KR20210091782A - 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 배양 방법과 배지 - Google Patents
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Abstract
인간 Vγ9Vδ2T세포 증폭 배양 방법 및 배지에 관한 것이다. 방법은, 먼저 인터류킨-2 및 포스포네이트계 화합물을 포함하는 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 자극한 다음, 인터류킨-15 및 비타민C를 첨가한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 배양하여 증폭 배양을 실현하는 단계를 포함한다. 배지는 추가로 인터류킨-15 및 비타민C를 포함한다. 기존의 증폭 방법과 배지에 비해, 본 개시의 방법 과 배지는 Vγ9Vδ2 T세포의 증식 효율과 세포의 순도를 향상시킬 수 있다. 본 개시의 방법으로 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 항 사멸 능력과 더 긴 세포 생존 기간을 가지고, 주요 살상 분자 NKG2D의 발현 수준도 더 높아, 종양 세포에 대한 살상 능력도 더 강하다.
Description
본 개시는 세포 배양 기술 분야에 관한 것으로, 특히, 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법과 배지에 관한 것이다.
본 개시는 2018년 12월 24일에 중국 특허청에 제출된 제201811580040.2호, 발명 명칭이 "인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법과 배지"인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 상기 출원의 전부 내용은 참조로서 본 개시에 포함된다.
면역 세포 요법은 전 세계 의료 분야에서 난치성 질환(예를 들어, 악성 종양)을 치료하는 새로운 중요한 치료법으로 되었는 바, 예를 들면, B세포 림프종을 치료하기 위해 CAR-T세포를 사용하는 것이다. 과학계와 의학계에 있어서, 안정적이고 신뢰할 수 있는 품질과 우수한 기능을 가진 면역 세포를 확보하는 것은 우수한 임상 치료 효과를 얻기 위해 아주 중요하다.
인간 Vγ9Vδ2 T세포는 영장류와 인간에게만 존재하는 항종양 및 항감염 기능을 가지는 T세포의 아집단이다. 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 종양, 난치성 감염 질환 및 면역 기능 조절 장애 질환으로 고통받는 사람들을 위한 면역 세포 요법 또는 면역 기능 재건에 사용될 수 있다.
기존의 인간 Vγ9Vδ2 T세포에 대한 증폭 방법은 두 가지 주요 유형이 있다:
첫번째 유형의 기존 증폭 기술은, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)의 배지에 IL-2 및 TCR 단일 클론 항체를 첨가하는 것이다. 이런 방법의 주요 단점은 말초 혈액에서 두 가지 유형의 γδT세포(Vδ1 세포 아집단 및 Vδ2 세포 아집단)가 모두 증폭되는데, Vδ1 세포 아집단이 면역 억제 기능을 가지고 있어 면역 세포 요법에 적합하지 않다는 것이다.
두번째 유형의 기존 증폭 기술은, PBMCs의 배지에 IL-2 및 졸레드론산과 같은 인산 소분자 화합물을 첨가하는 것이다. 이런 방법은 고순도 Vδ2 아집단의 γδ T세포를 얻을 수 있어 면역 세포 요법에 사용할 수 있고, 이는 국내외에서 인간 말초 혈액으로부터 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭하는 상용 방법이다. 그러나 이 방법은, 세포 배양 증폭 주기가 약 14일이고, 증폭된 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 생존 기간이 비교적 짧으며(약 7일 동안 지속적으로 생존 할 수 있음), 세포의 항 세포 사멸능력이 강하지 않고, 종양 세포에 대한 살상 능력이 강하지 않는 등 단점이 존재한다.
본 개시의 목적은, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증식 효율과 세포 순도를 향상시킬 수 있는 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증식 방법을 제공하는 것이다. 배양을 통해 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 비교적 강한 종양 살상 능력과 억제 능력을 가지고 있고 항사멸 능력이 더 강하며 세포 생존 기간이 더 길다.
본 개시의 목적은 예를 들어 인간 Vγ9Vδ2 T세포 배지를 제공하는 것이다. 해당 배지를 사용하여 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 배양할 경우, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증식 효율과 세포 순도를 향상시킬 수 있고, 배양을 통해 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 비교적 강한 종양 살상 능력과 억제 능력을 가지고 있으며 항사멸 능력이 더 강하고 세포 생존 기간이 더 길다.
본 개시의 목적은 또한 말초 혈액 단핵 세포로부터 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 선택적으로 증폭할 수 있는 인간 Vγ9Vδ2 T세포 자극 증폭 배지를 제공하는 것이다. 증폭하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 순도가 높고, 살상 능력과 항사멸 능력이 더 강하다.
본 개시에서 제공하는 T세포 증폭 방법은,
T세포를 자극할 수 있는 제1 배지로 T세포를 포함하는 조성물을 배양하여 상기 T세포를 자극하는 단계 A;
인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하는 제2 배지로 자극된 상기 T세포를 배양하는 단계 B; 를 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 T세포는 Vγ9Vδ2 T세포를 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제1 배지는 인터류킨-2와 포스포네이트(Phosphonic acid)계 화합물을 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제1 배지는 인터류킨-2, 포스포네이트계 화합물, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 비타민C 유도체는 에틸아스코빌에테르, 아스코빌팔미테이트, 아스코빌글루코사이드, 마그네슘아스코빌포스페이트과 소듐아스코빌포스페이트로부터 선택될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제2 배지에서, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제2 배지에서, 비타민C 또는 비타민C 유도체의 농도는 10μM-800mM일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 T세포를 포함하는 조성물은 인체 말초 혈액으로부터 추출한 말초 혈액 단핵 세포를 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 단계 A에서 상기 배양 시간은 60-100시간일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 포스포네이트계 화합물은 비스 포스포네이트계 화합물을 포함할 수 있고, 바람직하게, 졸레드론산, 에티드론산, 이반드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 미노드론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 졸레드론산일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제2 배지는 기초 배지, 인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 기초 배지는 RPMI-1640배지, D-MEM, MEM, RPMI, Opti-MEM 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어, RPMI-1640배지일 수 있다.
또한, 본 개시는 기초 배지, 인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하는 배지를 제공할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 배지에서 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있고, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있으며, 비타민C 또는 비타민C 유도체의 농도는 10μM-800mM일 수 있다.
본 개시는 또한 본 명세서에서의 증폭 방법으로 증폭하여 획득한 T세포와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
본 개시는 또한 본 명세서에서의 증폭 방법으로 증폭하여 획득한 Vγ9Vδ2 T세포와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 세포 현탁액일 수 있다.
본 개시는 또한 본 개시의 증폭 방법으로 증폭하여 획득한 T세포 또는 본 개시의 약학 조성물의 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방 또는 치료하는 약물을 제조하는데 있어서의 용도를 제공할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 악성 질환은 암일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 악성 질환은 폐암일 수 있다.
본 개시는 또한 (1)수요가 있는 피험자의 말초 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포를 추출하는 단계; (2)본 개시의 증폭 방법으로 상기 말초 혈액 단핵 세포를 증폭하는 단계, 및 (3)상기 수요가 있는 피험자에게 증폭후의 산물을 투여하는 단계; 를 포함하는 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방 또는 치료하는 방법을 제공할 수 있다.
본 개시는 또한 본 명세서의 증폭 방법으로 증폭하여 획득한 T세포 또는 본 명세서의 약학 조성물의 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방하는데 있어서의 용도를 제공할 수 있다.
또한, 본 개시는 본 명세서의 배지의 T세포를 증폭하는데 있어서의 용도를 제공할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 T세포는 Vγ9Vδ2 T세포일 수 있다.
본 개시는, 인체 말초 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포를 추출하는 단계 1; 제1 배지를 제공하고 상기 제1 배지로 상기 말초 혈액 단핵 세포를 재부유하여, 세포 현탁액을 획득하는 단계 2; 상기 세포 현탁액을 세포 배양 용기에 접종하여 60-100시간 배양하는 단계 3(또는 단계 A); 상기 제2 배지로 배양액을 교체하되, 후속 배양 과정은 모두 상기 제2 배지를 사용하는 단계 4(또는 단계 B); 를 포함하는 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법을 제공하고, 상기 제1 배지는 제2 배지 및 포스포네이트계 화합물을 포함하며; 상기 제2 배지는 기초 배지 및 상기 기초 배지에 첨가되는 인터류킨-2, 인터류킨-15 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하고; 상기 단계 1과 단계 2의 순서는 서로 조정될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 기초 배지는 RPMI-1640배지일 수 있고, 상기 포스포네이트계 화합물은 졸레드론산, 에티드론산, 이반드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 미노드론산중의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 단계 2에서, 상기 세포 현탁액의 세포 밀도는 3～4Х106cells/ml일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 단계 2에서, 상기 제1 배지중의, 포스포네이트계 화합물의 농도는 1-1000μM일 수 있고;
상기 제1 배지와 상기 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있고, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있으며, 비타민C 또는 비타민C 유도체의 농도는 10μM-800mM일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 세포 배양 용기는 24웰플레이트, 48웰플레이트 또는 96웰플레이트일 수 있고; 상기 단계 3에서는, 상기 세포 현탁액을 세포 배양 용기에 접종하여 72시간 배양할 수 있으며; 상기 단계 4의 후속 배양 과정에서, 세포는 48-72시간 마다 배양액이 교체될 수 있다.
또한, 본 개시는 기초 배지 및 상기 기초 배지에 첨가되는 인터류킨-2, 인터류킨-15 및 비타민C를 포함하는 배지를 제공할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 기초 배지는 RPMI-1640 배지일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있고, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있으며, 비타민C의 농도는 10μM-800mM일 수 있다.
또한, 본 개시는 제2 배지 및 포스포네이트계 화합물을 포함하는 제1 배지를 제공할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 제1 배지에서, 포스포네이트계 화합물의 농도는 1-1000μM일 수 있다.
본 개시는 다음과 같은 유익한 효과를 가진다:
(1)기존의 증폭 방법(두번째 유형의 증폭 기술)에 비해, 본 개시의 증폭 방법에 따르면, 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 빠른 증식 효율 및 더 높은 세포 순도를 가지고 10-12일 동안 배양 시(단계 3부터) 세포 순도는 90%에 도달할 수 있으며, 세포 증폭 비율은 1000배 이상(즉, 10만개의 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 적어도 1억개의 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 증폭 가능)에 도달하여, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증폭 및 배양 주기를 현저히 단축시킬 수 있다.
(2)기존의 증폭 방법(두번째 유형의 증폭 기술)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포에 비해, 본 개시에 따라 증폭하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 종양 살상 및 억제 능력을 갖는다.
(3)본 개시에 따라 증폭하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 항사멸 능력 및 더 긴 생존 기간을 가지며, 또한, 세포 증폭 배양 주기(단계 3부터 10-12일 경과후)가 종료된 후, 본 개시에 따라 증폭 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 약 20일 동안 계속 생존할 수 있다.
본 개시의 실시예의 기술적 해결 방안을 보다 명확하게 설명하기 위해, 이하에서는 실시예에서 필요한 도면을 간략히 소개할 것이며, 이하의 도면은 본 개시의 특정 실시예만을 도시한 것이므로, 본 개시의 범위를 한정하는 것으로 이해하여서는 아니된다.
도 1은 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양한 증식 효율 비교도이다.
도 2는 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포 사멸률의 비교도이다.
도 3은 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 주요 살상 분자 NKG2D의 발현 수준의 비교도이다.
도 4A는 기존의 증폭 방법 (IL2)에 의해 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료한 후의 종양 크기의 개략도이다.
도 4B는 본 개시 내용의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료한 후의 종양 크기의 개략도이다.
도 4C는 치료를 거치지 않은 폐암 인간화 마우스의 종양 크기 개략도이다.
도 5는 상이한 치료 조건하의 폐암 인간화 마우스의 종양 크기 개략도이다.
도 6은 상이한 치료 조건하의 폐암 인간화 마우스의 생존율의 개략도이다.
도 1은 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양한 증식 효율 비교도이다.
도 2는 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포 사멸률의 비교도이다.
도 3은 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 주요 살상 분자 NKG2D의 발현 수준의 비교도이다.
도 4A는 기존의 증폭 방법 (IL2)에 의해 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료한 후의 종양 크기의 개략도이다.
도 4B는 본 개시 내용의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료한 후의 종양 크기의 개략도이다.
도 4C는 치료를 거치지 않은 폐암 인간화 마우스의 종양 크기 개략도이다.
도 5는 상이한 치료 조건하의 폐암 인간화 마우스의 종양 크기 개략도이다.
도 6은 상이한 치료 조건하의 폐암 인간화 마우스의 생존율의 개략도이다.
본 명세서에 사용된 용어에 대해 설명하면 아래와 같다:
본 출원에서 사용된 용어 "기초 배지"는 포유류 동물 세포의 성장에 영양을 공급하는 영양소를 포함하는 용액을 의미한다. 기초 배지는 아연, 철, 마그네슘, 칼슘, 칼륨과 같은 표준 무기염 및 비타민, 포도당, 완충계 및 필수 아미노산을 제공한다. 예를 들어, 기초 배지는 RPMI-1640 배지, D-MEM, MEM, RPMI, Opti-MEM 또는 이들의 조합일 수 있다.
"...로/으로 제조된"은 "포함하다"와 같은 뜻을 가진다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는", "포괄하는", "갖는", "함유하는" 또는 임의의 다른 변형은 비배타적 포함을 포괄하도록 의도된다. 예를 들어, 나열된 요소를 포함하는 조성물, 단계, 방법, 제품 또는 장치는 이러한 요소들로 한정될 필요가 없고 명시적으로 나열되지 않은 요소 또는 이러한 조성물, 단계, 방법, 제품 또는 장치의 고유요소를 포함 할 수도 있다.
접속사 "...로/으로 조성된"은 명시되지 않은 요소, 단계 또는 조성을 배제한다. 청구항에 사용되는 경우, 해당 문구는 설명되는 재료 이외의 재료(관련되는 일반적인 불순물은 제외)를 포함하지 않도록 하는 폐쇄형 청구항이 된다. "...로/으로 조성된"이라는 문구가 카테고리 바로 뒤가 아니라 청구항 주요 문장의 절에 나타나는 경우, 이는 이 절에서 설명된 요소로에 대해서만 한정하고, 다른 요소는 청구 범위 전체에서 제외되지 않는다.
양, 농도 또는 기타 값 또는 파라미터가 범위, 우선 범위 또는 일련의 상한 및 하한 우선값에 의해 정의된 범위로 표현될 때, 이는 범위가 별도로 공개되는지 여부에 관계없이 임의의 범위의 상한 또는 우선값 및 임의의 범위의 하한 또는 우선값의 어느 한쌍에 의해 형성된 모든 범위를 구체적으로 공개하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "1~5"범위가 공개된 경우, 상술한 범위는 "1~4", "1~3", "1~2", "1~2 및 4~5", "1~3 및 5"등 범위를 포함하는 것으로 해석 되어야 한다. 수치 범위가 본 명세서에 기재되는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 해당 범위는 그 범위 내의 모든 정수 및 분수와 그 극한값을 포함하도록 의도된다.
"질량부"는 여러 조성의 질량비례 관계를 나타내는 기본 측정 단위로, 1질량부는 1g 또는 2.689g과 같은 임의의 단위 질량을 나타낼 수 있다. 조성A의 질량부가 a질량부고 조성B의 질량부가 b질량부라고 가정하면, 이는 조성A의 질량과 조성B의 질량의 비례가 a: b인 것을 의미한다. 또는, 조성A의 질량이 aK이고 조성B의 질량이 bK임을 의미한다(K는 임의의 숫자이며 배수를 나타냄). 질량분율과 달리, 모든 조성의 질량부의 합이 100질량부에 국한되지 않는다는 것을 오해해서는 안된다.
"및/또는"은 설명된 경우 중 하나 또는 둘 모두가 발생할 수 있음을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, A 및/또는 B는 (A 및 B) 및 (A 또는 B)를 포함한다.
또한, 본 개시의 구성요소 또는 조성 앞에 있는 부정 관사 "일종" 및 "하나"는 구성 요소 또는 조성의 수량 요건(즉, 출현 횟수)에 제한이 없다. 따라서, "일종" 또는 "하나"는 하나 또는 적어도 하나를 포함하도록 이해되어야 하며, 단수 형태의 구성 요소 또는 조성은 수량이 단수 형태인 것을 명확하게 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함한다.
용어 "비타민 C 유도체"는 일반적으로 비타민 C의 두번째 탄소 원자에 다른 기를 도입하여 환원형 비타민 C의 엔디올 구조를 안정화시키는 화합물을 말한다. 비타민 C 유도체의 예로는 마그네슘아스코빌포스페이트 및 소듐아스코빌포스페이트와 같은 아스코빌포스페이트(ascorbyl phosphate), 아스코빌팔미테이트(Ascorbyl Palmitate), 에틸아스코빌에테르(Ethyl Ascorbyl Ether), 아스코빌글루코사이드와(Ascorbyl Glucoside) 같은 비타민 C 당류 화합물 등이 포함된다.
"말초 혈액 단핵 세포", "PBMCs" 또는 "단핵 세포"는 말초 혈액에서 분리된 단핵 세포를 말하며, 일반적으로 항암 면역 요법에 사용된다. 예를 들어, 피콜-하이팩 밀도 구배 방법 (Ficoll-Hypaque density gradient method)을 사용하면 수집된 인간 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포를 획득할 수 있다.
"말초 혈액 단핵 세포"는 정상적인 인간, 질환 위험이 있는 피험자 또는 환자로 부터 획득할 수 있다. 여기서 사용되는 말초 혈액 단핵 세포는 반드시 자체에서 유래될 필요는 없으며 동종이계 말초 혈액 단핵 세포도 사용할 수 있다.
용어 "악성 질환"은 본 명세서에서 그 가장 넓은 의미로 사용되며, 제어되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 이는 부신피질암종, 항문암, 방광암, 뇌실막세포종(Ependymoma), 수모세포종(medulloblastoma), 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 간외담관암, 안암, 담낭암, 위암, 생식세포종(germ cell tumor), 생식선외 종양, 두경부암, 하인두암, 췌도세포암, 후두암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 구강암, 간암, 폐암 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "자가 면역 질환"은 자신의 조직에 대한 신체의 면역 반응에 의해 유발되는 질환 및 장애를 의미하며, 이는 장기간의 염증 및 후속 조직 파괴를 유발할 수 있다. 자가 면역 질환의 예는 원형 탈모증(alopecia areata), 제1형 당뇨병, 길랭-바레 증후군, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 경피증, 다발성 근염, 백반증 및 전신홍반루푸스를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
용어 "전염성 질환"은 임의의 병원체의 결과일 수 있다. 이는 에이즈, B 형 및 C 형 간염과 같은 바이러스 감염, 세포 감염, 박테리아 감염, 기생충 및 진균 감염의 결과를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 개시는 우선, 인체 말초 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 추출하는 단계1; 제1 배지를 제공하고 상기 제1 배지로 상기 말초 혈액 단핵 세포를 재부유(resuspension)하여, 세포 현탁액을 획득하는 단계2; 상기 세포 현탁액을 세포 배양 용기에 접종하여 60-100시간 배양하는 단계3; 및 상기 제2 배지로 배양액을 교체하되, 후속 배양 과정은 모두 상기 제2 배지를 사용하는 단계4; 를 포함하는 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법을 제공하고, 여기서, 상기 제1 배지는 제2 배지 및 포스포네이트계 화합물을 포함하며, 상기 제2 배지는 기초 배지 및 상기 기초 배지에 첨가되는 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-15(IL-15) 및 비타민C(Vitamin C)를 포함하고, 상기 단계1과 단계2의 순서는 서로 조정될 수 있다.
구체적으로, 상기 단계1에서, 상기 기초 배지는 RPMI-1640배지이다. RPMI은 Roswell Park Memorial Institute의 약칭으로, 로스웰·파크 기념 연구소를 지칭한다. RPMI은 해당 연구소에서 연구 개발한 일종의 세포 배지이고, 1640은 배지의 코드 번호이다. 해당 배지를 사용시 10％의 우태아 혈청을 첨가한다.
선택적으로, 상기 포스포네이트계 화합물은 졸레드론산(Zoledronate,ZOL), 에티드론산, 이반드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 미노드론산 중의 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다.
본 개시의 일 실시예에서, 상기 포스포네이트계 화합물은 졸레드론산이다.
구체적으로, 상기 단계 2에서, 상기 세포 현탁액의 세포 밀도는 3～4Х106cells/ml이다.
구체적으로, 상기 단계2 및 단계3의 목적은, 포스포네이트계 화합물을 포함하는 제1 배지로 상기 말초 혈액 단핵 세포를 배양함으로써, 상기 말초 혈액 단핵 세포중의 Vγ9Vδ2 T세포를 선택적으로 증폭하고, 기타 세포의 성장을 억제하여, 기타 세포가 사멸되도록 하는데 있다.
선택적으로, 상기 세포 배양 용기는 24웰플레이트, 48웰플레이트 또는 96웰플레이트일 수 있다.
상기 단계4의 목적은, Vγ9Vδ2 T세포의 수량을 증가시키기 위해 상기 단계3에서 선택적으로 증폭된 순도가 비교적 높은 Vγ9Vδ2 T세포를 추가로 증폭하는데 있다.
구체적으로, 상기 단계2에서, 상기 제1 배지 중, 포스포네이트계 화합물의 농도는 1-1000μM이고;
상기 제1 배지와 상기 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml이고, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml이며, 비타민C의 농도는 10μM-800mM이다.
바람직하게, 상기 단계3에서, 상기 세포 현탁액을 세포 배양 용기에 접종하여 72시간 배양할 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 4의 후속 배양 과정에서, 세포는 48-72시간 마다 배양액이 교체될 수 있다.
구체적으로, 상기 단계3 및 단계4의 총 배양 시간은 일반적으로 10-12일 이고, 해당 시점에서 세포 수량이 충족하고 살상 능력이 가장 뛰여나, 특히, 세포 요법에 적합하다.
본 개시는, 인터류킨-2과 포스포네이트계 화합물을 포함하고, 선택적으로 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 더 포함하는 제1 배지로 T세포를 포함하는 조성물을 배양하여 상기 T세포를 자극하는 단계A; 인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하는 제2 배지로 상기 자극된 T세포를 배양하는 단계B; 를 포함하는 T세포 증폭 방법을 제공한다.
본 개시는, 인터류킨-2과 포스포네이트계 화합물을 포함하고, 선택적으로 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 더 포함하는 배지로 T세포를 포함하는 조성물을 배양하여 상기 T세포를 자극하는 단계A; 자극된 말초 혈액 단핵 세포로부터 Vγ9Vδ2 T세포를 선택 및 분리하는 단계B; 선택 및 분리된 Vγ9Vδ2 T세포를 인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C유도체를 포함하는 제2 배지로 배양하는 단계C; 를 포함하는 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법을 제공한다.
본 개시는, 말초 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 추출하는 단계A; T세포를 자극할 수 있는 배지로 T세포를 포함하는 조성물을 배양하여 상기 T세포를 자극하는 단계B; 자극된 말초 혈액 단핵 세포로부터 Vγ9Vδ2 T세포를 선택 및 분리하는 단계C; 선택 및 분리된 Vγ9Vδ2 T세포를 인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하는 제2 배지로 배양하는 단계D; 를 포함하는 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법을 제공한다.
본 개시는, (1)제1 피험자의 말초 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포를 추출하는 단계; (2)인터류킨-2과 포스포네이트계 화합물을 포함하고, 선택적으로 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C유도체를 더 포함하는 배지로 말초 혈액 단핵 세포를 배양하여 Vγ9Vδ2 T세포를 자극하는 단계; (3)인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C유도체를 포함하는 제2 배지로 자극된 Vγ9Vδ2 T세포를 배양하는 단계; (4)배양하여 획득한 세포를 제2 피험자에게 투여 하는 단계; 를 포함하는 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 바람직하게, 제1 피험자와 제2 피험자는 동일 피험자일 수 있다. 대체적으로, 제1 피험자와 제2 피험자는 다른 피험자일 수 있다.
그 중, 상기 말초 혈액 단핵 세포는 상기 T세포를 포함하는 조성물이고, 바람직하게, 상기 악성 질환은 암, 예를 들어, 폐암일 수 있다.
본 개시의 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법에서, 명기하지 않는 조작 방법은 모두 기존 조건(예를 들면, 《short protocols in Molecular Biology》 (F.M.오스베르, R.E.킹스턴, J.G.세더만 등 주필, 마학군, 서월용 역. 북경: 과학출판사, 2004))에서 언급된 방법으로 진행된다.
본 개시의 주요 기술적 특징은 세포 배양 과정에서 인터류킨-15 및 비타민C의 사용에 있다. 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증폭 배양 과정에서 인터류킨-15 및 비타민C를 첨가하는 것은, 기존의 증폭방법(두번째 유형의 증폭 기술)에 비해, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증식 효율과 세포 순도를 증가할 수 있고, 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 항사멸 능력이 더 강하고, 세포 생존 기간이 더 길며, NKG2D의 발현 수준이 더 높아, 종양 세포에 대한 살상 능력이 더 강하다. 두번째 유형의 증폭 기술(배경 기술 참조)에 비해, 본 개시는, 예를 들어, 증폭 효율 및 순도가 낮은 문제, 획득한 세포의 살상 능력이 약한 문제 및 획득한 세포의 생존 기간이 짧고, 노화 및 사멸되기 쉬운 기술문제를 해결하였다.
총체적으로 말해서, 본 개시의 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법은 다음과 같은 유익한 효과를 가지고 있다:
(1)기존의 증폭 방법(두번째 유형의 증폭 기술)에 비해, 본 개시의 증폭방법에 따른 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증식 효율이 더 빠르고 세포 순도가 더 높고, 10-12일 동안 배양 시(단계3부터) 세포 순도는 90%에 도달할 수 있으며, 세포 증폭 비율은 1000배 이상(즉, 10만개의 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 적어도 1억개의 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 증폭 가능)에 도달하여, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증폭 및 배양 주기를 현저히 단축시킬 수 있다.
(2)기존의 증폭 방법(두번째 유형의 증폭 기술)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포에 비해, 본 개시에서의 증폭 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 종양 살상 및 억제 능력을 갖는다.
(3)본 개시에서의 증폭 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 항사멸 능력 및 더 긴 생존 기간을 가지며, 또한, 세포 증폭 배양 주기(단계3부터 10-12일 경과 후)가 종료된 후, 본 개시에서의 증폭 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 약 20일 동안 계속 생존할 수 있다.
상술한 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 방법에 기초하여, 본 개시는 또한 기초 배지 및 상기 기초 배지에 첨가되는 인터류킨-2, 인터류킨-15 및 비타민C를 포함하는 인간 Vγ9Vδ2 T세포 배지(본 명세서에서 제2 배지라고도 함)를 제공한다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 상기 기초 배지는 RPMI-1640 배지일 수 있다.
하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 제1 배지와 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있고, 또는 1-500ng/ml일 수 있으며, 또는 1-200ng/ml일 수 있고, 또는 70-130ng/ml일 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 제2 배지에서, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml일 수 있고, 또는 1-500ng/ml일 수 있으며, 또는 1-200ng/ml일 수 있고, 또는 70-130ng/ml일 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시양태에서, 제2 배지에서, 비타민C의 농도는 10μM-800mM일 수 있고, 또는 20μM-400mM일 수 있으며, 또는 50μM-100μM일 수 있다.
본 개시는 또한 상술한 제2 배지 및 포스포네이트계 화합물을 포함하는 인간 Vγ9Vδ2 T세포 자극 증폭 배지(본 명세서에서는 제1 배지라고도 함)를 제공한다.
선택적으로, 상기 제1 배지에서, 포스포네이트계 화합물의 농도는 1-1000μM일 수 있다.
실시예
실험 시약 및 재료
실험에 사용된 주요 시약 및 재료는 아래 표 1과 같다.
| 시약 명칭 | 회사 이름&생산국 |
| DiR염료 | 인비트로젠(Invitrogen),미국(USA) |
| CFSE | 씨그마(Sigma),미국(USA) |
| DMEM배지 | 지브코(Gibco),미국(USA) |
| RPMI-1640배지 | 지브코(Gibco),미국(USA) |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | 지브코(Gibco),미국(USA) |
| PBS | 동관 제남 대학교 연구소, 중국 |
| 우태아 혈청 | 지브코(Gibco),미국(USA) |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 씨그마(Sigma),미국(USA) |
| 재조합 인간 인터류킨2 주사액 | Beijing Four Rings Biopharmaceutical.Co., Ltd., 중국 |
| 재조합 인간IL-15 | 페프로텍(Peprotech),미국(USA) |
| L-아스코르브산 | 씨그마(Sigma),미국(USA) |
| 0.25%판크레아틴 | 지브코(Gibco),미국(USA) |
| 졸레드론산 | 씨그마(Sigma),미국(USA) |
| 피콜(Ficoll) 림프구 분리액 | GE헬스케어(GE Healthcare),미국(USA) |
| 적혈구 용해액 | TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO,.LTD. |
| 항 인간 CD3-BV510（Clone:SK7） | BD,미국(USA) |
| 항 인간 TCR-Vδ2(Clone:B6) | BD,미국(USA) |
| 항 인간 CD314(NKG2D)-PerCP/Cy5.5（Clone:1D11） | 바이오레전드(Biolegend),미국(USA) |
| 항 인간 Ki67-Alexa Fluor®647（Clone:B56） | BD,미국(USA) |
| 항 인간 CD45RA-PE-cy5（Clone:HI100） | 바이오레전드(Biolegend),미국(USA) |
| 항 인간 CD27-Pacific Blue（Clone:O323） | 바이오레전드(Biolegend),미국(USA) |
실시예1: Vγ9Vδ2 T세포 증폭효과 및 증폭하여 획득한 Vγ9Vδ2 T세포의 특성
말초 혈액에서의 단핵 세포 추출
1)인간 림프구 분리액 4mL를 취하여 15mL 원뿔형 원심 분리튜브에 넣고 1ХPBS 버퍼를 사용하여 말초 혈액에 대해 등비율 희석을 진행하였다. 균일하게 혼합한 후 희석된 말초 혈액 10mL를 튜브벽에 따라 천천히 림프구 분리액의 표면에 도포하여 25°C에서 600g로 25min동안 원심 분리하였다.
2)멸균 파스퇴르 피펫으로 가운데의 흰색 면상 세포층을 다른 멸균 원심 분리튜브로 전이하여 동일한 체적의 PBS를 첨가하고 충분히 혼합한 후 1500rpm로 10min 동안 원심 분리하였다.
3)상층액을 제거한 후, 적혈구 용해액 5~10mL를 첨가하여 세포를 재부유시켜 실온에서 3~7min 동안 용해시켰다. 용해를 중지하기 위해 5배 체적의 PBS를 첨가하였다. 40μm 스크린망으로 여과한 후 1500rpm로 10min 동안 원심 분리하였다.
4)상층액을 제거한 후, 10mL의 무혈청 RPMI 1640배지를 첨가하여 세포를 재부유시켜, 1500rpm로 10min 동안 원심 분리하였다.
5)상층액을 제거한 후, RPMI 1640 완전 배지(10% 우태아 혈청 함유)를 사용하여 튜브 바닥에 침전된 세포를 2mL로 희석하였다. 충분히 혼합한 후 세포 희석액 5μL를 취하여 적절한 배수로 희석한 후 혈구계로 카운트하였다.
Vγ9Vδ2 T세포의 체외 증폭
피콜(Ficoll) 분리액을 이용하여 생혈에서 PBMC를 분리한 후, 10% FBS의 RPMI-1640 완전 배지로 세포 밀도를 3~4×106cells/mL로 조절하여 24웰플레이트에 씨딩하고, 40ng/mL의 IL-2및 50μM 졸레드론산을 첨가하여3일 동안 자극하였다. 그 후, 졸레드론산을 제거하고 2~3일마다 배지를 교체하여 계대한 다음, 농도가 아래와 같은 성분을 포함하는 RPMI-1640 배지를 사용하여37°C, 5% CO2, PH=7.2-7.4 및 95% 습도의 조건으로 10-14 일 동안 배양기에서 배양하였다. 여기서, 해당 농도는 100IU/mL의 IL-15, 100IU/mL의 IL-2, 70μM의 비타민 C이다.
Vγ9Vδ2 T세포 순도 및 표현형 감정
체외에서 10~14일 동안 증폭된 Vγ9Vδ2 T 세포를 수집하여 1.5mL EP 튜브에 넣고 소형 원심 분리기 (Eppendorf 5424)에서 3500rpm로 5min 동안 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 4°C로 미리 냉각된 PBS를 이용하여 두 번 세척하였다. 세포를 블랭크 대조군 튜브, 이소 타입 대조군 및 실험 그룹에 따라 각 대응되는 튜브에 넣되, 각 튜브에는 약 5×105cells가 되도록 한다. 대조 튜브 및 검측 튜브에 항체 사용 설명서에 따라 각각 항 인간 CD3-V500, 항 인간 TCR-δ2-PE, 항 인간 CD45-PE-cy5, 항 인간 CD27-PB, NKG2D-PE-cy7의 형광 항체 염색 용액을 제조한다. 제조된 형광 항체 염색 용액으로 세포를 재부유하고, 4°C의 냉장고 또는 얼음위에 놓고, 차광조건에서 15-20분 동안 염색한 후, PBS로 두 번 세척하였다. 다음, 3500rpm로 5min 동안 원심 분리하고, 상층액을 제거한 후, 200-300μL PBS로 재부유시켜 유세포분석기로 Vγ9Vδ2 T세포의 순도와 표현형을 감정하였다.
Vγ9Vδ2 T세포ki67측정
1)10~14일 동안 체외에서 증폭한 7~10×105cells의 Vγ9Vδ2 T세포를 수집하여, 1.5mL EP튜브에 넣고, 소형 원심 분리기 (Eppendorf 5424)에서 3500rpm로 5min 동안 원심 분리한 후 상층액을 제거하여 4°C로 미리 냉각한 PBS로 두 번 세척하였다.
2)100μL의 PBS로 세포 침전을 재부유시키고, 표면 염색된 유세포 분석용 항체 CD3-FITC, TCR-δ2-PE (1:200 희석)를 첨가하였으며, 대조 튜브에 동일한 색 및 동일한 농도의 동형 대조 항체를 첨가하여 4°C의 차광조건에서 15 min동안 배양하였다.
3)염색 종료 후, PBS로 두번 세척하고, 3500rpm로 5min동안 원심 분리하였다.
4)Foxp3Staining Buffer Set를 사용하여 세포핵 ki67의 발현 수준을 측정하였다. Fixation&Permeabilization Buffer를 준비하고 F&P 농축액(Concentration)과 F&P 희석제(Diluent)를 1:3의 체적 비율로 혼합하여 F&P Buffer 500μL로 세포를 재부유시킨 후, 4°C의 냉장고 또는 얼음위에 차광조건에서 0.5-18시간동안 방치하여 세포를 고정하고 투과시킨다.
5)ddH2O를 사용하여 10×Permeabilization Buffer를 1×로 희석한다. 고정 완료 후 1mL의 1×Permeabilization Buffer를 첨가하여 5500rpm으로 4°C에서 5min 동안 원심 분리한 다음 두번 세척하였다.
6)APC-Ki67 형광 항체를 1×Perm Buffer에 1:200의 체적비로 희석하고 잘 섞어준다. 세포 침전을 염색 용액으로 재부유시켜 4°C의 냉장고 또는 얼음에 방치한 상태로 30min 동안 차광 염색하였다.
7)1×Perm Buffer 용액을 첨가하고 5500rpm으로 4°C에서 5min 동안 원심 분리한 후, 1×Perm 버퍼 용액으로 재부유시킨 다음, 다시 원심 분리하여 결합되지 않은 형광 항체를 씻어내도록 하였다. 200-300μL PBS로 세포를 재부유시켜, 체적을 조정하여, 유세포 측정기 분석에 의해 Ki67 발현 수준을 분석하였다.
도 1은 우선 졸레드론산을 함유하는 배지로 자극한 후, 네 가지의 상이한 세포 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양한 증식 효율 비교도이다.
도1에서, IL2는 전체 증폭 배양 과정에서 사용한 배지가 기초 배지의 기초상에 IL2를 첨가하여 획득한 배지인 것을 의미한다.
IL2+VC는 전체 증폭 배양 과정에서 사용한 배지가 기초 배지의 기초상에 IL2+VC를 첨가하여 획득한 배지임을 의미한다.
IL2+IL15는 전체 증폭 배양 과정에서 사용한 배지가 기초 배지의 기초상에 IL2+IL15를 첨가하여 획득한 배지임을 의미한다.
IL2+IL15+VC는 전체 증폭 배양 과정에서 사용한 배지가 기초 배지의 기초상에 IL2+IL15+VC를 첨가하여 획득한 배지임을 의미한다.
초기의 자극 및 증폭 단계에서, 상술한 네 가지 배지의 실험방안에서는 모두 ZOL (졸레드론산)과 IL+2가 첨가된 기초 배지를 사용하여 세포를 자극하였고, 또한, 도 1의 각 배지 성분의 용량은 본 실시예의 "Vγ9Vδ2 T세포의 체외 증폭"부분에서 설명한 농도와 같다.
도 1에 도시된 바와 같이, 상술한 네 가지의 배지를 사용하여 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양한 후 획득한 수치는, IL15를 첨가하지 않는 배지(IL2 및 IL2+VC)가 세포 증식 효율이 낮으나 IL15를 첨가한 배지(IL2+IL15 및 IL2+IL15+VC)는 세포 증식 효율이 더 높음을 나타냈다. 이로 부터, IL-15를 첨가하면 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 증식 효율을 크게 높일 수 있음을 알 수있다(Ki67 단백질 발현 증가).
도 2는 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포 사멸률의 비교도이고, 도 2에서, IL2, IL2+VC, IL2+IL15, IL2+IL15+VC는 도 1과 동일한 의미를 갖는다.
도 2로부터 알 수 있다 시피, 배지에 VC를 첨가함으로써 세포의 사멸 비율과 사멸 속도를 현저히 감소할 수 있다. 또한, IL-15와 VC를 함께 사용할 경우, 세포 항사멸 능력을 더 현저히 증가시킬 수 있다.
도 3은 네 가지의 상이한 배지로 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 증폭 및 배양하여 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T 세포의 주요 살상 분자 NKG2D의 발현 수준의 비교도이고, 도3에서, IL2, IL2+VC, IL2+IL15, IL2+IL15+VC는 도 1 및 도 2과 동일한 의미를 갖는다.
도 3으로부터, IL-15와 VC를 함께 사용할 경우, 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 주요 살상 분자 NKG2D가 지속적으로 높은 발현 수준을 유지하였고, 배양 21일 후에도 여전히 높은 발현 수준을 유지하고 있다는 것을 알 수 있다. 다시 말해, IL-15와 VC를 함께 사용하는 배합(즉, 본 개시의 기술방안)은 인간 Vγ9Vδ2 T세포의 높은 살상 능력을 더 오래동안 유지하도록 할 수 있다.
실시예2: 증폭된 Vγ9Vδ2 T세포의 항 종양 효과
폐암 인간화 마우스 모델의 구축 및 실험방법:
1. 실험동물
3-4주령의 Rag2-/-γc-/-암컷 마우스는 Taconic회사로부터 구매하였으며, SPF 등급이다. 면역 결핍 마우스는 독립적으로 환기할 수 있는 IVC 케이지를 사용한다. 각 케이지에는 5 마리의 마우스를 사육하였다. 각각의 아이솔레이터(isolator)는 독립적인 HEPA 공기 유입/배출이 실현되며 24시간 온도 및 습도 제어가 가능하다. 사료 및 깔짚은 진공 포장되고 γ-방사선으로 살균된 것을 제공하며 동물 식수로는 멸균수를 사용하였다. 이러한 환경에서 사육된 동물의 포장도 무균환경에서 수행되고, 동물은 번식과 운송이 동일한 미생물 상태로 유지되고 동물의 품질을 보장하고 유지하기 위해 생물 안전 운송 상자에 넣어 운송된다. 동물 실험은 실험 동물 윤리위원회의 승인을 받았다.
2. 종양 동물 모델을 구축하는 방법
Ficoll 액체 밀도 구배 원심 분리에 의해PBMC(huPBMC)를 분리하였고, 인간화 마우스 모델 ((huPBMCs humanized mice)을 구축에 사용된다. 인간화 마우스 구축 관련 PBMC의 HLA 타입은 재주입에 사용되는 γδ T세포와 다르며, 일반적으로는 HLA-A2+/- 이다. 후속 검출의 편리를 위해, 재주입된γδ T세포와 인간화 마우스 자체의 모든 γδ T세포는 구별될 수 있다.
그 다음, 4-6주령의 정상 Rag2-/-γc-/- 마우스를 선택하고, 300cGay의 아치사량으로 방사처리한 후 30×106 huPBMCs를 복강내 주사하였다. 4주 후, 살아남은 인간화 마우스는 다음 단계의 폐암 모델 구축에 사용될 수 있다. 부착 성장한 A549 세포를 분리한 후 세포 현탁액을 준비하고 A549 세포의 농도를 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 1×107cells/mL로 조정하였다. 제조된 세포 현탁액을 100μL/마리의 용량으로 서혜부 피하 주사 방식으로 인간화 마우스에 접종하였다.
3.증폭된 Vγ9Vδ2 T세포로 동물 모델 처리:
1)종양 형성 5~7일 후, 3일마다 마우스의 꼬리 정맥을 통해 폐암 인간화 마우스 모델에 5×106cells의 IL-2, IL-2+Vc, IL-2+IL-15, IL-2+IL-15+Vc로 배양된 γδ T세포를 주사하였으며, 각 그룹에는 5마리의 마우스가 있고, 투여량은 100μL/마리이다. PBS주사군은 치료의 대조군이다. IL-2, IL-2+Vc, IL-2+IL-15, IL-2+IL-15+Vc로 배양된 γδ T세포는 실시예1의 "Vγ9Vδ2 T세포의 체외 증폭"부분에 기재된 방법과 단계에 의해 획득하였으며 IL2, IL2+VC, IL2+IL15 및 IL2+IL15+Vc는 실시예1의 도1과 동일한 의미를 갖는다.
2)3~4회 치료 후 60일 이상 관찰하였다. 버니어 캘리퍼스를 사용하여 일주일에 두 번씩 마우스 종양에 대해 측정하되, 종양 짧은 지름 (A) 및 긴 지름 (B)을 측정하고, V=1/2×A2×B공식에 따라 종양 체적을 계산하였다
3)재주입 과정이 끝나면 말초 혈액을 채취하여 마우스 체내의 γδ T세포 비율과 세포 활성도를 측정하였다. 재주입 완류 후, 말초 혈액을 2주마다 채취하여 γδ T세포의 비율과 NKG2D, PD1, CD107a, Fas, FasL에 기반하여 세포 활성도를 테스트하였다.
4)마우스를 희생시키기 전에, 마우스 체내의 γδ T세포의 콜로니화 정황을 측정하였다. 동시에 GFP신호를 검출하여 말초 혈액에서 A549 종양 세포의 수량과 비율을 관찰하였다.
4.실험결과
종양 실험의 결과는 도4A, 도4B, 도4C, 도5 및 도6에 도시된 바와 같다.
도 4A는 기존의 증폭 방법 (IL2)에 의해 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대한 세포 치료 후의 종양 크기의 개략도이다.
상기 기존의 증폭 방법 (즉, 두번째 유형의 증폭 기술)은 기초 배지에 시종 IL2를 첨가하여 배양하고, 배양 초기 단계에서 ZOL을 첨가하여 자극적으로 증폭하는 것이다.
도 4B는 본 개시 내용의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포를 사용하여 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료 후의 종양 크기의 개략도이다.
도 4C는 치료를 거치지 않은 폐암 인간화 마우스의 종양 크기 개략도이다.
도 4A, 도 4B, 도 4C의 실험에서 사용하는 폐암 인간화 마우스는 종양 종류가 같고, 종류 체적이 거의 동일한 마우스이며, 도 4A, 도 4B, 도 4C에 나타난 종양의 성장시간도 동일하다.
도 4A, 도 4B 및 도 4C의 비교로 부터 알 수 있다 시피, 본 개시의 증폭 방법으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료할 경우, 기존의 증폭 방법으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포에 비해, 본 개시의 증폭하여 획득한 Vγ9Vδ2 T세포가 폐암 세포의 성장을 보다 효과적으로 억제할 수 있고(종양 부피가 현저히 감소) 폐암 인간화 마우스의 생존율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 증명하였다. 42일째에, 기존의 증폭 방법으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 세포 치료한 폐암 인간화 마우스 및 치료를 거치지 않은 폐암 인간화 마우스는 모두 사망하였으나, 본 개시의 증폭 방법으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 세포 치료한 폐암 인간화 마우스는 모두 살아 남아 생존율은 100%에 달하였다. 그 중, 한 마리의 종양은 완전히 사라졌다(도 4B의 블록으로 표시됨).
도 5는 상이한 치료 조건하의 폐암 인간화 마우스의 종양 크기 개략도이고, 도 5는 각각 기존의 증폭 방법(IL2)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료한 경우와, 본 개시의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 치료한 경우 및 치료를 거치지 않은 경우의 폐암 인간화 마우스의 종양 체적 변화를 보여주고 있다.
시간의 흐름에 따라 기존의 증폭 방법(IL2)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 처리한 폐암 인간화 마우스와 처리를 거치지 않은 폐암 인간화 마우스의 종양 체적은 지속적으로 증가하며, 종양 체적이 매우 빠르게 증가하였음을 알 수 있고, 본 개시의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 치료한 폐암 인간화 마우스의 종양 체적은 매우 느리게 증가한다는 것을 알 수 있다. 다시 말해, 기존의 증폭 방법(IL2)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포에 비해, 본 개시의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 생체내 종양 성장 억제 효과가 더욱 강해져 종양 체적을 축소할 수 있다.
도 6은 상이한 치료 조건하에서 폐암 인간화 마우스의 생존율의 개략도이고, 도 6은 각각 기존의 증폭 방법(IL2)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 세포 치료한 경우, 본 개시의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 폐암 인간화 마우스에 대해 치료한 경우 및 치료를 거치지 않은 경우의 폐암 인간화 마우스의 생존율 변화를 보여주고 있다.
시간의 흐름에 따라 기존의 증폭 방법(IL2)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 처리 한 폐암 인간화 마우스와 치료를 거치지 않은 폐암 인간화 마우스의 생존율이 매우 빠르게 저하되었음을 알 수 있고, 본 개시의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포로 처리된 폐암 인간화 마우스의 생존율은 시종 100%임을 알 수 있다. 다시 말해, 본 개시의 증폭 방법(IL2+IL15+VC)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 폐암 인간화 마우스의 생존율을 현저히 향상시킬 수 있다.
실시예3
해당 실시예3은 RPMI-1640배지 및 상기 RPMI-1640배지에 첨가되는 인터류킨-2, 인터류킨-15 및 비타민C를 포함하는 제2 배지를 제공한다.
그 중, 상기 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 300ng/ml이고, 인터류킨-15의 농도는 500ng/ml이며, 비타민C의 농도는 100mM이다.
실시예4
해당 실시예4는 RPMI-1640배지 및 상기 RPMI-1640배지에 첨가되는 인터류킨-2, 인터류킨-15 및 비타민C를 포함하는 제2 배지를 제공한다.
그 중, 상기 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 500ng/ml이고, 인터류킨-15의 농도는 700ng/ml이며, 비타민C의 농도는 300mM이다.
실시예5
해당 실시예5는 실시예1에서 상술한 제2 배지 및 졸레드론산을 포함하는 제1 배지를 제공한다.
그 중, 상기 제1 배지에서, 졸레드론산의 농도는 300μM이다.
실시예6
해당 실시예6은 실시예2에서 상술한 제2 배지 및 졸레드론산을 포함하는 제1 배지를 제공한다.
그 중, 상기 제1 배지에서, 졸레드론산의 농도는 500μM이다.
본 개시에 포함된 공정 파라미터의 모든 수치 범위를 전술한 실시예에서 모두 구현하는 것은 불가능하나, 당업자는 전술한 수치 범위에 속하는 임의의 값은 본 개시를 구현할 수 있음을 충분히 생각해낼 수 있다. 물론, 여러항의 수치 범위 내에서 특정 값의 임의의 조합도 포함할 수 있다. 여기서, 편폭상의 이유로, 하나 이상의 수치 범위 내에서 특정값을 부여하는 실시예를 생략하였으나, 이로 하여 본 개시의 기술적 방안의 개시가 불충분한 것으로 간주되어서는 아니된다.
출원인은 본 개시의 상세한 공정설비 및 공정절차를 설명하기 위해 상기 실시예를 사용하였으나, 본 출원은 상기 상세한 공정설비 및 공정절차에 한정되지 않는바, 즉 본 출원이 상기 상세한 공정설비 및 공정절차에 의존해야 한다는 것을 의미하지 않음을 성명한다. 당업자는 본 개시에 대한 모든 개진, 본 개시 제품의 각 원료의 동등한 대체, 보조 성분의 첨가, 특정 방법 선택 등이 본 개시의 보호 범위내에 있음을 이해할 수 있다.
기존의 증폭 방법(두번째 유형의 증폭 기술)에 비해, 본 개시의 증폭 방법의 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 빠른 증식 효율 및 더 높은 세포 순도를 가지고, 본 개시의 증폭 방법은 인간 Vγ9Vδ2 T세포 증폭 배양 주기를 현저히 단축하였다. 기존의 증폭 방법(두번째 유형의 증폭 기술)으로 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포에 비해, 본 개시에 따라 증폭 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 종양 살상 및 억제 능력을 갖는다. 본 개시에 따라 증폭 획득한 인간 Vγ9Vδ2 T세포는 더 강한 항사멸 능력 및 더 긴 생존 기간을 갖는다.
Claims (18)
- T세포 증폭 방법에 있어서,
상기 방법은,
T세포를 자극할 수 있는 제1 배지로 T세포를 포함하는 조성물을 배양하여 상기 T세포를 자극하는 단계A;
인터류킨-2, 인터류킨-15 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하는 제2 배지로 자극된 상기 T세포를 배양하는 단계B; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항에 있어서,
상기 T세포는 Vγ9Vδ2 T세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 제1 배지는 인터류킨-2와 포스포네이트계 화합물을 포함하고, 선택적으로 인터류킨-15 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 비타민C 유도체는 에틸아스코빌에테르, 아스코빌팔미테이트, 아스코빌글루코사이드, 마그네슘아스코빌포스페이트, 소듐아스코빌포스페이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 배지에서, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 배지에서, 비타민C 또는 비타민C 유도체의 농도는 10μM-800mM인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 배지에서, 인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 T세포를 포함하는 조성물은 인체 말초 혈액으로 추출한 말초 혈액 단핵 세포인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서,
단계A중에서 상기 배양 시간은 60-100시간인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제3항 내지 제9항중의 어느 한항에 있어서,
상기 포스포네이트계 화합물은 비스포스포네이트계 화합물을 포함하고, 바람직하게 졸레드론산, 에티드론산, 이반드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 미노드론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 예를 들어, 졸레드론산인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 제1항 내지 제10항중의 어느 한항에 있어서,
상기 제2 배지는 기초 배지를 더 포함하며, 상기 기초 배지는 RPMI-1640배지, D-MEM배지, MEM배지, RPMI배지, Opti-MEM배지 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 예를 들어, RPMI-1640배지인 것을 특징으로 하는 T세포 증폭 방법. - 기초 배지, 인터류킨-2, 인터류킨-15, 및 비타민C 또는 비타민C 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
- 제12항에 있어서,
인터류킨-2의 농도는 1-1000ng/ml이고, 인터류킨-15의 농도는 1-1000ng/ml이며, 비타민C 또는 비타민C 유도체의 농도는 10μM-800mM인 것을 특징으로 하는 배지. - 약학 조성물에 있어서,
상기 약학 조성물은 제1항 내지 제11항의 어느 한항에 따른 방법으로 증폭하여 획득한 T세포와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하고,
바람직하게, 상기 약학 조성물은 세포 현탁액인 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 제1항 내지 제11항의 어느 한항에 따른 방법으로 증폭하여 획득한 T세포 또는 제14항에 따른 약학 조성물의 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방 또는 치료하는 약물 제조에서의 용도에 있어서,
바람직하게, 상기 악성 질환은 암이고,
더 바람직하게, 상기 악성 질환은 부신피질암종, 항문암, 방광암, 뇌실막세포종, 수모세포종, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 간외담관암, 안암, 담낭암, 위암, 생식세포종, 생식선외 종양, 두경부암, 하인두암, 췌도세포암, 후두암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 구강암, 간암, 폐암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택 되며, 예를 들어, 폐암인 것을 특징으로 하는 용도. - 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방 또는 치료하는 방법에 있어서,
(1)수요가 있는 피험자의 말초 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포를 추출하는 단계;
(2)제1항 내지 제11항의 어느 한항에 따른 방법으로 상기 말초 혈액 단핵 세포를 증폭시키는 단계; 및
(3)상기 수요가 있는 피험자에게 증폭 후의 산물을 투여하는 단계; 를 포함하고,
그 중, 상기 말초 혈액 단핵 세포는 상기 T세포를 포함하는 조성물이고,
바람직하게, 상기 악성 질환은 암이며,
더 바람직하게, 상기 악성 질환은 부신피질암종, 항문암, 방광암, 뇌실막세포종, 수모세포종, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 간외담관암, 안암, 담낭암, 위암, 생식세포종, 생식선외 조양ㅇ, 두경부암, 하인두암, 췌도세포암, 후두암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 구강암, 간암, 폐암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택 되며, 예를 들어, 폐암인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제11항의 어느 한항에 따른 방법으로 증폭하여 획득한 T세포 또는 제14항에 따른 약학 조성물의 전염성 질환, 자가 면역 질환 또는 악성 질환을 억제, 예방 또는 치료하는 용도에 있어서,
바람직하게, 상기 악성 질환은 부신피질암종, 항문암, 방광암, 뇌실막세포종, 수모세포종, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 자궁내막암, 식도암, 간외담관암, 안암, 담낭암, 위암, 생식세포종, 생식선외 종양, 두경부암, 하인두암, 췌도세포암, 후두암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 구강암, 간암, 폐암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택 되며, 예를 들어, 폐암인 것을 특징으로 하는 용도. - 제12항 또는 제13항에 따른 배지의 T세포를 증폭하는 용도에 있어서,
바람직하게, 상기 T세포는 Vγ9Vδ2 T세포인 것을 특징으로 하는 용도.
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