CN104673750B - 一种自然杀伤细胞扩增的方法和一种培养基组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种自然杀伤细胞扩增的方法，该方法包括如下步骤：(1)从全血中分离淋巴细胞，并将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：(0.5‑2)的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作2‑7次。本发明还提供了一种培养基组合物，所述培养基组合物含有基础培养基和L‑谷氨酰胺、硫酸庆大霉素、甘露聚糖肽、白介素2和白介素15。本发明的扩增方法是一种简便、高效、易操作且安全性较高的自然杀伤细胞扩增方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种自然杀伤细胞扩增的方法和一种培养基组合物。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK细胞)是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫调节细胞。NK细胞可以分泌穿孔素、NK细胞毒因子(NK cytotoxic factor,NKCF)和肿瘤坏死因子(TNF)。其中，穿孔素是一种由NK细胞胞浆颗粒释放的杀伤靶细胞的介质。从NK细胞胞浆颗粒中纯化的穿孔素在体外能溶解多种肿瘤细胞，抗穿孔素抗体可抑制杀伤活性。IL-2可提高穿孔素基因的转录。IL-6可以促进IL-2对穿孔素基因转录的诱导作用。丝氨酸酯酶可能有活化穿孔素的作用。其中，NKCF与靶细胞结合后可选择性杀伤和裂解靶细胞。其中，TNF通过改变靶细胞溶酶体的稳定性，导致多种水解酶外漏，还能影响细胞膜磷脂代谢，还能改变靶细胞糖代谢使组织中pH降低，还能活化靶细胞核酸内切酶，降解基因组DNA从而引起程序性细胞死亡等机理杀伤靶细胞；TNF引起细胞死亡过程要明显慢于穿孔素溶解细胞的作用过程。
NK细胞确切的来源还不十分清楚，一般认为直接从骨髓中衍生，其发育成熟依赖于骨髓的微环境。小鼠和人的体外实验表明，胸腺细胞在体外IL-2等细胞因子存在条件下培养也可诱导出NK细胞。小鼠脾脏在体内IL-3诱导下可促进NK细胞的分化。NK细胞主要分布于外周血中，占外周血单个核细胞的5-10％，淋巴结和骨髓中也有NK细胞，但水平较外周血低。
扩增自然杀伤细胞能够使得针对自然杀伤细胞的研究更加方便，并有利于获得穿孔素、NK细胞毒因子和肿瘤坏死因子。目前对自然杀伤细胞扩增的方法包括抗体筛选自然杀伤细胞，联合各种有效的细胞因子相互组合扩增自然杀伤细胞以及通过表达细胞因子的饲养细胞共培养等。但这些方法在培养过程中对细胞培养人员的操作水平要求高，扩增、培养成本昂贵，培养体系不稳定，培养时需要培养扩增出的具有细胞毒作用的CD3-CD56+效应细胞数占比低。
CN102154207A公开了利用CD8-IL21-CD137复合方法扩增激活淋巴细胞(包括NK细胞)的方法，该方法包括：在含有所述淋巴细胞的培养液中，将表达CD8-IL21-CD137复合物的宿主细胞以及白介素2共同培养7天。CN102428173A公开了一种NK细胞培养的方法，该方法包括：利用灭活的K562肿瘤细胞饲养NK细胞以提高NK细胞的杀伤能力。CN103232973A公开一种通过K562肿瘤细胞作为饲养细胞培养NK细胞的方法，其中，K562肿瘤细胞含CD8α、IL21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体。
因此，现有的对自然杀伤细胞扩增的方法需要与饲养其它细胞的共培养，并且需要发费较长时间通过分子克隆手段构建饲养细胞或细胞因子表达体系，培养成本高，扩增步骤繁琐，难以符合GMP标准，可重复性及稳定性差。
发明内容
本发明的目的是克服现有的对自然杀伤细胞扩增的方法需要与其它细胞的共培养的缺陷，提供一种单独培养且扩增效率较高的自然杀伤细胞扩增的方法。
本发明的发明人出乎意料地发现使用添加了特定细胞因子和特定抗体的培养基对自然杀伤细胞进行扩增，能够在单独培养的条件下取得较高的自然杀伤细胞的扩增效率，由此得到了本发明。
为了实现上述目的，本发明提供一种自然杀伤细胞扩增的方法，该方法包括如下步骤：(1)从全血中分离淋巴细胞，并将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：(0.5-2)的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作2-7次；其中，所述第一培养基含有基础培养基和5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸庆大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2、5-40ng/mL的抗人CD16单抗和5-60ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸庆大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2、和5-60ng/mL的白介素15。
本发明还提供了一种培养基组合物，所述培养基组合物含有基础培养基和5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸庆大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2和5-60ng/mL的白介素15。
通过上述技术方案，本发明提供了一种简便、高效、易操作且安全性较高的自然杀伤细胞扩增方法，扩增倍数可达1000-1500倍，CD3-CD56+效应自然杀伤细胞纯度可达到70％以上，杀伤肿瘤细胞的细胞毒效应显著，且培养成本较低。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1与对比例1得到的扩增后的自然杀伤细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性。
图2是实施例1与对比例1得到的扩增后的自然杀伤细胞对HpeG2肿瘤细胞的杀伤活性。
图3是实施例1与对比例1得到的扩增后的自然杀伤细胞对A549肿瘤细胞的杀伤活性。
图4是实施例1扩增得到的NK细胞治疗后荷瘤小鼠的腹围变化。
图5是实施例1扩增得到的NK细胞治疗后荷瘤小鼠生存曲线。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的物料的体积数值均为1个标准大气压的压力和20℃的温度下的数值。
本发明提供一种自然杀伤细胞扩增的方法，该方法包括如下步骤：(1)从全血中分离淋巴细胞，并将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：(0.5-2)的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作2-7次；其中，所述第一培养基含有基础培养基和5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸庆大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2、5-40ng/mL的抗人CD16单抗和5-60ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸庆大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2、和5-60ng/mL的白介素15。
其中，进行了步骤(3)的操作之后得到的扩增产物中即含有扩增得到的自然杀伤细胞。
其中，将淋巴细胞接种在第一培养基中的接种浓度可以为(5-100)×105个细胞/mL培养基。
其中，优选地，将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：(0.8-1.2)的体积比混合并进行第二扩增培养；更优选地，将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：1的体积比混合并进行第二扩增培养。
其中，特别优选地，所述第一培养基含有基础培养基和10-20mg/mL的L-谷氨酰胺、100-200IU/mL的硫酸庆大霉素、5-10μg/mL的甘露聚糖肽、600-800IU/mL的白介素2、10-20ng/mL的抗人CD16单抗和10-30ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有10-20mg/mL的L-谷氨酰胺、100-200IU/mL的硫酸庆大霉素、5-10μg/mL的甘露聚糖肽、600-800IU/mL的白介素2和10-30ng/mL的白介素15。在该优选情况下，本发明能够取得更加优异的扩增效果。
其中，所述甘露聚糖肽可以为符合《新药转正标准第23册》第774页规定的甘露聚糖肽。其中，所述抗人CD16单抗可以为市售的各种抗人CD16的单抗，例如可以为购自Ebioscience公司的商品号为14-0168的单抗；抗人CD16单抗也可以按照制备单抗的常规方法自行制备。
其中，所述第一培养基和所述第二培养基可以含有或不含有血清，根据本发明特别优选的一种实施方式，所述第一培养基还含有8-12体积％的血清，所述第二培养基还含有0.5-10体积％的血清。
其中，所述第一培养基和所述第二培养基所含有的血清可以为细胞培养中常规使用的血清，例如胎牛血清；根据本发明特别优选的一种实施方式，所述血清为从分离所述淋巴细胞所用的全血中分离得到的自体血清。
其中，特别优选地，步骤(2)中所用的所述第二培养基还含有6-10体积％的血清；步骤(3)中所用的所述第二培养基还含有0.5-2体积％的血清；更优选地，步骤(2)中所用的所述第二培养基还含有7-9体积％的血清；步骤(3)中所用的所述第二培养基还含有0.8-1.2体积％的血清。
其中，优选地，所述第一扩增培养的时间为5-30小时，所述第二扩增培养的时间为50-100小时；更优选地，所述第一扩增培养的时间为10-20小时，所述第二扩增培养的时间为60-80小时。
其中，所述第一扩增培养和所述第二扩增培养可以各自独立地在包括饱和湿度、36-38℃和4-6体积％的二氧化碳浓度的条件下进行。
其中，从全血中分离所述淋巴细胞和所述自体血清的方法包括：将全血与18-22U/ml的肝素钠生理盐水溶液按(4-6)：1的体积比混合后离心得到血细胞和血浆；然后用淋巴细胞分离液从所述血细胞中分离得到淋巴细胞，并且将所述血浆在55-57℃下保持20-40分钟后离心取得上清液。所述上清液即可作为自体血清。
其中，所述基础培养基为opTmizerTMCTSTM T-Cell Expansion SFM培养基，例如可以为购自Invitrogen公司的商品号为A1048501的产品。
其中，所述淋巴细胞分离液含有Ficoll400和泛影酸葡甲胺。
本发明还提供了一种培养基组合物，所述培养基组合物含有基础培养基和5-30mg/mL的L-谷氨酰胺、50-400IU/mL的硫酸庆大霉素、2-20μg/mL的甘露聚糖肽、300-1600IU/mL的白介素2和5-60ng/mL的白介素15。
其中，所述培养基组合物还可以含有5-40ng/mL的抗人CD16单抗。
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
制备实施例1
本制备实施例用于说明淋巴细胞和自体血清的制备。
将肝素钠溶于生理盐水中，得到20U/ml的肝素钠生理盐水溶液。将全血与20U/ml的肝素钠生理盐水溶液按5：1的体积比混合后800×g速度下离心5分钟，得到下层的血细胞和上层的血浆。然后用淋巴细胞分离液从所述血细胞中分离得到淋巴细胞，具体地，将下层的血细胞用3倍体积的生理盐水悬浮后缓慢加入到1倍体积的淋巴细胞分离液(含有Ficoll400和泛影酸葡甲胺，购自天津TBD公司，商品号为LTS1077)的液面上，400-600×g速度下离心15-30分钟，离心完毕后，分为位于上层的残余的血浆层、位于中间层的淋巴细胞层、位于下层的血细胞。将位于中间层的淋巴细胞层抽出，用生理盐水清洗后备用。
将所述血浆在56℃下保持30分钟后离心取得上清液，上清液即为自体血清。
本制备实施例中的全血取自一名45岁的男性正常志愿者。
实施例1
按照如下步骤进行扩增：(1)将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：1的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作6次，得到扩增产物。
其中，将淋巴细胞接种在第一培养基中的接种浓度为106个细胞/mL培养基。所述第一培养基含有基础培养基(购自Invitrogen公司的商品号为A1048501的opTmizerTMCTSTM T-Cell Expansion SFM培养基，以下相同)和15mg/mL的L-谷氨酰胺、150IU/mL的硫酸庆大霉素、8μg/mL的甘露聚糖肽(购自武汉福鑫化工有限公司，商品号为9306-88-8，以下相同)、700IU/mL的白介素2(购自Ebioscience公司，商品号为14-8029，以下相同)、15ng/mL的抗人CD16单抗(购自Ebioscience公司，商品号为14-0168，以下相同)和20ng/mL的白介素15(购自ebioscience公司，商品号为14-8159，以下相同)；所述第二培养基含有15mg/mL的L-谷氨酰胺、150IU/mL的硫酸庆大霉素、8μg/mL的甘露聚糖肽、700IU/mL的白介素2和20ng/mL的白介素15。所述第一培养基还含有10体积％的自体血清，步骤(2)中所用的所述第二培养基还含有8体积％的自体血清；步骤(3)中所用的所述第二培养基还含有1体积％的自体血清。其中，所述第一扩增培养的时间为24小时，所述第二扩增培养的时间为72小时。其中，第一扩增培养和所述第二扩增培养在饱和湿度、37℃和5体积％的二氧化碳浓度的条件下进行。
实施例2
按照如下步骤进行扩增：(1)将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：0.8的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作7次，得到扩增产物。
其中，将淋巴细胞接种在第一培养基中的接种浓度为106个细胞/mL培养基。所述第一培养基含有基础培养基和10mg/mL的L-谷氨酰胺、100IU/mL的硫酸庆大霉素、10μg/mL的甘露聚糖肽、600IU/mL的白介素2、20ng/mL的抗人CD16单抗和10ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有10mg/mL的L-谷氨酰胺、100IU/mL的硫酸庆大霉素、10μg/mL的甘露聚糖肽、600IU/mL的白介素2和10ng/mL的白介素15。所述第一培养基还含有11体积％的自体血清，步骤(2)中所用的所述第二培养基还含有9体积％的自体血清；步骤(3)中所用的所述第二培养基还含有1.1体积％的自体血清。其中，所述第一扩增培养的时间为24小时，所述第二扩增培养的时间为72小时。其中，第一扩增培养和所述第二扩增培养在饱和湿度、37℃和5体积％的二氧化碳浓度的条件下进行。
实施例3
按照如下步骤进行扩增：(1)将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：1.2的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作5次，得到扩增产物。
其中，将淋巴细胞接种在第一培养基中的接种浓度为106个细胞/mL培养基。所述第一培养基含有基础培养基和20mg/mL的L-谷氨酰胺、200IU/mL的硫酸庆大霉素、5μg/mL的甘露聚糖肽、800IU/mL的白介素2、10ng/mL的抗人CD16单抗和30ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有20mg/mL的L-谷氨酰胺、200IU/mL的硫酸庆大霉素、5μg/mL的甘露聚糖肽、800IU/mL的白介素2和30ng/mL的白介素15。所述第一培养基还含有9体积％的自体血清，步骤(2)中所用的所述第二培养基还含有7体积％的自体血清；步骤(3)中所用的所述第二培养基还含有0.8体积％的自体血清。其中，所述第一扩增培养的时间为24小时，所述第二扩增培养的时间为72小时。其中，第一扩增培养和所述第二扩增培养在饱和湿度、37℃和5体积％的二氧化碳浓度的条件下进行。
实施例4
按照实施例1的方法进行扩增，所不同的是，所述第一培养基含有基础培养基和5mg/mL的L-谷氨酰胺、50IU/mL的硫酸庆大霉素、20μg/mL的甘露聚糖肽、300IU/mL的白介素2、40ng/mL的抗人CD16单抗和5ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有5mg/mL的L-谷氨酰胺、50IU/mL的硫酸庆大霉素、20μg/mL的甘露聚糖肽、300IU/mL的白介素2和5ng/mL的白介素15。
实施例5
按照实施例1的方法进行扩增，所不同的是，所述第一培养基含有基础培养基和30mg/mL的L-谷氨酰胺、400IU/mL的硫酸庆大霉素、2μg/mL的甘露聚糖肽、1600IU/mL的白介素2、5ng/mL的抗人CD16单抗和60ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有30mg/mL的L-谷氨酰胺、400IU/mL的硫酸庆大霉素、2μg/mL的甘露聚糖肽、1600IU/mL的白介素2和60ng/mL的白介素15。
对比例1
按照实施例1的方法进行扩增，所不同的是，将所述第一培养基和所述第二培养基中的甘露聚糖肽替换为等量的胸腺肽。
对比例2
按照实施例1的方法进行扩增，所不同的是，将所述第一培养基和所述第二培养基中的白介素2替换为等量的IL15。
对比例3
按照实施例1的方法进行扩增，所不同的是，将所述第一培养基和所述第二培养基中的白介素15替换为等量的IL21。
对比例4
按照实施例1的方法进行扩增，所不同的是，将所述第一培养基中的抗人CD16单抗替换为等量的抗人CD137单抗。
测试实施例1
按照文献(J.S.Miller et al,Biol Blood Marrow Transplant,2014)中显微镜下细胞计数的方法，检测实施例1-5和对比例1-4中的扩增产物中的自然杀伤细胞的数量，并用流式细胞术检测实施例1-5和对比例1-4中的扩增产物中的CD3-CD56+自然杀伤细胞所占的比例，计算扩增倍数，结果如表1所示。
表1
| 扩增产物 | CD3-CD56+自然杀伤细胞所占的比例(％) | 扩增倍数 |
| 实施例1 | 86.26 | 1059.96 |
| 实施例2 | 81.22 | 1269.14 |
| 实施例3 | 84.15 | 1080.03 |
| 实施例4 | 73.25 | 884.12 |
| 实施例5 | 74.33 | 854.35 |
| 对比例1 | 55.78 | 646.61 |
| 对比例2 | 21.86 | 262.32 |
| 对比例3 | 52.18 | 546.21 |
| 对比例4 | 34.28 | 452.17 |
根据表1的数据可见，本发明的方法扩增效率较高，并且，在优选所述第一培养基含有基础培养基和10-20mg/mL的L-谷氨酰胺、100-200IU/mL的硫酸庆大霉素、5-10μg/mL的甘露聚糖肽、600-800IU/mL的白介素2、10-20ng/mL的抗人CD16单抗和10-30ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有10-20mg/mL的L-谷氨酰胺、100-200IU/mL的硫酸庆大霉素、5-10μg/mL的甘露聚糖肽、600-800IU/mL的白介素2和10-30ng/mL的白介素15的情况下，本发明的扩增方法能够取得更加优异的扩增效果。
测试实施例2
按照制备实施例1的方法，使用来自表2中的不同志愿者的全血，进行淋巴细胞和自体血浆的分离，并按照实施例1的方法进行扩增，扩增结果如表2所示。
表2
根据表2的结果可见，本发明的扩增方法能够用于对来源于不同个体的自然杀伤细胞进行扩增。
测试实施例3
按照文献《KI R不相合的NK细胞对乳腺癌细胞的体外杀伤作用》中MTT法检测NK细胞杀伤功能的方法，测定实施例1和对比例1得到的扩增后的自然杀伤细胞对K562，HpeG2，A549肿瘤细胞的杀伤活性，结果分别如图1、图2和图3所示。
根据图1、图2和图3所示的结果可见，本发明的方法扩增得到的自然杀伤细胞具有较高的对肿瘤细胞的杀伤活性。
测试实施例4
按照文献《人外周血C D T细胞对裸鼠人肺癌移植瘤治疗作用的研究》中的方法，对10只裸鼠注射A549细胞后，第21天分别使用实施例1扩增得到的NK细胞进行注射，NK细胞浓度6.67×107/ml，10μl/只。对照组为注射同等剂量的生理盐水的小鼠。
早期治疗组的小鼠在注入A549细胞后第21天腹部可触及实体瘤组织，视为早期肿瘤，治疗后小鼠的腹围较对照组小，说明治疗后肿瘤进展缓慢，结果如图4所示。生存率表明小鼠的中位生存期延长，具有显著性差异，结果如图5所示。由此说明，本发明扩增得到的NK细胞有较好的体内杀伤肿瘤细胞的活性。
以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (5)
1.一种自然杀伤细胞扩增的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)从全血中分离淋巴细胞，并将淋巴细胞接种在第一培养基中进行第一扩增培养，得到第一扩增培养产物；
(2)将所述第一扩增培养产物与第二培养基按1：(0.5-2)的体积比混合并进行第二扩增培养，得到第二扩增培养产物；
(3)将所述第二扩增培养产物替代第一扩增培养产物返回步骤(2)的操作并循环进行步骤(2)的操作2-7次；
其中，所述第一培养基含有基础培养基和10-20mg/mL的L-谷氨酰胺、100-200IU/mL的硫酸庆大霉素、5-10μg/mL的甘露聚糖肽、600-800IU/mL的白介素2、10-20ng/mL的抗人CD16单抗和10-30ng/mL的白介素15；所述第二培养基含有10-20mg/mL的L-谷氨酰胺、100-200IU/mL的硫酸庆大霉素、5-10μg/mL的甘露聚糖肽、600-800IU/mL的白介素2和10-30ng/mL的白介素15；
其中，所述第一培养基还含有8-12体积％的血清，所述第二培养基还含有0.5-10体积％的血清；所述血清为从分离所述淋巴细胞所用的全血中分离得到的自体血清。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中所用的所述第二培养基还含有6-10体积％的血清；步骤(3)中所用的所述第二培养基还含有0.5-2体积％的血清。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一扩增培养的时间为5-30小时，所述第二扩增培养的时间为50-100小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一扩增培养和所述第二扩增培养各自独立地在包括饱和湿度、36-38℃和4-6体积％的二氧化碳浓度的条件下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，从全血中分离所述淋巴细胞和所述自体血清的方法包括：将全血与18-22U/ml的肝素钠生理盐水溶液按(4-6)：1的体积比混合后离心得到血细胞和血浆；然后用淋巴细胞分离液从所述血细胞中分离得到淋巴细胞，并且将所述血浆在55-57℃下保持20-40分钟后离心取得上清液。
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