例4，hCD80-Fc-IL-2野生型二聚體：hCD80-Fc-IL-2wt之製備

為了產生含有人CD80片段、Fc結構域與IL-2野生型蛋白之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成一個包含核苷酸序列(序列辨識編號：41)之多核苷酸，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、CD80片段(序列辨識編號：2)、連接子結合的Ig鉸鏈(序列辨識編號：3)、Fc結構域(序列辨識編號：4)、連接子(序列辨識編號：5)及IL-2野生型(序列辨識編號：10)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(Expi-CHO^TM)中，用以表現具序列辨識編號：46之融合蛋白。導入該載體後，使該等CHO細胞在37℃、125RPM及8% CO₂之環境中培養7天，之後收集以純化融合蛋白二聚體。將純化的融合蛋白二聚體命名為“hCD80-Fc-IL2wt”。

使用含MabSelect SuRe蛋白A樹脂之層析法進行純化。該融合蛋白在25mM Tris、25mM NaCl及pH 7.4之條件下會結合於其上。之後，用100mM NaCl及100mM乙酸於pH3下進行洗提。將20% 1M Tris-HCl，pH 9置於收集管中後，收集該融合蛋白。將收集的融合蛋白於PBS緩衝液中透析16個小時進行交換。

之後，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)之粒徑篩析層析法，測量在280nm波長下隨著時間變化的吸光度，獲得高濃度的融合蛋白。此時，對分離純化的融合蛋白進行在還原(R)或非還原(NR)條件下之SDS-PAGE處理，且用考馬斯藍染色，確定其純度(圖8)。結果確定該融合蛋白形成二聚體。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖9中。

製備範例5，hCD80-Fc二聚體：hCD80-Fc之製備

為了產生包含人CD80片段及Fc結構域之融合蛋白，透過ThermoFisher Scientific之Invitrogen GeneArt Gene Synthesis服務合成一個包含核苷酸序列之多核苷酸(序列辨識編號：39)，其從N端依序編碼含有訊息肽(序列辨識編號：1)、CD80片段(序列辨識編號：2)、連接子結合的Ig鉸鏈(序列辨識編號： 3)及Fc結構域(序列辨識編號：4)之融合蛋白，並選殖進入pcDNA3_4載體中。此外，將該載體導入CHO細胞(Expi-CHO^TM)中，用以表現具序列辨識編號：40之融合蛋白。導入該載體後，使該等CHO細胞在37℃、125RPM及8% CO₂之環境中培養7天，之後收集以純化融合蛋白二聚體。將純化的融合蛋白二聚體命名為"hCD80-Fc”。

使用含MabSelect SuRe蛋白A樹脂之層析法進行純化。該融合蛋白在25mM Tris、25mM NaCl及pH 7.4之條件下會結合於其上。之後，用100mM NaCl及100mM乙酸於pH3下進行洗提。在將20% 1M Tris-HCl，pH 9置於收集管中後，收集該融合蛋白。將收集的融合蛋白於PBS緩衝液中透析16個小時進行交換。

之後，使用具TSKgel G3000SWXL管柱(TOSOH Bioscience)之粒徑篩析層析法，測量在280nm波長下隨著時間變化的吸光度，獲得高濃度的融合蛋白。此時，對分離純化的融合蛋白進行在還原(R)或非還原(NR)條件下之SDS-PAGE處理，且用考馬斯藍染色，確定其純度(圖10)。結果確定該融合蛋白形成二聚體。且，使用粒徑篩析層析法分析的結果示於圖11中。

製備範例1，用於培養T細胞的培養組成物

按以下組成製備T細胞培養基。此時，製備以下表1及2中之基本培養基，然後在使用之前，根據於表3中各別的添加條件添加GI-101或hCD80-Fc+Fc-IL-2v。

範例1，根據CD4- PBMC細胞培養測定T細胞的增殖及活性 範例1.1，CD4- PBMC細胞之分離及培養

將人周邊血液單核細胞(PBMC)(Zen-Bio.Inc,Research Triangle Park,NC,USA,Cat# SER-PBMC-200-F)解凍並重新懸浮於5mL表1及2所示的基本培養基中，然後在300xg下離心5分鐘清洗細胞。然後，使用人CD4微珠(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany,Cat# 130-045-101)及磁珠式細胞分離系統從PBMCs中除去CD4+細胞。

將去除CD4+細胞的PBMCs(CD4- PBMC)懸浮於培養溶液中至1×10⁶細胞/mL，將各1mL分配於24孔盤中。之後，於分配有細胞的孔中以1μg/mL的濃度加入抗人CD3抗體(殖珠：OKT3，Biolegend,Cat# 317326)。同時，添加除基本培養基(表1及2)外之各添加物(表3)至1.6nM，之後於37℃及5% CO₂之條件下培養。4天後，於各孔中添加1mL之除基本培養基組份(表1及2)外之含有1.6nM抗人CD3抗體及1.6nM添加物(表3)之細胞培養組成物，在培養第14天收集，計算細胞數及細胞生存力。

具體地，在含有表1之基本培養基的T細胞培養基組成物中，CD4- PBMC細胞的增殖結果示於表4及圖12中，而細胞生存力示於表5及圖13中。此外，在含有表2之基本培養基的T細胞培養基組成物中，CD4- PBMC細胞的增殖結果示於表6及圖14中，而細胞生存力示於表7及圖15中。

範例1.2，透過細胞表面染色之流式細胞分析術分析結果

進行FACS分析法來判定以根據以上範例1.1之基本培養基組份(表1及2)與添加物(表3)培養14天之CD4-(CD4減除)細胞的表型。針對各細胞群，將2×10⁵至3×10⁵細胞分別分配於U底96孔盤中，於各孔中加入100μl FACS緩衝液(PBS、3% FBS、10mM EDTA、20mM HEPES、10μg/mL多黏菌素B、1×抗生素及1mM丙酮酸鈉)，在300×g下離心5分鐘，清洗該細胞。

人TruStain FcX^TM(BioLegend,Cat# 422302)係以含有1X莫能菌素 (monensin)之FACS緩衝予以稀釋至1：200，然後於各孔之細胞沈澱物中加入50μl，接著在4℃下培育10分鐘。在細胞表面分析方面，將2μl以下表8中之抗體與每個50μl FACS緩衝液混合，然後於各孔中分配50μl，接著在4℃下培育20分鐘。然後，於各孔中添加100μl FACS緩衝液，在300 xg下離心5分鐘，清洗細胞。清洗後，將細胞重新懸浮於FACS緩衝液中，之後使用BD FACS Celesta流式細胞儀(BD science,San Jose,Ca,USA)及FLOWJO^TM軟體判定細胞之表型。

因此，在含有表1之基本培養基的T細胞培養基組成物中，根據各添加物處理培養14天的CD4- PBMC細胞以流式細胞分析術進行細胞表面分析的結果(FACS圖)，示於圖16中。此外，T細胞數，具體地T細胞總數、CD8 T細胞數、CD25+ T細胞數及中央記憶T細胞數，如表9及圖17至20所示。

且，在包含表2之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中培養14天的CD4- PBMC細胞以流式細胞分析術進行細胞表面分析的結果(FACS圖)，示於圖21中。此外，T細胞數，具體地T細胞總數、CD8 T細胞數、CD25+ T細胞數及中央記憶T細胞數，如表10及圖22至25所示。

透過範例1.2之細胞表面染色，流式細胞分析術結果顯示，當包含GI-101作為添加物時，不論基礎培養基為何，T細胞總數、CD8 T細胞數、CD25+ T細胞數及中央記憶T細胞數全部均高度增殖。

範例1.3，透過胞內染色之流式細胞分析術

針對各細胞群，將2×10⁵至3×10⁵細胞分別分配於圓底96孔盤中，以其中添加1×細胞刺激雞尾酒(eBioscience,Cat# 00-4970-93)之表1及2中的培養基處理，在37℃下反應4個小時，然後用含有1×莫能菌素(Biolegend,Cat# 420701)之FACS緩衝液清洗。將含人TruStain FCX^TM(BioLegend,Cat# 422302)與1×莫能菌素之FACS緩衝液稀釋至1：200，然後於各細胞群中分配50μl，接著在4℃下培育10分鐘。將每50μl FACS緩衝液(其混合有1×莫能菌素)混合與2μl表8抗體中的細胞表面染色抗體(CD3、CD4及CD8)，且於各孔中分別分配50μl，接著在4℃下培育20分鐘。之後，用其中混合有1×莫能菌素的FACS緩衝液清洗二次。

清洗後，根據製造商的操作手冊，使用BD CYTOFIX/CYTOPERM^TM(BD Biosciences,Cat# 554714)，將細胞製作成可固定及可通透的。將每個50μl的1×BD PERM/WASH^TM(BD Biosciences,Cat# 554723)混合與2μl表8中之胞內染色抗體(穿孔素、顆粒酶B及IFN-γ)，然後分別於各孔中分配50μl，接著在4℃下培育20分鐘。然後，用1×BD PERM/WASH^TM緩衝液清洗細胞一次，用FACS緩衝液清洗二次。將清洗好的細胞重新懸浮於FACS緩衝液中，然後使用BD FACS Celesta流式細胞分析儀分選，使用FLOWJO^TM軟體分析結果。

因此，在包含表1之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中培養的CD4- PBMC細胞之胞內流式細胞分析術結果示於圖26中。此外，在包含表1之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中，表現顆粒酶B、IFN-γ及穿孔素的CTL細胞數之測定結果如表11及圖27至29所示。

且，在包含表2之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中培養的CD4- PBMC細胞之胞內流式細胞分析術結果(FACS圖)，示於圖30中。此外，在包含表2之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中，表現顆粒酶B、IFN-γ及穿孔素的CTL細胞數之測定結果如表12及圖31至33所示。

範例2，根據CD8+ T細胞培養測定T細胞的增殖以及活性 範例2.1，CD8+ T細胞之分離及培養

將人周邊血液單核細胞(PBMC)(Zen-Bio.Inc,Research Triangle Park,NC,USA,Cat# SER-PBMC-200-F)解凍並重新懸浮於5mL基本培養基(表1 及2中)中，然後在300xg下離心5分鐘，清洗細胞。然後，使用人CD8微珠(MiltenyiBiotec,BergischGladbach,Germany Cat# 130-045-201)及磁珠式細胞分離系統從PBMCs中獲得CD8+細胞。

將分離的CD8+ T細胞懸浮於培養溶液中至1×10⁶細胞s/mL，於24孔盤中各分配1mL。之後，於分配有各別細胞的各孔中以1μg/mL的濃度加入抗人CD3抗體(殖珠：OKT3，Biolegend,Cat# 317326)。同時，分別添加基本培養基(表1及2)及1.6nM的添加物(表3，GI-101及hCD80-Fc與Fc-IL2變異體同時處理)，之後於37℃及5% CO₂之條件下培養。培養第4天，於各孔中添加1mL細胞培養組成物，其包括含有抗人CD3抗體、1.6nM添加物(表3，GI-101及hCD80-Fc與Fc-IL2變異體同時處理)之以及該等培養基的基本組份(表1及2)，在培養第12天予以收集，計算細胞數及細胞生存力。

具體地，在含有表1之基本培養基的T細胞培養基組成物中，CD8+ PBMC細胞增殖的結果示於表13及圖34中，而細胞生存力示於表14及圖35中。

範例2.2，透過細胞表面染色之流式細胞分析術分析結果

進行FACS分析，以判定在根據以上範例2.1之含有表1之基本培養基及表3之添加物的組成物中培養12天的CD8+(CD8分離)細胞之表型。針對各細胞群，分別將2×10⁵至3×10⁵細胞分配於U底96孔盤中，加入100μl FACS緩衝液 (PBS、3% FBS、10mM EDTA、20mM HEPES、10μg/mL多黏菌素B、1×抗生素及1mM丙酮酸鈉)，在300×g下離心5分鐘，清洗該細胞。

將人TruStain FCX^TM(BioLegend,Cat# 422302)以1：200稀釋於FACS緩衝液中，然後加入50μl至具細胞沈澱物之各孔中，接著在4℃下培育10分鐘。在細胞表面分析方面，將每50μl FACS緩衝液混合與2μl以上表8中之抗體，然後於各孔中各分配50μl，接著在4℃下培育20分鐘。然後，於各孔中添加100μl FACS緩衝液，在300 xg下離心5分鐘以清洗細胞。清洗後，將細胞重新懸浮於FACS緩衝液中，之後使用BD FACS Celesta流式細胞儀(BD science,San Jose,Ca,USA)及FLOWJO^TM軟體判定細胞之表型。

因此，在含有表1之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞以流式細胞分析術進行細胞表面分析的結果(FACS圖)係顯示於圖36中。此外，T細胞數、CD8 T細胞數、CD25+ T細胞數及中央記憶T細胞數，如表15及圖37至40所示。

範例2.3，透過胞內染色之流式細胞分析術分析結果

針對各細胞群，分別將2×10⁵至3×10⁵細胞分配於圓底96孔盤中，與其中添加1×細胞刺激雞尾酒(eBioscience,Cat# 00-4970-93)之表1及2中的培養基，在37℃下反應4個小時，然後用含有1×莫能菌素(Biolegend,Cat# 420701)之FACS緩衝液清洗。將含人TruStain FCX^TM(BioLegend,Cat# 422302)與1×莫能菌素之FACS緩衝液稀釋至1：200，然後分別於各細胞群中分配50μl，接著在4℃下培育10分鐘。將每50μl FACS緩衝液(其混合與1×莫能菌素)混合與2μl表8抗體中之細胞表面染色抗體(CD3、CD4及CD8)，且分別於各孔中分配50μl，接著在4℃下培育20分鐘。之後，用其中混合與1×莫能菌素的FACS緩衝液清洗二次。

清洗後，根據製造商的操作手冊，使用BD CYTOFIX/CYTOPERM^TM(BD Biosciences,Cat# 554714)，將細胞製作成可固定及可通透的。將每50μl的1×BD PERM/WASH^TM(BD Biosciences,Cat# 554723)混合與2μl表8中之胞內染色抗體(穿孔素、顆粒酶B及IFN-γ)，然後於各孔中各分配50μl，接著在4℃下培育20分鐘。然後，用1×BD PERM/WASH^TM緩衝液清洗細胞一次，用FACS緩衝液清洗二次。將清洗好的細胞重新懸浮於FACS緩衝液中，然後使用BD FACS Celesta流式細胞分析儀分選，使用FLOWJO^TM軟體分析結果。

因此，在包含表1之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中培養12天的CD8+ PBMC細胞之胞內流式細胞分析術結果，示於圖41中。此外，在包含表1之基本培養基且經各添加物處理的T細胞培養基組成物中，表現顆粒酶B、IFN-γ及穿孔素的CTL細胞數之測定結果如表16及圖42至44所示。

範例3，經過GI101處理之Her2辨識性T細胞之癌細胞殺傷作用的確認 範例3.1，T細胞之活化

將於以上範例1中獲得的CD4-缺乏(CD4-)PBMC細胞懸浮於T細胞培養基之基本組份(表1)中至使用細胞計數器計數得1×10⁶細胞/mL，之後將各10mL種入T75培養瓶中。之後，將1μg/mL至10μg/mL之Her2蛋白(Acro,Cat# HE2-H5225-1mg)接種至其中種有該細胞之培養基中，在37℃、5% CO₂下培養2小時。

範例3.2，活化的T細胞之重新刺激

於範例3.1中以Her2蛋白(Acro,Cat# HE2-H5225-1mg)培養2小時之細胞中，同時加入50nM除表1之基本組份外之添加物(GI-101及普留淨)(Proleukin,Novartis,USA)及0.1μg/mL至1μg/mL OKT3(Biolegend)，培養7天。

通過共培養Her2蛋白(Acro,Cat# HE2-H5225-1mg)-以範例3.1中所述相同方法活化之接種T細胞，重新刺激培養7天的細胞，培養第4天至比率1：1。此時，不容許細胞之飽和程度超過1×10⁶細胞/mL。

範例3.3，活化的T細胞之癌細胞殺傷作用的分析

為了測定所培養之活化的T細胞之癌細胞殺傷作用，將從範3.2獲得的細胞共培養與二種癌細胞CAMA-1(ATCC® HTB-21^TM；乳癌細胞株)；BT-474(ATCC® HTB-20^TM；乳癌細胞株)，以各種比率(1：1、5：1及10：1)進行24小時。使用Annexin-V及7-AAD對細胞染色，利用流式細胞分析術評估癌細胞殺傷作用。

具體地，將二種癌細胞懸浮於T細胞培養基之基本組份(表1)中至1×10⁶細胞/mL，之後種在圓底96孔盤中。將從範例3.2中獲得之活化的T細胞懸浮於T細胞培養基之基本組份(表1)中，然後種在96孔盤中，如此與癌細胞之比例(E：T)為1：1、5：1或10：1，接著在37℃及5% CO₂條件下共培養24小時。共培養24小時後，將該細胞在1,300rpm下離心5分鐘，去除上清液。

將100μl預熱的0.25%胰蛋白酶加至各含有共培養細胞之孔中，在37℃下培養5分鐘。用FACS緩衝液清洗分離的細胞，並使用含7-AAD之FITC Annexin-V凋亡檢測套組，根據製造商的操作手冊，以抗人CD45抗體(殖株HI30,eBioscience,Cat# 25-0459-42)染色，接著用Annexin-V及7-AAD(BioLegend,USA,Cat# 640922)染色。在染色方面，使細胞在4℃下培育20分鐘，於各個中添加100μl FACS緩衝液，在300 xg下離心5分鐘，清洗細胞。然後，將細胞重新懸浮於FACS緩衝液中，然後使用BD FACS Celesta流式細胞儀(BD science,San Jose,Ca,USA)及FLOWJO^TM軟體測定癌細胞殺傷作用。

癌細胞殺傷作用的測定結果示於圖45與46中。

<110> 南韓商GI細胞股份有限公司(GI CELL,INC.)

<120> 用於培養T細胞之組成物及使用其來培養T細胞的方法

<140> 109140811

<141> 2020-11-20

<150> KR 10-2019-0149779

<151> 2019-11-20

<160> 46

<170> KopatentIn 3.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 訊息肽(TPA)

<400> 1

<210> 2

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hB7-1：35-242

<400> 2

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具連接子之鉸鏈

<400> 3

<210> 4

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 免疫球蛋白fc

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 5

<210> 6

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL-2M

<400> 6

<210> 7

<211> 617

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 含有IL-2之變異體與CD80之片段的融合蛋白

<400> 7

<210> 8

<211> 1857

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI101)之核苷酸

<400> 8

<210> 9

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI101)

<400> 9

<210> 10

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL-2

<400> 10

<210> 11

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80

<400> 11

<210> 12

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修飾的Fc

<400> 12

<210> 13

<211> 306

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mCD80

<400> 13

<210> 14

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(mGI101)之核苷酸

<400> 14

<210> 15

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(mGI101)

<400> 15

<210> 16

<211> 1437

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI101C1)之核苷酸

<400> 16

<210> 17

<211> 454

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI101C1)

<400> 17

<210> 18

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI101C2)之核苷酸

<400> 18

<210> 19

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI101C2)

<400> 19

<210> 20

<211> 1434

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(mGI101C1)之核苷酸

<400> 20

<210> 21

<211> 478

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(mGI101C1)

<400> 21

<210> 22

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-2變異體(3M,M45)

<400> 22

<210> 23

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-2變異體(3M,M61)

<400> 23

<210> 24

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-2變異體(3M,M72)

<400> 24

<210> 25

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI102-M45)之核苷酸

<400> 25

<210> 26

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI102-M45)

<400> 26

<210> 27

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI102-M61)之核苷酸

<400> 27

<210> 28

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI102-M61)

<400> 28

<210> 29

<211> 1857

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI102-M72)之核苷酸

<400> 29

<210> 30

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI102-M72)

<400> 30

<210> 31

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(GI101w)之核苷酸

<400> 31

<210> 32

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(GI101w)

<400> 32

<210> 33

<211> 1848

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(mGI102-M61)之核苷酸

<400> 33

<210> 34

<211> 616

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白(mGI102-M61)

<400> 34

<210> 35

<211> 153

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 野生型hIL-2

<400> 35

<210> 36

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具訊息序列之IL-2

<400> 36

<210> 37

<211> 474

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼具訊息序列之IL-2之核苷酸序列

<400> 37

<210> 38

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 38

<210> 39

<211> 1461

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼CD80-Fc蛋白之核苷酸

<400> 39

<210> 40

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80-Fc蛋白

<400> 40

<210> 41

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼融合蛋白(hCD80-Fc-IL2wt)之核苷酸

<400> 41

<210> 42

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc-IL2wt

<400> 42

<210> 43

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc-IL2wt

<400> 43

<210> 44

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc-IL2v2

<400> 44

<210> 45

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 編碼Fc-IL2v2之核苷酸

<400> 45

<210> 46

<211> 592

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD80-Fc-IL2wt

<400> 46

Claims

一種組成物用途，用於在活體外增殖T細胞，該組成物包含作為一活性成份之一融合蛋白二聚體，該融合蛋白二聚體包含一IL-2變異體與一CD80蛋白或其片段，其中該IL-2變異體包含在序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第42個胺基酸之取代，其中該CD80蛋白之片段包含CD80之胞外結構域，其中該T細胞為CD8+CD45RO+記憶T細胞。
如請求項1之組成物用途，其中該CD8+CD45RO+記憶T細胞為CD8+CD25+CD45RO+記憶T細胞、或CD8+CD62L+CD45RO+記憶T細胞。
如請求項1之組成物用途，其中該融合蛋白二聚體包含下列結構式(I)或(II)：N'-X-[連接子(1)]_n-Fc結構域-[連接子(2)]_m-Y-C' 式(I) N'-Y-[連接子(1)]_n-Fc結構域-[連接子(2)]_m-X-C' 式(II)N'是所述融合蛋白的N端，C'是所述融合蛋白的C端，X是CD80蛋白或其片段，Y是IL-2變異體，連接子(1)及(2)是胜肽連接子，及n及m各獨立地為0或1。
如請求項1之組成物用途，其中該CD80蛋白具有序列辨識編號：11之胺基酸序列。
如請求項1之組成物用途，其中該融合蛋白二聚體中之一融合蛋白具有序列辨識編號：9之胺基酸序列。
一種培養基用途，用於在活體外增殖T細胞，該培養基包含一融合蛋白二聚體，該融合蛋白二聚體包含一IL-2變異體與一CD80蛋白或其片段，其中該IL-2變異體包含在序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第42個胺基酸之取代，其中該CD80蛋白之片段包含CD80之胞外結構域，其中該T細胞為CD8+CD45RO+記憶T細胞。
如請求項6之培養基用途，其進一步包含一用於培養T細胞之培養基。
如請求項7之培養基用途，其中該用於培養T細胞之培養基包含一胺基酸、一糖、一無機鹽及一維生素。
一種用於培養T細胞之方法，其包含：在一包含一融合蛋白二聚體的培養基中培養CD8+ T細胞，該融合蛋白二聚體包含一IL-2變異體與一CD80蛋白或其片段，其中該IL-2變異體包含在序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第42個胺基酸之取代，其中該CD80蛋白之片段包含CD80之胞外結構域，其中該T細胞為CD8+CD45RO+記憶T細胞。
如請求項9之方法，其中該CD8+ T細胞是從周邊血液單核細胞(PBMCs)獲得。
如請求項9之方法，其中該培養係進行歷時7至21天。
如請求項9之方法，其中該CD8+CD45RO+記憶T細胞為CD8+CD25+CD45RO+記憶T細胞、或CD8+CD62L+CD45RO+記憶T細胞。
一種組成物用途，用於在活體外提高T細胞之抗原辨識效率，該組成物包含作為一活性成分之一融合蛋白二聚體，該融合蛋白二聚體包含一 IL-2變異體與一CD80蛋白或其片段，其中該IL-2變異體包含在序列辨識編號：10之胺基酸序列中第38個及第42個胺基酸之取代，其中該CD80蛋白之片段包含CD80之胞外結構域，其中該T細胞為CD8+CD45RO+記憶T細胞。