CN114107200B

CN114107200B - 一种高纯度CD56+γδT细胞及其制备方法和用途

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Publication number: CN114107200B
Application number: CN202111429090.2A
Authority: CN
Inventors: 方小燕; 徐南; 康立清; 俞磊; 谭靖雯; 叶晶; 贾裕杰
Original assignee: East China Normal University; Shanghai Unicar Therapy Bio Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: East China Normal University; Shanghai Unicar Therapy Bio Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2041-11-29
Also published as: CN114107200A

Abstract

本发明提供一种高纯度CD56+γδT细胞，一种高效诱导和大量扩增CD56+γδT细胞的培养方法，和将CD56+γδT细胞用于治疗肺癌、胃癌、胰腺癌和膀胱癌等癌症的用途。所培养的CD56+γδT细胞增殖能力强，杀瘤能力强，可以较好地解决γδT细胞来源问题，并有应用于临床的前景。

Description

一种高纯度CD56+γδT细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及一种高纯度CD56+γδT细胞、高效诱导和扩增所述高纯度CD56+γδT的培养基和培养方法、以及所述高纯度CD56+γδT细胞治疗肿瘤的用途。

背景技术

免疫系统对癌症的先天和获得性免疫可以在称为癌症免疫监视的过程中识别和破坏新生的肿瘤细胞。正常细胞受致癌物和其他遗传毒性损害以及内在的肿瘤抑制机制(例如p53，ATM，Ras)失效而转化为肿瘤细胞。这些肿瘤细胞表达应激诱导的分子，例如表面钙网蛋白，MHC I类分子的肿瘤抗原，NKG2D配体等，它们可分别被免疫细胞识别。T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，根据T细胞表面受体(TCR)不同，T淋巴细胞可以分为αβT和γδT。αβT主要参与获得性免疫，γδT主要参与先天性免疫。目前主要的CART产品以αβT为主，将抗原抗体的高亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，通过构建特异性嵌合抗原受体，经基因转导使T淋巴细胞表达这种嵌合抗原受体，特异性地识别靶抗原从而杀伤靶细胞。与αβT细胞相比，γδT具有以下优势，有望成为通用CART的候选药物。

1.大多数癌细胞除了具有抗原和信号外，还能分泌一种叫做IPP(异戊烯焦磷酸)的物质。目前，在免疫细胞中，只发现γδT细胞具有这种识别IPP的功能，在激活和增殖细胞后可攻击癌细胞。

2.γδT细胞肿瘤浸润性强，研究发现TIL中γδT数量丰富，已在多种类型的癌症(包括结直肠癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌和肾细胞癌)中分离得到γδT细胞性质的TIL。在常规药物难以进入的肿瘤，例如胰腺癌中，γδT，浸润性是影响疗效的主要因素之一。

3.γδT作为先天免疫细胞，反应比αβT细胞更快，在没有CAR的情况下，对肿瘤细胞也能具有杀伤能力，因此不受常规的突变影响，还可以绕过最常见的癌症免疫逃逸机制之一——表面MHC I类分子的下调。

4.αβT识别抗原需要依赖HLA分子的提呈，不同个体HLA系统具有特异性，除非供者和受体的HLA分子精确匹配，否则供者αβT将与受体发生免疫排斥反应。而γδT细胞识别抗原不依赖HLA分子的提呈，不会将患者的身体识别为外来物，因此不会引起GvHD(移植物抗宿主病)。

5.γδT细胞对普通细胞更安全，尚没有与γδT细胞疗法相关的严重的不良反应的报道，而αβT会有“脱靶”现象，产生不良反应。

CD56是一种神经细胞粘附分子，通常被认为是自然杀伤细胞(NK)的表型标志物，NK细胞通常定义为CD3-CD56+，而CD3+/CD56+细胞通常被命名为NKT或NKT样细胞，常见的NKT多为αβT。到目前为止，CD56细胞的表达对淋巴细胞的功能尚不够清楚，可能与淋巴细胞与靶细胞之间的粘附有关。CD56+γδT细胞表现出来的优点包括：

1、杀伤肿瘤细胞能力更强。

2、主要以穿孔素颗粒酶途径杀伤靶细胞，速度快。

3、CD56+γδT细胞的CD16表达水平高于CD56-γδT细胞，因此CD56+γδT细胞的抗体依赖的细胞细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)效应更强。

4、CD56+γδT对CD95抗体的敏感性低于CD56-γδT细胞，因此CD56+γδT细胞的抗凋亡能力更强。

目前，已有包括Omn

在内的十几种γδT相关细胞疗法进入临床实验，现有技术中也有多种用于扩增γδT细胞的方案，例如使用唑来膦酸或其他磷酸抗原，干扰素-γ(IFN-γ)，白介素2(IL-2)，白介素15(IL15),CD3抗体或饲养细胞来诱导PBMC、扩增γδT细胞。(参见ZL201910404788.5；ZL201910408512.4；ZL201910791742.3；ZL202110815574.4；ZL201980062358.8以及Am J Cancer Res,2021.11(1):p.79-91；Front Immunol,2020.11:p.1347；Sci Immunol,2018.3(30),eaav4036)，但目前的培养体系还存在如下问题：

尚未有高效的CD56+γδT细胞的诱导方法，也未有专门的培养扩增体系，已有的培养体系中利用唑来膦酸、IL15虽然也能诱导一定比例的CD56表达，但扩增能力相对较差，且γδT纯度只有60～70％左右。纯度低、产量低、成本高，且掺杂的αβT不仅不能杀灭癌细胞，还产生副作用，因而成为推广应用的重要阻碍。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中γδT细胞扩增困难、杀瘤效果不理想的缺陷，从而提供一种高纯度CD56+γδT细胞，γδT细胞占细胞总数的90％以上，CD56高表达的CD56+γδT细胞占γδT细胞总数的75％以上。

本发明还进一步给出了所述高纯度CD56+γδT细胞治疗肿瘤的用途。

本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中的诱导γδT细胞效率较低的缺陷，从而提供一种高效诱导和扩增所述高纯度CD56+γδT的培养基，并提供了相应的培养方法。

诱导和扩增的具体方案如下：

1.分离单个核细胞(PBMC)：从外周血中用淋巴细胞分离液分离PBMC；

2.分选γδT细胞：按照10ul/1*10⁷的用量加入分选抗体和磁珠，将γδT细胞从PBMC中分选出来，流式检测CD3+γδT所占比例。所得γδT细胞纯度＞90％。

3.γδT细胞的激活：用含5％FBS的T009培养基按照浓度2*10⁶个/ml重悬分选的γδT细胞，培养基中加入10～100ng/ml CD3抗体激活，37℃，5％CO₂，培养过夜。

4.CD56+γδT细胞的诱导：使用特制培养基，37℃，5％CO₂，进行培养。

5.每隔1～3天，向培养基中补液，控制细胞浓度，培养2～3周后收获CD56+γδT细胞。

6.流式检测CD3+γδT所占比例、Vδ1T、Vδ2T亚型、CD56、CD16、CD4、CD8、CD45RA、CCR7、CD28。

本发明提供一种特制培养基，在含5％FBS的T009培养基基础上，向培养基中加入10～200ng/ml IL15,10～1000ng/ml pVC(L-抗坏血酸-2-磷酸盐)，获得基础型培养基。

作为一种优选的方案，还向基础型培养基中加入10～200ng/ml IL21。

作为另一种优选的方案，还向基础型培养基中加入10～200ng/ml IL4和100～1000IU IL2。

作为另一种优选的方案，还向基础型培养基中加入10～200ng/ml IL21和100～1000IU IL2。

优选的培养基在扩增倍数和诱导效率上优于基础型培养基。

本发明的CD56+γδT细胞，对肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞均有强大的杀伤能力。因此，本发明提供高纯度CD56+γδT细胞在制备肿瘤治疗剂中的用途，所述肿瘤优选为肺癌、胃癌、胰腺癌或膀胱癌，特别优选胰腺癌。

本发明还提供一种用于治疗肿瘤的制剂，其特征在于，包括前述的高纯度CD56+γδT细胞。

本发明创新性地建立了一种高效诱导和大量扩增CD56+γδT细胞的培养体系，并且所培养的CD56+γδT细胞杀瘤能力强，可以较好地解决γδT细胞来源问题，并有应用于临床的前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1的分选结果展示图，从图中可见，分选前(a)γδT细胞仅占5.68％，分选后(b)γδT细胞占98.3％。

图2是本发明实施例2的诱导结果展示图，自(a)-(c)分别是诱导前、D6和D13的图像，从图中可见，诱导前γδT几乎不表达CD56，仅有2.68％；随着诱导的进行，CD56+细胞比例逐渐上升，至D13时已经达到79.2％。

图3是CD56+γδT扩增倍数图，从图中可见，按照实施例2中方法培养，CD56+γδT细胞总数呈近似指数增长，可扩增超过1500倍，仍保持分裂活性，未出现耗竭趋势。

图4是CD56+γδT与CD56-γδT杀伤对比图，图中可见CD56+γδT对肺癌细胞有强大的杀伤，而CD56-γδT中加入的肺癌细胞仍有较多存活。(a)CD56+γδT blank(b)CD56+γδT+肺癌细胞(c)肺癌细胞(d)CD56-γδT blank(e)CD56-γδT+肺癌细胞。

图5是显示CD56+γδT与CD56-γδT对各种癌细胞杀伤检测的柱状图，纵坐标表示计算修正后的肿瘤细胞裂解率，该数值与杀伤能力正相关。

具体实施方式

实施例1

高纯度γδT细胞的制备

1)用抗凝管取10ml外周血待用；

2)在生物安全柜内1∶1加入PBS稀释外周血，混匀放于50ml离心管；

3)在生物安全柜内放1个无菌50ml离心管，向管内加入10ml淋巴分离液；

4)用移液器吸取稀释后的外周血，并缓缓注入淋巴分离液上层；

5)2000rpm，离心30分钟；

6)小心吸取中间白膜层，注意不要吸到下层红细胞，用生理盐水洗2遍；

7)第2遍离心后，弃上清，用5％FBS的PBS重悬，计数；

8)1500rpm，离心5分钟，弃上清，加入预冷的分选缓冲液，按40ul/1*10⁷标准重悬PBMC，计数；

9)每1*10⁷加入10μLγδTCR抗体，混匀后4°孵育10分钟；

10)每1*10⁷加入30ul预冷的分选缓冲液和20ul分选磁珠，混匀后4°孵育15分钟；

11)孵育结束后，加入10mlPBS洗一遍，用1ml分选缓冲液重悬；

12)准备两个无菌50ml离心管，分选柱润洗后将重悬的细胞液加进去，在磁力架上分选γδT细胞。

所分选的γδT细胞纯度可达90％以上。图一为分选前和分选后的γδT细胞流式检测图。

实施例2

CD56+γδT细胞的诱导

CD56+γδT细胞扩增基础型培养基配制：在含5％FBS的T009淋巴细胞培养基中加入以下因子：50ng/ml IL15，100ng/ml pVC(L-抗坏血酸-2-磷酸盐)；

CD56+γδT细胞的诱导：将分选后的γδT细胞用CD56+γδT细胞扩增基础型培养基按照1.5*10⁶个/ml浓度重悬。每隔1～3天计数，补液，控制细胞浓度5*10⁵～5*10⁶个/ml，制作细胞生长曲线，如图3所示，绘制CD56+γδT细胞扩增曲线。

培养2～3周后，收获细胞，流式细胞仪检测，21天后扩增1680倍。

实施例3

CD56+γδT细胞的诱导

培养基使用实施例2的基础型培养基，额外添加30ng/ml的IL21，其余条件参照实施例2，21天后扩增1750倍。

实施例4

CD56+γδT细胞的诱导

培养基使用实施例2的基础型培养基，额外添加30ng/ml的IL4和20ng/ml的IL2，其余条件参照实施例2，21天后扩增1730倍。

实施例5

CD56+γδT细胞的诱导

培养基使用在含5％FBS的T009淋巴细胞培养基中加入以下因子：150ng/ml的IL15，150ng/ml的pVC，额外添加30ng/ml的IL21和20ng/ml的IL2，其余条件参照实施例2，21天后扩增1780倍。

实施例6

测试CD56+γδT细胞的杀伤功能

1)离心收集靶细胞和效应细胞悬液：高速冷冻离心机1500rpm，升9降9，离心5min，弃上清。这里靶细胞包括肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞，效应细胞为CD56+γδT细胞和CD56-γδT细胞。

2)用PBS分别将靶细胞和效应细胞洗一遍

3)用杀伤培养基分别重悬靶细胞和效应细胞，计数。

4)计算效应细胞和靶细胞所需要的体积。

5)加入96孔板时靶细胞的细胞量需要每孔1*10⁴～5*10⁴，效应细胞的比例可以设为20:1，10:1,5:1，1:1，所以需要的细胞量为每孔5*10⁴～1*10⁶，效应细胞和靶细胞每孔的体积都为50uL～100ul。

6)在96孔板中分别加入效应细胞，每个实验孔3个复孔；

7)除了Blank组外，在96孔板中分别加入靶细胞，每个实验孔3个复孔；设置靶细胞最大裂解组和背景值作为对照，Blank组用杀伤培养基补足体积。

8)将96孔板250xg，离心5min，放入培养箱37℃培养过夜。

9)酶标仪上机检测前(提前至少40分钟)向靶细胞最大裂解组的孔中每孔加入10uL/孔裂解液，并放入37℃培养箱中继续培养。

10)取一个新的96孔平底(酶分析)板，向每孔中加入50μL对应的上清。

11)以每孔50uL的体积，将底物转移到已经加入上清的新96孔板中。

12)避光室温孵育10分钟左右。观察是否反应完全，及时检测。

13)使用酶标仪在490或492nm测量吸光值,并记录。

14)杀伤数据计算：将3个复孔取平均值(如果异常数值则去掉)

将所有实验孔、靶细胞孔和效应细胞孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值。

将靶细胞最大值的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值。

将以上两个步骤获得的经过校正的值带入下面公式，计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。

细胞毒性％＝(实验孔-效应细胞孔-靶细胞孔)/(靶细胞最大孔-靶细胞孔)x100％

最终靶细胞毒性率：当实验组细胞毒性％≤0.00％，则没有杀伤；当实验组细胞毒性％≥0.00％，则有杀伤，值越高，杀伤能力越强。

杀伤结果如图4和5所示，结果表明CD56+γδT细胞对各种肿瘤细胞均有较强的杀伤作用，且明显优于CD56-γδT。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种制备高纯度CD56+γδT细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从血液中利用淋巴细胞分离液制备PBMC；

(2)使用分选抗体和磁珠，从PBMC中制备纯度90％以上的γδT细胞；

(3)诱导和扩增：将步骤(2)得到的γδT细胞，加入培养基，放入二氧化碳培养箱37℃，5％CO₂培养2-3周；所述培养基选自以下方案：1)在含5％FBS的T009培养基的基础上，外加成分由10～200ng/ml IL15和10～1000ng/ml L-抗坏血酸-2-磷酸盐组成；2)在含5％FBS的T009培养基的基础上，外加成分由10～200ng/ml IL15、10～1000ng/ml L-抗坏血酸-2-磷酸盐和10～200ng/ml IL21组成；3)在含5％FBS的T009培养基的基础上，外加成分由10～200ng/ml IL15、10～1000ng/ml L-抗坏血酸-2-磷酸盐、10～200ng/ml IL21和100～1000IU IL2组成；4)在含5％FBS的T009培养基的基础上，外加成分由10～200ng/ml IL15、10～1000ng/ml L-抗坏血酸-2-磷酸盐、10～200ng/ml IL4和100～1000IUIL2组成；

所述高纯度CD56+γδT细胞指，γδT细胞占细胞总数的90％以上，CD56高表达的CD56+γδT细胞占γδT细胞总数的75％以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用的分选抗体为γδTCR抗体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，每隔1-3天计数，补液，控制细胞浓度在5*10⁵～5*10⁶个/ml。