CN113528439A - 一种nk细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞培养方法，包括步骤：往CD3、胸腺肽及PBS溶液包被处理的培养瓶内装入单个核细胞、含细胞因子IL‑15、IL‑18、IL‑2和CD16的激活培养基，随后对细胞进行静态培养；第3和6天，分别添加一定数量的含细胞因子IL‑15、IL‑18、IL‑2和CD16的激活培养基；第9、12和15天，分别添加含细胞因子IL‑2的扩增培养基；第18天，停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。该培养方法，NK细胞生长速度快，18天培养周期，NK细胞数量可以达到1122～1343倍；有效NK细胞活率达到91％以上，且该NK细胞适用于临床应用。

Description

一种NK细胞培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种NK细胞培养基及NK细胞培养方法。
背景技术
肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。
肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法；其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。
NK细胞，又称自然杀伤细胞(natural killer cell)，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种NK细胞培养方法。
本发明的技术方如下：
一种NK细胞快速扩增的培养方法，包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶加入1～10ugCD3、10～40ug胸腺肽及10～20mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2～4h，包被结束吸出包被液待用；其次，取1×106-3×106个/ml的单个核细胞进行接种处理；再其次，加入10～40ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在20～100ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天：往培养瓶中加入20～50ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；
第6天：往培养瓶中加入50～150ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；
第9天：往培养瓶中加入200～400ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
第12天：往培养瓶中加入450～650ml扩增培养基，且该扩增培养基中含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
第15天：往培养瓶中加入1000～1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
本发明提供的NK培养方法；相对于现有技术，具有如下有点：
1、NK细胞生长速度快，18天培养周期，NK细胞数量可以达到2000～3000倍。
2、有效NK细胞活率达到91％以上。
3、培养工艺简单、操作方便。
附图说明
图1为实施例1至4、对比例1培养的NK细胞生长曲线图；
图2为实施例1至4、对比例1培养的NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；
图3a、3b、3c、3d分别为实施例1至3、对比例1的NK细胞培养18天后的CD3-CD56+表型检测图。
具体实施方式
本发明提供的一种采用外周血培养NK细胞的快速扩增培养方法，具体培养如下：
1、获取单个核细胞(PBMC)
采集志愿者外周血，抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30分钟，得到清澈的血浆，保存于2～8℃环境；全血细胞与生理盐水1:1稀释后，按1:2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30分钟，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，备用；
2、NK细胞培养
2.1、细胞培养第0天；
2.1.1、准备洁净、消毒处理的非TC175培养瓶。
2.1.2、往培养瓶加入1～10ugCD3、10～40ug胸腺肽及10～20mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2～4h，包被结束吸出包被液待用。
注意：在吸出包被液时，不要触碰培养瓶底面，在细胞确实需要接种前才吸出，避免包培养瓶壁上的包被液干掉，影响细胞爬壁生长。
2.1.3、取1×106-3×106个/ml的单个核细胞进行接种处理。
2.1.4、加入10～40ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基，且所述518培养基含。
2.1.5、为培养瓶中加入CD16并使浓度维持在20～100ng/ml。
2.1.6、将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养；
2.2、细胞培养第3天。往培养瓶中加入20～50ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；
2.4、细胞培养第6天。往培养瓶中加入50～150ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；
2.5、细胞培养第9天。往培养瓶中加入200～400ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
2.6、细胞培养第12天。往培养瓶中加入450～650ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
2.7、细胞培养第15天。往培养瓶中加入1000～1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
2.8、细胞培养第18天。停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
较好地，在一实施例中，NK细胞培养，还可以采用如下工艺步骤:
第0天：首先，往培养瓶加入3～7ugCD3、15～30ug胸腺肽及12～18mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁1～3h，包被结束吸出包被液待用；其次，取1.5×106-2.5×106个/m单个核细胞进行接种处理；再其次，加入15～30ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆，其中，所述激活培养基中包含浓度15～25ng/ml的IL-15、浓度15～25ng/ml的IL-18、浓度800～1500U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在30～60ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天：往培养瓶中加入25～35ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度15～25ng/ml的IL-15、浓度15～25ng/ml的IL-18、浓度800～1500U/ml的IL-2及581培养基；
第6天：往培养瓶中加入80～140ml激活培养基和6～15ml自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度15～25ng/ml的IL-15、浓度15～25ng/ml的IL-18、浓度800～1500U/ml的IL-2及581培养基；
第9天：往培养瓶中加入250～350ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基浓度800～1500U/ml的IL-2；
第12天：往培养瓶中加入480～600ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度800～1500U/ml的IL-2；
第15天：往培养瓶中加入1100～1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度800～1500U/ml的IL-2；
第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
下面通过一些具体实施例来进一步说明。
实施例1 NK细胞培养
1、细胞培养第0天
1.1、往培养瓶中加入5ugCD3、20ug胸腺肽及15mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁3h，包被结束吸出包被液待用。
注意：在吸出培养瓶中的包被液时，不要触碰底面，且只有在细胞确实需要接种前才可吸出包被液，避免包培养瓶壁上的包被液干掉，影响细胞爬壁生长。
1.2、取2×106个/ml单个核细胞，转入培养瓶中，进行细胞接种处理。
1.3、往培养瓶中加入22.5ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆，加入激活培养基和自体灭活血浆时，确保培养瓶中初始体积为25ml；其中，激活培养基中，包含有浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-1、浓度1000U/ml的IL-28及581培养基。
1.4、往培养瓶中加入CD16并使浓度维持在50ng/ml。
1.5、将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3天
往培养瓶中加入31.5ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆；其中，激活培养基中包含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；相应地，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为35ml，并控制培养瓶中总体积为60ml。
3、细胞培养第6天
往培养瓶中加入133ml激活培养基和14v/v％的自体灭活血浆；其中，激活培养基中包含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；相应地，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为140ml，并控制培养瓶中总体积为200ml。
4、细胞培养第9天
往培养瓶中加入300ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为300ml，并控制培养瓶中总体积为500ml。
5、细胞培养第12天
往培养瓶中加入500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为500ml，并控制培养瓶中总体积为1000ml。
6、细胞培养第15天
往培养瓶中加入1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基浓度1000U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为1200ml，并控制培养瓶中总体积为2200ml。
7、细胞培养第18天
停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心500g，离心8分钟后再用0.9％生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例2 NK细胞培养
1、细胞培养第0天
1.1、往培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
注意：在吸出培养瓶中的包被液时，不要触碰底面，且只有在细胞确实需要接种前才可吸出包被液，避免包培养瓶壁上的包被液干掉，影响细胞爬壁生长。
1.2、取1×106个/ml单个核细胞，转入培养瓶中，进行细胞接种处理。
1.3、往培养瓶中加入10ml激活培养基和10v/v％的自体灭活血浆，加入激活培养基和自体灭活血浆时，确保培养瓶中初始体积为11ml；其中，激活培养基中，包含有浓度10ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml的IL-2及581培养基。
1.4、往培养瓶中加入CD16并使浓度维持在20ng/ml。
1.5、将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3天
往培养瓶中加入20ml激活培养基和10v/v％的自体灭活血浆；其中，激活培养基中包含浓度10ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml的IL-2及581培养基；相应地，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为21ml，并控制培养瓶中总体积为42ml。
3、细胞培养第6天
往培养瓶中加入50ml激活培养基和12v/v％的自体灭活血浆；其中，激活培养基中包含浓度10ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml的IL-2及581培养基；相应地，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为55ml，并控制培养瓶中总体积为97ml。
4、细胞培养第9天
往培养瓶中加入200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基浓度500U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为200ml，并控制培养瓶中总体积为297ml。
5、细胞培养第12天
往培养瓶中加入450ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为450ml，并控制培养瓶中总体积为747ml。
6、细胞培养第15天
往培养瓶中加入1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为1000ml，并控制培养瓶中总体积为1797ml。
7、细胞培养第18天
停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心500g，离心8分钟后再用0.9％生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例3 NK细胞培养
1、细胞培养第0天
1.1、往培养瓶中加入10ugCD3、40ug胸腺肽及20mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁4h，包被结束吸出包被液待用。
注意：在吸出培养瓶中的包被液时，不要触碰底面，且只有在细胞确实需要接种前才可吸出包被液，避免包培养瓶壁上的包被液干掉，影响细胞爬壁生长。
1.2、取3×106个/ml单个核细胞，转入培养瓶中，进行细胞接种处理。
1.3、往培养瓶中加入40ml激活培养基和20v/v％的自体灭活血浆，加入激活培养基和自体灭活血浆时，确保培养瓶中初始体积为50ml；其中，激活培养基中，包含有浓度50ng/ml的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基。
1.4、往培养瓶中加入CD16并使浓度维持在20ng/ml。
1.5、将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3天
往培养瓶中加入50ml激活培养基和20v/v％的自体灭活血浆；其中，激活培养基中包含浓度50ng/ml的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基；相应地，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为60ml，并控制培养瓶中总体积为110ml。
3、细胞培养第6天
往培养瓶中加入150ml激活培养基和16v/v％的自体灭活血浆；其中，激活培养基中包含浓度50ng/ml的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基；相应地，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为200ml，并控制培养瓶中总体积为310ml。
4、细胞培养第9天
往培养瓶中加入400ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度2000U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为400ml，并控制培养瓶中总体积为710ml。
5、细胞培养第12天
往培养瓶中加入650ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度2000U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为650ml，并控制培养瓶中总体积为1360ml。
6、细胞培养第15天
往培养瓶中加入1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度2000U/ml的IL-2；相应地，加入扩增培养基补液体积数为1500ml，并控制培养瓶中总体积为3010ml。
7、细胞培养第18天
停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心500g，离心8分钟后再用0.9％生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
对比例1
NK细胞的培养工艺，包括如下步骤：
1、细胞培养第0天
1.1、往培养瓶中加入1ugCD3、10ug胸腺肽及10mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2h，包被结束吸出包被液待用。
注意：在吸出培养瓶中的包被液时，不要触碰底面，且只有在细胞确实需要接种前才可吸出包被液，避免包培养瓶壁上的包被液干掉，影响细胞爬壁生长。
1.2、取2×106个/ml单个核细胞，转入培养瓶中，进行细胞接种处理。
1.3、往培养瓶中加入10ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆，加入激活培养基和自体灭活血浆时，确保培养瓶中初始体积为11ml；其中，激活培养基中，包含有浓度10ng/ml的IL-15、浓度1000IU/ml的IL-2及581基础培养基。
1.4、将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养。
3、第3天：往细胞培养瓶中加入50ml含细胞因子的581培养基，进行细胞培养；其中，细胞因子包括浓度10ng/ml的IL-15及浓度1000IU/ml的IL-2。
4、第6天，再次往细胞培养瓶中加入120ml含细胞因子的581培养基，继续进行细胞培养；其中，细胞因子包括浓度为1000IU/ml的IL-2及浓度10ng/ml的IL-15。
5、第8天，将细胞连同培养基质转至两个2000ml规格的细胞培养袋中，同时往细胞培养袋中添加浓度为1000IU/ml的IL-2、浓度10ng/ml的IL-15的581培养基400ml；继续在培养箱中进行细胞培养。
6、第10天，再次往细胞培养袋中添加浓度为1000IU/ml的IL-2、浓度10ng/ml的IL-15的581培养基600ml；
7、第12天，往细胞培养袋中继续添加浓度为1000IU/ml的IL-2、浓度10ng/ml的IL-15的581培养基800ml；
8、第15天，最后一次添加浓度为1000IU/ml的IL-2、浓度10ng/ml的IL-15的达肝素钠的581培养基1000ml；
9、第18天，停止培养，将培养好的外周血NK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的10％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到外周血NK细胞产品。
三、NK细胞检测
1、NK细胞培养生长曲线图
图1表示外周血NK细胞培养生长曲线图；图1为细胞经过18天的培养生长曲线。培养18天后，本发明培养方法使NK细胞数量达到近6.72×109/ml，远大于对比例1中培养NK细胞的数量4.22×109个/ml。表1中，分别表示实施例1、实施例2、实施例3及对比例1中，外周血NK细胞在第0、3、6、9、12、15、18天后测得的细胞生长数量；其中，实施例1、实施例2、实施例3培养的NK细胞数量扩增达到1122～1343倍，对比例1培养的NK细胞扩增数量为843倍左右；实施例1、实施例2、实施例3培养的NK细胞数量分别是对比例1培养细胞数量的1.59、1.20、1.46倍。因此，本发明NK细胞培养方法，可是使NK细胞得到快速生长。
表1 NK细胞扩增数量表(×107cells/ml)
Figure BDA0003245965360000111
Figure BDA0003245965360000121
2、NK细胞活率检测
将实施例1至3、对比例1的NK细胞进行台盼蓝染色，放入18～25℃下保存4小时后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如表2。
表2细胞数和细胞活率表
Figure BDA0003245965360000122
从表2中可以看出，实施例1至3的NK细胞数量以及细胞活率，高于对比例1，也就说明采用本发明NK培养基质及培养方法培养的NK细胞扩增比例远高于对比例1，基本上超出临床应用标准规定的细胞活率(≥90％)。
3、NK细胞杀伤活性测试
取实施例1至3、对比例1培养18天后的NK细胞且细胞数量相同。转至3组离心管组(每组离心管组4支离心管，每组都对应有实施例1至3、对比例1中培养的NK细胞)中，然后采用各自对应的培养液，将3组离心管组分别调整终浓度约为1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的细胞悬液，作为3组效应细胞。
K562细胞作为靶细胞，按照效靶比1:1、5:1、10:1、20:1进行靶细胞K562和效应细胞NK细胞进行铺孔，每组3个复孔。NK细胞和K562靶细胞的每个孔分别为500μl。每孔加入500μl实施例6至10、对比例1中各自对应的培养基。
效应细胞NK细胞自然释放组：1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的NK细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
K562靶细胞最大释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养40分钟。
K562靶细胞自然释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
培养液空白对照试验组：每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
铺板后，将培养板250g离心4分钟，置于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。在培养结束后前45分钟，取出培养板，在靶细胞最大释放组加入解冻液，250g离心4分钟，继续培养45分钟取出，之后轻轻混匀细胞，再300g离心5min，收集上清液，用LDH(乳酸脱氢酶)测定492nm波长的吸光度值。
杀伤活性按照如下公式计算：
杀伤活性＝(A-B-C)/(D-C)×100％；
其中：
A-表示试验组吸光度值校正值；
B-表示效应细胞自然释放组；
C-表示靶细胞自然释放组；
D-表示靶细胞最大释放组。
测试结果见表3和图2
表3NK细胞对K562靶细胞的杀伤活性检测
组别 20:1 10:1 5:1 1:1
实施例1 95.12％ 86.79％ 67.36％ 40.12％
实施例2 90.28％ 77.46％ 56.15％ 30.25％
实施例3 91.79％ 83.25％ 62.54％ 35.45％
对比例1 73.33％ 51.48％ 29.86％ 10.29％
由表3和图2可知，在杀伤K562细胞时，本发明方法诱导培养的NK细胞比对比例1诱导培养的NK细胞的杀伤效果更好，差异较明显，说明采用本发明培养基质和培养方法培养NK细胞，可以增强杀伤肿瘤的活性。实施例1至3中NK细胞培养18天后，在杀伤K562细胞时，以效靶比为20:1条件下，其细胞杀伤率介于90.28％～95.12％，远高于临床应用标准，即大于等于40％。
4、NK细胞免疫表型检测
图3a、3b、3c、3d分别对应实施例1至3、对比例1的NK细胞培养18天后的CD3-CD56+表型检测图。
第18天后，分别取实施例1至3、对比例1培养的NK细胞，制成细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个/ml，加入标记的CD3-CD56+单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果如图3a、3b、3c、3d所示的NK细胞表型分析图。由图3a、3b、3c说明，实施例1至3中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例分别是84.99％、62.33％、73.57％，比对比例1的NK细胞在CD3-CD56+的含量(24.42％)分别高出60.57％、37.91％、49.15％，且实施例1至3的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例均已超过临床应用标准(≥60％)。
因此，说明本发明NK培养方法相对于对比例1而言，NK细胞具有较好的细胞活性及体外杀伤能力强。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种NK细胞快速扩增的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶加入1～10ugCD3、10～40ug胸腺肽及10～20mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁2～4h，包被结束吸出包被液待用；其次，取1×106-3×106个/ml的单个核细胞进行接种处理；再其次，加入10～40ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在20～100ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天：往培养瓶中加入20～50ml激活培养基和10～20v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；
第6天：往培养瓶中加入50～150ml激活培养基和12～16v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度10～50ng/ml的IL-15、浓度10～50ng/ml的IL-18、浓度500～2000U/ml的IL-2及581培养基；
第9天：往培养瓶中加入200～400ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
第12天：往培养瓶中加入450～650ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
第15天：往培养瓶中加入1000～1500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度500～2000U/ml的IL-2；
第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述NK细胞培养基包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶加入5ugCD3、20ug胸腺肽及15mlPBS溶液，常温包被所述培养瓶内壁3h，包被结束吸出包被液待用；其次，取2×106个单个核细胞进行接种处理；再其次，加入22.5ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；随后，加入CD16并使浓度维持在50ng/ml；最后，将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为5％CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天：往培养瓶中加入31.5ml激活培养基和15v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；
第6天：往培养瓶中加入133ml激活培养基和14v/v％的自体灭活血浆；其中，所述激活培养基中含浓度20ng/ml的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；
第9天：往培养瓶中加入300ml，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；
第12天：往培养瓶中加入500ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；
第15天：往培养瓶中加入1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中含581培养基及浓度1000U/ml的IL-2；
第18天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第0天细胞培养中，加入激活培养基和自体灭活血浆，使初始体积为25ml。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第3天细胞培养中，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为35ml，并控制培养瓶中总体积为60ml。
5.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第6天细胞培养中，加入激活培养基和自体灭活血浆共计补液体积数为140ml，并控制培养瓶中总体积为200ml。
6.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第9天细胞培养中，加入扩增培养基补液体积数为300ml，并控制培养瓶中总体积为500ml。
7.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第12天细胞培养中，加入扩增培养基补液体积数为500ml，并控制培养瓶中总体积为1000ml。
8.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，第15天细胞培养中，加入扩增培养基补液体积数为1200ml，并控制培养瓶中总体积为2200ml。
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