KR102351020B1 - 자연살해세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 제조방법 - Google Patents

자연살해세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물은 자연살해세포의 증식을 촉진시키며, CD16, NKp46 발현을 유도하고, 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현 및 분비를 증가시켜 항암면역 기능이 우수한 자연살해세포의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자연살해세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 제조방법{COMPOSITION FOR CULTURING NATURAL KILLER CELL AND METHOD FOR PRODUCING NATURAL KILLER CELL USING THE SAME}
본 발명은 자연살해세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 자연살해세포 제조방법에 관한 것이다.
암을 치료하기 위해 외과적인 수술, 방사선 치료, 화학요법 등의 다양한 치료법이 개발되어 왔으나, 여러 부작용이 보고되면서 최근 환자의 면역기능을 이용한 면역치료법이 개발되고 있다. 특히, 대량 생산 및 동결이 가능한 자연살해세포를 이용한 면역치료법이 연구되고 있다.
구체적으로, 자연살해세포는 림프구의 일종으로 체내 골수, 비장, 말초 림프절 및 말초 혈액에 분포하며, 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocyte)의 약 10% 정도를 차지하며, 선천성 면역반응에 중요한 역할을 한다(Ann Rev Immunol., 24: 257-286, 2006). 또한, 자연살해세포는 CD56 및 CD16이 양성이나, CD3에는 음성을 나타낸다. 자연살해세포가 세포를 살해하는 방법은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme)을 포함하는 세포질 과립의 배출을 통해 이루어진다. 자연살해세포는 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF 및 IL-10 등 다양한 사이토카인을 분비한다.
또한, 자연살해세포는 세포 표면에 여러 수용체를 발현하는데 이들 수용체는 세포 흡착, 세포 살해능력의 활성화, 또는 세포 살해능력의 억제에 관여한다. 하지만, 정상인의 체내에 존재하는 대부분의 자연살해세포는 비활성화 상태로 존재한다. 따라서, 암을 제거하기 위해서는 활성화된 자연살해세포가 필요하다. 또한, 암환자의 체내에 존재하는 자연살해세포의 경우, 암세포의 면역회피 기전에 의해 자연살해세포의 기능적 결함이 존재한다. 따라서, 자연살해세포를 치료제로서 이용하기 위해서는 자연살해세포를 활성화시키는 것이 매우 중요하다. 또한, 체내에 존재하는 자연살해세포의 세포수는 한정되어 있으므로, 정상인의 혈액 또는 환자의 혈액의 자연살해세포를 대량으로 증식시키고 동결하는 기술의 개발이 필수적이다.
한편, IL-2는 T 세포 성장 인자(T-cell growth factors, TCGF)로도 불리며, 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 하는 구형의 당단백질이다. IL-2의 단백질 크기는 15.5 kDa 내지 16 kDa이며, 133개 아미노산으로 이루어져 있다. IL-2는 개별적 3개의 서브유닛으로 구성된 IL-2 수용체에 결합함으로써 각종 면역 작용을 매개한다.
또한, CD80은 B7-1로 알려져 있으며, 리간드와 결합하여 공동자극 반응(costimulatory responses) 및 공동억제 반응(coinhibitory responses)을 전달하여 면역 조절에 관여하는 막 단백질(membrane-bound proteins) 중 B7 패밀리의 하나이다. CD80은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 단핵구(monocyte)의 표면에 발현하는 막관통 단백질이다. CD80은 CD28, CTLA4(CD152) 및 PD-L1에 결합하는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 자연살해세포가 항암 치료에 중요하다는 점은 많이 알려져 있지만, 이를 효과적으로 사용하기 위하여 증폭시킬 수 있는 구체적인 방법은 아직까지 부족한 상황이다.
Annu Rev Immunol., 24: 257-286, 2006
이에 본 발명자들은, 활성화된 자연살해세포를 대량으로 제조하기 위해 연구한 결과, IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체를 이용하여 자연살해세포를 제조하였다. 또한, 이와 같이 제조한 자연살해세포의 활성이 증가하고, 우수한 항암효과를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적 달성을 위해, 본 발명의 일 측면은, IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, i) PBMC(peripheral blood mononuclear cell)로부터 CD3를 발현하지 않는 세포를 분리하는 단계; ii) 상기에서 분리된 CD3를 발현하지 않는 세포로부터 CD56을 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및 iii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) PBMC로부터 CD3를 발현하지 않는 세포를 분리하는 단계; 및 ii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, i) PBMC로부터 CD56을 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및 ii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 PBMC를 배양하는 단계를 포함하는 PBMC 내 자연살해세포의 활성을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 PBMC 내 자연살해세포의 활성을 촉진시키는 방법으로 제조된 PBMC를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 PBMC를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물은 자연살해세포의 증식을 촉진시키며, CD16, NKp46 발현을 유도하고, 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현 및 분비를 증가시켜 항암면역 기능이 우수한 자연살해세포의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a은 본 발명에서 사용된 융합단백질 이량체의 모식도를 나타낸 것이다.
도 1b는 수득한 융합단백질 이량체(GI-101)를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 1c는 흡광도에 따른 융합단백질 이량체(GI-101)의 함량을 나타낸 것이다.
도 1d는 수득한 융합단백질 이량체(GI-101)를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 2a는 수득한 hCD80-Fc 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 2b는 수득한 hCD80-Fc 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 3a는 수득한 Fc-IL2v2 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 3b는 수득한 Fc-IL2v2 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 3c는 수득한 Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 3d는 수득한 Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 4a는 수득한 hCD80-Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE로 확인한 것이다.
도 4b는 수득한 hCD80-Fc-IL2wt 융합단백질 이량체를 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석한 것이다.
도 5a 및 도 5b는 AIM-V(5%SR) 조건에서 배양시 NK 세포수를 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 AIM-V(5%SR) 조건에서 배양시 NK 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 AIM-V(5%hABS) 조건에서 배양시 NK 세포수를 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 AIM-V(5%hABS) 조건에서 배양시 NK 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 9a 및 도 9b는 X-vivo(5%hABS) 조건에서 배양시 NK 세포수를 나타낸 것이다.
도 10a 및 도 10b는 X-vivo(5%hABS) 조건에서 배양시 NK 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 11a 및 도 11b는 NK MACS(5% hABS) 조건에서 배양시 NK 세포수를 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 NK MACS(5% hABS) 조건에서 배양시 NK 세포의 생존율을 나타낸 것이다.
도 13은 AIM-V(5%SR) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 순도를 확인한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 AIM-V(5% hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 순도를 확인한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 X-vivo15(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 순도를 확인한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 NK MACS(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 순도를 확인한 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 AIM-V(5%SR) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 활성 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 AIM-V(5%SR) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 저해 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 AIM-V(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 활성 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 AIM-V(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 저해 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 X-vivo(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 활성 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 X-vivo(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 저해 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 NK MACS(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 활성 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 NK MACS(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 저해 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 AIM-V(5%SR) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 세포살해(cytotoxicity) 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 AIM-V(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 세포살해(cytotoxicity) 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 X-vivo15(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 세포살해 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 NK MACS(5%hABS) 배지 포함 조성물로부터 배양된 자연살해세포의 세포살해 마커에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 AIM-V(5%hABS) 배지에 GI-101(50 nM), GI-101_wt(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2wt(50 nM)를 포함하는 조성물로부터 21일간 배양된 자연살해세포의 탈과립능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 AIM-V(5%hABS) 배지에 GI-101(50 nM), GI-101_wt(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2wt(50 nM)를 포함하는 조성물로부터 21일간 배양된 자연살해세포에 의한 암세포 사멸효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 X-vivo15(5%hABS) 배지에 GI-101(50 nM), GI-101_wt(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2wt(50 nM)를 포함하는 조성물로부터 21일간 배양된 자연살해세포의 탈과립능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 X-vivo15(5%hABS) 배지에 GI-101(50 nM), GI-101_wt(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2wt(50 nM)를 포함하는 조성물로부터 21일간 배양된 자연살해세포에 의한 암세포 사멸효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 NK MACS(5%hABS) 배지에 GI-101(50 nM), GI-101_wt(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2wt(50 nM)를 포함하는 조성물로부터 21일간 배양된 자연살해세포의 탈과립능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 NK MACS(5%hABS) 배지에 GI-101(50 nM), GI-101_wt(50 nM), CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2v2(50 nM) 또는 CD80-Fc(50 nM)+Fc-IL2wt(50 nM)를 포함하는 조성물로부터 21일간 배양된 자연살해세포에 의한 암세포 사멸효과를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
NK 세포 증식용 조성물 및 배지
본 발명의 일 측면은, IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 조성물을 제공한다. 또한, 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 배양용 배지를 제공한다.
상기 자연살해세포 배양용 조성물은 배지, 혈청, 보충제 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 NK 세포 배양용 배지는 세포 배양용 배지에 상기 IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체가 첨가된 배지일 수 있다. 이때, 상기 세포 배양용 배지는 아미노산(amino acids), 당류(sugars), 무기염(inorganic salts) 및 비타민으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 세포 배양용 배지는 아미노산, 당류, 무기염 및 비타민을 모두 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예로는 상기 NK 세포 배양용 배지는 하기 표 1 내지는 표 4의 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포 배양용 배지"는 세포를 배양하기 위해 사용된 배지를 의미하며, 구체적으로 NK 세포, 보다 구체적으로 CD3-CD56+ 세포를 배양하기 위한 배지를 의미한다. 시험관 내에서(in vitro) 세포 성장 및 생존을 위해 세포가 필요로 하는 성분을 함유하거나, 세포 성장 및 생존을 돕는 성분을 함유한다. 구체적으로, 상기 성분은 비타민, 필수 또는 비필수 아미노산, 및 미량 원소일 수 있다. 상기 배지는 세포, 바람직하게는 진핵세포, 더 바람직하게는 NK 세포 배양에 사용되는 배지일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 세포배양배지는 아미노산 성분, 비타민 성분, 무기염 성분, 기타 성분 및 정제수로 구성되며,
a) 상기 아미노산 성분은 글리신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-트레오닌, L-세린, L-시스테인, L-메티오닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-글루탐산, L-글루타민, L-리신, L-아르기닌, L-히스티딘, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, L-프롤린, β-알라닌, 膨-아미노부티르산, 오르니틴, 시트룰린, 호모세린, 트리요드티로신, 티록신 및 디옥시페닐알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 글리신, L-알라닌, L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, L-히스티딘, L-라이신, L-메티오닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌 및 L-발린으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 또는 이의 조합이며,
b) 상기 비타민 성분은 바이오틴, D-판토텐산칼슘, 엽산, 나이아신아미드, 피리독신 하이드로클로라이드, 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, 염화콜린, i-이노시톨 및 아스코르브산으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 비타민 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, i-이노시톨, 티아민 하이드로클로라이드, 나이아신아마이드 및 피리독신 하이드로클로라이드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 비타민 또는 이의 조합이며,
c) 상기 무기염 성분은 염화칼슘(CaCl2)(무수), 황산동 펜타하이드레이트(CuSO4-5H2O), 황산제이철 헵타하이드레이트(FeSO4-7H2O), 염화마그네슘(무수), 황산마그네슘(MgSO4)(무수), 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 인산수소이나트륨(Na2HPO4), 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O), 황산아연 헵타하이드레이트(ZnSO4-7H2O), 질산제이철 노나하이드레이트(Fe(NO3)3·9H2O) 및 탄산수소나트륨(NaHCO3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 무기염 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 염화나트륨(NaCl), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(CaCl2)(무수) 및 인산수소나트륨 모노하이드레이트(NaH2PO4-H2O)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 무기염 또는 이의 조합이며,
d) 상기 기타 성분은 D-글루코즈 (덱스트로즈), 소듐 피루베이트, 히포크산틴 Na, 티미딘, 리놀레산, 리포산, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘, 2'-데옥시아데노신, 2'-데옥시시티딘 HCl 및 2'-데옥시구아노신으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 기타 성분 또는 이의 조합이고, 바람직하게는, 소듐 피루베이트일 수 있다.
e) 정제수는 상기 아미노산, 비타민, 무기염 및 기타 성분을 용해시키기 위해 사용되며, 1차 이상의 증류를 거쳐 수득되거나, 필터를 통해 정제된 물일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 세포배양배지에 성장인자 또는 사이토카인을 더 포함할 수 있다. 상기 성장인자로 IGF, bFGF, TGF, HGF, EGF, VEGF 또는 PDGF 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 사이토카인으로 IL-1, IL-4, IL-6, IFN-γ, IL-10, IL-15, IL-17 또는 IL-21 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 상기 세포배양배지에 자연살해세포 활성용 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 활성용 항체로써 항 CD3 항체, 항 CD2 항체, 항 CD335 항체 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 자연살해세포 활성용 항체가 결합된 비드를 포함할 수 있다. 또한 상기 자연살해세포 활성용 항체 또는 가변영역 단편을 2종 이상 포함하는 융합단백질을 사용할 수 있다.
특히, 상기 NK 배양용 배지는 IL-15, IL-21 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 IL-15 및 IL-21은 인터루킨(Interleukin, IL)의 한 종류로서, 림프구나 단핵구 및 대식세포 등 면역담당세포가 생산하는 단백질성 생물 활성물질을 의미한다. 상기 IL-15 및 IL-21는 자연살해세포를 증식을 촉진시켜 단핵세포를 원료세포로 사용하여 자연살해세포를 배양하는 경우에 사용할 수 있으나, 이들 만을 단독 또는 혼합하여 사용할 경우, 증식률 및 순도가 낮은 문제가 있다(Biossel L. et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 14, 1031-1038, 2008).
구체적으로, 상기 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), EDM(Endothelial differentiation medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, a-MEM(a-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, AIM-V Medium, X-vivo™ 15 Medium, NK MACS Medium과 같은 통상의 동물세포 배양용 배지를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 배지로서 AIM-V Medium, X-vivo™ 15 Medium 및 NK MACS Medium을 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혈청"이란, 혈액이 완전 응고된 후 혈액으로부터 유리된 투명한 상층액을 의미한다. 또한, 동물세포의 배양에는 합성배지에 혈청을 필수적으로 첨가해야 하며, 소나 말, 인간의 혈청을 사용하는 것이 일반적이다. 소 유래 혈청의 경우, 채혈시기에 따라 소의 태자혈청(fetal bovine serum; FBS), 소의 신생자혈청(newborn bovine serum), 새끼소혈청(calf serum), 어미소혈청(bovine serum) 등을 사용할 수 있다. 인간 유래 혈청의 경우, 혈액형이 AB형인 공여자의 인간 혈청을 사용하며, A 및 B 혈액형 항원에 대한 항체가 없어 면역 반응성을 최소화할 수 있는 인간 AB 혈청(Human AB serum)을 사용할 수 있다. 또한 상기 "혈청"의 대채제로써 CTS Immune Cell SR 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간 AB 혈청 또는 CTS Immune Cell SR을 사용하였다.
상기 보충제는 세포 배양시 안정성과 세포 활성을 개선하기 위해, L-Glutamine 대체제인 GlutaMAX(Gibco®)를 사용할 수 있다. 또한, 상기 보충제는 NK MACS supplement(Miltenyi Biotec, 130-113-102)일 수 있다.
IL-2 단백질 및 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 이량체
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 의미한다. 상기 IL-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-2는 야생형 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서는 IL-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-2 단백질" 혹은 "IL-2 폴리펩티드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-2, IL-2 단백질, IL-2 폴리펩티드, 및 IL-2 변이체는 예를 들어 IL-2 수용체(receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 IL-2의 일 구체예는 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 이때, 상기 IL-2는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-2는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 IL-2는 야생형 IL-2의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함하는 개념으로 이용될 수 있다.
또한, 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 N 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다. 또한 상기 IL-2의 단편은 서열번호 35 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 C 말단으로부터 연속적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 아미노산이 결실된 형태일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2 변이체"는 전장(full-length) IL-2 또는 상술한 IL-2의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-2 변이체는 야생형 IL-2 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-2 활성"은 예를 들어 IL-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 이 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 IL-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 또는 72번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 뿐만 아니라, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 N 말단의 일 부분이 결실된 형태일 경우, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 예를 들어, IL-2가 서열번호 35의 아미노산을 서열을 가질 경우에, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 35의 아미노산 서열에서 58번째, 62번째, 65번째, 81번째 또는 92번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이들은 각각 서열번호 10의 아미노산 서열의 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 잔기에 각각 해당한다. 일 구체예에 따르면, IL-2 활성이 유지되는 한, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 혹은 10개의 아미노산이 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 1개에서 5개까지의 아미노산이 치환될 수 있다.
일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번재, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 다섯 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째, 42번재, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 모두 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환에 의해 도입되는 "다른 아미노산"은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(Asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 단, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 상기 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째는 아르기닌으로 치환될 수 없으며, 42번째는 페닐알라닌으로 치환될 수 없고, 45번째는 티로신으로 치환될 수 없으며, 61번째는 글루탐산으로 치환될 수 없고, 72번째는 루신으로 치환될 수 없다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 아르기닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 알라닌으로 치환(R38A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 페닐알라닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 알라닌으로 치환(F42A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 티로신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 알라닌으로 치환(Y45A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 글루탐산을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 아르기닌으로 치환(E61A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 10의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 글리신으로 치환(L72G)될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데, 세 군데, 네 군데 또는 다섯 군데의 위치에서 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 F42A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 일 구체예는 서열번호 10의 아미노산 서열에서 하기 (a) 내지 (d) 조합 중 선택되는 어느 하나의 조합의 치환이 일어난 것일 수 있다:
(a) R38A/F42A
(b) R38A/F42A/Y45A
(c) R38A/F42A/E61R
(d) R38A/F42A/L72G
이때, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 경우, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치에 아미노산 치환을 가질 수 있다. 또한, IL-2가 서열번호 35의 아미노산 서열의 단편인 경우에도, 서열번호 10과 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 6, 22, 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 생체 내에서 낮은 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합하여 유발되는 부작용일 수 있다. 상기 IL-2와 IL-2Rα 결합에 의한 부작용을 개선시키기 위해서 다양한 IL-2 변이체가 개발되었으며, 이러한 IL-2 변이체는 미국특허 제5,229,109호 및 대한민국특허 제10-1667096호에 개시된 것들을 사용할 수 있다. 특히, 본 출원에서 기술되는 IL-2의 변이체는 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합력이 낮아 생체내 독성이 야생형 IL-2에 비해 낮다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80"은 "B7-1"로도 불리며, 수지상세포, 활성화된 B세포 및 단핵구에 존재하는 막단백질이다. CD80은 T 세포의 활성화와 생존에 필수적인 공자극 신호를 제공한다. CD80은 T 세포 표면에 존재하는 서로 다른 두 단백질인 CD28 및 CTLA-4에 대한 리간드로 알려져 있다. CD80은 288개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 구체적으로 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 "CD80 단백질"은 전장 CD80 또는 CD80 단편을 의미한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD80 단편"이란, CD80의 절단형을 의미한다. 또한, 상기 CD80 단편은 CD80의 세포외도메인일 수 있다. CD80 단편의 일 구체예로는 CD80의 신호서열인 N-말단으로부터 1번째 내지 34번째의 아미노산이 제외된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 288번째의 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 232번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 35번째 내지 139번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 또한, 상기 CD80 단편의 일 구체예는 서열번호 11의 142번째 내지 242번째 아미노산으로 구성된 단백질일 수 있다. 상기 일 실시예로 CD80 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질은 링커 혹은 캐리어(carrier)에 의해 결합된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 상기 CD80(B7-1) 또는 이의 단편은 링커 혹은 캐리어에 의해 결합된 것일 수 있다. 본 명세서에서 링커와 캐리어는 호환적으로 사용되기도 한다.
상기 링커는 두 개의 단백질을 연결시켜준다. 링커의 일 구체예로는 1개 내지 50개의 아미노산, 알부민 또는 이의 단편, 또는 면역글로불린의 Fc 도메인 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CH1)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4일 수 있다. 이때, 야생형 면역글로불린 G4의 Fc 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인 뿐만 아니라, Fc 도메인 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 도메인 변이체"는 야생형 Fc 도메인의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 도메인에 비해 증가된 당쇄, 야생형 Fc 도메인에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된(deglycosylated) 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 도메인도 포함된다. Fc 도메인 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 함량이 조절된 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 도메인의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 면역글로불린은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 도메인 변이체는 상기 Fc 도메인의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 상기 Fc 도메인 변이체의 일 구체예로는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
융합단백질은 Fc 도메인을 링커(혹은 캐리어)로 하여 이의 N-말단과 C-말단에 각각 CD80과 IL-2 단백질이 연결되거나 혹은 IL-2와 CD80이 연결된 구조를 가질 수 있다(도 1a). Fc 도메인의 N-말단 혹은 C-말단과 CD-80 혹은 IL-2의 연결은 임의적으로 링커 펩타이드에 의해 이루어질 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I) 또는 (II)로 이루어진 것일 수 있다:
N'-X-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-Y-C' (I)
N'-Y-[링커(1)]n-Fc 도메인-[링커(2)]m-X-C' (II)
이때, 상기 구조식 (I) 및 (II)에 있어서,
상기 N'은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C'는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 X는 CD80 단백질이고,
상기 Y는 IL-2 단백질이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 n 및 m은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
바람직하게는, 상기 융합단백질은 구조식 (I)로 이루어진 것일 수 있다. 상기 IL-2 단백질은 상술한 바와 같다. 또한, 상기 CD80 단백질은 상술한 바와 같다. 일 구체예에 따르면, IL-2 단백질은 야생형 IL-2와 비교하여 하나에서 다섯개까지의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체일 수 있다. CD80 단백질은 야생형 CD80의 N-말단 혹은 C-말단으로부터 연속적으로 약 34개까지의 아미노산 잔기가 결실된(truncated) 단편일 수 있다. 혹은 CD80 단백질은 T-세포 표면 수용체(T cell surface receptors) CTLA-4와 CD28에 결합하는 활성을 갖는 세포외 면역글로불린-유사 도메인일 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 융합단백질은 서열번호 9, 26, 28 또는 30의 아미노산 서열에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 혹은 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이때, 동일성은, 예를 들어, 퍼센트 상동성, NCBI(National Center of Biotechnology Information)의 BlastN software와 같은 상동성 비교 소프트웨어를 통해 결정될 수 있다.
상기 CD80 단백질과 Fc 도메인의 사이에는 펩타이드 링커(1)가 포함될 수 있다. 상기 펩타이드 링커(1)은 5 내지 80개의 연속된 아미노산, 20 내지 60개의 연속된 아미노산, 또는 25 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 30 내지 40개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 펩타이드 링커(1)은 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 한 개, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수) 일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)가 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 IL-2 단백질 및 상기 CD80 단백질을 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다. 상기 IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다. 상기 이량체를 구성하는 융합단백질의 일 실시예는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다.
NK 세포 배양 방법 1
본 발명의 다른 측면은, i) PBMC(peripheral blood mononuclear cell)로부터 CD3를 발현하지 않는 세포를 분리하는 단계; ii) 상기 단계에서 분리된 CD3를 발현하지 않는 세포로부터 CD56을 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및 iii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "PBMC"란, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)를 의미한다. 상기 PBMC는 림프구(T세포, B세포, 자연살해세포)와 단핵구로 구성되며, 전혈로부터 피콜(Ficoll)과 원심분리를 이용해 분리할 수 있다. 상기 PBMC는 개체로부터 수득된 전혈로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 융합단백질 이량체는 자연살해세포 배양용 조성물에서 상술한 바와 동일하다. 상기 융합단백질 이량체는 1 nM 내지 500 nM 농도로 처리될 수 있다. 구체적으로 상기 융합단백질 이량체는 1 nM 내지 500 nM, 5 nM 내지 300 nM 또는 10 nM 내지 150 nM 농도로 처리될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 융합단백질 이량체를 1.6 nM 및 50 nM 농도로 처리하였다.
상기 분리된 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 분리된 세포를 배양하는 단계에서 배양 온도는 27℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 37℃일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 37℃ 온도에서 배양하였다. 또한, 상기 분리된 세포를 배양하는 단계에서 배양 시 CO2 농도 조건은 1% 내지 10%일 수 있으며, 바람직하게는, 5% CO2 조건에서 배양할 수 있다.
상기 분리된 세포를 배양하는 단계에서 배양 기간은 5일 내지 25일, 6일 내지 23일 또는 7일 내지 21일일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 배양기간은 20일이였으며, 5일째부터 유의미한 증식 차이가 나타났다.
수득된 NK 세포 및 이의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다.
상기 자연살해세포는 CD16 및 NKp46의 발현이 증가된 것일 수 있다. 상기 자연살해세포는 그랜자임 B 및 퍼포린의 발현이 증가된 것일 수 있다. 상기 자연살해세포 배양방법에 따라 배양된 자연살해세포는 동결이 가능하고 다시 해동할 경우에도 세포의 기능이 손상되지 않는다.
상기 자연살해세포는 CD16 및 NKp46과 같은 활성화 수용체(activating receptor)의 발현이 높아 암세포주에 대한 살해능 및 그랜자임 B 및 퍼포린 분비가 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 임상 적용이 가능한 다량의 활성화된 자연살해세포를 이용하여 암 치료에 유효한 치료제를 제조할 수 있다. 또한, 상기 자연살해세포는 NKp30, DNAM1의 발현이 높을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 상기 자연살해세포 배양방법에 의해 제조된 자연살해세포는 약학 조성물의 총 중량에 대하여 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 포함된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 약학 조성물의 투여량은 유효성분인 자연살해세포를 기준으로 1Х102 cells/㎏ 내지 1.0Х1013 cells/㎏일 수 있고, 1Х107 cells/㎏ 내지 1.5Х1011 cells/㎏일 수 있다. 이때 투여는 하루에 한 번 투여할 수 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 투여 경로는 투여 방법, 체액의 부피, 점성도 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
수득된 NK 세포를 이용한 치료 방법
본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 NK 세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 이때, NK 세포 및 암은 상술한 바와 같다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 암의 치료를 위한 상기 NK 세포의 용도를 제공한다.
NK 세포 배양 방법 2
본 발명의 또 다른 측면은, i) PBMC로부터 CD3를 발현하지 않는 세포를 분리하는 단계; 및 ii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 NK 세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 이때, NK 세포 및 암은 상술한 바와 같다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 암의 치료를 위한 상기 NK 세포의 용도를 제공한다.
상기 자연살해세포는 CD16 및 NKp46과 같은 활성화 수용체(activating receptor)의 발현이 높아 암세포주에 대한 살해능 및 그랜자임 B 및 퍼포린 분비가 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 임상 적용이 가능한 다량의 활성화된 자연살해세포를 이용하여 암 치료에 유효한 치료제를 제조할 수 있다. 또한, 상기 자연살해세포는 NKp30, DNAM1의 발현이 높을 수 있다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
NK 세포 배양 방법 3
본 발명의 또 다른 측면은, i) PBMC로부터 CD56을 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및 ii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 자연살해세포를 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포 배양 방법으로 제조된 자연살해세포를 제공한다. 상기 자연살해세포는 CD16 및 NKp46과 같은 활성화 수용체(activating receptor)의 발현이 높아 암세포주에 대한 살해능 및 그랜자임 B 및 퍼포린 분비가 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 임상 적용이 가능한 다량의 활성화된 자연살해세포를 이용하여 암 치료에 유효한 치료제를 제조할 수 있다. 또한, 상기 자연살해세포는 NKp30, DNAM1의 발현이 높을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 NK 세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 이때, NK 세포 및 암은 상술한 바와 같다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 암의 치료를 위한 상기 NK 세포의 용도를 제공한다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
NK 세포 배양 방법 4
본 발명의 또 다른 측면은, IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 PBMC를 배양하는 단계를 포함하는 PBMC 내 자연살해세포의 활성을 촉진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 PBMC 내 자연살해세포의 활성을 촉진시키는 방법으로 제조된 PBMC를 제공한다. 상기 PBMC 내의 자연살해세포는 CD16 및 NKp46과 같은 활성화 수용체(activating receptor)의 발현이 높아 암세포주에 대한 살해능 및 그랜자임 B 및 퍼포린 분비가 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 임상 적용이 가능한 다량의 활성화된 자연살해세포를 포함하는 PBMC를 이용하여 암 치료에 유효한 치료제를 제조할 수 있다. 또한, 상기 PBMC 내의 자연살해세포는 NKp30, DNAM1의 발현이 높을 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 PBMC를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 NK 세포를 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 이때, NK 세포 및 암은 상술한 바와 같다. 본 발명의 또 다른 측면으로, 암의 치료를 위한 상기 NK 세포의 용도를 제공한다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
I. GI-101, 자연살해세포 및 자연살해세포 배양 조성물 제조
제조예 1. hCD80-Fc-IL-2 변이체(2M)의 제조: GI-101
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 8)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 9의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질을 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "GI-101"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1 M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비-환원(NR) 조건하에서 SDS-PAGE를 실행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 1b). NanoDrop을 사용하여 검출시 2.78 ㎎/㎖의 농도로 융합단백질이 포함된 것을 확인하였다(도 1c). 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 1d에 나타난 바와 같다.
제조예 2. Fc-IL-2 변이체(2M) 이량체의 제조: Fc-IL-2v2
Fc 도메인 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), Ig 힌지(서열번호 38), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 두 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(2M)(R38A, F42A)(서열번호 6)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 45)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 44의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "Fc-IL2v2"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 3a). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 3b에 나타낸 바와 같다.
제조예 3. Fc-IL-2 이량체의 제조: Fc-IL-2wt
Fc 도메인 및 야생형 IL-2를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), Ig 힌지(서열번호 38), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 야생형 IL-2(서열번호 10)를 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 43)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 42의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "Fc-IL2wt"으로 명명하였다.
상기 정제 및 융합단백질 수거는 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 3c). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 3d에 나타낸 바와 같다.
제조예 4. hCD80-Fc-IL-2 야생형 이량체의 제조: hCD80-Fc-IL-2wt
인간 CD80 단편, Fc 도메인 및 IL-2 야생형 단백질을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3), Fc 도메인(서열번호 4), 링커(서열번호 5) 및 IL-2 야생형(서열번호 10)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열(서열번호 41)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 46의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "hCD80-Fc-IL2wt"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 4a). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 4b에 나타낸 바와 같다.
제조예 5. hCD80-Fc 이량체의 제조: hCD80-Fc
인간 CD80 단편 및 Fc 도메인을 포함하는 융합단백질을 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), CD80 단편(서열번호 2), 링커가 결합된 Ig 힌지(서열번호 3) 및 Fc 도메인(서열번호 4)을 N-말단으로부터 이 순서대로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 39)를 ThermoFisher Scientific 사의 Invitrogen GeneArt Gene Synthesis 서비스를 통해 폴리뉴클레오티드를 합성하여 pcDNA3_4 벡터에 적재하였다. 또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM)에 도입하여 서열번호 40의 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 RPM, CO2 8%의 농도인 환경에서 7일 배양 후 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를 "hCD80-Fc"로 명명하였다.
정제는 MabSelect SuRe protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 25 mM Tris, 25 mM NaCl, pH 7.4의 조건에서 융합단백질을 결합시켰다. 그 후, 100 mM NaCl, pH 3의 100 mM의 아세트산으로 용출하였다. pH 9의 20%의 1 M Tris-HCl를 수거용 튜브에 넣은 후, 융합단백질을 수거하였다. 수거된 융합단백질을 16시간 동안 PBS 버퍼로 투석하여 바꾸어 주었다.
그 후, TSKgel G3000SWXL column(TOSOH Bioscience)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 시간에 따른 280 nm 파장에서의 흡광도를 측정하여 고농도 융합단백질을 확보하였다. 이때, 분리 정제된 융합단백질은 환원(R) 또는 비환원(NR) 조건 하에서 SDS-PAGE를 수행하고, 코마시블루(coomassie blue)로 염색하여 그 순도를 확인하였다(도 2a). 그 결과, 상기 융합단백질은 이량체를 형성함을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 분석한 결과는 도 2b에 나타낸 바와 같다.
준비예 1. 자연살해세포 배양배지 제조
하기 표 1 내지 표 4의 조성을 갖는 기본 배양배지 별로 하기 표 5의 첨가조건 1 내지 4에 해당하는 물질을 각각 첨가하여 자연살해세포 배양배지 조성물을 제조하였다.
기본 배양배지 1
성분명 제조사 Cat.# 용량 최종 농도
CTSTM Immune Cell SR (Serum replacement) Thermo A2596102 0.5ml 5%
GlutaMAX 100X Gibco A12860-01 0.5ml 1X
rhIL-15 R&D systems 247-ILB/CF 사용전 즉시 첨가 66.7IU
rhiL-21 R&D systems 8879-IL/CF 사용전 즉시 첨가 0.341IU
anti-CD2/CD335 Beads Miltenyi Biotec 130-094-483
OKT3 Biolegend 317326 10ng/mL
AIM-V medium Gibco 0870112-DK to 50ml
기본 배양배지 2
성분명 제조사 Cat.# 용량 최종 농도
Human AB serum Sigma H4522 2.5ml 5%
GlutaMAX 100X Gibco A12860-01 0.5ml 1X
rhIL-15 R&D systems 247-ILB/CF 사용전 즉시 첨가 66.7IU
rhIL-21 R&D systems 8879-IL/CF 사용전 즉시 첨가 0.341IU
anti-CD2/CD335 Beads Miltenyi Biotec 130-094-483
OKT3 Biolegend 317326 10ng/mL
AIM-V medium Gibco 0870112-DK to 50ml
기본 배양배지 3
성분명 제조사 Cat.# 용량 최종 농도
Human AB serum Sigma H4522 2.5ml 5%
GlutaMAX 100X Gibco A12860-01 0.5ml 1X
rhIL-15 R&D systems 247-ILB/CF 사용전 즉시 첨가 66.7IU
rhIL-21 R&D systems 8879-IL/CF 사용전 즉시 첨가 0.341IU
anti-CD2/CD335 Beads Miltenyi Biotec 130-094-483
OKT3 Biolegend 317326 10ng/mL
X-vivoTM 15 Medium Lonza 04-418Q to 50ml
기본 배양배지 4
성분명 제조사 Cat.# 용량 최종 농도
Human AB serum Sigma H4522 2.5ml 5%
NK MACS supplement Miltenyi Biotec 130-113-102 500 ㎕ 1%
anti-CD2/CD335 beads Miltenyi Biotec 130-094-483
OKT3 Biolegend 317326 10ng/mL
NK MACS medium 130-112-968 to 50ml
첨가물질
구분 성분명 제조사 용량 최종 농도
첨가조건 1 GI-101 GI-Innovation 사용전 즉시 첨가 1.6nM / 50nM
첨가조건 2 GI-101WT GI-Cell 사용전 즉시 첨가 1.6nM / 50nM
첨가조건 3 CD80-Fc+Fc-IL2WT GI-Cell 사용전 즉시 첨가 CD80-Fc(1.6nM)+ Fc-IL2WT(1.6nM) / CD80-Fc(50nM)+ Fc-IL2WT(50nM)
첨가조건 4 CD80-Fc+Fc-IL2v2 GI-Cell 사용전 즉시 첨가 CD80-Fc(1.6nM)+ Fc-IL2v2(1.6nM) / CD80-Fc(50nM)+ Fc-IL2v2(50nM)
실시예 1. 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 유래 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포 준비
CD3(-) 세포를 수득하기 위해, PBMC(peripheral blood mononuclear cell, Zen-Bio. Inc, NC 27709, USA, Cat#: SER-PBMC-200-F)를 ADAM-MC2 자동 세포 계수기(NanoEnTek, ㈜코스모진텍 구입)를 이용하여 세포수를 측정하였다. 상기 PBMC를 새로운 튜브로 옮긴 후 300×g, 4℃ 온도에서 5분간 원심분리 하였다. PBS에 0.5%(v/v) BSA(bovine serum albumin)와 2 mM 농도의 EDTA가 포함된 MACS 버퍼(pH 7.2)를 제조하였다. 원심분리가 끝난 후, 1×107 세포수 당 80 ㎕의 MACs 버퍼와 20 ㎕의 CD3 자성비드(Miltenyi biotech, 130-050-101)를 처리하여 세포 펠릿을 현탁한 후, 4℃ 온도에서 15분간 반응시켰다. 세척을 위해, 10 ㎖ MACs 버퍼를 넣고 300×g, 4℃ 온도에서 10분간 원심분리한 후, 0.5 ㎖의 MACs 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁하였다.
LD 컬럼(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-042-901)에 먼저 2 ㎖의 MACs 버퍼를 흘려준 후, 상기 세포 현탁액을 흘려주었다. 그 후, LD 컬럼을 통과하여 나오는 CD3(-) 세포를 수득하였다. 이때, LD 컬럼 내에 남아있는 세포가 충분히 분리될 수 있도록 2 ㎖의 MACs 버퍼를 3회 흘려주어 CD3(-) 세포를 수득하였다. 수득한 CD3(-) 세포를 세포계수기를 이용하여 세포수를 측정한 후, 새로운 튜브에 담아 300×g, 4℃ 온도에서 5분간 원심분리 하였다. 그 후, 상층액을 제거한 후, 1×107 개의 세포수 당 80 ㎕의 MACs 버퍼와 20 ㎕의 CD56 자성비드(Miltenyi biotech, Cat#: 130-050-401)를 넣고 4℃ 온도에서 15분간 반응시켰다. 세척을 위해, 10 ㎖ MACs 버퍼를 넣어 300×g, 4℃ 온도에서 10분 동안 원심분리한 후, 0.5 ㎖의 MACs 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁하였다.
LS 컬럼(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany, Cat#: 130-042-901)에 먼저 3 ㎖의 MACs 버퍼를 흘려준 후, 상기 세포 현탁액을 흘려주었다. 이때, LS 컬럼 내에 남아있는 세포가 충분히 분리될 수 있도록 2 ㎖의 MACs 버퍼를 3회 흘려 주었다. 그 후, LS 컬럼을 자성스탠드(Magnet stand)에서 분리한 후, 5 ㎖의 MACs 버퍼를 넣고 피스톤으로 압력을 주어 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포를 수득하였다. 상기 수득한 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포를 새로운 튜브에 담아 300×g, 4℃ 온도에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 배양조건을 고려하여 표1 내지 표4의 기본 배양배지에 세포를 현탁하였다. 상기 현탁된 세포의 세포수는 세포 계수기를 이용하여 측정하였다.
실시예 2. 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 유래 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포 배양
NK Cell Activation/Expansion Kit (Cat#: 130-112-968) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 내 포함되어 있는 CD335 (NKp46)-Biotin 100 μL와 CD2-Biotin 100 μL를 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣고 섞어준 다음, Anti-Biotin MACSiBead Particles 500 μL를 넣고 섞어주었다. 이후, MACs 버퍼 300 μL를 넣고 Microtube Rotator를 이용하여 2시간 동안 2℃~8℃에서 섞어주었다. 세포수를 고려하여 1x106 cells 당 5 μL의 NK activation Beads를 새로운 튜브에 옮겨주었다. 1 mL의 PBS를 넣어주고 300×g로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액 제거 후 사용할 NK MACs medium(Cat#: 130-094-483) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 106 NK cells 당 5 μL 기준으로 추가하여 비드(bead)를 풀어준 후 실시예 1에서 분리된 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포에 접종하였다.
다음으로 상기 준비된 CD3(-)CD56(+) 자연살해세포를 총 세포수가 2.5x105가 되도록 준비예 1에서 제조한 첨가물질을 포함하는 배양배지 조성물에 현탁하여 48-웰 플레이트에 파종한 후, 37℃, 5% CO2 조건하에 배양하였다. 이후 2일 간격으로 세포수를 확인하여 세포가 배양 용기의 80% 이상 차지(Confluency)하는 경우 48-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 25T 플라스크 순으로 계대 배양하였으며, 최종적으로 21일차에 모든 세포를 수확하였다.
실시예 3. 세포수 측정 및 세포생존율 비교
배양된 자연살해세포의 총 세포수 및 생존율을 5일, 9일, 11일, 13일, 15일, 17일, 21일에 세포 계수기(ADAM-MC2)를 이용하여 측정하였다. 이때 처리된 물질 및 배양배지 종류에 따라 세포 증식 속도가 다르므로, 계대 기준인 80%를 채우는 속도에 맞추어 상기 날짜에 세포수를 측정하였다.
준비예 1에서 제조된 배양배지 조성물 조건 하에서 배양된 CD3-CD56+ 세포의 총 세포수 및 생존율을 비교한 결과는 표 6 내지 표 13, 및 도 5a 내지 도 12b에 나타내었다.
그 결과, 제조예 1에 의해 제조된 GI-101이 첨가된 배양배지 조성물은 4종의 기본 배양배지(표 1 내지 표 4) 조건에서 처리 농도와 상관없이 모두 대조군(CD80-Fc+Fc-IL2v2, CD80-Fc+Fc-IL2WT 첨가) 대비 자연살해세포의 총 세포수가 많은 것을 확인하였다(도 5a, 도 5b, 도 7a, 도 7b, 도 9a, 도 9b, 도 11a 및 도 11b).
또한, 세포 생존율에 있어서도 GI-101을 첨가한 경우 기본 배양배지 및 농도와 관계없이 모두 높은 생존율을 나타내었다(도 6a, 도 6b, 도 8a, 도 8b, 도 10a, 도 10b, 도 12a 및 도 12b).
상기 결과를 통해 GI-101은 기본 배양배지 및 농도와 관계없이 대조군(CD80-Fc+Fc-IL2v2, CD80-Fc+Fc-IL2WT 첨가) 보다 자연살해세포 증식 능력 향상과 생존율에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다.
TOTAL CELL NUMBER ( X10 5 )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0(seeding) DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 1 50nM GI-101 2.50 3.17 8.56 - 23.84 - 27.38 23.76
GI-101WT 2.50 2.36 6.40 - - - 15.45 13.33
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.50 2.62 6.61 - 16.16 - 21.93 13.19
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.50 1.87 -　 11.04 13.92 -　 17.86 13.33
1.6nM GI-101 2.50 2.27 6.79 - 13.98 - 15.62 11.19
GI-101WT 2.50 1.92 4.65 - - - - 3.58
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.50 0.23 - - - - - -
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.50 1.76 -　 - 6.96 -　 6.64 4.46
Cell Viability ( % )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0(seeding) DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 1 50nM GI-101 - 76.58 82.41 - 90.94 - 86.68 84.19
GI-101WT - 75.98 83.42 - - - 89.27 89.53
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 78.18 81.73 - 90.57 - 88.76 89.64
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 83.64 - 86.50 92.19 - 89.62 82.36
1.6nM GI-101 - 75.08 82.94 - 87.85 - 90.34 88.22
GI-101WT - 77.55 82.32 - - - - 87.01
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 49.77 - - - - - -
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 74.51 - - 86.47 - 88.90 93.29
TOTAL CELL NUMBER ( X10 5 )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0
(seeding)		 DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 2 50nM GI-101 2.5 11.71 38.81 - 214.88 415.25 - 694.59
GI-101WT 2.5 8.57 30.58 62.31 96.42 - - 152.16
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.5 8.12 - - 90.54 122.27 - 153.14
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.5 7.80 29.97 - 92.32 118.56 - 152.23
1.6nM GI-101 2.5 5.60 28.69 - 55.39 - - 94.22
GI-101WT 2.5 6.58 14.92 - 35.18 - - 37.81
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.5 6.02 19.85 - 56.26 - - 75.83
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.5 6.04 18.39 - 46.50 - - 55.51
CELL VIABILITY ( % )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0
(seeding)		 DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 2 50nM GI-101 - 93.31 95.64 - 96.47 96.58 - 93.21
GI-101WT - 94.38 95.45 96.06 94.96 - - 92.14
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 93.32 - - 97.01 95.96 - 91.73
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 91.51 96.49 - 96.19 95.23 - 91.81
1.6nM GI-101 - 91.81 93.75 - 95.14 - - 85.22
GI-101WT - 93.56 93.56 - 94.81 - - 88.63
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 93.57 94.00 - 94.36 - - 89.53
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 90.87 94.04 - 95.01 - - 87.36
TOTAL CELL NUMBER ( X10 5 )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0
(seeding)		 DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 3 50nM GI-101 2.50 6.07 24.64 - 46.13 61.25 - 99.60
GI-101WT 2.50 6.98 24.90 - 49.75 64.15 - 67.71
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.50 4.11 - 21.60 - - - 56.02
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.50 5.73 23.52 - 51.17 66.32 - 76.19
1.6nM GI-101 2.50 6.47 25.14 - 54.13 69.59 - 86.68
GI-101WT 2.50 3.34 - - - - - 10.91
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.50 1.07 - - - - - -
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.50 4.61 13.16 - 16.27 - - 13.16
CELL VIABILITY ( % )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0
(seeding)		 DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 3 50nM GI-101 - 89.72 90.65 - 90.59 88.11 - 82.08
GI-101WT - 90.74 92.95 - 93.20 90.52 - 87.38
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 87.57 - 88.80 - - - 87.63
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 88.60 93.44 - 95.13 94.99 - 91.38
1.6nM GI-101 - 90.07 92.11 - 92.64 90.80 - 85.62
GI-101WT - 85.76 - - - - - 75.98
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 66.33 - - - - - -
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 88.05 90.17 - 89.08 - - 79.81
TOTAL CELL NUMBER ( X10 5 )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0
(seeding)		 DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 4 50nM GI-101 2.50 6.31 37.36 58.21 - 146.76 - 467.75
GI-101WT 2.50 5.74 30.24 52.00 - 126.99 - 347.59
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.50 6.96 31.20 51.52 - 130.65 - 285.63
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.50 6.30 35.52 50.08 - 147.54 - 350.28
1.6nM GI-101 2.50 6.75 37.28 63.68 - 166.42 - 419.02
GI-101WT 2.50 2.46 - 8.08 9.84 - - 8.93
CD80-Fc+Fc-IL2v2 2.50 0.73 - - - - - -
CD80-Fc+Fc-IL2WT 2.50 3.86 18.85 - 48.90 67.86 - 134.21
CELL VIABILITY ( % )
배양
조건		 농도 처리물질 CD3-CD56+ cells
DAY0
(seeding)		 DAY5 DAY9 DAY11 DAY13 DAY15 DAY17 DAY21
표 4 50nM GI-101 - 94.72 96.93 97.24 - 96.20 - 96.04
GI-101WT - 94.90 96.79 96.11 - 63.11 - 64.73
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 95.33 97.83 96.70 - 95.73 - 96.43
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 95.99 97.86 97.52 - 97.09 - 96.39
1.6nM GI-101 - 94.75 97.72 96.89 - 94.67 - 95.00
GI-101WT - 89.00 - 88.06 - - - 88.22
CD80-Fc+Fc-IL2v2 - 75.94 - - - - - -
CD80-Fc+Fc-IL2WT - 91.40 96.61 - - 96.49 - 95.99
II. 자연살해세포 배양 조성물을 이용한 자연살해세포의 특성 분석
실시예 4. 자연살해세포 순도 확인
실시예 2에서 수득한 CD3-CD56+ 자연살해세포들을 각각 300×g 조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 FACS 버퍼 1 ㎖을 넣어 펠릿을 풀어주었다. 그 후, PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 ㎍/㎖ 폴리믹신B, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨을 첨가하여 제조한 FACS 버퍼 1 ㎖을 넣어 세포 펠릿을 재현탁하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2×106 세포수/㎖이 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다.
5 ㎖ FACS 튜브에 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 넣고, FACS 버퍼 100 ㎕을 추가로 넣고 PerCP가 표지된 항-인간 CD3 항체(PerCP human anti-CD3(Clone UCHT1)) 및 PE/cy7가 표지된 항-인간 CD56 항체(PE/cy7 human anti-CD56(Clone B159))을 처리하였다. 그 후, 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 200 ㎕ FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 200 ㎕ FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후, 유세포분석기(Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)를 이용하여 세포의 표현형을 확인하였다.
상기 실험에서 사용된 항체 정보는 표 14에 나타내었다. 또한, 준비예1에서 제조된 배양배지 조성물 조건 하에서 21일 동안 배양된 CD3-CD56+ 자연살해세포의 순도를 측정하여 도 13 내지 도 16에 나타내었다.
Target Color Clone Producer Cat#
NK marker CD3 PerCP UCHT1 BioLegend 300428
CD56 APC/cy7 5.1H11 BioLegend 362512
실시예 5. 자연살해세포의 활성 및 저해 마커 확인
실시예 2에서 수득한 CD3-CD56+ 자연살해세포들을 각각 300×g 조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하고 FACS 버퍼 1 ㎖을 넣어 펠릿을 풀어주었다.
PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 ㎍/㎖ 폴리믹신B, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨을 첨가하여 제조한 FACS 버퍼 1 ㎖을 넣어 세포 펠릿을 재현탁하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2×106 세포수/㎖이 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 ㎖ FACS 튜브에 희석한 세포 용액을 100 ㎕씩 넣고, 유세포분석기를 이용하여 Pe-CF594가 표지된 항-인간 CD16 항체(PE-CF594 human anti-CD16 (Clone 3G8)), APC가 표지된 항-인간 DNAM1 항체(APC human anti-DNAM1 (Clone 11A8)), BV605가 표지된 항-인간 NKG2C항체(BV605 human anti-NKG2C (Clone 134591)), BV650가 표지된 항-인간 NKG2D 항체(BV650 human anti-NKG2D(Clone 1D11)), BB515가 표지된 항-인간 NKp46 항체(BB515 human anti-NKp46 (Clone 9E2)), BV480가 표지된 항-인간 NKp30 항체(BV480 human anti-NKp30 (Clone p30-15)), PE가 표지된 항-인간 PD-1 항체(PE human anti-PD-1 (Clone EH12.2H7)), 및 APC가 표지된 항-인간 NKG2A 항체(APC anti-human NKG2A (Clone 131411))를 이용하여 확인하였다. 그 후, 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 ㎕ FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 3분간 원심분리하였다.
상층액을 제거하고, 200 ㎕ FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후, 유세포분석기(Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)를 이용하여 세포의 표현형을 확인하였다. 상기 실험에서 사용된 항체 정보는 표 15에 나타내었다. 준비예 1에서 제조된 배양배지 조성물 조건 하에서 21일 동안 배양된 CD3-CD56+ 자연살해세포의 활성 및 저해 마커를 확인하여 도 17 내지 도 24에 나타내었다.
Target Color Clone Producer Cat#
Activation marker CD16 PE-CF594 3G8 BD 562293
DNAM1 APC 11A8 BioLegend 338312
NKp46 BB515 9E2 BD 564536
NKp30 BV480 p30-15 BD 746491
Inhibition marker PD-1 PE EH12.2H7 BioLegend 329906
NKG2A APC 131411 R&D systems FAB1059A-100
실시예 6. 자연살해세포의 그랜자임B, 퍼포린, 인터페론 감마 분비능 확인
실시예 2에서 수득한 CD3-CD56+ 자연살해세포의 그랜자임 및 퍼포린 분비능을 확인하기 위해, 세포내 염색(intracellular staining)을 통해 자연살해세포 내 그랜자임 B, 퍼포린, 인터페론 감마의 발현량을 측정하였다. 배양된 자연살해세포를 300×g 조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하였다. 그 후, 세포 계수기를 이용하여 2x106 세포수/㎖이 되도록 각 배양 조성물로 희석하였다.
준비된 세포를 96-웰 플레이트 각각의 웰에 200 ㎕씩 분주 후 1%(v/v) Stimulation Cocktail(1X)(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 넣고 37℃, CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 주었다. 그 후, 플레이트를 300×g 조건에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 제거하였다. 그 후, PBS에 3%(v/v) FBS, 10 mM EDTA, 20 mM HEPES, 10 ㎍/㎖ 폴리믹신B, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 피루브산나트륨을 첨가하여 제조한 FACS 버퍼 100 ㎕를 넣어 세포 펠릿을 재현탁하였다. 상층액을 제거하고, 고정(fixation) 및 침투(permeation)을 위해 100 ㎕ BD Cytofix/Cytoperm™ 버퍼(perm/fixation buffer, BD science)를 넣어 현탁한 후 30분간 4℃ 온도에서 반응시켰다. FACS 버퍼 100 ㎕을 추가로 넣고 1,500 rpm으로 3분간 원심분리하였다.
Pe/cy7가 표지된 항-인간 그랜자임 B 항체(PE/cy7 anti-human Granzyme B (Clone NGZB)), 및 APC가 표지된 항-인간 퍼포린 항체(APC anti-human Perforin (Clone B-D48)), BV421이 표지된 항-인간 인터페론 감마 항체(BV421 anti-human IFN-gamma (Clone B27))를 처리하였다. 그 후, 20분간 4℃ 온도에서 반응시킨 후, 100 ㎕ FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 3분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 200 ㎕ FACS 버퍼(fixation buffer)를 넣어 현탁한 후, 유세포 분석기를 이용하여 세포의 발현량을 확인하였다.
상기 실험에서 사용된 항체 정보는 표 16에 나타내었다. 준비예1에서 제조된 배양배지 조성물 조건 하에서 21일 동안 배양된 CD3-CD56+ 자연살해세포의 마커를 확인하여 도 25 내지 도 28에 나타내었다.
Target Color Clone Producer Cat#
Cytotoxicity Perforin APC B-D48 BioLegend 353312
IFN-γ BV421 B27 BioLegend 506538
GranzymeB(GB11) PE/cy7 NGZB ebioscience 25-8898-82
III. 배양 조성물에 따른 자연살해세포의 암 세포 살해능 분석
실시예 8. 암세포에 대한 자연살해세포의 탈과립능 및 사멸효과 확인
구체적으로, K562 암세포주(American Type Culture Collection, ATCC)를 하기 표 17에 나타난 세포수가 되도록 PBS에 희석시켜 각 웰에 분주하였다.
E : T 1 : 1 1 : 5 1 : 10
(E) NK cells 2.5Х105 cells 1Х105 cells 1Х105 cells
(T) K562 2.5Х105 cells 5Х105 cells 1Х106 cells
구체적으로, K562 암세포주를 1×107 세포수/㎖이 되도록 각 배양조성물로 희석시킨 후, 각 웰당 상기 표에 정해진 세포수에 따라 분주하였다. 그 후, 자연살해세포도 5×106 세포수/㎖가 되도록 각 배양조성물로 희석시킨 후, 각 웰당 상기 표에 정해진 세포수에 따라 분주하고, 30×g 조건에서 3분동안 원심분리시켰다.
그 후, 4시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양한 후, BV421이 표지된 항-인간 CD3 항체(BV421 human anti-CD3 (Clone UCHT1)), PE가 표지된 항-인간 CD16 항체(PE human anti-CD16 (Clone 3G8)), PE/cy7가 표지된 항-인간 CD56 항체(PE/cy7 human anti-CD56(Clone B159)) 및 FITC가 표지된 항-인간 CD107a 항체(Clone H4A3)를 처리하고 얼음 위에서 20분 동안 반응시켰다.
그 후, 100 ㎕의 FACS 버퍼를 넣고 1,300 rpm, 4℃ 조건에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 7-AAD Viability Staining Solution을 처리하고 빛을 차단하여 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 그 후, 100 ㎕의 FACS 버퍼를 넣고 1,300 rpm, 4℃ 조건에서 5분 동안 원심분리하였다. 다시 200 ㎕의 FACS 버퍼를 넣고 1,300 rpm, 4℃ 조건에서 5분 동안 원심분리하였다. 상기 과정을 한 번 더 반복한 후, 상층액을 제거하고 400 ㎕의 FACS 버퍼를 넣고 유세포분석기(Cytek® Aurora, Cytek, Fremont, CA, USA)을 이용하여 분석하였다.
상기 실험을 통해 표 1 내지 표 4의 기본 배양배지에 표5의 첨가물질을 각각 50 nM 첨가한 조성물에서 21일 동안 배양된 자연살해세포의 탈과립능 및 사멸효과는 도 29 내지 도 34에 나타내었다.
<110> GI Cell, Inc. <120> COMPOSITION FOR CULTURING NATURAL KILLER CELL AND METHOD FOR PRODUCING NATURAL KILLER CELL USING THE SAME <130> SPD20-130GIC <150> KR 10-2019-0149779 <151> 2019-11-20 <150> KR 10-2020-0015802 <151> 2020-02-10 <160> 46 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide (TPA) <400> 1 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala 20 25 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hB7-1:35-242 <400> 2 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hinge with linker <400> 3 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 4 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> immunoglobulin fc <400> 4 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 210 215 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hIL-2M <400> 6 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 7 <211> 617 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein comprising variants of IL-2 and fragments of CD80 <400> 7 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu 20 25 30 Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser 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Glu Ser Lys Tyr Gly 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 260 265 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg 275 280 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro 290 295 300 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305 310 315 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325 330 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340 345 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr 355 360 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370 375 380 Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 385 390 395 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405 410 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420 425 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser 435 440 445 Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 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780 cctaccagct cctctaccaa gaaaacccag ctccagttgg agcatctgct gctggacctc 840 cagatgattc tgaacgggat caacaactat aagaacccca agctgacccg catgctgacc 900 tttaagttct acatgcccaa gaaggccacc gagctgaagc acctccagtg cctggaagaa 960 gaactgaagc ccctggaaga ggtgctgaat ctggcccagt ccaagaactt ccacctgagg 1020 ccacgggacc tgatcagcaa catcaacgtg atcgtgctgg aactgaaggg ctccgagaca 1080 acctttatgt gcgagtacgc cgacgagaca gccaccatcg tggaatttct gaaccggtgg 1140 atcaccttct gccagagcat catctccaca ctgacc 1176 <210> 44 <211> 392 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc-IL2v2 <400> 44 Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 20 25 30 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 35 40 45 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr 50 55 60 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 65 70 75 80 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 85 90 95 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 100 105 110 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 115 120 125 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 130 135 140 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 145 150 155 160 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 165 170 175 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 180 185 190 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 195 200 205 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 210 215 220 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu 225 230 235 240 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln 260 265 270 Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr 290 295 300 Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu 305 310 315 320 Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn 325 330 335 Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val 340 345 350 Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp 355 360 365 Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys 370 375 380 Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 385 390 <210> 45 <211> 1200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotides coding Fc-IL2v2 <400> 45 ggatccgcca ccatggatgc tatgctgaga ggcctgtgtt gcgtgctgct gctgtgtggc 60 gctgtgttcg tgtctccatc tcacgccgct gagtctaagt acggccctcc ttgtcctcca 120 tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 180 gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 240 gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 300 accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctacagag tggtgtccgt gctgaccgtg 360 ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 420 ccttccagca tcgaaaagac catctccaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 480 tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 540 gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 600 aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 660 cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 720 cacgaggccc tgcacaatca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggcggaggc 780 ggaggatctg ctcctacctc cagctccacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 840 ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 900 gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacctccag 960 tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1020 ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1080 ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1140 ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagtcc atcatctcca cactgacctg atgactcgag 1200 1200 <210> 46 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD80-Fc-IL2wt <400> 46 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys 1 5 10 15 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp 20 25 30 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn 35 40 45 Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn 50 55 60 Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr 65 70 75 80 Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His 85 90 95 Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn 130 135 140 Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr 165 170 175 Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn 180 185 190 Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230 235 240 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245 250 255 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 260 265 270 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 290 295 300 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 305 310 315 320 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 325 330 335 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 340 345 350 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 355 360 365 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 370 375 380 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 385 390 395 400 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 420 425 430 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser 450 455 460 Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu 465 470 475 480 Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr 485 490 495 Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu 500 505 510 Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val 515 520 525 Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu 530 535 540 Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr 545 550 555 560 Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe 565 570 575 Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 580 585 590

Claims (25)

  1. IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 자연살해세포 증식용 조성물로,
    상기 IL-2의 변이체는 서열번호 10의 38번째 및 42번째의 아미노산이 치환되고,
    상기 CD80의 단편은 CD80의 세포 외 도메인인, 자연살해세포 증식용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2의 변이체는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 자연살해세포 증식용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 CD80의 단편은 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열 중 35번 내지 242번의 아미노산으로 이루어진 것인, 자연살해세포 증식용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 자연살해세포 증식용 조성물.
  6. i) PBMC(peripheral blood mononuclear cell)로부터 CD3를 발현하지 않는 세포를 분리하는 단계;
    ii) 상기에서 분리된 CD3를 발현하지 않는 세포로부터 CD56을 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및
    iii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 iii) 단계의 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 10의 38번째 및 42번째의 아미노산이 치환되고,
    상기 CD80의 단편은 CD80의 세포 외 도메인인, 자연살해세포의 증식 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 융합단백질 이량체는 1 nM 내지 500 nM 농도로 처리된 것인, 자연살해세포의 증식 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 배양하는 단계에서 배양 기간은 5일 내지 25일인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 증식 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. i) PBMC로부터 CD3를 발현하지 않는 세포를 분리하는 단계; 및
    ii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 ii) 단계의 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 10의 38번째 및 42번째의 아미노산이 치환되고,
    상기 CD80의 단편은 CD80의 세포 외 도메인인, 자연살해세포의 증식 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. i) PBMC로부터 CD56을 발현하는 세포를 분리하는 단계; 및
    ii) IL-2 또는 이의 변이체 및 CD80 또는 이의 단편을 포함하는 융합단백질 이량체 존재 하에 상기 분리된 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 ii) 단계의 상기 IL-2의 변이체는 서열번호 10의 38번째 및 42번째의 아미노산이 치환되고,
    상기 CD80의 단편은 CD80의 세포 외 도메인인, 자연살해세포의 증식 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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