KR102137954B1 - 사이토카인 유도 살해세포를 포함하는 활성화 림프구 및 이의 제조 방법 - Google Patents
사이토카인 유도 살해세포를 포함하는 활성화 림프구 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CD8+CD56+NKG2D+의 비율이 20% 이상인 사이토카인 유도 살해세포를 포함한 활성화 림프구 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하기는 높은 종양 세포 살해 능력과 증식률을 가지며, 인터루킨-2의 병합 투여가 필요하지 않아 부작용이 거의 없는 사이토카인 유도 살해세포를 포함한 활성화 림프구 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 사이토카인 유도 살해세포를 포함하는 활성화 림프구 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
암은 다양한 유전적 변이의 축적과 정상적인 세포의 조절 과정이 사라짐으로써 나타난다. 암의 발생을 조절하는 과정에서 면역체계는 암세포를 효과적으로 사멸시키기 위하여 몇 가지 순차적인 과정이 진행되어야 한다. 이를 암 면역 주기(Cancer Immunity Cycle)이라고 한다. 암 면역 주기의 첫 번째 과정에서는 종양발생으로 만들어진 신규종양항원(Neoantigen)이 방출되고 이것을 처리하기 위해서 수지상세포(Dendritic Cell, DC)가 작용한다. 이 과정에서 전염증성 사이토카인(Pro-inflammatory cytokine)과 같은 요소들이 죽어가는 종양세포에서 방출된다. 두 번째 단계에서는 수지상세포가 포획된 항원을 MHC-I과 MHC-II 분자형태로 표지하게 되고, 이것은 작용 T 세포(Effector T cell)을 활성화하여 종양 특이적인 항원에 대해 반응하게 된다. 마지막 단계에서는 활성화된 작용 T 세포가 종양이 있는 위치로 이동 및 침투하여 종양세포를 특이적으로 인지하고 사멸을 일으킨다. 암 환자에서는 이런 암 면역 주기가 정상적으로 작동하지 않는다.
암 발생의 억제와 촉진에 대한 면역체계의 역할에 대하여 “암 면역 편집(Cancer Immunoediting)”이라는 것이 존재하는데, 이는 크게 3단계로 구분된다. 1단계는 Elimination으로, 선천면역(innate immunity)과 획득면역(adoptive immunity)이 함께 작용하여 종양의 발생을 감지하고 사멸시키는 cancer immunosurveillance 과정을 말한다. 이 과정은 상기에서 말한 암 면역 주기과정과 동일하다. 2단계는 Equilibrium으로, Elimination 단계에서 종양이 살아남아서 획득면역이 종양의 증식을 막으면서도 종양에 면역원성이 형성되는 과정이다. 이 과정에서 면역체계가 잔여 종양세포에 대해서 일종의 ‘기능적 휴면기 상태’를 유지함으로써 암 면역 편집 과정에서 가장 긴 시간이 소요되는 단계로 여겨진다. 3단계는 Escape로, 종양세포가 면역체계를 피하여 증식하는 단계이다. 이 단계에서 종양세포는 항원을 잃고 세포독성면역에 대한 저항성이 증가되어있다. 또한 종양미세환경은 면역억제상태로, VEGF, TGF-beta와 같은 면역억제 사이토카인이 종양에서 분비된다. 더불어 조절 T 세포는 인터루킨-10, TGF-beta를 분비하여 종양 특이적인 T 림프구의 기능을 억제하고, negative-co-stimulatory molecule(PD-1등)을 발현하며 인터루킨-2를 소비하여 CTL의 기능 저하를 유도한다.
암을 치료하는 방법에는 1890년대 이전부터 현재까지 가장 오래 사용한 방법인 수술, 그 후로 방사선치료, 화학요법, 정밀의학요법이 발전되어왔다. 수술적인 방법으로 암을 치료하는 경우, 수술의 범위가 제한적일 수 있어 종양이 완전히 제거되지 않을 수 있다는 단점이 있다. 방사선 치료와 화학요법으로 암을 치료하는 경우, 암세포뿐 아니라 정상세포까지 독성의 영향을 받아 강한 부작용을 동반하는 경우가 많다. 정밀의학요법의 경우 환자마다 다른 유전체 정보, 환경적 요인, 생활습관 등을 종합적으로 분석하여 최적의 치료방법을 제공하는 것이지만, 현재 적용하고 있는 표준치료법은 특정집단에서의 결과로 도출된 방법을 사용함으로써 유전적, 생화학적으로 다양한 개인의 질환을 모두 치료할 수 없다는 단점이 있다. 항암면역치료법은 암 환자에서 면역시스템을 유발, 강화 또는 억제 시킴으로써 치료하는 방법으로 능동적 면역치료법과 수동적 면역치료법이 있다. 능동적 면역치료법은 반응이 느리지만 오랜 기간 치료효과가 유지된다는 장점을 가지고 있다. 대표적인 능동적 면역치료에는 백신, 면역관문억제제 등이 있다. 수동적 면역치료법은 빠르게 반응하지만 지속시간이 짧은 것이 특징이다. 대표적인 수동적 면역치료법에는 종양침윤림프구(Tumor infiltrating Lymphocyte, TIL), 단일클론항체, CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T Cell)과 획득성 면역치료법이 있다.
획득성 면역치료법은 환자로부터 채혈하여 면역세포만을 분리한 후 체외에서 항암활성을 증진시킬 수 있는 배양 과정을 통해 분화와 증식을 유도하고, 이로 인해 활성화된 면역세포를 다시 환자에게 주입함으로써 항암효과를 증진시키는 방법이다. 인터루킨-2 의 존재 하에 암환자의 말초 혈액에서 분리한 단핵구를 배양하여 세포독성 활성이 증가된 림프구 (Lymphokine-activated killer cells, LAK cells)를 얻었고, 이를 암환자의 치료에 시도하였으며 암환자의 암조직에 존재하는 림프구(Tumor Infiltration Lymphocytes, TIL)를 분리하여 같은 방식으로 배양하여 이를 암 환자의 치료에 이용하였다.
그러나, 이러한 기존의 면역치료법은 고농도의 인터루킨-2를 이용하기 때문에 이로 인한 부작용이 발생하였고 치료 효과를 내기에 충분한 숫자의 림프구 확보가 어려웠다.
따라서, 본 발명자들은 LAK 세포에 비해 뛰어난 종양 세포 살해 능력과 높은 증식률을 가지며 인터루킨-2의 병합 투여가 필요하지 않기 때문에 심각한 부작용이 없는 항암 면역세포치료제 조성물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 높은 종양 세포 살해 능력과 증식률을 가진, 사이토카인 유도 살해세포를 포함한 활성화 림프구를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 부작용이 거의 없는, 사이토카인 유도 살해세포를 포함한 활성화 림프구를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 활성화 림프구를 포함하는 활성화 림프구를 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함하는 활성화 림프구.
2. 위 1에 있어서, 상기 CD8+CD56+NKG2D+ 세포의 비율이 20% 이상인, 활성화 림프구.
3. 위 1에 있어서, 상기 CD8+CD56+NKG2D+ 세포의 비율이 20% 내지 30% 인, 활성화 림프구.
4. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 활성화 림프구를 포함하는 항암 면역세포치료제 조성물.
5. 위 4에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암 및 반지세포암종으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.
6. 위 4에 있어서, 상기 암은 간암, 신장암, 췌장암, 악성흑색종, 전립샘암 및 대장암로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.
7. 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS(Fetal bovine serum)를 포함한 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함하는 활성화 림프구의 제조 방법.
8. 위 7에 있어서, 상기 배양은 2단계 이상으로 수행되며,
1단계 배지는 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2 및 FBS를 포함하는, 방법.
9. 위 8에 있어서, 상기 항 CD3 항체의 농도는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml이고, 상기 1단계 배지 및 2단계 배지에서 인터루킨-2의 농도는 100 내지 800U/ml, FBS의 농도는 0.1 내지 15부피%인, 방법.
10. 위 7에 있어서, 상기 배양은 3단계로 수행되며, 1단계 배지는 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하고, 2단계 및 3단계 배지는 인터루킨-2 및 FBS를 포함하되, 항 CD3 항체는 포함하지 않으며, 상기 항 CD3 항체 농도는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml이고, 상기 1, 2 및 3단계 배지의 인터루킨-2 농도는 100 내지 800U/ml이고, 상기 1단계 배지의 FBS 농도는 5 내지 15부피%, 2단계 배지의 FBS 농도는 0.1 내지 1부피%, 3단계 배지의 FBS 농도는 0.1 내지 2부피%인, 방법.
10. 위 1 내지 3 중 어느 한 항의 활성화 림프구를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 위 10에 있어서, 상기 암은 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암 및 반지세포암종으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.
12. 위 10에 있어서, 상기 암은 간암, 신장암, 췌장암, 악성흑색종, 전립샘암 및 대장암로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 조성물.
13. 위 10에 있어서, 상기 조성물은 상기 활성화 림프구, 식염수 및 사람 혈청 알부민을 포함하는 것인, 조성물.
본 발명의 활성화 림프구는 CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함하여 우수한 항암 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 활성화 림프구는 CD8+CD56+NKG2D+ 세포의 비율이 매우 높아 항암 활성을 극대화 할 수 있다.
본 발명의 제조 방법은 CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함하는 활성화 림프구를 제조할 수 있다.
도 1은 활성화 림프구 내의 세포 표현형을 FACS 분석법을 이용하여 확인한 것이다.
도 2는 활성화 림프구의 Human renal cancer (ACHN)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 3은 활성화 림프구의 Human pancreatic cancer (AsPC-1)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 4는 활성화 림프구의 Human melanoma cancer (LOX-IMV1)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 5는 활성화 림프구의 Human prostate cancer (PC-3)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 6은 활성화 림프구의 Human prostate cancer (PC-3)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 7은 활성화 림프구의 Human colon cancer (SW620)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 8은 활성화 림프구의 간암 임상시험 결과이다.
도 9는 활성화 림프구의 간암 임상시험 장기간 추적조사 결과이다.
도 10은 활성화 림프구의 교모세포종 임상시험 결과이다.
도 11은 활성화 림프구의 췌장암 임상시험 결과이다.
도 2는 활성화 림프구의 Human renal cancer (ACHN)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 3은 활성화 림프구의 Human pancreatic cancer (AsPC-1)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 4는 활성화 림프구의 Human melanoma cancer (LOX-IMV1)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 5는 활성화 림프구의 Human prostate cancer (PC-3)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 6은 활성화 림프구의 Human prostate cancer (PC-3)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 7은 활성화 림프구의 Human colon cancer (SW620)에 대한 항암 효과 조사 결과이다.
도 8은 활성화 림프구의 간암 임상시험 결과이다.
도 9는 활성화 림프구의 간암 임상시험 장기간 추적조사 결과이다.
도 10은 활성화 림프구의 교모세포종 임상시험 결과이다.
도 11은 활성화 림프구의 췌장암 임상시험 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 활성화 림프구에 관한 것이다.
본 명세서에서 활성화 림프구는 면역 작동세포(immune effector cell)의 집단으로서, CD3+CD56+ 세포, CD8+CD56+ 세포, CD3+CD8+ 세포 등을 포함하는 이형 세포 집단이다.
본 발명의 활성화 림프구는 CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함한다.
CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함함으로써 우수한 항암 효능을 나타낼 수 있다.
CD8+CD56+NKG2D+ 세포의 비율은 예를 들면 20% 이상일 수 있고, 구체적으로는 20 내지 30%일 수 있고, 보다 구체적으로 25 내지 30%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 다량으로 포함함으로써 항암 효능을 극대화 할 수 있다.
본 발명의 활성화 림프구는 여러 표현형을 갖는 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면, CD3+CD56+, CD8+CD56+, CD3+CD8+ 등일 수 있다.
구체적인 예를 들면, 본 발명의 활성화 림프구는 CD3+CD56+ 세포의 비율은 예를 들면 40% 이상, 구체적으로 40 내지 60%일 수 있고, 보다 구체적으로 40% 내지 50%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
CD8+CD56+ 세포의 비율은 예를 들면 30% 이상, 구체적으로 30 내지 40%일 수 있고, 보다 구체적으로 30% 내지 35%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
CD3+CD8+ 세포의 비율은 예를 들면 60% 이상, 구체적으로 60 내지 90%일 수 있고, 보다 구체적으로 60% 내지 70%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 활성화 림프구는 말초혈액으로부터 분리된 림프구를 활성화, 증식, 배양하여 얻어진 것일 수 있으며, 구체적으로는 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체, 인터루킨-2, FBS를 포함하는 배지에서 배양하여 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 전술한 활성화 림프구를 포함하는 항암 면역세포치료제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 면역세포치료제란 체외에서 사람의 혈액 내에 존재하는 면역세포를 대량 증식 및 활성화시켜 다시 본인에게 투여하여 암을 치료하는 항암면역 세포치료제 중의 하나로서 수지상세포 (Dendritic cells)을 이용한 항암 면역세포치료제와 마찬가지로 환자 본인의 면역세포를 활성화하여 체내 면역을 유도하는 개인 맞춤식 항암치료제이다.
본 발명의 조성물은 전술한 활성화 림프구를 포함함으로써 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 조성물의 예방 또는 치료 대상인 암은 예를 들면 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암, 반지세포암종 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들면 1x109 내지 2x1010 세포가 포함된 조성물을 투여할 수 있고, 그 용량은 예를 들면 100ml 내지 1000ml, 구체적으로 100ml 내지 300ml일 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 CD8+CD56+NKG2D+ 세포를 포함하는 활성화 림프구의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함한다.
말초혈액은 자가말초혈액일 수 있다.
필요에 따라 말초혈액을 원심분리하여 상층의 혈장층을 제거하고 분리한 단핵구층으로부터 림프구를 얻을 수 있다.
림프구를 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하는 배지에서 배양한다. 이에 의해 림프구를 활성화, 증식시킬 수 있다.
항 CD3 항체의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 0.1㎍/ml 내지 100㎍/ml 일 수 있고, 구체적으로는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml일 수 있다.
항 CD3 항체는 배양 플라스크에 코팅되어 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인터루킨-2의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 50U/ml 내지 1000U/ml일 수 있고, 구체적으로는 100U/ml 내지 800U/ml일 수 있다. 상기 범위 내에서 100 내지 800U/ml, 400 내지 800U/ml, 100 내지 500U/ml, 100 내지 300U/ml 등으로 다양하게 포함될 수 있다.
FBS의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 0.1 내지 15부피%일 수 있다.
본 발명의 배지는 인터페론 감마(IFN-γ)는 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 배지는 그 외 림프구 배양을 위해 통상 사용되는 성분, T 세포 활성화, 그리고 콜로니 증식, 장기간 배양 등에 사용되는 성분들을 더 포함할 수 있다. 예를 들면 글라이신(Glycine), L-아르기닌(L-Arginine), L-아스파라긴(L-Asparagine), L-아스파르트산(L-Aspartic acid), L-시스틴 2HCl(L-Cystine 2HCl), L-글루탐산(L-Glutamic Acid), L-글루타민(L-Glutamine), L-히스티딘(L-Histidine), L-히드록시프롤린(L-Hydroxyproline), L-이소류신(L-Isoleucine), L-류신(L-Leucine), L-라이신 하이드로클로라이드(L-Lysine hydrochloride), L-메티오닌(L-Methionine), L-페닐알라닌(L-Phenylalanine), L-프롤린(L-Proline), L-세린(L-Serine), L-트레오닌(L-Threonine), L-트립토판(L-Tryptophan), L-타이로신 이나트륨 2수화물(L-Tyrosine disodium salt dihydrate), L-발린(L-Valine), 비오틴(Biotin), 염화콜린(Choline chloride), D- 판토텐산칼슘(D-Calcium pantothenate), 엽산(Folic Acid), 나이아신아마이드(Niacinamide), 파라-아미노벤조산(Para-Aminobenzoic Acid), 피리독신 하이드로클로라이드(Pyridoxine hydrochloride), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민 하이드로클로라이드(Thiamine hydrochloride), 비타민 B12(Vitamin B12), i-이노시톨(i-Inositol), 질산칼슘(Calcium nitrate), 황산마그네슘(Magnesium Sulfate), 염화칼륨(Potassium Chloride), 중탄산나트륨(Sodium Bicarbonate), 염화나트륨(Sodium Chloride), 제일인산나트륨 수화물(Sodium Phosphate dibasic anhydrous), D-글루코스(D-Glucose), 글루타티온(Glutathione), HEPES, 페놀레드(Phenol Red) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
시판되는 제품의 예시로는 GIBCO사의 RPMI 1640 Medium이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
필요에 따라 상기 배양은 여러 단계로 수행될 수 있다. 예를 들어, 1단계 또는 2단계 이상으로 수행될 수 있다.
2단계 이상으로 수행되는 경우, 예를 들면 1단계에서 배양된 림프구를 분리해 내고, 2단계에서 이를 새로운 배지로 옮겨 배양할 수 있다.
2단계 이상으로 수행되는 경우, 1단계 배지는 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2 및 FBS를 포함 하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 1단계 배지는 항 CD3 항체 및 인터루킨-2를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2 및 FBS를 포함하되, 항 CD3 항체는 포함하지 않을 수 있다.
항 CD3 항체, 인터루킨-2는 전술한 범위 내의 농도로 포함될 수 있으며, 앞서 예시한 배지를 사용할 수 있다.
2단계 이상으로 수행되는 경우 1단계 배지는 FBS를 5 내지 15부피%, 구체적으로 8 내지 12부피% 포함할 수 있고, 2단계 배지는 FBS를 0.1 내지 2부피%, 구체적으로 0.3 내지 1.5부피% 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
3단계로 수행되는 경우 1단계 배지는 FBS를 5 내지 15부피%, 구체적으로 8 내지 12부피% 포함할 수 있고, 2단계 배지는 FBS를 0.1 내지 1부피%, 구체적으로 0.3 내지 0.8부피% 포함할 수 있고, 3단계 배지는 FBS를 0.1 내지 2부피%, 구체적으로 0.5 내지 1.5부피% 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양은 일반적인 세포배양방법, 예를 들면 CO2 인큐베이터 내에서 행해질 수 있다. CO2 농도는 예를 들면 1 내지 10%, 구체적으로는 3 내지 7% 일 수 있고, 온도는 30 내지 40℃, 구체적으로 35 내지 38℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양은 림프구가 충분히 활성, 증식할 때까지 수행될 수 있으며 예를 들면 10일 내지 30일, 구체적으로 12일 내지 21일간 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 효율 개선을 위해, 배양 동안 세포 수 증가에 맞추어 배지를 추가해주는 것이 바람직하다. 배지 추가의 주기는 배양액의 열화 방지를 위해 예를 들면 1 내지 10일, 구체적으로 1 내지 7일에 1회씩 추가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이후 필요에 따라 배지를 원심분리하여 상층액을 제거하여 활성화 림프구를 분리할 수 있다.
앞서 예시한 배양 기간, 그리고 배지의 양은 세포의 증가 속도, 증가 정도에 따라 적절하게 조절될 수 있는 것으로, 그 세포의 공여자에 따라 세포가 자라는 속도가 다르기 때문에 그에 맞추어 상기 범위 내에서 배양 기간이 적절하게 선택될 수 있고, 배지의 양을 추가하거나, 보다 큰 양의 배지로 세포를 옮길 수 있다.
본 발명의 방법에서 림프구는 말초혈액에서 분리되고 동결된 것일 수 있다.
구체적으로, 말초혈액에서 분리되고 배양 후 동결된 것일 수 있다. 상기 배양은 전술한 배지에서의 배양일 수 있다.
동결된 림프구는 해동 후 다시 배양하여 활성화 림프구를 얻을 수 있다.
해동은 예를 들면 30℃ 내지 40℃에서 1분 내지 20분간 가온하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
해동된 림프구의 배양은 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함한 배지에서 수행될 수 있다.
항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS의 농도는 전술한 범위 내일 수 있고, 배지 성분은 앞서 예시한 성분들이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 해동된 림프구의 배양은 1단계 또는 2단계 이상으로 나누어 수행될 수 있고, 보다 구체적으로 3단계 이상으로 수행될 수 있다.
2단계로 수행되는 경우 예를 들면 항 CD3 항체를 포함하지 않는 배지에서 제1 배양 후, 항 CD3 항체를 포함하는 배지에서 제2 배양될 수 있다.
제1 배양은 예를 들면 1 내지 3일간 수행될 수 있고, 제2 배양은 예를 들면 2 내지 5일 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항 CD3 항체의 농도는 전술한 범위 내일 수 있다.
제3 배양의 배지는 항 CD3 항체는 포함하지 않을 수 있다.
제3 배양의 배지에서 FBS는 예를 들면 0.1 내지 2부피%, 구체적으로 0.5 내지 1.5부피% 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 앞서 예시한 단계들을 포함함으로써, 별도의 세포 분류과정(예를 들어, FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting), MACS(Magnetic activated cell sorting) 등)으로 CD3+, CD8+, CD56+ 또는 NKG2D+ 세포를 분류하거나, 이들 세포만 모으거나, 선택적으로 분리하여 배양 등의 과정 없이도, CD8+CD56+NKG2D+ 세포 비율이 높은 활성화 림프구를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 활성화 림프구를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 암의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 췌장암, 위암, 유방암, 악성 폐신생물, 난소암, 뇌신생물, 담관암, 결장직장암, 담낭암, 직장암, 악성흑색종, 자궁경부암, 담관암, 결장암, 전이성 위암, 교모세포종, 신장암, 십이지장 신생물, 침샘 신생물, 식도암, 자궁내막암, 부비강암, 소장암종, 유잉육종, 자궁육종, 바터팽대의 악성 신생물, 전립샘암, 전립선 신생물, 골육종, 다형교모세포종, 별아교세포종, 자궁암, 흉선종, 내분비 신생물, 연부조직암, 뇌간교종, 재발 난소암, 혀신생물, 지방육종, 신경섬유종, 신경내분비 암종, 방광암, 악성 신생물, 림프종, 피부 신경내분비암종, 부신암, 횡문근 육종, 신생물, 자궁 평활근종, 전이성 유방암, 간암 및 반지세포암종으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있고, 구체적으로는 간암, 신장암, 췌장암, 악성흑색종, 전립샘암 및 대장암로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 앞서 예시한 다양한 담체, 부형제, 희석제 등을 포함할 수 있으며, 일 구현예에 따르면 식염수를 포함할 수 있고, 구체적으로는 활성화 림프구, 식염수, 사람 혈청 알부민을 포함하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 상기 성분들로 이루어진 것일 수 있다.
사람 혈청 알부민은 식염수에 포함되어 제공될 수 있고, 구체적으로 0.5% 내지 3%, 보다 구체적으로 1% 사람 혈청 알부민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
활성화 림프구의 제조
1. 제조방법 1
(1) 채혈과 림프구의 분리
본 발명에서 사용된 활성화 림프구는 환자의 자가말초혈액 20~70mL을 채취하여 제조를 시작한다. 채취된 혈액은 250mL 시험관으로 옮긴 후 RPMI1640와 1:2의 비율로 3배 희석한 뒤, Ficoll-paque가 분주되어있는 50mL 시험관에 희석한 혈액 30~40mL을 층이 섞이지 않게 분주하고 회전수 2,000rpm으로 실온에서 20분간 원심분리를 실시한다.
상층의 혈장층을 림프구 층의 세포가 빨려 들어가지 않도록 서서히 제거한 후 분리된 단핵구 층을 50mL 시험관에 옮긴다. 분리된 단핵구 층을 RPMI1640과 1:2로 3배 희석한 뒤, 회전수 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 모아진 세포를 풀어준다.
(2) 림프구 배양 1
(1)에서 분리한 림프구를 림포미디움(lymphomedium) 50mL에 풀어주고 1ug/ml 내지 10ug/ml의 항 CD3 항체가 바닥면적 225cm2에 코팅된 플라스크에 분주하여 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양을 개시한다. 이 때, 림포미디움(lymphomedium) 안에는 500U/ml 내지 800U/ml의 인터루킨-2와 10%의 FBS가 포함되어 있다. 림포미디움(lymphomedium)은 human leukemic cell을 포함한 다양한 포유동물 세포 등의 부유성 세포배양에 통상 사용되고 있는 성분들을 더 포함하는 것으로, 질산칼슘(Ca(NO3)2 4H2O, 90 내지 100mg/L), 염화칼륨(KCl, 380 내지 400mg/L), 황산마그네슘(MgSO4, 40 내지 50mg/L), 염화나트륨(NaCl, 5500 내지 6000mg/L), 인산수소이나트륨(Na2HPO4, 750 내지 800mg/L), D-글루코스(D-Glucose, 1900 내지 2000mg/L), 글루타티온(Glutathione, 0.8 내지 1.5mg/L), 페놀레드(Phenol Red, 4 내지 6mg/L), L-아르기닌(L-Arginine, 190 내지 200mg/L), L-아스파라긴(L-Asparagine, 40 내지 50mg/L), L-아스파르트산(L-Aspartic Acid, 15 내지 25mg/L), L-시스틴 2하이드로클로라이드(L-Cystine 2HCL, 50 내지 70mg/L), L-글루탐산(L-Glutamic Acid, 15 내지 25mg/L), L-글루타민(L-Glutamine, 450 내지 460mg/L), 글라이신(Glycine, 8 내지 15 mg/L), L-히스티딘(L-Histidine, 10 내지 20mg/L), L-하이드록시프롤린(L-Hydroxyproline, 15 내지 25mg/L), L-이소류신(L-Isoleucine, 45 내지 55mg/L), L-류신(L-Leucine, 45 내지 55 mg/L), L-라이신 하이드로클로라이드(L-Lysine HCL, 30 내지 50mg/L), L-메티오닌(L-Metionine, 10 내지 20mg/L), L-페닐알라닌(L-Phenylalanine, 10 내지 20mg/L), L-프롤린(L-Proline, 10 내지 25mg/L), L-세린(L-serine, 25 내지 35mg/L), L-트레오닌(L-Threonine, 15 내지 25mg/L), L-트립토판(L-Tryptophan, 1 내지 10mg/L), L-타이로신 2Na 2 H2O(L-Tyrosine 2Na 2H2O, 25 내지 35mg/L), L-발린(L-Valine, 15 내지 25mg/L), 비오틴(Biotin, 0.1 내지 1mg/L), D-판토텐산칼슘(D-Ca pantothenate, 0.1 내지 1mg/L), 염화콜린(Choline Chloride, 1 내지 5mg/L), 엽산(Folic Acid, 0.5 내지 1.5mg/L), I-이노시톨(I-inositol, 30 내지 40mg/L), 나이아신아마이드(Niacinamide, 0.5 내지 1.5mg/L), 파라아미노벤조산(Para-aminobenzoic A, 0.5 내지 1.5mg/L), 피리독신 하이드로클로라이드(Pyridoxine HCL, 0.5 내지 1.5mg/L), 리보플라빈(Riboflavin, 0.1 내지 1mg/L), 티아민 하이드로클로라이드 (Thiamine HCL, 0.1 내지 1.5mg/L), 비타민 B12(Vitamin B12, 0.001 내지 0.01mg/L), 옥살로아세트산(Oxaloacetic acid, 0.1 내지 1g/L), 인슐린(Insulin, 0.001 내지 0.01g/L), 카나마이신(Kanamycin, 0.01 내지 0.1g/L), 스트렙토마이신(Streptomycin, 0.01 내지 0.1g/L), 헤페스(HEPES, 1 내지 5g/L), 탄산수소나트륨(NaHCO3, 1 내지 5g/L), 파이루빈산나트륨(Pyruvic acid sodium, 100 내지 150mg/L)를 포함한 배지이다.
배양 3~4일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포를 육안 확인 후 세포 농도의 증가에 따라 총 200mL의 림포미디움(lymphomedium)을 넣어주고 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양한다.
(3) 림프구 배양 2
배양 5~8일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 플라스크 측면에 손으로 충격을 주어 바닥에 붙은 세포를 떼어낸다. 백팩미디움(bagpackmedium)이 750mL 들어있는 bagpack을 준비하고 FBS 최종 농도가 0.5부피%가 되도록 3.75mL의 FBS를 넣는다. Bagpack의 syringe port를 열어서 70%의 에탄올로 소독한 후, 60mL Lock 타입 주사기를 연결한다. 주사기를 이용하여 플라스크에 배양된 세포를 배지와 함께 옮긴 후, Bag과 주사기를 분리한다. Bag용 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 폐쇄계 배양을 시작한다. 백팩미디움은 100 내지 300U/ml의 인터루킨-2를 포함한다.
백팩미디움(bagpackmedium)은 콜로니 증식, T 세포 증식에 통상 사용되는 성분들을 더 포함하는 것으로, 염화칼슘(CaCl2, 50 내지 60mg/L), 황산구리-5H2O(CuSO4-5H2O, 0.0001 내지 0.001 mg/L), 질산철 9H2O (Fe(NO3)3"9H2O, 0.1 내지 1 mg/L), 황산철-7H2O(FeSO4-7H2O, 0.1 내지 0.5mg/L), 염화칼륨(KCL, 140 내지 160 mg/L), 염화마그네슘(MgCl2, 10 내지 20 mg/L), 황산마그네슘(MgSO4, 20 내지 30 mg/L), 염화나트륨(NaCl, 3000 내지 4000 mg/L), 인산수소나트륨(NaH3PO4, 20 내지 40 mg/L), 인산수소이나트륨(Na2HPO4, 20 내지 40 mg/L), 황산아연-7H2O(ZnSO4-7H2O, 0.1 내지 1mg/L), D-글루코스(D-Glucose, 1500 내지 1600mg/L), Na 히포잔틴(Na Hypoxanthine, 1 내지 5mg/L), 리놀레산(Linoleic Acid, 0.01 내지 0.1mg/L), 리포산(Lipoic Acid, 0.01 내지 0.1mg/L), 페놀레드(Phenol Red, 1 내지 10mg/L), 푸트레신 2하이드로클로라이드(Putrescine 2HCL, 0.01 내지 0.1mg/L), 피루브산나트륨(Sodium Pyruvate, 50 내지 60mg/L), 티미딘(Thymidine, 0.1 내지 0.5mg/L), L-알라닌(L-Alanine, 1 내지 5mg/L), L-아르기닌-하이드로클로라이드(L-Arginine-HCL, 70 내지 80mg/L), L-아스파라긴- H2O(L-Asparagine-H2O, 1 내지 5mg/L), L-아스파르트산(L-Aspartic Acid, 1 내지 5mg/L), L-시스테인-H2O(L-Cysteine-H2O, 5 내지 10mg/L), L-시스테인 2하이드로클로라이드(L-Cystine 2HCL, 10 내지 20mg/L), L-글루탐산(L-Glutamic Acid, 1 내지 5mg/L), L-글루타민(L-Glutamine, 280 내지 290mg/L), 글라이신(Glycine, 5 내지 15mg/L), L-히스티딘하이드로클로라이드-H2O(L-Histidine HCL-H2O, 10 내지 20mg/L), L-이소류신(L-Isoleucine, 20 내지 30mg/L), L-류신(L-Leucine, 25 내지 35mg/L), L-라이신 하이드로클로라이드(L-Lysine HCL, 40 내지 50mg/L), L-메티오닌(L-Metionine, 5 내지 10mg/L), L-페닐알라닌(L-Phenylalanine, 15 내지 20mg/L), L-프롤린(L-Proline, 5 내지 10mg/L), L-세린(L-Serine, 10 내지 15mg/L), L-트레오닌(L-Threonine, 20 내지 30mg/L), L-트립토판(L-Tryptophan, 1 내지 10mg/L), L-타이로신 2Na 2 H2O (L-Tyrosine 2Na2H2O, 25 내지 30mg/L), L-발린(L-Valine , 20 내지 30mg/L), 비오틴(Biotin, 0.001 내지 0.01mg/L), D-판토텐산칼슘(D-Ca pantothenate, 1 내지 5mg/L), 염화콜린(Choline Chloride, 1 내지 10mg/L), 엽산(Folic Acid, 1 내지 5mg/L), I-이노시톨(I-inositol, 1 내지 10mg/L), 나이아신아마이드(Niacinamide, 1 내지 5mg/L), 피리독신 하이드로클로라이드(Pyridoxine HCL, 1 내지 5mg/L), 리보플라빈(Riboflavin , 0.1 내지 0.5mg/L), 티아민 하이드로클로라이드(Thiamine HCL, 1 내지 5mg/L), 비타민 B12(Vitamin B12, 0.1 내지 0.5mg/L), 옥살로아세트산(Oxaloacetic acid, 0.1 내지 0.5g/L), 인슐린(Insulin, 0.001 내지 0.01g/L), 카나마이신(Kanamycin, 0.01 내지 0.1g/L), 스트렙토마이신(Streptomycin, 0.01 내지 0.1g/L), 헤페스(HEPES, 1 내지 5g/L), 탄산수소나트륨(NaHCO3, 0.1 내지 1g/L), 알부민(Albumin, 0.1 내지 1g/L), 셀레늄(Selenium, 0.001 내지 0.01g/L), AIM-V (400 내지 600mL)를 포함한 배지이다.
(4) 림프구 배양 3
Bag내 배양 3~8일 후 1000ml의 스플릿미디움(splitmedium)이 들어있는 split bag을 준비하여 FBS 농도가 1부피%가 되도록 FBS를 syringe port를 통해 10mL의 FBS를 넣는다. Splitbag과 세포를 배양하고 있는 bagpack의 양쪽라인을 무균연결장치를 사용하여 접합한다. Splitbag의 스플릿미디움(splitmedium)을 세포가 들어있는 bagpack에 전량 넣어준 뒤 각 배양 용기에 동일한 양이 들어가도록 균등 분할하여 무균접합기를 이용해 두 백을 분리 접합 시킨다. 이 후 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 폐쇄계 배양을 3일 이상 배양한다. 스플릿미디움은 100 내지 300U/ml의 인터루킨-2를 포함한다.
스플릿미디움(splitmedium)은 콜로니 증식, 장기간 배양에 통상 사용되는 성분들을 더 포함하는 것으로, 염화칼슘(CaCl2, 100 내지 120mg/L), 황산구리-5H2O (CuSO4-5H2O, 0.001 내지 0.01mg/L), 질산철 9H2O(Fe(NO3)3"9H2O, 0.01 내지 0.1mg/L), 황산철-7H2O(FeSO4-7H2O, 0.1 내지 1mg/L), 염화칼륨 (KCl, 300 내지 320mg/L), 염화마그네슘(MgCl2, 25 내지 30mg/L), 황산마그네슘(MgSO4, 45 내지 50mg/L), 염화나트륨(NaCl, 6500 내지 7500mg/L), 인산수소나트륨(NaH3PO4, 60 내지 70mg/L), 인산수소이나트륨(Na2HPO4, 70 내지 80mg/L), 황산아연-7H2O(ZnSO4-7H2O, 0.1 내지 1mg/L), D-글루코스(D-Glucose, 3100 내지 3200mg/L), Na 히포잔틴(Na Hypoxanthine, 1 내지 5mg/L), 리놀레산(Linoleic Acid, 0.01 내지 0.1mg/L), 리포산(Lipoic Acid, 0.1 내지 0.5mg/L), 페놀레드(Phenol Red, 5 내지 10mg/L), 푸트레신 2하이드로클로라이드(Putrescine 2HCl, 0.01 내지 1mg/L), 피루브산나트륨(Sodium Pyruvate, 100 내지 120mg/L), 티미딘(Thymidine, 0.1 내지 1mg/L), L-알라닌(L-Alanine, 1 내지 10mg/L), L-아르기닌-하이드로클로라이드(L-Arginine-HCL, 140 내지 160mg/L), L-아스파라긴-H2O(L-Asparagine-H2O, 5 내지 10mg/L), L-아스파르트산(L-Aspartic Acid, 5 내지 10mg/L), L-시스테인-H2O(L-Cysteine-H2O, 15 내지 20mg/L), L-시스틴 2하이드로클로라이드(L-Cystine 2HCL, 30 내지 35mg/L), L-글루탐산(L-Glutamic Acid, 5 내지 10mg/L), L-글루타민(L-Glutamine, 560 내지 570mg/L), 글라이신(Glycine, 15 내지 20mg/L), L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O(L-Histidine HCL-H2O, 30 내지 35mg/L), L-이소류신(L-Isoleucine, 50 내지 60mg/L), L-류신(L-Leucine, 55 내지 65mg/L), L-라이신 하이드로클로라이드(L-Lysine HCL, 85 내지 95mg/L), L-메티오닌(L-Metionine, 15 내지 20mg/L), L-페닐알라닌(L-Phenylalanine, 30 내지 40mg/L), L-프롤린(L-Proline, 15 내지 20mg/L), L-세린(L-Serine, 20 내지 30mg/L), L-트레오닌(L-Threonine, 50 내지 55mg/L), L-트립토판(L-Tryptophan, 5 내지 10mg/L), L-티로신 2Na2H2O(L-Tyrosine 2Na2H2O, 50 내지 60mg/L), L-발린(L-Valine, 50 내지 55mg/L), 비오틴(Biotin, 0.001내지 0.01mg/L), D-판토텐산칼슘(D-Ca pantothenate, 1 내지 5mg/L), 염화콜린(Choline Chloride, 5 내지 15mg/L), 엽산(Folic Acid, 1 내지 5mg/L), I-이노시톨 (I-inositol, 10 내지 15mg/L), 나이아신아마이드(Niacinamide, 1 내지 5mg/L), 피리독신 하이드로클로라이드(Pyridoxine HCL, 1 내지 5mg/L), 리보플라빈(Riboflavin, 0.1 내지 1mg/L), 티아민 하이드로클로라이드(Thiamine HCL, 1 내지 5mg/L), 비타민 B12(Vitamin B12, 0.1 내지 1mg/L), 옥살로아세트산(Oxaloacetic acid, 0.1 내지 1g/L), 인슐린(Insulin, 0.001 내지 0.01g/L), 카나마이신(Kanamycin, 0.01내지 0.1g/L), 스트렙토마이신(Streptomycin, 0.01 내지 0.1g/L), 헤페스(HEPES, 1 내지 5g/L), 탄산수소나트륨(NaHCO3, 1 내지 5g/L), 알부민(Albumin, 0.5 내지 1.5g/L), 셀레늄(Selenium, 0.001 내지 0.01g/L)를 포함한 배지이다.
(5) 오염 및 성능의 확인
세포를 수집하기 전 배양중인 제품의 시험 샘플을 채취해 제품의 오염과 성능을 확인한다.
(5)-1: 세포 수집 3일 전, 세포 육안시험을 실시한 후 채취 전 세포가 골고루 섞이도록 배양액을 흔들어 준다. 세포 배양 중인 백의 syringe port를 먼저 소독한 후 주사기로 세포 배양액 32 ~ 55mL를 채취하여 각 시험(A~C)에 의뢰한다.
(5)-2: 세포 수집 1일 전 또는 당일, 세포 육안시험을 실시한 후 채취 전 세포가 골고루 섞이도록 배양액을 흔들어 준다. 세포 배양 중인 백의 syringe port를 먼저 소독한 후 주사기로 세포배양액 24 ~ 30mL를 채취하여 각 시험(D, E)에 의뢰한다.
A: 무균시험
B: 마이코플라스마 부정시험
C: 외래성 바이러스 부정시험
D: 확인시험 및 순도시험
E: 역가시험
(6) 세포 수집
배양 12 ~ 21일에 배양을 종료하고 Bag 하나의 세포 배양액 1,000mL을 250mL 시험관 4개에 옮긴다. 이 때 배양백의 수집 라인을 70% 에탄올로 소독한 후 가위로 자른다.
회전속도 2,000rpm 으로 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후, 상층액을 제거 한 뒤 vortex를 이용해 세포를 잘 풀어준다. 나머지 배양백도 동일한 시험관 4개에 세포 배양액을 모아 상동의 조건에서 원심분리를 한 뒤, 상층액을 제거하고 세포를 잘 풀어준다.
사람혈청알부민과 생리식염수를 섞어 0.1% 사람혈청알부민 용액을 만든 후, 시험관에 있는 세포를 1회차 세척한다.
회전속도 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후 상층액을 깨끗이 제거한 뒤, vortex를 이용해 세포를 풀어준다.
0.1% 사람혈청알부민 용액으로 2회차 세척 후 회전속도 2,000rpm으로 실온에서 원심분리하여 세포를 모은 후 상층액을 깨끗이 제거한 뒤 vortex를 이용해 세포를 풀어준다.
사람혈청알부민과 생리식염수를 섞어 1% 사람혈청알부민 용액을 만든다.
모아진 세포를 1% 사람혈청알부민 용액에 부유시킨 뒤, 골고루 혼합한다. 검체 중 일부를 채취하여 각 시험(A~D)에 의뢰한다.
완제품 충전백의 라인을 70% 에탄올로 소독한 후 잘라서 50mL 주사기와 연결한 후 세포부유액을 완제품 충전백에 충전한다. 완제품 충전백의 라인은 입구로부터 1cm 위치에서 3번(0.5cm) 밀봉한 후 두번째 밀봉 부분을 잘라주어 최종적으로 활성화 림프구를 완성하였다.
A: 총 세포 수 측정시험 및 세포 생존율시험
B: 무균시험
C: 엔도톡신시험
D: 마이코플라스마 검출시험
2. 제조방법 2
(1) 채혈과 림프구의 분리
본 발명에서 사용된 활성화 림프구는 환자의 자가말초혈액 20~70mL을 채취하여 제조를 시작한다. 채취된 혈액은 250mL 시험관으로 옮긴 후 RPMI1640와 1:2의 비율로 3배 희석한 뒤, Ficoll-paque가 분주되어있는 50mL 시험관에 희석한 혈액 30~40mL을 층이 섞이지 않게 분주하고 회전수 2,000rpm으로 실온에서 20분간 원심분리를 실시한다.
상층의 혈장층을 림프구 층의 세포가 빨려들어가지 않도록 서서히 제거한 후 분리된 단핵구 층을 50mL 시험관에 옮긴다. 분리된 단핵구 층을 RPMI1640과 1:2로 3배 희석한 뒤, 회전수 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 모아진 세포를 풀어준다.
(2) 림프구 배양
(1)에서 분리한 림프구를 림포미디움(lymphomedium) 50mL에 풀어주고 항 CD3 항체가 바닥면적 225cm2에 코팅된 플라스크에 분주하여 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양을 개시한다. 이 때, 림포미디움(lymphomedium) 안에는 500U/ml 내지 800U/ml의 인터루킨-2와 10%의 FBS가 포함되어 있다.
배양 3~4일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포를 육안 확인 후 세포 농도의 증가에 따라 총 130mL의 림포미디움(lymphomedium)을 넣어주고 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양한다.
(3) 림프구 동결
배양 5일째에 배양 중인 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포 육안시험을 실시하여 적합한지 확인한다. 육안시험 적합 시 플라스크 측면에 손으로 충격을 주어 바닥에 붙은 세포를 떼어낸다. 이 때 거품이 나지 않도록 주의한다. 떼어낸 세포를 500uL를 채취하여 세포 수를 측정한 후 한 개의 동결튜브 당 3Х107 cells 이상이 되도록 계산하여 몇 개의 동결튜브가 필요한지 확인 후 동결튜브를 준비해 놓는다.
동결튜브 개수에 맞게 FBS가 10% 농도가 되도록 첨가하여 세포동결보존액을 만든다.
플라스크에 있는 배양된 림프구를 250mL 시험관에 옮겨 회전수 1,200rpm으로 실온에서 5분간 원심분리 후 suction을 사용하여 상층액을 깨끗이 제거한다. 이 때 세포가 딸려오지 않도록 주의한다. 상층액이 제거된 세포를 손으로 tapping한 후 vortex를 이용해 풀어준 뒤, 세포 동결보존액을 동결튜브 하나당 1.8mL씩 분주되도록 양을 설정하여 세포와 섞어준다. 준비된 동결튜브에 세포부유액을 분주한다. 분주된 동결튜브는 Freezing Container(Freezing Container)에 넣어 Deep Freezer에 보관한다. Deep Freezer에서 보관후, 균검출시험에 대한 중간판정의 적·부 판정결과를 확인한 뒤, 적합 시 -196℃ 질소탱크로 옮겨서 해동 시까지 보관한다.
(4) 동결림프구의 안정성 시험
동결림프구를 -196℃ 질소탱크로 옮긴 날로부터 이틀 뒤 얼려진 동결림프구 하나를 꺼내 Freezing Container에 넣어 37℃ Dry Bath로 이동 후 가온시켜 녹인다. 15mL 시험관에 미리 분주해 놓은 세정액 10mL에 녹인 동결림프구 중 0.45mL (4배 희석)를 부유 시킨 후 회전수 1,200rpm으로 실온에서 3분간 원심분리를 실시한다. 분리된 세포의 상층액을 제거 후 세포를 풀어준 다음 배양배지 10mL에 부유시킨다. 검체를 채취하여 15mL 시험관에 옮긴 뒤, 품질관리팀에 시험 A~C를 의뢰한다. 나머지 세포부유액은 24 well plate에 well당 2mL씩 분주한 후 플라스크용 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 2일간 배양한다. 2일 뒤, 24 well plate에서 배양 중인 세포를 현미경으로 관찰하여 세포육안시험을 실시한다. 24 well plate에 있는 세포를 15mL 시험관 하나로 모은 뒤, 공정 중 시험용 검체 10㎕를 채취한 뒤 세포 수 및 생존율을 측정하여 적·부 판정을 한다. 동결림프구의 안정성 시험의 품질시험 A~C의 최종 결과를 확인하여 동결보관완료 적합을 판정한다.
A: 균검출시험
B: 엔도톡신시험
C: 마이코플라스마 검출시험
3. 제조방법 2
(1) 림프구 해동 및 배양
얼려진 동결림프구 하나를 꺼내어 Freezing Container에 넣고, 이동하여 37℃ Dry-Bath에서 가온시켜 녹인다. 시험관에 미리 분주해 놓은 세정액 (RPMI1640 배지+1.0N HCL 3mL) 10mL에 녹인 세포를 부유시켜 회전수 1,200rpm으로 실온에서 3분간 원심분리를 실시한다. 분리된 세포의 상층액을 제거 후 세포를 풀어준 다음 림포미디움(lymphomedium) 40mL에 세포를 부유시킨다. 공정 중 시험검체 10㎕를 채취하여 세포 수 및 생존율을 측정하고 세포부유액을 24 well plate에 2mL씩 분주하고 플라스크용 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양을 실시한다.
인터루킨-2의 경우 배양이 종료되는 시점까지 500U/ml 내지 800U/ml의 농도로 유지한다.
(2) 림프구 배양 1
배양 이틀째, 24 well plate에서 배양 중인 세포를 육안으로 확인 후 T225 플라스크로 옮겨준다. 그리고 림포미디움(lymphomedium) 50mL을 더 첨가한 후 플라스크용 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양한다. 배양 4일째, 현미경을 통해 세포를 육안으로 확인 후 배양중인 세포를 풀어주고 항 CD3 항체가 바닥면적 225cm2에 코팅된 플라스크로 옮기고 림포미디움(lymphomedium) 150mL을 넣는다. 플라스크용 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양을 실시한다.
(3) 림프구 배양 2
배양 6~8일째, 배양 중인 플라스크를 꺼내 현미경으로 세포 육안시험을 실시하여 적합한지 확인 후 바닥 면에 손으로 충격을 주어 바닥에 붙은 세포를 떼어낸다. 검체 500㎕를 채취하여 15mL 시험관으로 옮겨 세포 수 및 생존율을 측정한다. 세포를 떼어낸 플라스크 안에 백팩미디움(bagpackmedium)의 최종 농도가 0.5%가 되도록 FBS를 넣어준다. 배양용 Bag의 syringe port를 열어 70% 에탄올로 소독 후 60mL Lock 타입 주사기를 연결한다. 주사기를 이용하여 플라스크에 배양된 세포를 배지와 함께 옮긴 후 Bag과 주사기를 분리한다. Bag용 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 폐쇄계 배양을 실시한다.
(4) 림프구 배양 3
Bag내 배양 3~8일 후 1000ml의 스플릿미디움(splitmedium)이 들어있는 배양용 bag을 준비하고 FBS 농도가 1%가 되도록 syringe port를 통해 10mL의 FBS를 넣는다. 배양용 bag과 세포를 배양하고 있는 bag의 양쪽라인을 무균연결장치를 사용하여 접합한다. 배양용 bag의 스플릿미디움(splitmedium)을 세포를 배양하고 있는 bag에 전량 넣어준 뒤 각 배양 용기에 동일한 양이 들어가도록 균등 분할하여 무균접합기를 이용해 두 백을 분리 접합 시킨다. 이 후 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 폐쇄계 배양을 3일 이상 배양한다.
(5) 오염 및 성능의 확인
세포를 수집하기 전 배양중인 제품의 시험 샘플을 채취해 제품의 오염과 성능을 확인한다.
(5)-1: 세포 수집 3일 전, 세포 육안시험을 실시한 후 채취 전 세포가 골고루 섞이도록 배양액을 흔들어 준다. 세포 배양 중인 백의 syringe port를 먼저 소독한 후 주사기로 세포 배양액 32 ~ 55mL를 채취하여 각 시험(A~C)에 의뢰한다.
(5)-2: 세포 수집 1일 전 또는 당일, 세포 육안시험을 실시한 후 채취 전 세포가 골고루 섞이도록 배양액을 흔들어 준다. 세포 배양 중인 백의 syringe port를 먼저 소독한 후 주사기로 세포배양액 24 ~ 30mL를 채취하여 각 시험(D, E)에 의뢰한다.
A: 무균시험
B: 마이코플라스마 부정시험
C: 외래성 바이러스 부정시험
D: 확인시험 및 순도시험
E: 역가시험
(6) 세포 수집
배양 12 ~ 21일에 배양을 종료하고 Bag 하나의 세포 배양액 1,000mL을 250mL 시험관 4개에 옮긴다. 이 때 배양백의 수집 라인을 70% 에탄올로 소독한 후 가위로 자른다.
회전속도 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후, 상층액을 제거 한 뒤 vortex를 이용해 세포를 잘 풀어준다. 나머지 배양백도 동일한 시험관 4개에 세포 배양액을 모아 상동의 조건에서 원심분리를 한 뒤, 상층액을 제거하고 세포를 잘 풀어준다.
사람혈청알부민과 생리식염수를 섞어 0.1% 사람혈청알부민 용액을 만든 후, 시험관에 있는 세포를 1회차 세척한다.
회전속도 2,000rpm으로 실온에서 5분간 원심분리하여 세포를 모은 후 상층액을 깨끗이 제거한 뒤, vortex를 이용해 세포를 풀어준다.
0.1% 사람혈청알부민 용액으로 2회차 세척 후 회전속도 2,000rpm으로 실온에서 원심분리하여 세포를 모은 후 상층액을 깨끗이 제거한 뒤 vortex를 이용해 세포를 풀어준다.
사람혈청알부민과 생리식염수를 섞어 1% 사람혈청알부민 용액을 만든다.
모아진 세포를 1% 사람혈청알부민 용액에 부유시킨 뒤, 골고루 혼합한다. 검체 중 일부를 채취하여 각 시험(A~D)에 의뢰한다.
완제품 충전백의 라인을 70% 에탄올로 소독한 후 잘라서 50mL 주사기와 연결한 후 세포부유액을 완제품 충전백에 충전한다. 완제품 충전백의 라인은 입구로부터 1cm 위치에서 3번(0.5cm) 밀봉한 후 두번째 밀봉 부분을 잘라주어 최종적으로 활성화 림프구를 완성하였다.
A: 총 세포 수 측정시험 및 세포 생존율시험
B: 무균시험
C: 엔도톡신시험
D: 마이코플라스마 검출시험
제조된 활성화 림프구의 세포 표현형 분석
사이토카인 유도 살해세포의 분포 정도를 확인하기 위하여, 배양 완료된 세포의 샘플을 일부 채취하여 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)로 분석하였다.
음성 대조군 항체로 IgG1-FITC, IgG1-PE, IgG1-APC를 준비하고, 실험군 항체로 항 CD3-FITC, 항 CD8-PE, 항 CD8-FITC, 항 CD56-PE, 항 CD56 APC, 항 NKG2D-PE를 준비한다. (Double stain 및 triple stain시 형광이 겹치지 않게 하기 위해 다른 형광이 붙은 같은 항체를 사용하였다.) 완충용액은 albumin이 0.5% 함유된 인산염 완충용액으로 사용한다.
배양이 완료된 항암 면역세포치료제의 세포 수를 측정하고 0.5x107cells/mL이 되도록 준비한다. 회전수 1,600rpm으로 실온에서 4분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 0.5x107cells/mL이 되도록 완충용액을 넣어준다. 5mL 시험관을 준비한 후 0.5x107cells/mL의 세포부유액을 각각 100uL씩 넣고 대조군 항체와 실험군 항체를 넣는다. 잘 섞어준 후 암소 상태로 상온에서 30분동안 반응시킨다. 30분 경과 후 완충용액 1mL을 첨가하고 회전수 1,600rpm으로 상온에서 4분간 원심분리한다. 상층액 제거 후 완충용액을 500㎕씩 넣어준 후 유세포분석기로 세포 표현형을 분석한다.
제조된 활성화 림프구의 항암 효능 평가 항목, 평가 방법 및 암종별 동물모델의 준비
1. Human renal cancer (ACHN)에 대한 항암 효과 규명
동물모델 제작 및 시험물질 투여
누드 마우스(Nude mouse)는 구입 후, 한국생명공학연구원의 Specific pathogen free(SPF) room에서 보관하였으며, 1주일 동안 순화한 후 사용하였다. Human renal cancer인 ACHN 세포는 1.2Х107cells의 농도로 누드 마우스에 피하주사 하였다. 암세포 이식 다음날로부터 본 발명의 조성물을 누드마우스의 꼬리정맥으로 매주 1회씩 총 4회 주사하였다. 양성대조군으로는 아드리아마이신을 2mg/kg의 농도로 매주 1회씩 총 4회 정맥투여하였다.
종양 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 종양 크기, 무게 측정 및 일반 증상을 관찰하여 항암 효능을 평가하였으며 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다.
통계
모든 시험 결과의 표준 편차(SDs) 및 p-value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student's t-test 를 사용하여 산출되었다.
2. Human pancreatic cancer (AsPC-1)에 대한 항암 효과 규명
동물모델 제작 및 시험물질 투여
누드 마우스(Nude mouse)는 구입 후, 한국생명공학연구원의 Specific pathogen free(SPF) room에서 보관하였으며, 1주일 동안 순화한 후 사용하였다. Human pancreatic cancer인 AsPC1 세포는 9Х106cells의 농도로 누드 마우스에 피하주사 하였다. 암세포 이식 다음날로부터 본 발명의 조성물을 누드마우스의 꼬리정맥으로 매주 1회씩 총 4회 주사하였다. 양성대조군으로는 아드리아마이신을 2mg/kg의 농도로 매주 1회씩 총 4회 정맥투여하였다.
종양 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 종양 크기, 무게 측정 및 일반 증상을 관찰하여 항암 효능을 평가하였으며 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다.
통계
모든 시험 결과의 표준 편차(SDs) 및 p value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student's t test 를 사용하여 산출되었다.
3. Human melanoma cancer (LOX-IMV1)에 대한 항암 효과 규명
동물모델 제작 및 시험물질 투여
누드 마우스(Nude mouse)는 구입 후, 한국생명공학연구원의 Specific pathogen free(SPF) room에서 보관하였으며, 1주일 동안 순화한 후 사용하였다. Human melanoma cancer인 LOX-IMV1 세포는 1.5Х106cells의 농도로 누드 마우스에 피하주사 하였다. 암세포 이식 다음날로부터 본 발명의 조성물을 누드마우스의 꼬리정맥으로 매주 1회씩 총 3회 주사하였다. 양성대조군으로는 아드리아마이신을 2mg/kg의 농도로 매주 1회씩 총 3회 정맥투여하였다.
종양 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 종양 크기, 무게 측정 및 일반 증상을 관찰하여 항암 효능을 평가하였으며 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다.
통계
모든 시험 결과의 표준 편차(SDs) 및 p-value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student's t test 를 사용하여 산출되었다.
4. Human prostate cancer (PC-3)에 대한 항암 효과 규명
동물모델 제작 및 시험물질 투여
누드 마우스(Nude mouse)는 구입 후, 한국생명공학연구원의 Specific pathogen free(SPF) room에서 보관하였으며, 1주일 동안 순화한 후 사용하였다. Human prostate cancer인 PC-3 세포는 9Х106cells의 농도로 누드 마우스에 피하주사 하였다. 암세포 이식 다음날로부터 본 발명의 조성물을 누드마우스의 꼬리정맥으로 매주 1회씩 총 4회 주사하였다. 양성대조군으로는 아드리아마이신을 2mg/kg의 농도로 매주 1회씩 총 4회 정맥투여하였다.
종양 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 종양 크기, 무게 측정 및 일반 증상을 관찰하여 항암 효능을 평가하였으며 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다.
통계
모든 시험 결과의 표준 편차(SDs) 및 p value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student's t test 를 사용하여 산출되었다.
5. Human colon cancer (SW620)에 대한 항암 효과 규명
동물모델 제작 및 시험물질 투여
누드 마우스(Nude mouse)는 구입 후, 한국생명공학연구원의 Specific pathogen free(SPF) room에서 보관하였으며, 1주일 동안 순화한 후 사용하였다. Human colon cancer인 SW620 세포는 6Х106cells의 농도로 누드 마우스에 피하주사 하였다. 암세포 이식 다음날로부터 본 발명의 조성물을 누드마우스의 꼬리정맥으로 매주 1회씩 총 4회 주사하였다. 양성대조군으로는 아드리아마이신을 2mg/kg의 농도로 매주 1회씩 총 4회 정맥투여하였다.
종양 성장에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 종양 크기, 무게 측정 및 일반 증상을 관찰하여 항암 효능을 평가하였으며 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 동물의 체중을 측정하였다.
통계
모든 시험 결과의 표준 편차(SDs) 및 p-value는 ANOVA(Prisim, GraphPad software, USA) 및 student's t test 를 사용하여 산출되었다.
활성화 림프구의 세포 표현형 분석 결과
1) 상기 실시예에 따라 제조된 사이토카인 유도 살해세포의 세포 표현형을 분석한 결과, 여러가지 subpopulation들 중 가장 강한 세포 독성을 보이는 CD56+ 세포는 전체의 46.9%를 차지하였다. 그 중 MHC 비의존성이면서 CD56+을 단독 발현하는 세포군보다 더 높은 증식률과 세포 독성 활성을 가지는 세포인 사이토카인 유도 살해세포인 CD3+CD56+세포군은 44.4%로 CD56+ 세포의 94.7%를 차지하였다. CD8+CD56+를 동시 발현하는 세포군은 32.5%로 측정되었다. CD3+CD8+을 동시 발현하는 세포독성 T 림프구(Cytotoxicity T lymphocyte)는 65%로 측정되었다.(도 1 참고)
2) 상기 실시예에 따라 제조된 활성화 림프구를 CD8+로 gating 하여 CD8+CD56+의 발현을 분석한 결과, CD8+CD56+NKG2D+를 동시에 발현하는 세포가 전체의 28% 정도를 차지하였다.
제조된 활성화 림프구의 항암 효과 평가 결과
1. Human renal cancer (ACHN)에 대한 항암 효과 평가 결과
1) 종양 크기 변화
대조군의 경우 28일째에 321±47mm3으로 성장하였으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 274±51mm3으로 14%의 성장억제를, 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 209±26mm3으로 34%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.05). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 138±32mm3으로 56%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 192±44mm3으로 40%의 암성장 억제효과를 나타내었다.
2) 종양 무게 변화
최종일 (day 28)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. 대조군의 경우 평균 종양 무게는 651±164mg 이었으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 530±100mg으로 18%의 성장억제를, 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 435±118mg으로 33%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.05). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 308±95mg으로 52%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 409±41mg으로 37%의 암성장 억제효과를 나타내었다 (p<0.05).
3) 체중 변화
Day -1의 몸무게 (100%)와 비교하였을 때, day 28에는 대조군의 경우 105%, 본 발명의 조성물 투여군에서는 104~106%, 아드리아마이신 투여군에서는 95%의 정상적인 몸무게의 변화를 나타내었으며, 이상행동도 관찰되지 않았다.
4) 일반 증상 관찰
본 발명의 조성물을 투여하는 28일 동안 사망동물은 관찰되지 않았으며, 이상행동을 보이는 동물도 관찰되지 않았다.
2. Human pacnreatic cancer (AsPC-1)에 대한 항암 효과 규명
1) 종양 크기 변화
대조군의 경우 25일째에 251±50mm3으로 성장하였으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 192±25mm3으로 23%의 성장억제를 (p<0.05), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 146±26mm3으로 42%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 73±30mm3으로 70%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 130±28mm3으로 48%의 암성장 억제효과를 나타내었다.
2) 종양 무게 변화
최종일 (day 25)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. 대조군의 경우 평균 종양 무게는 790±193mg 이었으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 591±106mg으로 25%의 성장억제를 (p<0.05), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 457±45mg으로 42%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.05). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 267±84mg으로 66%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 473±64mg으로 44%의 암성장 억제효과를 나타내었다 (p<0.01).
3) 체중 변화
Day -1의 몸무게 (100%)와 비교하였을 때, day 25에는 대조군의 경우 130%, 본 발명의 조성물 투여군에서는 120~125%, 아드리아마이신 투여군에서는 125%의 정상적인 몸무게의 변화를 나타내었으며, 이상행동도 관찰되지 않았다.
4) 일반 증상 관찰
본 발명의 조성물을 투여하는 25일 동안 사망동물은 관찰되지 않았으며, 이상행동을 보이는 동물도 관찰되지 않았다.
3. Human melanoma cancer (LOX-IMV1)에 대한 항암 효과 규명
1) 종양 크기 변화
대조군의 경우 15일째에 254±43mm3으로 성장하였으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 167±78mm3으로 34%의 성장억제를 (p<0.05), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 108±35mm3으로 57%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 60±21mm3으로 76%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 71±458mm3으로 72%의 암성장 억제효과를 나타내었다.
2) 종양 무게 변화
최종일 (day 15)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. 대조군의 경우 평균 종양 무게는 1676±530mg 이었으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 1158±631mg으로 30%의 성장억제를, 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 799±258mg으로 52%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 401±166mg으로 76%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 496±306mg으로 70%의 암성장 억제효과를 나타내었다 (p<0.01).
3) 체중 변화
Day -1의 몸무게 (100%)와 비교하였을 때, day 15에는 대조군의 경우 130%, 본 발명의 조성물 투여군에서는 121~126%, 아드리아마이신 투여군에서는 122%의 정상적인 몸무게의 변화를 나타내었으며, 이상행동도 관찰되지 않았다.
4) 일반 증상 관찰
본 발명의 조성물을 투여하는 15일 동안 사망동물은 관찰되지 않았으며, 이상행동을 보이는 동물도 관찰되지 않았다.
4. Human prostate cancer (PC-3)에 대한 항암 효과 규명
1) 종양 크기 변화
대조군의 경우 22일째에 378±23mm3으로 성장하였으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 300±54mm3으로 20%의 성장억제를 (p<0.01), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 211±33mm3으로 44%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 183±22mm3으로 51%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 225±59mm3으로 40%의 암성장 억제효과를 나타내었다.
2) 종양 무게 변화
최종일 (day 22)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. 대조군의 경우 평균 종양 무게는 1346±159mg 이었으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 1018±127mg으로 24%의 성장억제를 (p<0.01), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 761±131mg으로 43%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 677±56mg으로 49%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 808±156mg으로 40%의 암성장 억제효과를 나타내었다 (p<0.01).
3) 체중 변화
Day -1의 몸무게 (100%)와 비교하였을 때, day 22에는 대조군의 경우 103%, 본 발명의 조성물 투여군에서는 103~106%, 아드리아마이신 투여군에서는 102%의 정상적인 몸무게의 변화를 나타내었으며, 이상행동도 관찰되지 않았다.
4) 일반 증상 관찰
본 발명의 조성물을 투여하는 22일 동안 사망동물은 관찰되지 않았으며, 이상행동을 보이는 동물도 관찰되지 않았다.
5. Human colon cancer (SW620)에 대한 항암 효과 규명
1) 종양 크기 변화
대조군의 경우 25일째에 473±190mm3으로 성장하였으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 436±214mm3으로 7%의 성장억제를 (not significant), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 220±138mm3으로 53%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.05). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 127±60mm3으로 73%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.01). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 142±97mm3으로 48%의 암성장 억제효과를 나타내었다 (p<0.05).
2) 종양 무게 변화
최종일 (day 25)에 종양을 분리한 후 무게를 측정하였다. 대조군의 경우 평균 종양 무게는 1661±817mg 이었으며, 본 발명의 조성물을 1Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 1482±659mg으로 10%의 성장억제를 (not significant), 3Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 765±424mg으로 53%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.05). 또한 본 발명의 조성물을 10Х106cells/마우스로 투여할 경우에는 440±222mg으로 73%의 성장억제를 나타내었다 (p<0.001). 양성대조군으로 사용한 아드리아마이신 투여군에서는 834±306mg으로 49%의 암성장 억제효과를 나타내었다 (p<0.05).
3) 체중 변화
Day -1의 몸무게 (100%)와 비교하였을 때, day 25에는 대조군의 경우 116%, 본 발명의 조성물 투여군에서는 120~121%, 아드리아마이신 투여군에서는 114%의 정상적인 몸무게의 변화를 나타내었으며, 이상행동도 관찰되지 않았다.
4) 일반 증상 관찰
본 발명의 조성물을 투여하는 25일 동안 사망동물은 관찰되지 않았으며, 이상행동을 보이는 동물도 관찰되지 않았다.
| Cell line | Organ | Cell No.a | Daysb | Controlc | CIK(1)d | CIK(3)e | CIK(10)f | ADRg |
| ACHN | Renal | 1.2Х107 | 28 | 100±25 | 81±15 | 67±18 | 47±15 | 63±6 |
| AsPC-1 | Pancreas | 9Х106 | 25 | 100±24 | 75±13 | 58±6 | 34±11 | 55±8 |
| LOX-IMVI | Skin | 1.5Х106 | 15 | 100±32 | 69±38 | 48±15 | 24±10 | 30±18 |
| PC-3 | Prostate | 9Х106 | 22 | 100±12 | 76±9 | 57±10 | 50±4 | 60±12 |
| SW-620 | Colon | 6Х106 | 25 | 100±53 | 89±48 | 55±39 | 31±12 | 54±28 |
a: 누드 마우스에 투여한 human cancer cell의 수b: 종양 무게 측정 및 실험 진행 최종일
c: 대조군의 종양 성장률 (%)
d: 대조군 대비 항암 면역세포치료제 조성물 투여군 (1x106cells/마우스)의 종양 성장률 (%)
e: 대조군 대비 항암 면역세포치료제 조성물 투여군 (3x106cells/마우스)의 종양 성장률 (%)
f: 대조군 대비 항암 면역세포치료제 조성물 투여군 (1x106cells/마우스)의 종양 성장률 (%)
g: 대조군 대비 아드리아마이신 (2mg/kg) 투여군의 종양 성장률 (%)
활성화 림프구의 국내 임상시험
1. 간암 임상시험
간암 AJCC 병기 분류법(6판)에 따라 간세포암 1기 또는 2기로 근치적 치료법(수술적 절제, 고주파열치료술 또는 경피적에탄올 주입술)을 받은 230명의 환자를 대상으로 본 발명의 조성물의 안전성과 유효성을 평가하였다. 재발이 없는 생존율(Recurrence Free Survival, RFS)의 중앙값은 면역요법군이 44개월, 대조군이 30개월이였으며(p=0.010), HR 0.63 (95% CI, 0.43-0.94)으로 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이차 결과변수인 전반적 생존율은 면역요법군에서 대조군에 비해 HR 0.21(95% CI, 0.06-0.75; p=0.008)로 더 길었다.
2. 간암 임상시험 장기간 추적조사
상기 임상시험에 참가했던 환자들 중 장기간 추적조사에 서명으로 동의한 대상자들을 임상시험 종료된 날로부터 최대 6개월 간격으로 36개월까지 재발의 장기간 생존율 추적조사 하였다. 60개월 재발이 없는 생존율은 면역요법군이 44.8%, 대조군이 33.1%이었고, 통계적으로 유의한 차이(p=0.0033)를 보였다.
3. 교모세포종 임상시험
교모세포종 환자를 대상으로 본 발명의 조성물을 사용하여 유효성을 평가하였다. 질병의 진행이 없는 생존기간(Progression Free Survival, PFS)의 중간값은 면역요법군에서 8.1개월 (95% confidence interval (CI), 5.8 to 8.5 개월), 대조군에서 5.4 개월(95% CI, 3.3 to 7.9 개월, p = 0.0401)을 보였다. 전반적 생존기간의 중앙값의 경우 면역요법군에서 22.5개월(95% CI, 17.2 - 23.9 개월), 대조군에서 16.9개월(95% CI, 13.9 - 21.9 개월)의 결과를 보였고, 통계적으로 유의한 차이는 없었으나 면역요법군에서 5.6개월 연장되는 효과를 보였다.
4. 췌장암 임상시험
췌장암 환자를 대상으로 본 발명의 조성물을 사용하여 유효성을 평가하였다. 질병의 진행 없는 생존 중앙값은 11.0주(95% CI 8.8-13.2주)였고, 전반적 생존 중앙값은 26.6주(95% CI 8.6-44.6주)이었다. 등록일자로부터 6개월 생존율은 60%이었다.
Claims (5)
- 말초혈액에서 분리된 림프구를 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS(Fetal bovine serum)를 포함하되, IFN-γ(인터페론-감마)는 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 활성화 림프구 중 CD8+CD56+NKG2D+ 세포의 비율을 20% 이상으로 증가시키는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 세포 분류 단계를 포함하지 않는, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 2단계 이상으로 수행되며,
1단계 배지는 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하고, 2단계 배지는 인터루킨-2 및 FBS를 포함하는, 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 항 CD3 항체의 농도는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml이고, 상기 1단계 배지 및 2단계 배지에서 인터루킨-2의 농도는 100 내지 800U/ml, FBS의 농도는 0.1 내지 15부피%인, 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 배양은 3단계로 수행되며,
1단계 배지는 항 CD3 항체, 인터루킨-2 및 FBS를 포함하고, 2단계 및 3단계 배지는 인터루킨-2 및 FBS를 포함하되, 항 CD3 항체는 포함하지 않으며,
상기 항 CD3 항체 농도는 1㎍/ml 내지 10㎍/ml이고, 상기 1, 2 및 3단계 배지의 인터루킨-2 농도는 100 내지 800U/ml이고, 상기 1단계 배지의 FBS 농도는 5 내지 15부피%, 2단계 배지의 FBS 농도는 0.1 내지 1부피%, 3단계 배지의 FBS 농도는 0.1 내지 2부피%인, 방법.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| CN202080017747.1A CN113544262A (zh) | 2019-05-16 | 2020-05-04 | 包括细胞因子诱导的杀伤细胞的活化淋巴细胞及其制备方法 |
| US17/434,814 US20220160763A1 (en) | 2019-05-16 | 2020-05-04 | Activated lymphocytes comprising cytokine-induced killer cells and preparation method therefor |
| PCT/KR2020/005896 WO2020231058A1 (ko) | 2019-05-16 | 2020-05-04 | 사이토카인 유도 살해세포를 포함하는 활성화 림프구 및 이의 제조 방법 |
Applications Claiming Priority (2)
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