CN108690829B - 一种高效扩增nk细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，本发明的培养方法培养的NK细胞纯度高，数量大。本发明通过主要通过环孢素A、氢化可的松、IL‑2、CS1单抗、IL‑2、IL‑15联合使用来实现NK细胞的活化及扩增。本发明对具体的培养方法也进行描述，包含抗体的包被、NK细胞的活化及NK的扩增。本发明避免的饲养细胞的污染并且简化了流程，最大程度的避免了污染；同时培养的NK细胞纯度高，周期短，并且获得的NK具有较高的杀伤活性。

Description

一种高效扩增NK细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种NK细胞培养组合物及其培养方法。
背景技术
自然杀伤(Nature Killer，NK)细胞，是一种自然杀伤细胞，它是除T淋巴细胞、B淋巴细胞之外的第三类淋巴细胞。它作为人体第一道防线，能够清除病毒、细菌等有害物质，同时还可以清除衰老、病变及癌变的细胞，从而维持人体的健康。
NK作为重要免疫效应细胞，不需要预先致敏即可直接杀伤病毒感染或异变的靶细胞，同时具有以下特征：1、无需特异性抗原识；2、直接杀伤靶细胞；3、不受MHC限制；4、具有较广的抗瘤谱；5、基本无不良反应。在控制癌症的发生和发展中起着非常重要的作用。其可以通过释放穿孔素/颗粒酶、ADCC效应、Fas/FasL系统及NK细胞毒因子消灭人体内的病毒、细菌以及癌细胞。
过继免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一，它主要包括特异性的TIL、TCR、CAR-T、CAR-NK和非特异性的CIK、DC、NK等。正是由于以上NK其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。研究显示：衰老及肿瘤病人的的NK细胞数量降低而且活力也降低了。在日本，NK细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还应用于亚健康人群，预防癌症发生。因此，如何获得大量的NK细胞成为目前亟待解决的问题。
目前，NK细胞的大量获得仍然主要是通过与X射线辐射过的K562作为饲养细胞共培养获得；或者是采用磁珠分选及流式分选。但是这些方法都有明显的缺点。使用饲养绌胞无疑引入了外源性的细胞，增加了临床应用的风险；而磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。因此，研发一种低风险、低成本的NK细胞培养方法称为一个亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种无需滋养细胞激活NK细胞体外扩增活性技术，解决了外源性细胞引入的问题，增加了安全性；同时在本发明中无需通过流式分选及磁珠分选来纯化NK细胞，简化了操作流程且大大降低了成本。
本发明所采用的技术方案是：
对从外周血中分离PBMC细胞进行活化，活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：
(1)抗体包被
用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。
(2)PBMC分离及自体血清制备
使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X-VIVO15培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。
(3)NK细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度约为500-1000IU/mL、10-4μM/L及50-100ng/mL。最后加入7-10％的自体血清。
(4)NK细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-15的X-VIVO15培养基，IL-2及IL-15的终浓度分别为1000-1500IU/mL和10-15ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。
作为优选，本发明所述步骤(1)中单抗浓度为35μg/mL。
并且，本发明所述步骤(1)中抗体的孵育条件即可以是4℃孵育过夜，也可以是37℃孵育2h。在操作时，两者选其一。
并且，本发明步骤(2)中的人血为人的外周血或脐血。
并且，本发明步骤(3)中的IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度为1000IU/mL、10-4μM/L及80ng/mL。
并且，本发明步骤(3)中的自体血清的浓度为10％。
并且，本发明步骤(4)中的克隆团较大是指在10X的显微镜下观察绌胞团的直径大约1cm。
并且，本发明步骤(4)中的新培养瓶是指未曾包被过的培养瓶
并且，本发明步骤(4)中的IL-2及IL-15的终浓度分别为1500IU/mL和15ng/mL。
与现代技术相比，本发明的有益结果是：
(1)本发明NK活化及扩增所采用的CS1单抗(Elotuzumab)为美国FDA认证的可用于临床的药物，研究表明其可以活化NK细胞。而氢化可的松、环孢素A、IL-2及IL-15均是临床药物。我们采用临床药物进行NK培养安全性高，原料来源广泛。
(2)本发明采用单抗配合临床用药对NK进行活化后，然后进行扩增就可以获得高纯度的NK细胞。与之前的技术相比，避免了磁珠筛选及流式分选等步骤。大大降低了成本，并且简化了培养流程，使得NK的培养操作简单易行。
(3)本发明所得到的NK细胞在第14天时，NK细胞的扩增倍数高达1000倍，且NK细胞的纯度高达80％以上。且培养的NK对K562细胞的杀伤能力高于使用饲养细胞培养的NK细胞的杀伤能力。
综上所述，本发明优化了NK细胞的培养方法，为以后的NK细胞在肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。
附图说明
图1为采用本发明培养的PBMC细胞生长示意图。
图2为人外周血PBMC细胞经培养14天后的流式检测结果
图3NK细胞对K562及肿瘤细胞杀伤活性分析
具体实施方式
下面结合实施例及对发明进一步说明：下述实施例是说明性的，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以通过借鉴本文内容，适当改进工艺参数设置。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明。
本发明所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法；本发明中的试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂。
实施例
本实施例中从人外周血中分离培养NK细胞的细胞培养方法具体步骤如下：
1.抗体包被
用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为35μg/mL.然后置于4℃孵育过夜。
2.PBMC分离及自体血清制备
对志愿者进行采血，取外周血30mL，然后使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X-VIVO15培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清，并于4℃储存备用。
3.NK细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度为1000IU/mL、10-4μM/L及80ng/mL。最后加入10％的自体血清。
4.NK细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-15的X-VIVO15培养基，IL-2及IL-15的终浓度分别为1500IU/mL和15ng/mL。随后进行隔天补液，使细胞的浓度维持1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NK细胞。
为了更好的说明，在实施例中我们设置了实验组及对照组。对照组是使用同型对照人IgG取代CS1单抗进行包被，其他培养条件一致。我们对这两组细胞进行观察及检测。检测结果如下：
1.在培养的第0，9，14,18,23天对实验组和对照组细胞进行计数。结果显示：实验组细胞扩增倍数远远大于对照组：在培养14天时，实验组的细胞总数就达到2X109(见图1)，细胞总数扩增80倍；在培养第21天时，实验组的细胞总数就达到6.6X109(见图1)，细胞总数扩增200倍。结果表明：使用我们的方法，所获得的细胞数目多、增殖快，可以满足临床需求。
2.为了检测细胞的纯度，我们在细胞培养第14、21天时，对实验组及对照组培养的细胞进行细胞免疫表型测定分析检测。我们使用CD3及CD56的流式抗体与PBS洗好的实验组及对照组细胞进行孵育，孵育条件为：4℃，30min。然后使用PBS进行清洗2次。将处理好的细胞进行上机检测。检测结果显示：实验组中在第14、21天的NK纯度为83.75％、92.41％，而对照组中对应时间的NK纯度为22.47％、58.71％(见图2)。结果表明实验组的NK纯度要远高于对照组。
3.为了进一步检测使用本发明培养的NK的杀伤活力，我们进行了实验组及对照组的NK细胞杀伤实验，检测了其对K562及人胃癌细胞系MKN-45、NCI-N87的杀伤活力。我们将K562、MKN-45及NCI-N87细胞浓度调整为1X104，然后进行铺板，在96孔板中每孔加入100μL。然后按照效应细胞与靶细胞的比为5∶1的比例加入效应细胞，即培养第14天的NK细胞。再本实验室中设置对照组，对照组有2组：一组只加靶细胞，另一组只加效应细胞。加完效应细胞后，将96孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，在培养12h后加入CCK8。然后再次置于培养箱中培养，培养2h后，置于酶标仪测定其在450nm及600nm的吸光度。其中600nm为参比波长。进行吸光度检测。那么NK的杀伤活性＝【1-(实验组OD-效应细胞对照组OD)/靶细胞对照组OD】X100％。检测结果显示：对照组NK细胞对K562、MKN-45、NCI-N87的杀伤率为70.32％、61.05％、60.96％.而实验组NK细胞对K562、MKN-45、NCI-N87的杀伤率分别高达94.16％、88.67％、91.30％(见图3)。结果表明使用本发明培养的NK具有较高的杀伤活性。
我们采用CS1单抗来活化NK是基于已有的报道。研究显示CS1单抗可以通过NK上的CS1配体作用激活NK，并且提高NK的细胞活力。通过对细胞的增殖，纯度及杀伤活性的测定，实验组NK细胞增殖快，纯度高，杀伤活性高。因此CS1单抗是一种参与NK调节的因子，可以用于NK培养。
此外使用本发明所培养的NK细胞扩增倍数高，仅需要30mL外周血就可以培养出近10亿个细胞。而且NK细胞纯度高，对肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。满足了临床上NK细胞数量大，纯度高的要求。而且本发明避免了磁珠筛选或流式分选等工作简化了NK培养工作，同时也避免了使用滋养细胞导致的外源细胞引入问题。该培养方法培养的NK优于常规的培养方法，为以后NK的免疫治疗等临床上的应用奠定了基础。

Claims (5)

1.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，所述方法首先使用CS1单抗，氢化可的松及环孢素A对NK细胞进行活化，并且活化后再进行扩增培养，所述的方法包括以下几个步骤：
(1)抗体包被
用PBS稀释CS1单抗，并用稀释好的CS1单抗包被T75培养瓶，抗体包被浓度为35μg/mL，然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h；
所述CS1单抗为商品化的人源化的单克隆抗体Elotuzumab；
(2)PBMC分离及自体血清制备
使用Ficoll分离人血中的PBMC，并使用X-VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL；同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min；然后离心后取上清并于4℃储存备用；
(3)NK细胞活化培养
将步骤(2)中分离后的PBMC细胞转移至步骤(1)中抗体包被的并用PBS清洗过的培养瓶中；然后加入IL-2、氢化可的松及环孢素A，它们的终浓度分别为1000IU/mL、10-4μM/L及80ng/mL；最后加入7-10％的自体血清；
(4)NK细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-15的X-VIVO培养基，IL-2及IL-15的终浓度分别为1500IU/mL和15ng/mL；随后进行隔天补液；使细胞浓度维持在1×106个/mL；在培养第14天后，进行细胞收集，所收集的细胞即为NK细胞，
所述步骤(4)中的克隆团较大是指在10X的显微镜下观察细胞团的直径大约1cm。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中人血为人的脐血或外周血。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中自体血清量为10％。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中的新的培养瓶是指未曾包被过的培养瓶。
5.一种NK细胞，其特征在于，所述的NK细胞是用权利要求1～4中任一项所述的培养方法所制备的。
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