CN115537397A - Nk细胞诱导培养基及其培养方法 - Google Patents

Nk细胞诱导培养基及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞诱导培养基及其培养方法，该诱导培养基中包含581培养基及浓度0.1~10ug/ml的氟达拉滨；NK培养中，采用培养瓶A和B分别接种单个核细胞培养，第0天至第7天，培养瓶A中培养基添加含组分氟达拉滨及581培养基的诱导培养基，培养瓶B中添加含10~20v/v%的自体灭活血浆、IL‑15、IL‑18、IL‑2及581培养基的激活培养基；第9天，将培养瓶A离心收集的细胞转移至培养瓶B中，继续培养至第16天，且每隔2天补加激活培养基，停止培养，收集离心处理沉淀物，获得高纯度的NK细胞。本发明诱导培养基的成分氟达拉滨可以诱导NK细胞快速扩增，16天培养周期，NK细胞数量可扩增2000~4000倍。

Description

NK细胞诱导培养基及其培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种NK细胞诱导培养基及NK细胞培养方法。
背景技术
肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。
肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法；其中，自体免疫细胞治疗技术，比如，NK细胞免疫治疗正成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗，且副作用小，不损伤正常组织。
NK细胞，又称自然杀伤细胞（natural killer cell），NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种NK细胞诱导培养基及培养方法。
本发明提供的技术方之一如下：
一种NK细胞诱导培养基，包含581培养基及浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨。
在一实施例中，该诱导培养基包含浓度1~5ug/ml的氟达拉滨。
本发明提供的技术方之二如下：
一种NK细胞快速扩增的培养方法，包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶A和培养瓶B中分别接种1×107~6×107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶A加入10~40ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶B加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为10~40ml，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的IL-15、浓度10~50ng/ml的IL-18、浓度500~2000U/ml的IL-2及581培养基；最后，将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶A中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为80~600ml；第9天：收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为100~500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml的IL-15、浓度10~50ng/ml的IL-18、浓度500~2000U/ml的IL-2及581培养基；
第11天：往培养瓶中加入600~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000U/ml的IL-2，浓度5~20ng/ml的IL-21及581培养基；
第13天：往培养瓶中加入800~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000U/ml的IL-2，浓度5~20ng/ml的IL-21及581培养基；
第16天：停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
另一实施例， NK细胞快速扩增的培养方法包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶A和培养瓶B中分别接种5×107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶A加入15~35ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶B加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为15~35ml，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的IL-15、浓度15~30ng/ml的IL-18、浓度800~1500U/ml的IL-2及581培养基；最后，将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶A分别往培养瓶A中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为100~550ml；
第9天：收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为200~400ml；其中，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的IL-15、浓度15~30ng/ml的IL-18、浓度800~1500U/ml的IL-2及581培养基；
第11天：往培养瓶中加入700~1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500U/ml的IL-2，浓度8~15ng/ml的IL-21及581培养基；
第13天：往培养瓶中加入900~1100ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500U的IL-2，浓度8~15ng/ml的IL-21及581培养基；
第16天：停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
本发明提供的NK培养方法；相对于现有技术，具有如下有点：
1、诱导培养基中，成分氟达拉滨在外周血单个核细胞培养中，可以诱导NK细胞快速扩增，同时对T细胞及其他免疫细胞又有抑制扩增效果，并培养到第8天，NK细胞数量获得集群优势，以确保NK细胞快速扩增培养，16天培养周期，NK细胞数量可扩增2000~4000倍；
2、氟达拉滨诱导单个核细胞培养的NK细胞，有效NK细胞活率达到92%以上。
3、本发明NK细胞培养，采用培养瓶A和B分开实现诱导培养和扩增培养，有利于NK细胞快速扩增生长，且培养工艺简单、无需包被、操作方便。
附图说明
图1为实施例1至6中NK细胞和T细胞分别对应的生长曲线图；
图2为实施例1中NK细胞培养16天后的CD3-CD56+表型检测图；
图3为实施例2中NK细胞培养16天后的CD3-CD56+表型检测图；
图4为实施例3中NK细胞培养16天后的CD3-CD56+表型检测图；
图5为实施例4中NK细胞培养16天后的CD3-CD56+表型检测图；
图6为实施例5中NK细胞培养16天后的CD3-CD56+表型检测图；
图7为实施例6中NK细胞培养16天后的CD3-CD56+表型检测图。
具体实施方式
本发明提供的一种采用外周血培养NK细胞的快速扩增培养方法，具体培养如下：
1、获取单个核细胞（PBMC）
采集志愿者外周血，抽取80ml血液，置于无菌肝素钠采血管中，血液转入50ml的离心管中，离心后，得到血浆和全血细胞。血浆合并后放入56℃水浴中灭活20min，再放于-20℃环境上速冻15min，离心1500g，30分钟，得到清澈的血浆，保存于2~8℃环境；全血细胞与生理盐水1:1稀释后，按1:2的比例缓慢加入到淋巴分离液中，尽量保证分层清晰，650g，升1降0，离心30分钟，吸取白膜层，再用生理盐水重悬洗涤2次，收集单个核细胞PBMC，备用；
2、NK细胞培养
2.1、细胞培养第0天；
2.1.1、准备洁净、消毒处理的非TC T75培养瓶，标识号分别为A和B；
2.1.2、取1×107~6×107个/ml的单个核细胞分别置于培养瓶A和B中进行接种处理；
2.1.3、培养瓶A中加入10~40ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；
2.1.4、培养瓶B中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积数为10~40ml；其中，激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的IL-15、浓度10~50ng/ml的IL-18、浓度500~2000U/ml的IL-2及581培养基。
2.1.5、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2.2、细胞培养第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶A中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为80~600ml；
2.3、细胞培养第9天：收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为100~500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的IL-15、浓度10~50ng/ml的IL-18、浓度500~2000U/ml的IL-2及581培养基；
2.4、细胞培养第11天：往培养瓶B中加入600~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000U/ml的IL-2，浓度5~20ng/ml的IL-21及581培养基；
2.5细胞培养第13天：往培养瓶B中加入800~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000U/ml的IL-2，浓度5~20ng/ml的IL-21及581培养基；
2.6、细胞培养第16天：停止细胞培养，收集细胞并将细胞培养基质转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
较好地，在一实施例中，NK细胞培养，还可以采用如下工艺步骤：
第0天：首先，往培养瓶A和培养瓶B中分别接种5×107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶A加入15~35ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶B加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为15~35ml，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的IL-15、浓度15~30ng/ml的IL-18、浓度800~1500U/ml的IL-2及581培养基；最后，将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶A分别往培养瓶A中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为100~550ml；
第9天：收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为200~400ml；其中，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的IL-15、浓度15~30ng/ml的IL-18、浓度800~1500U/ml的IL-2及581培养基；
第11天：往培养瓶中加入700~1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500U/ml的IL-2，浓度8~15ng/ml的IL-21及581培养基；
第13天：往培养瓶中加入900~1100ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500U的IL-2，浓度8~15ng/ml的IL-21及581培养基。
下面通过一些具体实施例来进一步说明。
一、NK细胞制备
下述各实施例中，单个核细胞接种数量均为5×107个/ml。当然，也是可以是1×107个/ml、2×107个/ml、4×107个/ml、6×107个/ml或3×107个/ml等。
实施例1
1、细胞培养第0天
1.1、准备两个非TC的T75培养瓶，分别标识A和B；
1.2、分别往培养瓶A和培养瓶B中接种5×107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶A中加入25ml诱导培养基，该培养基包含浓度2ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶B中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为25ml，且激活培养基中包含浓度20ng/ml 的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；
1.3、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3至第7天
2.1、细胞培养第3天，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为150ml；
2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为200ml；
2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
3、细胞培养第9天
3.1、收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；
3.2、将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基15v/v%的自体灭活血浆体积为300ml；其中，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml 的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基。
4、细胞培养第11天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度1000U/ml的IL-2、浓度10ng/ml的IL-21及581培养基。
5、细胞培养第13天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度1000U的IL-2、浓度10ng/ml的IL-21及581培养基。
6、细胞培养第16天
停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例2
1、细胞培养第0天
1.1、准备两个非TC的T75培养瓶，分别标识A和B；
1.2、分别往培养瓶A和培养瓶B中接种5×107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶A中加入10ml诱导培养基，该培养基包含浓度0.1ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶B中加入激活培养基和10v/v%的自体灭活血浆体积为10ml，且激活培养基中包含浓度10ng/ml的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml的IL-2及581培养基；
1.3、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3至第7天
2.1、细胞培养第3天，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为80ml；
2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为300ml；
2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
3、细胞培养第9天
3.1、收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；
3.2、将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基20v/v%的自体灭活血浆体积为100ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10ng/ml 的IL-15、浓度10ng/ml的IL-18、浓度500U/ml的IL-2及581培养基。
4、细胞培养第11天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度500U/ml的IL-2、浓度5ng/ml的IL-21及581培养基。
5、细胞培养第13天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度500U的IL-2、浓度5ng/ml的IL-21及581培养基。
6、细胞培养第16天
停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例3
1、细胞培养第0天
1.1、准备两个非TC的T75培养瓶，分别标识A和B；
1.2、分别往培养瓶A和培养瓶B中接种5×107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶A中加入50ml诱导培养基，该培养基包含浓度10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶B中加入激活培养基和20v/v%的自体灭活血浆体积为40ml，且激活培养基中包含浓度50ng/ml的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基；
1.3、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3至第7天
2.1、细胞培养第3天，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为300ml；
2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为400ml；
2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为600ml，继续细胞培养。
3、细胞培养第9天
3.1、收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；
3.2、将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基20v/v%的自体灭活血浆体积为500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度50ng/ml 的IL-15、浓度50ng/ml的IL-18、浓度2000U/ml的IL-2及581培养基。
4、细胞培养第11天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度2000U/ml的IL-2、浓度20ng/ml的IL-21及581培养基。
5、细胞培养第13天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度2000U的IL-2、浓度20ng/ml的IL-21及581培养基。
6、细胞培养第16天
停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例4
1、细胞培养第0天
1.1、准备两个非TC的T75培养瓶，分别标识A和B；
1.2、分别往培养瓶A和培养瓶B中接种5×107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶A中加入35ml诱导培养基，该培养基包含浓度5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶B中加入激活培养基和20v/v%的自体灭活血浆体积为35ml，且激活培养基中包含浓度30ng/ml 的IL-15、浓度30ng/ml的IL-18、浓度1500U/ml的IL-2及581培养基；
1.3、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3至第7天
2.1、细胞培养第3天，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为100ml；
2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为350ml；
2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为550ml，继续细胞培养。
3、细胞培养第9天
3.1、收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；
3.2、将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基20v/v%的自体灭活血浆体积为400ml；其中，激活培养基中包含浓度30ng/ml 的IL-15、浓度30ng/ml的IL-18、浓度1500U/ml的IL-2及581培养基。
4、细胞培养第11天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度2000U/ml的IL-2、浓度15ng/ml的IL-21及581培养基。
5、细胞培养第13天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度2000U的IL-2、浓度15ng/ml的IL-21及581培养基。
6、细胞培养第16天
停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例5
1、细胞培养第0天
1.1、准备两个非TC的T75培养瓶，分别标识A和B；
1.2、分别往培养瓶A和培养瓶B中接种5×107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶A中加入15ml诱导培养基，该培养基包含浓度1ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；培养瓶B中加入激活培养基和10v/v%的自体灭活血浆体积为15ml，且激活培养基中包含浓度15ng/ml 的IL-15、浓度15ng/ml的IL-18、浓度800U/ml的IL-2及581培养基；
1.3、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3至第7天
2.1、细胞培养第3天，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为120ml；
2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为250ml；
2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
3、细胞培养第9天
3.1、收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；
3.2、将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基10v/v%的自体灭活血浆体积为200ml；其中，激活培养基中包含浓度15ng/ml 的IL-15、浓度15ng/ml的IL-18、浓度800U/ml的IL-2及581培养基。
4、细胞培养第11天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度800U/ml的IL-2、浓度8ng/ml的IL-21及581培养基。
5、细胞培养第13天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度800U的IL-2、浓度8ng/ml的IL-21及581培养基。
6、细胞培养第16天
停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
实施例6
1、细胞培养第0天
1.1、准备两个非TC的T75培养瓶，分别标识A和B；
1.2、分别往培养瓶A和培养瓶B中接种5×107个/ml的单个核细胞；其中，培养瓶A中加入25ml 581培养基；培养瓶B中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为25ml，且激活培养基中包含浓度20ng/ml 的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基；
1.3、将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养。
2、细胞培养第3至第7天
2.1、细胞培养第3天，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为150ml；
2.2、细胞培养第5天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为200ml；
2.3、细胞培养第7天，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml，继续细胞培养。
3、细胞培养第9天
3.1、收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心500g、8分钟后除去诱导培养基；
3.2、将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基15v/v%的自体灭活血浆体积为300ml；其中，所述激活培养基中包含浓度20ng/ml 的IL-15、浓度20ng/ml的IL-18、浓度1000U/ml的IL-2及581培养基。
4、细胞培养第11天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml，且该扩增培养基中包含浓度1000U/ml的IL-2、浓度10ng/ml的IL-21及581培养基。
5、细胞培养第13天
往培养瓶B中加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000m，且该扩增培养基中包含浓度1000U的IL-2、浓度10ng/ml的IL-21及581培养基。
6、细胞培养第16天
停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心500g、8分钟，除去扩增培养基分离后再用0.9%生理盐水反复洗涤离心管底部沉淀物多次，获得NK细胞。
二、NK细胞检测
1、细胞培养生长计数统计
图1为实施例1至6中单个核细胞培养16天，NK细胞与T细胞的生长曲线图；其中：
图1中，虚线表示N细胞生长曲线；实线表示T细胞生长曲线；1-NK表示实施例1中NK细胞、1-T表示实施例1中T细胞，其他依次类推；
采用流式细胞计数仪计数细胞数量；
实施例6的细胞培养过程中，第0天至第7天，诱导培养基中均未添加氟达拉滨组分。
实施例1至6接种的单个核细胞中所拥有的NK和T细胞，分别按照NK细胞10%、T细胞70%计算；第0天初始NK和T细胞分别是：NK细胞为0.5×107个/ml、T细胞为3.5×107个/ml。
表1为图1各实施例中对应曲线细胞生长数量。
表1 各实施例中NK、T细胞统计数量，（×107个/ml）
Figure 95585DEST_PATH_IMAGE001
由图1和表1可知，实施例1至5中，诱导培养基中含有组分氟达拉滨时，单个核细胞在第9天前培养过程中，NK细胞生长速度较快，容易形成NK细胞集群优势，而T细胞虽然在初始细胞数量中占有绝对优势，但在氟达拉滨组分的抑制作用下，T细胞生长缓慢，慢慢失去了T细胞集群优势，如从第5天至第9天，NK细胞数量为T细胞数量6~8倍；因此，导致细胞扩增培养时，T细胞也不占有集群生长优势，相应地，NK细胞由于前期培养占有集群优势，后期发展得到迅速扩增生长；16天培养周期，NK细胞数量可扩增2000~4000倍。实施例6中，诱导培养基中无组分氟达拉滨时，由于T细胞在初始状态就占有集群优势，所以T细胞在16天培养中，获得快速扩增，而NK细胞则被抑制生长了。
2、NK细胞活率检测
将实施例1至6中的NK细胞进行台盼蓝染色，放入18~25℃下保存4小时后，用流式细胞计数仪进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如表2。
表2 细胞数和细胞活率表
Figure 127869DEST_PATH_IMAGE002
从表2中可以看出，实施例1至5的NK细胞数量及细胞活率，都高于实施例6，也就说明NK诱导培养基质成分氟达拉滨可以提升NK细胞扩增速率，且细胞活率也超出临床应用标准规定的细胞活率（≥90%）。
3、NK细胞免疫表型检测
图2至7分别对应实施例1至6的NK细胞培养第16天的CD3-CD56+表型检测图。
第16天，分别取实施例1至6培养的NK细胞，制成细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个/ml，加入标记的CD3-CD56+单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果，如图2至7所示的NK细胞表型分析图。
由图2至7说明，实施例1至5中培养的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例分别是88.37%、85.55%、87.79%、83.84%、84.37%，比实施例6的NK细胞在CD3-CD56+的含量（25.32%）分别高出63.05%、60.25%、62.48%、58.52%、59.05%，且实施例1至5的NK细胞中CD3-CD56+细胞比例均已超过临床应用标准（≥60%）；说明NK诱导培养基质成分氟达拉滨可以提升NK细胞的纯度。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种NK细胞诱导培养基，其特征在于，该诱导培养基中包含581培养基及浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨。
2.根据权利要求1所述的NK细胞诱导培养基，其特征在于，该诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞诱导培养基，其特征在于，该诱导培养基中包含浓度2ug/ml 的氟达拉滨。
4.一种NK细胞快速扩增的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶A和培养瓶B中分别接种1×107~6×107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶A加入10~40ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度0.1~10ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶B加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为10~40ml，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的IL-15、浓度10~50ng/ml的IL-18、浓度500~2000U/ml的IL-2及581培养基；最后，将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶A中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为80~600ml；
第9天：收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基和10~20v/v%的自体灭活血浆体积为100~500ml；其中，所述激活培养基中包含浓度10~50ng/ml 的IL-15、浓度10~50ng/ml的IL-18、浓度500~2000U/ml的IL-2及581培养基；
第11天：往培养瓶中加入600~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000U/ml的IL-2，浓度5~20ng/ml的IL-21及581培养基；
第13天：往培养瓶中加入800~1200ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度500~2000U/ml的IL-2，浓度5~20ng/ml的IL-21及581培养基；
第16天：停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
第0天：首先，往培养瓶A和培养瓶B中分别接种5×107个/ml的单个核细胞；其次，培养瓶A加入15~35ml诱导培养基，所述诱导培养基中包含浓度1~5ug/ml 的氟达拉滨及581培养基；随后，培养瓶B加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为15~35ml，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的IL-15、浓度15~30ng/ml的IL-18、浓度800~1500U/ml的IL-2及581培养基；最后，将培养瓶A和B分别放入环境温度为37℃、环境气氛为5%CO2的培养箱中，进行细胞培养；
第3天、第5天和第7天：分别往培养瓶A分别往培养瓶A中补液诱导培养基并控制培养瓶中总体积为100~550ml；
第9天：收集培养瓶A中的细胞及诱导培养基转入离心管中，离心分离后除去诱导培养基，将培养瓶A中收集的细胞加入到培养瓶B中，并往培养瓶B中加入激活培养基和15v/v%的自体灭活血浆体积为200~400ml；其中，所述激活培养基中包含浓度15~30ng/ml 的IL-15、浓度15~30ng/ml的IL-18、浓度800~1500U/ml的IL-2及581培养基；
第11天：往培养瓶中加入700~1000ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500U/ml的IL-2，浓度8~15ng/ml的IL-21及581培养基；
第13天：往培养瓶中加入900~1100ml扩增培养基，且该扩增培养基中包含浓度800~1500U的IL-2，浓度8~15ng/ml的IL-21及581培养基；
第16天：停止细胞培养，收集培养瓶B中的细胞及扩增培养基转入离心管中，离心分离后再用生理盐水反复洗涤多次，获得高纯度、高活性的NK细胞。
6.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第0天细胞培养中，培养瓶A中加入25ml诱导培养基；培养瓶B中加入激活培养基和自体灭活血浆体积为25ml。
7.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第3天细胞培养中，培养瓶A中补液诱导培养基后控制培养瓶A中总体积为150ml；第5天细胞培养中，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为200ml；第7天细胞培养中，补液诱导培养基后控制培养瓶中总体积为500ml。
8.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第9天细胞培养中，收集培养瓶A中的细胞加入到培养瓶B中，培养瓶B中加入激活培养基和自体灭活血浆体积为300ml。
9.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第11天细胞培养中，加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为2000ml。
10.根据权利要求4或5所述的培养方法，其特征在于，第13天细胞培养中，加入扩增培养基补液后控制培养瓶B中总体积为3000ml。
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