TW202237824A - 培養免疫細胞之方法 - Google Patents

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尤金 帕特爾
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Abstract

本揭示案提供在包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子之培養基中培養TIL之方法。在一些態樣中，相對於CD4 +TIL，本文所揭示之方法增強CD8 +TIL之擴增。在一些態樣中，該等方法進一步增加細胞群體中低分化細胞、例如低分化TIL的數量。在一些態樣中，本文所揭示之方法富集腫瘤反應性、例如 腫瘤特異性TIL，使得保持純系多樣性。在一些態樣中，將該等細胞、例如該等TIL投與有需要之個體。

Description

培養免疫細胞之方法
本揭示案係關於包含腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之組合物及培養細胞之方法。在一些態樣中，本文所揭示之方法優先促進寡純系或多純系腫瘤反應性腫瘤特異性幹細胞樣T細胞( 例如特徵在於低分化TIL)之富集。使用本文所揭示方法培養之細胞可用於多種細胞療法，包括(但不限於)授受性細胞療法，例如自體T細胞療法。
使用免疫治療策略已展示在治療某些類型之晚期癌症方面相當大之臨床功效。然而，儘管取得顯著成功，但絕大多數患有晚期癌症之患者仍無法受益於免疫療法治療且最終將屈服於其疾病。細胞治療技術(例如授受性細胞療法，包括嵌合抗原受體(CAR)及經改造TCR T細胞)之關鍵限制係缺乏適宜腫瘤靶，此可能導致在患有已用 例如CAR T細胞治療之實體癌症之患者中無法觀察到廣泛的臨床反應。
已在調介患有晚期癌症之患者之臨床反應方面取得一定成功之另一方法係分離、擴增及輸注自體腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。TIL係異質的，具有可變的腫瘤反應性及不相關或抑制性T細胞組成。腫瘤反應性群體通常對抗原高度敏感，導致細胞產物處於功能障礙前狀態且功能受限。
已發現培養及擴增TIL之傳統方法導致TIL之終末分化，從而導致TIL在轉移至患者後之持久性較差。參見例如Rosenberg等人， Clinical Cancer Research 17(13):4550-557 (2011)。另外，目前自腫瘤片段擴增異質TIL群體之方法產生具有降低的多純系性並損失許多腫瘤優勢T細胞純系之TIL群體(參見例如Poschke等人， Clin. Cancer Res.(2020)，其全文皆以引用方式併入本文中)。因此，產生該等TIL源性輸注產物通常會導致腫瘤特異性T細胞在擴增期間損失，及不同分化狀態下免疫細胞之不確定混合，此在根除實體腫瘤方面係無效的。為進行治愈，需要具有增強的自我更新幹細胞/效應物性質之TIL。另外，尚未闡述獲得具有高水準之純系多樣性之低分化TIL之擴增群體的方法，該等低分化TIL保留進一步分裂且靶向及殺傷癌細胞之能力。
迄今為止，該等及其他關鍵限制已剝奪使用TIL作為有效治療劑，此使得難以獲得足夠數量之腫瘤反應性TIL用於T細胞療法。因此，業內仍需要製備TIL組合物之改良方法及使用該等組合物之療法。
本揭示案之一些態樣係關於 離體或 活體外培養腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法，其包括將異質TIL群體置於包含濃度為約30 mM至約100 mM之鉀離子之代謝再程式化培養基(「MRM」)中。在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後富集CD8 +TIL。
本揭示案之一些態樣係關於增加CD8 +TIL之數量或百分比之 離體或 活體外方法，其包括在包含濃度為約30 mM至約100 mM之鉀離子之MRM中培養異質TIL群體。
本揭示案之一些態樣係關於製備CD8 +富集之TIL群體之方法，其包括在包含濃度為約30 mM至約100 mM之鉀離子之MRM中 離體或 活體外培養異質TIL群體。
在一些態樣中，異質TIL群體包含CD4 +TIL及CD8 +TIL。在一些態樣中，異質TIL群體係自個體獲得之一或多個腫瘤樣品獲得。在一些態樣中，腫瘤樣品經受初始TIL培養。在一些態樣中，初始TIL培養包括在MRM中培養腫瘤樣品。
在一些態樣中，MRM在初始TIL培養期間進一步包含IL-2。在一些態樣中，MRM在初始TIL培養期間進一步包含IL-7、IL-15、IL-21或其任一組合。在一些態樣中，MRM在初始TIL培養期間包含IL-2及IL-21。在一些態樣中，初始TIL培養持續至少約14-19天。在一些態樣中，初始TIL培養持續至少約11天。在一些態樣中，初始TIL培養持續至少約14天。在一些態樣中，與初始TIL培養前CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例相比，在初始TIL培養後CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例增加。在一些態樣中，在初始TIL培養後刺激TIL。在一些態樣中，藉由將TIL與CD3促效劑及/或CD28促效劑一起培養來刺激TIL。
在一些態樣中，腫瘤樣品包含腫瘤活體組織切片。在一些態樣中，將腫瘤樣品在培養之前片段化。在一些態樣中，使腫瘤樣品在培養之前解離。
在一些態樣中，在培養異質TIL群體後，群體中至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，在培養異質TIL群體後，群體中至少約50%之TIL係CD8 +TIL。
在一些態樣中，MRM進一步包含鈉離子、鈣離子、葡萄糖或其任一組合。
在一些態樣中，MRM進一步包含細胞擴增劑。在一些態樣中，細胞擴增劑包括GSK3B抑制劑、ACLY抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑或其任一組合。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114或其任一組合。在一些態樣中，AKT抑制劑包括MK2206、A443654、AKTi-VIII或其任一組合。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、至少約85 mM、至少約90 mM、至少約95 mM或至少約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約30 mM至約100 mM、約30 mM至約90 mM、約30 mM至約80 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約50 mM、約40 mM至約100 mM、約40 mM至約90 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約60 mM或約40 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM。
在一些態樣中，MRM進一步包含鈉離子。在一些態樣中，鈉離子之濃度為約25 mM至約100 mM。在一些態樣中，鈉離子之濃度為約30 mM至約40 mM、約30 mM至約50 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約80 mM、約40 mM至約50 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約80 mM、約50 mM至約55 mM、約50 mM至約60 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約80 mM、約55 mM至約60 mM、約55 mM至約65 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約80 mM、約60 mM至約65 mM、約60 mM至約70 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約80 mM、約70 mM至約75 mM、約70 mM至約80 mM或約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子之濃度為約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM或約80 mM。在一些態樣中，鈉離子之濃度為約55 mM。在一些態樣中，鈉離子之濃度為約60 mM。在一些態樣中，鈉離子之濃度為約65 mM。
在一些態樣中，MRM進一步包含葡萄糖。在一些態樣中，葡萄糖之濃度大於約10 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。
在一些態樣中，MRM進一步包含鈣離子。在一些態樣中，鈣離子之濃度大於約0.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約1.3 mM、約1.2 mM至約1.4 mM、約1.2 mM至約1.5 mM、約1.2 mM至約1.6 mM、約1.2 mM至約1.7 mM、約1.2 mM至約1.8 mM、約1.3 mM至約1.4 mM、約1.3 mM至約1.5 mM、約1.3 mM至約1.6 mM、約1.3 mM至約1.7 mM、約1.3 mM至約1.8 mM、約1.4 mM至約1.5 mM、約1.4 mM至約1.6 mM、約1.4 mM至約1.7 mM、約1.4 mM至約1.8 mM、約1.5 mM至約1.6 mM、約1.5 mM至約1.7 mM、約1.5 mM至約1.8 mM、約1.6 mM至約1.7 mM、約1.6 mM至約1.8 mM或約1.7 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。
在一些態樣中，MRM包含約40 mM至約90 mM鉀離子及(i)約40 mM至約80 mM鈉離子；(ii)約10 mM至約24 mM葡萄糖；(iii)約0.5 mM至約2.8 mM鈣離子；或(iv) (i)-(iii)之任一組合。
本揭示案之一些態樣係關於擴增自人類個體獲得之TIL之方法，其包括：在初始TIL培養基中培養TIL；在二次TIL培養基中培養TIL；在第三(或最終)TIL培養基中培養TIL，其中初始TIL培養基、二次TIL擴增培養基及/或第三TIL擴增培養基係MRM。在一些態樣中，初始TIL培養基及二次TIL擴增培養基為高血鉀性且第三TIL擴增培養基不為高血鉀性。在一些態樣中，初始TIL培養基進一步包含IL-2。在一些態樣中，初始TIL培養基進一步包含IL-21。在一些態樣中，初始TIL培養基進一步包含T細胞補充物、血清替代物、麩醯胺酸、麩醯胺酸取代物(例如Glutamax (L-丙胺酸-L-麩醯胺酸))、非必需胺基酸、抗生素(例如青黴素(Penicillin)、鏈黴素(Streptomycin)或二者)、抗真菌劑(例如 Fungin™)及/或丙酮酸鈉。
在一些態樣中，將TIL在初始TIL培養基中培養至少約10天、至少約11天、至少約1週、至少約2週或至少約3週。在一些態樣中，在初始TIL培養基中培養TIL直至初始培養物中之細胞產量達到至少約1×10 5個、至少約2×10 5個、至少約3×10 5個、至少約4×10 5個、至少約5×10 5個、至少約6×10 5個、至少約7×10 5個、至少約8×10 5個、至少約9×10 5個、至少約1×10 6個、至少約2×10 6個、至少約3×10 6個、至少約4×10 6個、至少約5×10 6個、至少約6×10 6個、至少約7×10 6個、至少約8×10 6個、至少約9×10 6個、至少約10×10 6個、至少約15×10 6個、至少約20×10 6個、至少約25×10 6個、至少約30×10 6個、至少約35×10 6個、至少約40×10 6個、至少約45×10 6個或至少約50×10 6個細胞/片段。
在一些態樣中，在(b)中之二次TIL培養基中或之前，用CD3促效劑、CD28促效劑或二者刺激TIL。在一些態樣中，在二次TIL培養基中或之前，用CD27促效劑進一步刺激TIL。在一些態樣中，在二次TIL培養基中或之前，用4-1BB促效劑進一步刺激TIL。在一些態樣中，在刺激後，將TIL培養至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天或至少約26天。在一些態樣中，在二次培養基中培養TIL直至細胞產量達到至少約1×10 7個、至少約2×10 7個、至少約3×10 7個、至少約4×10 7個、至少約5×10 7個、至少約6×10 7個、至少約7×10 7個、至少約8×10 7個、至少約9×10 7個、至少約10×10 7個、至少約11×10 7個、至少約12×10 7個、至少約13×10 7個、至少約14×10 7個、至少約15×10 7個、至少約16×10 7個、至少約17×10 7個、至少約18×10 7個、至少約19×10 7個或至少約20×10 7個細胞。
在一些態樣中，在第三TIL培養基中，用CD3促效劑、CD28促效劑、CD27促效劑及/或4-1BB促效劑刺激TIL。在一些態樣中，第三TIL培養基不為高血鉀性。在一些態樣中，將TIL在第三TIL培養基中培養至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天或至少約21天。
本揭示案之一些態樣係關於增加腫瘤反應性( 例如腫瘤特異性) TIL之方法，其包括：將一或多個腫瘤片段在初始TIL培養基中培養長達約11至19天，該等初始TIL培養基為高血鉀性且包含IL-2及視情況地IL-21，由此自腫瘤片段獲得TIL；在添加(i) CD3促效劑及(ii) CD28促效劑、CD27促效劑、4-1BB促效劑或其任一組合後，將TIL在二次TIL培養基中培養約7天至至少約14天，該等二次TIL培養基為高血鉀性；在添加(i) CD3促效劑及(ii) CD28促效劑、CD27促效劑、4-1BB促效劑或其任一組合後，將TIL在第三TIL培養基中培養約14天至至少約21天，該等第三TIL培養基為高血鉀性。
在一些態樣中，相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後TIL群體中之TCF7表現，TIL在MRM中培養後展現增加的TCF7表現。在一些態樣中，相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後CD8 +CD62L +TIL之比例，TIL群體在MRM中培養後包含增加的CD8 +CD62L +TIL比例。在一些態樣中，相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後CD8 +PD1 +TIL之比例，TIL群體在MRM中培養後包含增加的CD8 +PD1 +TIL比例。
在一些態樣中，與置於對照培養基中之異質TIL群體之純系多樣性相比，異質TIL群體在置於MRM中後具有增加的純系多樣性。
在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。
在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後之純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性(Simpsons clonality)所量測。
在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後之純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。
在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後之純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。
在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後之純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。
在一些態樣中，異質TIL群體在置於MRM中後之純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。
本揭示案之一些態樣係關於免疫細胞之組合物，其包含根據本文所揭示之任一方法培養之一或多個CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之免疫細胞係CD8 +TIL。
本揭示案之一些態樣係關於包含免疫細胞群體之組合物，其中至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之免疫細胞係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約50%之細胞係CD8 +TIL。
在一些態樣中，相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後免疫細胞群體中之TCF7表現，細胞在MRM中培養後展現增加的TCF7表現。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +/CD62L +TIL。在一些態樣中，在初始TIL培養結束時獲得之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +。在一些態樣中，在初始TIL培養結束時獲得之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD39 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD28 +。在一些態樣中，在初始TIL培養結束時獲得之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +CD39 +。在一些態樣中，在初始TIL培養結束時獲得之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +CD27 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD62L +。在一些態樣中，在初始TIL培養結束時獲得之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD28 +CD103 +PD1 +TCF7 +。
在一些態樣中，免疫細胞群體包含至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個細胞。在一些態樣中，免疫細胞群體包含至少約1 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個CD8 +細胞。
在一些態樣中，CD8 +TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。
在一些態樣中，CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。
本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之癌症的方法，其包括向個體投與TIL群體，其中根據本文所揭示之任一方法培養TIL群體。在一些態樣中，TIL群體富集CD8 +TIL。在一些態樣中，TIL群體中至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，TIL群體中至少約50%之TIL係CD8 +TIL。
本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之癌症的方法，其包括向個體投與本文所揭示之組合物。在一些態樣中，癌症包括實體腫瘤。在一些態樣中，癌症包括衍生自以下之實體腫瘤：黑色素瘤、結腸癌、肺癌、子宮頸癌、胃腸癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰臟癌、頭頸部小細胞癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、睪丸生殖細胞腫瘤、胃腺癌、皮膚黑色素瘤、間皮瘤、腎透明細胞癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、浸潤性乳癌、腎乳頭狀細胞癌、結腸腺癌或其任一組合。
在一些態樣中，該方法包括向個體投與至少約2 × 10 9個、至少約3 × 10 9個、至少約4 × 10 9個、至少約5 × 10 9個、至少約6 × 10 9個、至少約7 × 10 9個、至少約8 × 10 9個、至少約9 × 10 9個或至少約1 × 10 10個或至少約10 × 10 10個或至少約15 × 10 10個或至少約20 × 10 10個或至少約25 × 10 10個或至少約30 × 10 10個細胞。在一些態樣中，該方法包括向個體投與至少約1 × 10 9個、至少約3 × 10 9個、至少約4 × 10 9個、至少約5 × 10 9個、至少約6 × 10 9個、至少約7 × 10 9個、至少約8 × 10 9個、至少約9 × 10 9個或至少約1 × 10 9個CD8 +細胞。在一些態樣中，該方法包括向個體投與約1×10 9至約4 × 10 9個、約5 × 10 9至約7 × 10 9個、約10 × 10 9至約30 × 10 9個、約40 × 10 9至約60 × 10 9個、約70 × 10 9至約90 × 10 9個細胞。在一些態樣中，該方法包括向個體投與大於90 × 10 9個細胞。
在一些態樣中，該方法進一步包括投與檢查點抑制劑。在一些態樣中，檢查點抑制劑係在投與細胞群體後投與個體。在一些態樣中，檢查點抑制劑包括CTLA-4拮抗劑、PD1拮抗劑、TIM-3拮抗劑或其組合。在一些態樣中，檢查點抑制劑包括抗CTLA-4抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIM-3抗體或其組合。在一些態樣中，該方法進一步包括投與檢查點活化劑。在一些態樣中，檢查點抑制劑係在投與TIL群體後投與個體。在一些態樣中，檢查點活化劑包括OX40促效劑、LAG-3促效劑、4-1BB (CD137)促效劑、GITR促效劑、TIM3促效劑或其組合。在一些態樣中，檢查點活化劑包括抗OX40抗體、抗LAG-3抗體、抗CD137抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體或其組合。
在一些態樣中，該方法進一步包括投與細胞介素。在一些態樣中，細胞介素係在投與TIL群體後投與個體。在一些態樣中，細胞介素係IL-2。
在一些態樣中，該方法進一步包括在投與細胞群體之前向個體投與淋巴清除療法。在一些態樣中，淋巴清除療法包含環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟達拉濱(fludarabine)或環磷醯胺及氟達拉濱二者。
本揭示案之一些態樣係關於擴增TIL群體，其純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。
本揭示案之一些態樣係關於擴增TIL群體，其純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。
在一些態樣中，至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個細胞。在一些態樣中，至少約1 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個CD8 +細胞。
在一些態樣中，至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之擴增TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約50%之擴增TIL係CD8 +TIL。
在一些態樣中，相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後免疫細胞群體中之TCF7表現，擴增TIL在MRM中培養後展現增加的TCF7表現。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之擴增TIL係CD8 +/CD62L +TIL。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD39 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD28 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +CD39 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +CD27 +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD62L +。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD28 +CD103 +PD1 +TCF7 +。
在一些態樣中，本文所揭示之組合物或本文所揭示之擴增TIL群體包含表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之至少一種免疫細胞。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或其任一組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+及TCF7+或其任一組合。在一些態樣中，效應物樣標記物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或其任一組合。在一些態樣中，組合物或群體中至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之經擴增TIL包含表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之至少一種免疫細胞。
本揭示案之一些態樣係關於表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或其任一組合。在一些態樣中，幹細胞標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+及TCF7+。在一些態樣中，效應物樣標記物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或其任一組合。
本揭示案之一些態樣係關於擴增TIL群體，其包含本文所揭示之TIL， 例如包含一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL。在一些態樣中，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之擴增TIL群體包含含有一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL。
本揭示案之一些態樣係關於醫藥組合物，其包含含有一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL，及醫藥學上可接受之載劑。
本揭示案之某些態樣係關於治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包括向個體投與本文所揭示之TIL、本文所揭示之擴增TIL群體或本文所揭示之醫藥組合物。在一些態樣中，疾病或疾患係癌症。
在一些態樣中，相對於在對照培養基中培養後CD39 -/CD69 -TIL之比例，TIL群體在MRM中培養後包含增加的CD39 -/CD69 -TIL比例。
在一些態樣中，擴增TIL群體或如請求項117-136中任一項，其中TIL群體中TIL總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%係CD39 -/CD69 -。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2020年11月23日提出申請之美國臨時申請案第63/198,933號；於2021年2月5日提出申請之美國臨時申請案第63/146,477號；於2021年2月25日提出申請之美國臨時申請案第63/153,922號；於2021年3月23日提出申請之美國臨時申請案第63/165,023號；於2021年3月29日提出申請之美國臨時申請案第63/167,592號；於2021年4月28日提出申請之美國臨時申請案第63/181,218號；及於2021年10月28日提出申請之美國臨時申請案第63/273,138號的優先權及權益；該等美國臨時申請案中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。
本揭示案係關於培養免疫細胞( 例如TIL)之方法、藉由該等方法製備之細胞( 例如包含寡純系或多純系腫瘤反應性( 例如腫瘤特異性)幹細胞樣T細胞及/或CD8 +TIL富集之組合物)及/或使用本文所述之免疫細胞治療個體之方法。本揭示案之細胞培養方法能夠增強CD8 +TIL之擴增及/或增加所培養TIL之多能性及/或多潛能性。在一些態樣中，當培養免疫細胞及/或將免疫細胞用於 活體內療法時，培養方法能夠減少及/或防止免疫細胞耗竭， 例如TIL耗竭。在一些態樣中，本揭示案之培養方法能夠保持衍生自癌症患者之TIL之純系多樣性。
在一些態樣中，本揭示案係關於 離體或 活體外培養TIL之方法，其包括在代謝再程式化培養基(例如包含濃度高於40 mM之鉀離子之高血鉀性培養基)中培養異質TIL群體，其中高血鉀性培養基不為高滲的。在一些態樣中，本揭示案係關於增加CD8 +TIL之數量或百分比之 離體或 活體外方法，其包括在代謝再程式化培養基(例如包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基)中培養異質TIL群體。在其他態樣中，本揭示案係關於製備CD8 +富集之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體之方法，其包括在代謝再程式化培養基(例如包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基)中 離體或 活體外培養異質TIL群體。在一些態樣中，本揭示案係關於製備CD8 +富集之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體之方法，其包括在代謝再程式化培養基(例如包含濃度介於40 mM與80 mM之間之鉀離子及濃度介於100 mM與30 mM之間之NaCl的培養基)中 離體或 活體外培養異質TIL群體，其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，高血鉀性培養基不為高滲的。在一些態樣中，高血鉀性培養基係低滲的。在一些態樣中，高血鉀性培養基係等滲的。在一些態樣中，高血鉀性培養基進一步包含介白素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任一組合。在一些態樣中，高血鉀性培養基進一步包含鈉離子、鈣離子、葡萄糖或其任一組合。
在更詳細闡述本揭示案之前應理解，本揭示案並不限於所述之特定組合物或製程步驟，其當然會發生變化。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後應明瞭，本文闡述及說明之每一個別態樣具有離散組分及特徵，其可容易地自其他若干態樣中任一者之特徵分離或與其組合而不背離本揭示案之範圍或精神。可以所列舉事件之順序或以邏輯上可能之任何其他順序來實施任一所列舉方法。
本文所提供之標題並非本揭示案之各個態樣之限制，本揭示案可藉由參考整個說明書來定義。亦應理解，本文所用之術語僅用於闡述特定態樣之目的，而不欲具有限制性。 I. 術語
為可更容易地理解本揭示案，首先定義某些術語。如本申請案中所用，除非本文另外明確提供，否則以下術語中之每一者應具有下文所述之含義。其他定義闡述於本申請案通篇中。
在本揭示案通篇中，術語「一(a)」或「一(an)」實體係指一或多個該實體；例如，「嵌合多肽」應理解為代表一或多個嵌合多肽。因此，術語「一(a)」或(「一(an)」)、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
另外，本文所用之「及/或」應視為具或不具另一者之兩個指定特徵或組分中之每一者之特定揭示。因此，如本文片語(例如「A及/或B」) 中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如片語(例如「A、B及/或C」)中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。另外，「或」用於指清單中組分之開放清單。舉例而言，「其中X包含A或B」意指X包含A，X包含B，X包含A及B，或X包含A或B及任何其他組分。
應理解，每當在本文中使用語言「包含」闡述態樣時，亦提供根據「由……組成」及/或「基本上由……組成」闡述之其他類似態樣。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與本揭示案相關之領域之普通技術人員通常理解之含義相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show，第2版，2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular  Biology，第3版，1999, Academic Press；及Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press向熟習此項技術者提供本揭示案中所用之許多術語之通用詞典。
單位、前綴及符號以其國際單位製(Système International de Unites，SI)接受之形式表示。數字範圍包括定義範圍之數字。
本文所用之縮寫定義於本揭示案通篇中。本揭示案之各個態樣進一步詳細闡述於以下子部分中。
術語「約」或「基本上包含」係指值或組成在如由熟習此項技術者所測定之特定值或組成之可接受之誤差範圍內，此將部分取決於量測或測定值或組成之方式， 即量測系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意指根據此項技術中之實踐在1個標準偏差內或大於1個標準偏差。替代地，「約」或「基本上包含」可意指高達10%之範圍。另外，尤其對於生物系統或過程，該等術語可意指高達一個數量級或高達值之5倍。當申請案及申請專利範圍中提供特定值或組成時，除非另有說明，否則「約」或「基本上包含」之含義應假設在特定值或組成之可接受之誤差範圍內。
如本文所用之術語「大約」在應用於一或多個所關注值時係指與所述參考值相似之值。在一些態樣中，除非另有說明或自上下文明顯看出，否則術語「大約」係指在任一方向上(大於或小於)在所述參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內之一系列值(此數值將超過可能值之100%的情況除外)。
如本文所述，除非另有指示，否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所列舉範圍內之任一整數及(適當時)其分數(例如整數之十分之一及百分之一)的值。
如本文所用之術語「對照培養基」係指與本文所揭示之代謝再程式化培養基(「MRM」)相比之任何培養基。對照培養基可包含與代謝再程式化培養基相同之組分，某些離子濃度除外，例如鉀離子。在一些態樣中，本文所述之代謝再程式化培養基係自對照培養基藉由調整一或多種離子濃度(例如鉀離子濃度)來製備，如本文所述。在一些態樣中，對照培養基包含基礎培養基，例如CTS™ OPTIMIZER™。在一些態樣中，對照培養基包含AIM V、RPMI或包含AIM V及RPMI之混合物。在一些態樣中，對照培養基包含(i) 50% AIM V，(ii) 50% RPMI1640，(iii) 5%或10%人類血清，及(iv) IL-2。因此，在一些態樣中，對照培養基包含亦在代謝再程式化培養基中添加之一或多種其他組分，包括(但不限於)胺基酸、葡萄糖、麩醯胺酸、T細胞刺激劑、抗體、取代物等，但對照培養基具有不同於代謝再程式化培養基之某些離子濃度。除非另有指示，否則術語「培養基(media)」及「培養基(medium)」可互換使用。
如本文所用之術語「免疫細胞」係指免疫系統之細胞。在一些態樣中，免疫細胞選自T淋巴球(「T細胞」)、B淋巴球(「B細胞」)、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞或嗜中性球。在一些態樣中，免疫細胞係腫瘤浸潤細胞(TIL)。如本文所用之「TIL」係指已至少一次進入腫瘤中或能夠進入腫瘤( 例如在腫瘤之實質內)之T細胞。在一些態樣中，腫瘤係實體腫瘤。在一些態樣中，腫瘤係液體腫瘤， 例如造血系統癌症。藉由本發明方法製備之TIL可具有與天然TIL相同之一或多種性質。在一些態樣中，藉由本發明方法製備之TIL具有不存在於天然TIL中之一或多種性質。TIL可使用任何方法獲得。在一些態樣中，TIL係自個體之腫瘤樣品獲得。在一些態樣中，在促進TIL自腫瘤組織逃逸、TIL增殖及/或TIL擴增之條件下培養腫瘤樣品或其部分。在一些態樣中，用於促進TIL逃逸、增殖及/或擴增之培養基係本文所揭示之任何代謝再程式化培養基，例如高血鉀性培養基。
如本文所用之細胞「群體」係指一個以上之細胞( 例如複數個細胞)之集合。在一些態樣中，細胞群體包含一個以上之TIL， 例如複數個TIL。在一些態樣中，細胞群體包含含有多種類型之細胞之細胞異質混合物， 例如TIL及除TIL以外之細胞之異質混合物。
TIL包括(但不限於) CD8+ T細胞( 即細胞毒性T細胞)、CD4+ T細胞、B細胞及自然殺手細胞。TIL包括原代TIL ( 例如自患者組織樣品獲得)及次代TIL ( 例如已自原代TIL培養、擴增或增殖之TIL細胞群體)。在一些態樣中，TIL經遺傳修飾。在一些態樣中，TIL係CD8 +T細胞。CD8 +TIL通常視為負責破壞癌細胞之TIL亞群。相反，CD4 +TIL通常視為用作免疫反應之抑制劑，其可限制針對腫瘤之免疫反應。
在一些態樣中，TIL可使用細胞表面標記物進行生物化學定義。TIL通常可藉由表現以下生物標記物中之一或多者來分類：CD4、CD8、TCR αβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45RA、CD95、PD-1及CD25。在一些態樣中，TIL可根據其浸潤腫瘤及選擇性殺傷癌細胞之能力進行功能定義。
如本文所用之術語「T細胞」及「T淋巴球」係可互換的且係指由胸腺產生或處理之任何淋巴球。T細胞之非限制性類別包括效應T細胞(例如CD8 +T細胞)及Th細胞(例如CD4 +T細胞)。在一些態樣中，免疫細胞係Th1細胞。在一些態樣中，免疫細胞係Th2細胞。在一些態樣中，免疫細胞係Tc17細胞。在一些態樣中，免疫細胞係Th17細胞。在一些態樣中，免疫細胞係T reg細胞。
如本文所用之術語「記憶」T細胞係指先前遇到並對其同源抗原有反應( 例如， 活體內、 活體外或 離體)或已用 例如抗CD3抗體刺激( 例如， 活體外或 離體)之T細胞。具有「記憶樣」表型之免疫細胞( 例如TIL)在二次暴露於抗原或刺激時會繁殖或增殖以引起比初次暴露期間更快且強之免疫反應。在一些態樣中，記憶T細胞包括中央記憶T細胞(T CM細胞)、效應記憶T細胞(T EM細胞)、組織駐留記憶T細胞(T RM細胞)、幹細胞樣記憶T細胞(T SCM細胞)或其任一組合。
如本文所用之術語「幹細胞樣(stem-like)」或「幹細胞樣(stem cell-like)」係指細胞自我更新之性質或能力，且具有產生及復原記憶及效應T細胞亞組之整個譜之多能能力。在一些態樣中，幹細胞樣細胞可藉由細胞表現之特異性標記物來量測。在一些態樣中，彼等幹細胞樣標記物可為CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+及TCF7+中之一或多者。在一些態樣中，幹細胞樣細胞可藉由轉錄體分析、例如使用本文所揭示之幹性基因印記來鑑別。在一些態樣中，效應物樣標記物包括Krishna等人， Science 370:1328-34 (2020年12月11日)；及/或Galletti等人， Nature Immunology(2018年10月)中所揭示之標記物，該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。
如本文所用之術語「幹細胞樣記憶T細胞」、「T記憶幹細胞」或「T SCM細胞」係指表現CD95、CD45RA、CCR7及CD62L且被賦予幹細胞樣自我更新能力及復原記憶及效應T細胞亞組之整個譜之多能能力的記憶T細胞。
如本文所用之術語「中央記憶T細胞」或「T CM細胞」係指表現CD45RO、CCR7及CD62L之記憶T細胞。中央記憶T細胞通常發現於淋巴結內及外周循環中。
如本文所用之術語「效應物樣」或「效應細胞樣」係指腫瘤細胞殺傷能力及細胞介素多功能性，例如細胞產生發炎細胞介素及/或細胞毒性分子之能力。在一些態樣中，效應物樣細胞可藉由細胞表現之特異性標記物來量測。在一些態樣中，彼等效應物樣標記物可為pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+中之一或多者。在一些態樣中，效應物樣標記物包括選自由以下組成之群之STAT靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任一組合。在一些態樣中，效應物樣細胞可藉由轉錄體分析來鑑別。在一些態樣中，效應物樣標記物包括Kaech等人， Cell 111:837-51 (2002)；Tripathi等人， J. Immunology 185:2116-24 (2010)；及/或Johnnidis等人， Science Immunology 6:eabe3702 (2021年1月15日)中所揭示之標記物，該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些態樣中，效應物樣細胞係使用Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10):1290-97 (2011)中所述之效應物相關基因組來表徵。在一些態樣中，效應物樣細胞之基因印記包括一或多個選自以下之基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMI、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、KLRB1及其任一組合(參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10):1290-97 (2011)。
如本文所用之術語「效應記憶T細胞」或「T EM細胞」係指表現CD45RO但不表現CCR7及CD62L之記憶T細胞。由於效應記憶T細胞缺少淋巴結歸巢受體( 例如CCR7及CD62L)，故該等細胞通常發現於外周循環及非淋巴組織中。
如本文所用之術語「組織駐留記憶T細胞」或「T RM細胞」係指不進行循環且保持駐留於外周組織(例如皮膚、肺及胃腸道)中之記憶T細胞。在一些態樣中，組織駐留記憶T細胞亦係效應記憶T細胞。
如本文所用之術語「原初T細胞」、「T N細胞」或「原初TIL」係指表現CD45RA、CCR7及CD62L、但不表現CD95之T細胞及/或TIL。該等細胞代表T細胞譜系中分化程度最低之細胞。原初T細胞與抗原呈遞細胞(APC)之間之相互作用誘導原初T細胞向活化T EFF細胞分化且誘導免疫反應。
如本文所用之術語「片段化」、「片段」及「片段化的」闡述破壞腫瘤之製程，包括機械片段化方法，例如破碎、切割、分裂及粉碎腫瘤組織以及破壞腫瘤組織之物理結構之任何其他方法。
如本文所用之術語「培養」係指 離體及/或 活體外細胞之受控生長。如本文所用之「培養」包括細胞( 例如TIL)在細胞擴增期間之生長。在一些態樣中，所培養細胞係自個體( 例如人類個體)獲得。在一些態樣中，所培養細胞包含自人類個體獲得之TIL。在一些態樣中，培養包括將腫瘤樣品或腫瘤片段置於本文所揭示之培養基中，其中培養基促進TIL自腫瘤樣品逃逸及TIL擴增。在一些態樣中，TIL在培養之前經分離或純化。在一些態樣中，細胞培養意欲擴增所培養細胞之數量， 例如以增加細胞之增殖。
如本文用於TIL之「擴增(expand)」或「擴增(expansion)」係指刺激或活化細胞及培養細胞之過程。擴增過程可在刺激或活化及培養細胞後引起所培養細胞群體中期望細胞之比例或總數增加， 例如TIL之比例或總數增加。擴增無需所培養細胞群體中之所有細胞類型之數量增加。相反，在一些態樣中，僅所培養細胞群體中之細胞亞組之數量在擴增期間增加，而其他細胞類型之數量可能無變化或可能減少。
如本文所用之術語「產量」係指培養方法後之細胞總數或其一部分。在一些態樣中，術語「產量」係指特定細胞群體， 例如TIL群體中之幹細胞樣TIL。產量可使用任何方法來測定，包括(但不限於)基於代表性樣品估計產量。
如本文所用之術語「幹細胞樣」、「幹細胞樣」或「低分化」係指表現與更原初表型一致之標記物之細胞， 例如免疫細胞( 例如TIL)。舉例而言，低分化TIL可表現T N或T SCM細胞所特有之一或多種標記物。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」TIL表現CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」TIL表現CD45RA、CCR7及CD62L，且為CD45RO 低。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」免疫細胞( 例如TIL)表現CD45RA、CCR7及CD62L，且不表現CD45RO。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，本文所揭示之方法促進具有低分化表型之細胞( 例如TIL)之生長及/或增殖。不受限於任何特定機制，在一些態樣中，本文所揭示之方法阻斷、抑制或限制低分化細胞( 例如TIL)之分化，從而增加培養物中幹細胞樣細胞之數量。舉例而言，通常認為，為有效地控制腫瘤，具有幹細胞樣記憶或中央記憶表型之低分化TIL之授受性轉移係較佳的。參見例如Gattinoni, L.等人 ， J. Clin. Invest. 115:1616-1626 (2005)；Gattinoni, L.等人， Nat Med15(7):808-814 (2009)；Lynn, R.C.等人， Nature576(7786): 293-300 (2019)；Gattinoni, L.等人 ， J. Clin. Invest. 115:1616-1626 (2005)；Gattinoni, L.等人， Nat Med15(7):808-814 (2009)；及Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011)。
幹性之特徵在於自我更新之能力、多能性及增殖潛能之持久性。在一些態樣中，幹性之特徵在於特定基因印記， 例如跨大量基因之組合表現模式。在一些態樣中，基因印記包含一或多個選自以下之基因：ACTN1、DSC1、TSHZ2、MYB、LEF1、TIMD4、MAL、KRT73、SESN3、CDCA7L、LOC283174、TCF7、SLC16A10、LASS6、UBE2E2、IL7R、GCNT4、TAF4B、SULT1B1、SELP、KRT72、STXBP1、TCEA3、FCGBP、CXCR5、GPA33、NELL2、APBA2、SELL、VIPR1、FAM153B、PPFIBP2、FCER1G、GJB6、OCM2、GCET2、LRRN1、IL6ST、LRRC16A、IGSF9B、EFHA2、LOC129293、APP、PKIA、ZC3H12D、CHMP7、KIAA0748、SLC22A17、FLJ13197、NRCAM、C5orf13、GIPC3、WNT7A、FAM117B、BEND5、LGMN、FAM63A、FAM153B、ARHGEF11、RBM11、RIC3、LDLRAP1、PELI1、PTK2、KCTD12、LMO7、CEP68、SDK2、MCOLN3、ZNF238、EDAR、FAM153C、FAAH2、BCL9、C17orf48、MAP1D、ZSWIM1、SORBS3、IL4R、SERPINF1、C16orf45、SPTBN1、KCNQ1、LDHB、BZW2、NBEA、GAL3ST4、CRTC3、MAP3K1、HLA-DOA、RAB43、SGTB、CNN3、CWH43、KLHL3、PIM2、RGMB、C16orf74、AEBP1、SNORD115-11、SNORD115-11、GRAP及其任一組合(參見例如Gattinoni (2011))。在一些態樣中，基因印記包含一或多個選自以下之基因：NOG、TIMD4、MYB、UBE2E2、FCER1G、HAVCR1、FCGBP、PPFIBP2、TPST1、ACTN1、IGF1R、KRT72、SLC16A10、GJB6、LRRN1、PRAGMIN、GIPC3、FLNB、ARRB1、SLC7A8、NUCB2、LRRC7、MYO15B、MAL、AEBP1、SDK2、BZW2、GAL3ST4、PITPNM2、ZNF496、FAM117B、C16orf74、TDRD6、TSPAN32、C18orf22、C3orf44、LOC129293、ZC3H12D、MLXIP、C7orf10、STXBP1、KCNQ1、FLJ13197、LDLRAP1、RAB43、RIN3、SLC22A17、AGBL3、TCEA3、NCRNA00185、FAM153B、FAM153C、VIPR1、MMP19、HBS1L、EEF2K、SNORA5C、UBASH3A、FLJ43390、RP6-213H19.1、INPP5A、PIM2、TNFRSF10D、SNRK、LOC100128288、PIGV、LOC100129858、SPTBN1、PROS1、MMP28、HES1、CACHD1、NSUN5C、LEF1、TTTY14、SNORA54、HSF2、C16orf67、NSUN5B、KIAA1257、NRG2、CAD、TARBP1、STRADB、MT1F、TMEM41B、PDHX、KDM6B、LOC100288322、UXS1、LGMN、NANOS2、PYGB、RASGRP2、C14orf80、XPO6、SLC24A6、FAM113A、MRM1、FBXW8、NDUFS2、KCTD12及其任一組合(參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21, 1552-1562 (2020))。
在延長抗原暴露存在下，例如在許多癌症中，更高分化之免疫細胞( 例如效應T細胞及效應記憶T細胞)通常變得耗竭且失去其抗腫瘤功能。生物標記物( 例如T細胞標記物)可使用任何方法來量測。在一些態樣中，T細胞係使用抗體染色、然後藉由設門流式細胞術來鑑別。
如本文所用之術語「純系型」係指具有源自TCRα或TCRß重排之獨特DNA序列之T細胞群體。獨特的可變α鏈(VA)序列可與一條以上之可變ß鏈(VB)序列配對。相反，獨特VB序列可與一條以上之VA序列配對。
如本文所用之術語「張力」係指穿過細胞膜之有效滲透壓梯度之量度。張力可基於溶液中鉀離子及氯化鈉(NaCl)之水準來量測或計算。在本文中，張力計算為鉀離子(K+)之濃度及氯化鈉(NaCl)之濃度之和乘以2。張力可以溶液( 例如培養基)之滲透壓來表示。如本文所用，當培養基中溶質之濃度等效於細胞內溶質之濃度時，溶液( 例如培養基)視為「等滲」。如本文所用之等滲培養基具有約280 mOsm/L之滲透壓( 例如([K+] + [NaCl]) × 2 = 280)。
如本文所用，若溶液中溶質之濃度低於細胞中溶質之濃度，則溶液( 例如培養基)視為「低滲」。如本文所用之低滲溶液具有小於280 mOsm/L之張力( 例如([K+] + [NaCl]) × 2 ＜ 280)。在一些態樣中，本文所述之低滲培養基具有約240 mOsm/L或約250 mOsm/L之滲透壓。在一些態樣中，低滲培養基具有至少約220 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低滲培養基具有至少約230 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低滲培養基具有至少約240 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，本文所述之低滲培養基具有約250 mOsm/L之張力( 例如([K+] + [NaCl]) × 2 = 250)。
如本文所用，若溶液中溶質之濃度高於細胞中溶質之濃度，則溶液( 例如培養基)視為「高滲」。如本文所用之高滲溶液具有大於300 mOsm/L之滲透壓( 例如([K+] + [NaCl]) × 2 ＞ 280)。在一些態樣中，本文所述之高滲培養基具有約320 mOsm/L之滲透壓。在某些態樣中，藉由增加或減小一或多種溶質之濃度來調整溶液( 例如培養基)之張力，該一或多種溶質選自鉀離子、鈉離子、葡萄糖及其任一組合。在一些態樣中，溶液( 例如培養基)之張力係藉由增加或減小鉀離子及NaCl之濃度來調整。在一些態樣中，培養基之張力可藉由用第二溶質之減少抵消一種溶質之增加來維持。舉例而言，增加培養基中鉀離子之濃度而不改變鈉離子之濃度可增加培養基之張力。然而，若增加鉀離子之濃度且減小鈉離子之濃度，則可維持原始培養基之張力。如本文所用培養基之張力係藉由鉀濃度及NaCl濃度之和乘以2來定義。參見例如表2。
如本文所用之術語「鉀」、「鉀離子」、「鉀陽離子」及「K+」可互換使用且係指元素鉀。元素鉀以正離子存在於溶液中。然而，熟習此項技術者將容易地明瞭，製備包含鉀離子之溶液之標準方法包括將含鉀鹽( 例如KCl)稀釋至溶液中。因此，包含莫耳(M)濃度鉀離子之溶液( 例如培養基)可闡述為包含等莫耳(M)濃度之包含鉀之鹽。
如本文所用之術語「鈉離子」及「鈉陽離子」可互換使用且係指元素鈉。元素鈉以單價陽離子存在於溶液中。然而，熟習此項技術者將容易地明瞭，製備包含鈉離子之溶液之標準方法包括將含鈉鹽( 例如NaCl)稀釋至溶液中。因此，包含莫耳(M)濃度鈉離子之溶液( 例如培養基)可闡述為包含等莫耳(M)濃度之包含鈉之鹽。
如本文所用之術語「鈣離子」及「鈣陽離子」可互換使用且係指元素鈣。元素鈣以二價陽離子存在於溶液中。然而，熟習此項技術者將容易地明瞭，製備包含鈣離子之溶液之標準方法包括將含鈣鹽( 例如CaCl 2)稀釋至溶液中。因此，包含莫耳(M)濃度鈣離子之溶液( 例如培養基)可闡述為包含等莫耳(M)濃度之包含鈣之鹽。
如本文所用之術語「高血鉀性」( 例如「高血鉀性培養基」)係指具有增加的鉀濃度之培養基。在一些態樣中，高血鉀性培養基包含濃度大於5 mM之鉀離子。在一些態樣中，高血鉀性培養基包含濃度高於40 mM之鉀離子。在一些態樣中，高血鉀性培養基包含至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM或約100 mM之鉀離子濃度。如本文所用之術語「代謝再程式化培養基(metabolic reprogramming media)」、「代謝再程式化培養基(metabolic reprogramming medium)」或「MRM」係指本揭示案之高血鉀性培養基。在某些態樣中，代謝再程式化培養基包含約40 mM至約80 mM NaCl、約40 mM至約90 mM KCl、約0.5 mM至約2.8 mM鈣及約10 mM至約24 mM葡萄糖。在一些態樣中，代謝再程式化培養基進一步包含約250 mOsmol至約340 mOsmol之滲透壓。
如本文所用之術語「基礎」培養基係指補充有本文所揭示之一或多種其他元素( 例如鉀、鈉、鈣、葡萄糖、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其任一組合)之任何起始培養基。基礎培養基可為用於培養免疫細胞( 例如TIL)之任何培養基。在一些態樣中，基礎培養基選自平衡鹽溶液( 例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、克里克氏培養基(Click’s medium)、最小必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培養基(Glasgow Minimal Essential Medium，GMEM)、α最小必需培養基(α MEM)、伊斯科夫改良達爾伯克氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)、M199、OPTMIZER™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZER™完全培養基、IMMUNOCULT™ XF (STEMCELL™ Technologies)、IMMUNOCULT™ XF、AIM V/TEXMACS™培養基、TRANSACT™ TIL擴增培養基、TIL快速擴增方案培養基及其任一組合。在一些態樣中，基礎培養基係不含血清的。在一些態樣中，基礎培養基包含PRIME-XV T細胞CDM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER TM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER TMPro。在一些態樣中，基礎培養基包含X-VIVO TM15 (LONZA)。在一些態樣中，基礎培養基包含IMMUNOCULT TM。在一些態樣中，基礎培養基包含克里克氏培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含TRANSACT TMTIL擴增培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含TIL快速擴增培養基。在一些態樣中，基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。舉例而言，在一些態樣中，基礎培養基包括補充有ICSR之OPTMIZER™完全培養基、補充有ICSR之AIM V、補充有ICSR之IMMUNOCULT™ XF、補充有ICSR之RPMI、補充有ICSR之TEXMACS™或其任一組合。在一些態樣中，適宜基礎培養基包括克里克氏培養基、OpTimizer® (CTS®)培養基、Stemline® T細胞擴增培養基(Sigma-Aldrich)、AIM V®培養基(CTS®)、TexMACS®培養基(Miltenyi Biotech)、ImmunoCult®培養基(Stem Cell Technologies)、PRIME-XV® T細胞擴增XSFM (Irvine Scientific)、伊斯科夫培養基及/或RPMI-1640培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含不含NaCl之CTS™ OpTimizer™。在一些態樣中，適宜基礎培養基包括克里克氏培養基、OpTimizer® (CTS®)培養基、Stemline® T細胞擴增培養基(Sigma-Aldrich)、AIM V®培養基(CTS®)、TexMACS®培養基(Miltenyi Biotech)、ImmunoCult®培養基(Stem Cell Technologies)、PRIME-XV® T細胞擴增XSFM (Irvine Scientific)、伊斯科夫培養基及/或RPMI-1640培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含不含NaCl之CTS™ OpTimizer™。在一些態樣中，除經添加以控制張力之NaCl外，基礎培養基包含一或多種鈉鹽， 例如與鉀離子組合添加之NaCl。
如本文所用之術語「細胞介素」係指對細胞之間之相互作用及通信具有特異性效應之由細胞釋放之小分泌蛋白。細胞介素之非限制性實例包括介白素( 例如介白素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IL-21、IL-23及IL-29)、干擾素(IFN； 例如IFN-α、IFN-β及IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)家族成員及轉型生長因子(TGF)家族成員。本揭示案之一些態樣係關於在包含細胞介素之培養基中培養細胞( 例如T細胞及/或NK細胞)之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含細胞介素之培養基中培養TIL之方法。本揭示案之一些態樣係關於在包含細胞介素之培養基中擴增TIL之方法。在一些態樣中，細胞介素係介白素。在一些態樣中，細胞介素選自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及其組合。IL-2 (UniProtKB - P60568)係由T細胞因應抗原或有絲分裂刺激產生。已知IL-2刺激T細胞增殖及調控免疫反應之其他關鍵活性。IL-7 (UniProtKB - P13232)係能夠刺激淋巴樣祖細胞增殖之造血系統生長因子。認為IL-7在B細胞成熟之某些時期中在增殖中起作用。與IL-2一樣，IL-15 (UniProtKB - P40933)係刺激T淋巴球增殖之細胞介素。IL-21 (UniProtKB - Q9HBE4)係具有免疫調控活性之細胞介素。認為IL-21促進先天性免疫與授受性免疫之間之轉換且誘導B細胞產生IgG1及IgG3。IL-21亦可在自然殺手(NK)細胞之增殖及成熟中與IL-15協同起作用，且IL-21可調控成熟B細胞及T細胞因應活化刺激物之增殖。在與IL-15及IL-18協同作用下，IL-15亦刺激T細胞及NK細胞產生干擾素γ，且IL-21亦可在T細胞介導之免疫反應期間抑制樹突細胞活化及成熟。
如本文所用之術語「高於」意指大於但不等於。舉例而言，「高於5 mM」意指大於5 mM、但不包括5 mM之任一量。
如本文所用之術語「優先」係指主要結果。舉例而言，若本文所揭示之方法優先促進CD8 +TIL之擴增，則應理解擴增之主要產物係CD8 +TIL。術語「優先」不一定意指100%之 例如所得TIL係CD8 +，而是該術語表明CD8 +TIL擴增之程度大於CD8 -TIL。
如本文所用之「投與」係指使用多種方法及遞送系統中之任一者將治療劑或包含治療劑之組合物物理引入個體。本文所述治療劑( 例如如本文所述培養之TIL)之不同投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、脊柱或其他腸胃外投與途徑，例如藉由注射或輸注。
如本文所用之片語「腸胃外投與」意指除腸及局部投與外之投與模式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內、病灶內、囊內、眶內、心內、真皮內、經氣管、氣管內、肺、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、心室內、玻璃體內、硬膜外及胸骨內注射及輸注以及 活體內電穿孔。
替代地，本文所述之治療劑( 例如如本文所述培養之TIL)可經由非腸胃外途徑、例如局部、表皮或黏膜投與途徑、例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部來投與。投與亦可實施例如一次、複數次及/或在一或多個延長時段內實施。
如本文所用之術語「抗原」係指任何天然或合成免疫原性物質，例如蛋白質、肽或半抗原。如本文所用之術語「同源抗原」係指免疫細胞( 例如TIL)識別且藉此誘導免疫細胞活化( 例如觸發誘導效應功能、例如細胞介素產生及/或細胞增殖之細胞內信號)的抗原。
「癌症」係指特徵在於異常細胞在體內不受控生長之一大組各種疾病。失調的細胞分裂及生長可形成惡性腫瘤，其侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分。如本文所用之「癌症」係指原發性、轉移性及復發性癌症。
術語「血液惡性病」或「血液癌」係指哺乳動物造血及淋巴組織癌症及腫瘤。血液惡性病之非限制性實例包括侵襲血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統組織之彼等血液惡性病，包括急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴球性淋巴瘤(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CIVIL)、急性單核球性白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。血液惡性病亦稱為「液體腫瘤」。液體腫瘤癌症包括(但不限於)白血病、骨髓瘤及淋巴瘤以及其他血液惡性病。自液體腫瘤獲得之TIL在本文中亦可稱為骨髓浸潤淋巴球(MIL)。
如本文所用之「實體腫瘤」係指異常組織團塊。實體腫瘤可為良性或惡性。實體腫瘤之非限制性實例包括肉瘤、癌瘤及淋巴瘤，例如肺癌、乳癌、前列腺癌、結腸癌、直腸癌及膀胱癌。實體腫瘤之組織結構包括相互依賴的組織隔室，包括實質(癌細胞)及支持基質細胞，其中癌細胞係分散的，且可提供支持微環境。
如本文所用之術語「免疫反應」係指脊椎動物內對外源劑之生物反應，該反應保護有機體抵抗該等劑及由其引起之疾病。免疫反應係藉由免疫系統細胞( 例如T淋巴球( 例如TIL)、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞或嗜中性球)及由該等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)的作用來調介，該作用可選擇性靶向、結合、損傷、破壞及/或自脊椎動物之身體消除侵入性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或(在自體免疫或病理性發炎之情形下)正常人類細胞或組織。免疫反應包括 例如活化或抑制T細胞， 例如效應T細胞或Th細胞，例如CD4 +或CD8 +TIL，或抑制Treg細胞。如本文所用之術語「T細胞」及「T淋巴球」係可互換的且係指由胸腺產生或處理之任何淋巴球。在一些態樣中，TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，TIL係CD4 +TIL。
如本文所用之術語「抗腫瘤免疫反應」係指針對腫瘤抗原之免疫反應。
「個體」包括任何人類或非人類動物，術語「非人類動物」包括(但不限於)脊椎動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗及嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠及豚鼠。在一些態樣中，個體係人類。術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。如本文所用之片語「有需要之個體」包括將受益於 例如投與如本文所述培養之免疫細胞( 例如TIL)以控制腫瘤生長之個體，例如哺乳動物個體。
術語「治療有效量」或「治療有效劑量」係指提供期望生物、治療及/或預防結果之劑( 例如如本文所述培養之TIL)之量。個結果可為減少、改善、緩和、減弱、延遲及/或減輕疾病之一或多個徵象、症狀或病因或生物系統之任何其他期望變化。關於實體腫瘤，有效量包含足以引起腫瘤皺縮及/或足以減小腫瘤生長速率(例如抑制腫瘤生長)或足以防止或延遲其他不希望細胞增殖之量。在一些態樣中，有效量係足以延遲腫瘤發展之量。在一些態樣中，有效量係足以防止或延遲腫瘤復發之量。有效量可以一或多種投與來投與。
組合物( 例如如本文所述培養之細胞)之有效量可例如，(i)減少癌細胞之數量；(ii)減小腫瘤大小；(iii)抑制、延遲、在一定程度上減緩且可停止癌細胞浸潤至外周器官中；(iv)抑制( 即在一定程度上減緩且可停止腫瘤轉移)；(v)抑制腫瘤生長；(vi)防止或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上解除與癌症相關之一或多種症狀。
在一些態樣中，「治療有效量」係在臨床上證實實現癌症之顯著減少或減緩癌症(例如晚期實體腫瘤)之進展(消退)的本文所揭示組合物( 例如如本文所述培養之T細胞)之量。本揭示案之治療劑( 例如如本文所述培養之T細胞)促進疾病消退之能力可使用熟習此項技術者已知之多種方法來評估，例如在人類個體中在臨床試驗期間、在預測人類中之功效之動物模型系統中或藉由在 活體外分析中分析劑之活性。
關於治療之術語「有效」及「有效性」包括藥理學有效性及生理學安全性二者。藥理學有效性係指本文所揭示之組合物( 例如如本文所述培養之細胞)促進患者之癌症消退之能力。生理學安全性係指源自投與本文所揭示之組合物( 例如如本文所述培養之細胞)之在細胞、器官及/或有機體層級上之毒性或其他不良生理學效應(不良效應)之水準。
如本文所用之術語「腫瘤反應性」係指免疫細胞( 例如TIL)靶向及殺傷腫瘤細胞之能力。如本文所用之術語「腫瘤特異性」係指特異性靶向腫瘤細胞之腫瘤反應性免疫細胞， 例如TIL。
如本文所用之術語「T細胞受體」或「TCR」係指由2條不同之跨膜多肽鏈構成之異二聚體：α鏈及β鏈，其各自係由恆定區及可變區組成，該恆定區將鏈錨定於T細胞表面膜內，該可變區識別並結合至由MHC呈遞之抗原。TCR複合物與6條多肽締合形成2種異二聚體CD3γε及CD3δε及1種同二聚體CD3 ζ，其一起形成CD3複合物。T細胞受體改造之T細胞療法利用保持該等複合物特異性靶向由特定腫瘤細胞表現之抗原之T細胞修飾。如本文所用之術語「TCR」包括天然TCR及經改造TCR。
如本文所用之術語「ug」及「uM」可分別與「μg」及「μΜ」互換使用。
本文所述之各個態樣進一步詳細闡述於以下子部分中。 II. 本揭示案之方法
本揭示案係關於 離體或 活體外培養免疫細胞( 例如TIL)之方法。在一些態樣中，本揭示案之方法包括在培養條件中培養免疫細胞( 例如TIL)或將其置於培養條件中，其中培養( 例如某些離子濃度、培養基張力、細胞介素及或其任一組合)能夠增強CD8 +TIL之擴增。在一些態樣中，培養( 例如某些離子濃度、培養基張力、細胞介素及或其任一組合)能夠減少、限制或防止免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL及/或CD4 +TIL)分化，藉此影響或改良其在細胞療法中之用途。在一些態樣中，本揭示案包括在高鉀濃度代謝再程式化培養基中培養TIL。令人驚奇地發現，與使用較低鉀水準(例如小於約40 mM鉀離子，例如5 mM鉀離子)之習用方法相比，增加的鉀與具有增加的幹細胞樣標記物表現及增加的純系多樣性之增加的CD8 +TIL擴增相關聯，同時維持腫瘤反應性( 例如腫瘤特異性)。另外，儘管超高鉀濃度( 例如＞ 80 mM、＞ 90 mM或＞ 100 mM)會減少TIL擴增，但本文所述之方法在培養條件( 例如持續時間)後產生治療有效數量之TIL，此與習用方法一致。
使用免疫治療策略已展示在治療某些類型之晚期癌症方面相當大之臨床功效。免疫檢查點阻斷(ICB)在患有轉移性黑色素瘤之患者中可產生客觀的且有時耐久的反應。某些結腸癌、肺癌患者及小比例之患有其他惡性病之患者隊列亦可受益於ICB。嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法已在患有血球惡性病、最顯著地可用CD19或B細胞成熟抗原(BCMA) CAR靶向之B細胞血球譜系腫瘤之患者中調介顯著的臨床反應。用經識別共用非突變腫瘤抗原(例如NY-ESO-1)之T細胞受體(TCR)轉導之T細胞治療亦可在表現TCR匹配之人類白血球抗原(HLA)之患者中調介臨床反應。然而，儘管取得該等顯著成功，但絕大多數患有晚期癌症之患者仍無法受益於免疫療法治療且最終將屈服於其疾病。
TIL療法亦已顯示在調介患有晚期癌症之患者之臨床反應方面的潛能。新的證據已證實，TIL係由腫瘤反應性細胞及非特異性旁觀細胞構成之異質群體。此異質TIL群體在TIL療法中產生困難及不希望效應及/或稀釋TIL療法之功效，此乃因異質群體中之非特異性旁觀細胞並非較佳的。旁觀細胞係非特異性T細胞，其可稀釋反應性TIL之多樣性。旁觀細胞包括識別與腫瘤無關之抗原決定基之TIL。另外，TIL療法之功效已在患有黑色素瘤、晚期子宮頸癌、肺癌、乳癌及/或胃腸癌之患者中展示多種反應。
在一些態樣中，本揭示案提供用於 活體內療法之 離體或 活體外減少TIL群體之異質性的方法。在一些態樣中，本文所揭示之方法富集特定類型之TIL群體， 例如CD8+ TIL及/或腫瘤反應性CD8+ TIL。在一些態樣中，本文所揭示之方法富集幹細胞樣T細胞群體， 例如幹細胞樣腫瘤反應性TIL及/或幹細胞樣腫瘤反應性CD8+ TIL。
不受限於任何理論，本揭示案闡述使用高血鉀性培養基富集具有特定細胞類型之TIL群體(即腫瘤反應性TIL、CD8+ TIL、腫瘤反應性CD8+ TIL、幹細胞樣腫瘤反應性TIL、幹細胞樣CD8+ TIL及/或幹細胞樣腫瘤反應性CD8+ TIL)之方法。因此，本揭示案之一些態樣係關於 離體或 活體外培養TIL之方法，其包括將異質TIL群體置於包含濃度高於40 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中。在一些態樣中，異質TIL群體在置於高血鉀性培養基中後富集CD8 +TIL。
本揭示案之一些態樣係關於增加CD8+ TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL， 例如腫瘤特異性CD8+ TIL)之數量或百分比 離體或 活體外方法，其包括在包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中培養異質TIL群體。本揭示案之其他態樣係關於製備CD8 +富集( 例如腫瘤反應性CD8 +富集) TIL群體之方法，其包括在包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中 離體或 活體外培養異質TIL群體。
本揭示案之一些態樣係關於增加腫瘤反應性TIL之數量或百分比之 離體或 活體外方法，其包括在包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中培養異質TIL群體。本揭示案之其他態樣係關於製備腫瘤反應性富集之TIL群體之方法，其包括在包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中 離體或 活體外培養異質TIL群體。
本揭示案之一些態樣係關於增加幹細胞樣TIL ( 例如幹細胞樣腫瘤反應性TIL、幹細胞樣CD8+ TIL或幹細胞樣腫瘤反應性CD8+ TIL)之數量或百分比之 離體或 活體外方法，其包括在包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中培養異質TIL群體。本揭示案之其他態樣係關於製備富集幹細胞樣TIL ( 例如幹細胞樣腫瘤反應性TIL、幹細胞樣CD8+ TIL或幹細胞樣腫瘤反應性CD8+ TIL)之TIL群體之方法，其包括在包含濃度為至少5 mM之鉀離子之高血鉀性培養基中 離體或 活體外培養異質TIL群體。
在一些態樣中，與在對照條件( 例如在包含濃度小於約5 mM之鉀離子之培養基中)下培養之TIL相比，本文所揭示之方法及/或組合物增加培養物中TIL之純系多樣性。
純系多樣性可使用任何方法來評價。在一些態樣中，純系多樣性係使用根據本文所揭示之方法培養之TIL亞組來評價。評價TIL群體之純系多樣性之方法之非限制性實例可參見例如Venturi等人， J. Immunolog. Mtd. 321:182-95 (2007)，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，純系多樣性係使用IMMUNOSEQ® (ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES®)來評價。在一些態樣中，純系多樣性係使用TCR深度測序來評價。在某些態樣中，純系多樣性係藉由對自TIL群體分離之總RNA ( 例如自總RNA製備之cDNA)中之TCRß CDR3序列測序來評價。在一些態樣中，純系多樣性係使用辛普森純系性來評價。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性與腫瘤樣品中TIL之純系多樣性相同。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約95%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約90%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約85%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約80%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約75%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約70%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約60%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約50%至約100%。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約40%至約100%。
在一些態樣中，純系多樣性係使用辛普森純系性(√∑pi 2，其中 pi係給定樣品中純系 i之比例豐度)來評價。辛普森純系性常用於評價樣品內之生產性重排，由此量測純系頻率分佈之量級(參見例如Venturi等人， J. Immunol. Meth. 321:182-95 (2007)，其全文皆以引用方式併入本文中)。辛普森純系性之值介於0至1範圍內，其中值接近1代表純系多樣性較低且因此更單株之TIL群體。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.5，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.4，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.275，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.24，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.23，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.22，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.21，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.19，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.18，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.17，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.16，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.15，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.14，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.13，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.12，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.11，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.09，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.08，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.07，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.06，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL之純系多樣性的純系多樣性評分小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。
在一些態樣中，本揭示案包括擴增自人類個體獲得之TIL之方法，其包括： a.    在初始TIL培養基中培養TIL (「初始TIL培養」)； b.    在二次TIL培養基中培養TIL (「第二TIL培養」)；及 c.    在第三(或最終) TIL培養基中培養TIL (「最終TIL培養」)， 其中初始TIL培養基、二次TIL培養基及/或第三TIL培養基為高血鉀性。在一些態樣中，最終TIL培養進一步包括T細胞刺激或活化。在一些態樣中，第二TIL培養進一步包括T細胞刺激或活化。
在一些態樣中，本揭示案包括擴增自人類個體獲得之TIL之方法，其包括： a.    在初始TIL培養基中培養TIL (「初始TIL培養」)；及 b.    在二次TIL培養基中擴增TIL (「第二TIL擴增」)； 其中初始TIL培養基及/或二次TIL培養基為高血鉀性。
在一些態樣中，本揭示案包括擴增自人類個體獲得之TIL之方法，其包括： a.    在初始TIL培養基中培養TIL (「初始TIL培養」)； b.    在二次TIL培養基中擴增TIL (「第二TIL擴增」)；及 c.    在第三(或最終) TIL培養基中擴增TIL (「最終TIL擴增」)， 其中初始TIL培養基、二次TIL培養基及/或第三TIL培養基為高血鉀性。
在一些態樣中，僅初始TIL培養基為高血鉀性。在一些態樣中，僅二次TIL培養基為高血鉀性。在一些態樣中，初始TIL培養基及二次TIL培養基皆為高血鉀性。在一些態樣中，初始TIL培養基及二次TIL培養基為高血鉀性且第三TIL培養基不為高血鉀性。在一些態樣中，初始TIL培養基進一步包含IL-2、IL-21或二者。在一些態樣中，初始TIL培養物、二次TIL培養物及第三或最終TIL培養物包含IL-2，含或不含IL-21。
在一些態樣中，初始TIL培養基、二次TIL培養及/或第三或最終TIL培養物進一步包含T細胞補充物、血清替代物、麩醯胺酸、麩醯胺酸取代物(例如Glutamax (L-丙胺酸-L-麩醯胺酸))、非必需胺基酸、抗生素(例如青黴素、鏈黴素或二者)、抗真菌劑(例如 Fungin™)及/或丙酮酸鈉。
在一些態樣中，將TIL在初始TIL培養基中培養長達約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天或約19天。在一些態樣中，將TIL在初始TIL培養基中培養約14天至約19天。
在一些態樣中，在(b)中用二次TIL培養基中之CD3促效劑、CD28促效劑或二者刺激第二TIL培養中之TIL。在一些態樣中，用二次TIL培養基中之CD27配位體進一步刺激第二TIL培養中之TIL。在一些態樣中，用二次TIL培養基中之4-1BB配位體進一步刺激第二TIL培養中之TIL。
在一些態樣中，在刺激或活化後，將第二TIL擴增中之TIL培養至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天。
在一些態樣中，在刺激或活化後，將第二TIL擴增中之TIL培養約6天至約12天、約7天至約11天、約7天至約10天、約8天至約12天。
在一些態樣中，在第二刺激或活化後，將第三或最終TIL擴增中之TIL培養至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天。
在一些態樣中，在第二刺激或活化後，將第三或最終TIL擴增中之TIL培養約7天至約14天、約7天至約12天、約7天至約11天、約8天至約14天、約8天至約13天、約8天至約12天。
本揭示案亦提供在本文所揭示之代謝再程式化培養基、本文所揭示之細胞培養物或本文所揭示之細胞袋或生物反應器中培養TIL作為初始TIL培養物。在一些態樣中，將初始TIL培養物培養維持至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天。在一些態樣中，將初始TIL培養物培養維持14天至約19天。
本發明方法可進一步發展成二次TIL擴增。為開始二次TIL擴增，用CD3促效劑及/或CD28促效劑(例如TRANSACT™)刺激或活化TIL。在一些態樣中，用CD27配位體進一步刺激培養基中之TIL。在一些態樣中，用4-1BB配位體進一步刺激培養基中之TIL。在一些態樣中，將第二TIL擴增維持至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天。在一些態樣中，將二次TIL擴增培養維持約7天(約1週)。
在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約1×10 7至至少約50×10 7個、至少約2×10 7至至少約40×10 7個、至少約3×10 7至至少約30×10 7個、至少約4×10 7至至少約25×10 7個、至少約5×10 7至至少約20×10 7個、至少約1×10 7至至少約20×10 7個、至少約2×10 7至至少約20×10 7個、至少約3×10 7至至少約20×10 7個或至少約4×10 7至至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約5×10 7至至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約1×10 7個、至少約2×10 7個、至少約3×10 7個、至少約4×10 7個、至少約5×10 7個、至少約6×10 7個、至少約7×10 7個、至少約8×10 7個、至少約9×10 7個、至少約10×10 7個、至少約11×10 7個、至少約12×10 7個、至少約13×10 7個、至少約14×10 7個、至少約15×10 7個、至少約16×10 7個、至少約17×10 7個、至少約18×10 7個、至少約19×10 7個或至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約5×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約6×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約7×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約8×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約9×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約10×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約15×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約20×10 7個細胞。
二次TIL擴增後，可在最終擴增階段進一步擴增TIL。為開始最終TIL擴增，將TIL自第二TIL擴增培養物轉移至對照培養基(即非高血鉀性培養基)。在開始最終TIL擴增培養時，用CD3促效劑及/或CD28促效劑(例如TRANSACT™)進一步刺激TIL。在一些態樣中，用CD27配位體進一步刺激培養基中之TIL。在一些態樣中，用4-1BB配位體進一步刺激培養基中之TIL。
在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約1×10 7至至少約50×10 7個、至少約2×10 7至至少約40×10 7個、至少約3×10 7至至少約30×10 7個、至少約4×10 7至至少約25×10 7個、至少約5×10 7至至少約20×10 7個、至少約1×10 7至至少約20×10 7個、至少約2×10 7至至少約20×10 7個、至少約3×10 7至至少約20×10 7個或至少約4×10 7至至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約5×10 7至至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約1×10 7個、至少約2×10 7個、至少約3×10 7個、至少約4×10 7個、至少約5×10 7個、至少約6×10 7個、至少約7×10 7個、至少約8×10 7個、至少約9×10 7個、至少約10×10 7個、至少約11×10 7個、至少約12×10 7個、至少約13×10 7個、至少約14×10 7個、至少約15×10 7個、至少約16×10 7個、至少約17×10 7個、至少約18×10 7個、至少約19×10 7個或至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約5×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約6×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約7×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約8×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約9×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約10×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約15×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約20×10 7個細胞。
在一些態樣中，使TIL經受最終擴增。在一些態樣中，最終擴增包括刺激。在一些態樣中，刺激與二次擴增期間所用之刺激相同。在一些態樣中，在最終擴增期間藉由在含或不含4-1BBL及/或CD27L之包含TRANSACT™之培養基中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在最終擴增期間藉由在包含TRANSACT™及4-1BBL及/或CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在最終擴增期間藉由在包含至少約1:100 TRANSACT™、至少約1 µg/ml 4-1BBL及至少約5 µg/ml CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。
在一些態樣中，在靜態GREX中實施最終擴增步驟。在一些態樣中，在攪拌罐中實施最終擴增。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9至至少約100×10 9個、至少約40×10 9至至少約90×10 9個、至少約40×10 9至至少約80×10 9個、至少約40×10 9至至少約70×10 9個、至少約40×10 9至至少約60×10 9個、至少約40×10 9至至少約50×10 9個、至少約10×10 9至至少約100×10 9個、至少約20×10 9至至少約100×10 9個、至少約30×10 9至至少約100×10 9個、至少約30×10 9至至少約50×10 9個或至少約35×10 9至至少約45×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9至至少約100×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9個、至少約45×10 9個、至少約50×10 9個、至少約55×10 9個、至少約60×10 9個、至少約65×10 9個、至少約70×10 9個、至少約75×10 9個、至少約80×10 9個、至少約85×10 9個、至少約90×10 9個、至少約95×10 9個或至少約100×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約50×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約60×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約70×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約80×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約90×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約100×10 9個細胞。
在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約7天至至少約21天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約7天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約8天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約9天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約10天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約11天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約12天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約13天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約14天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約15天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約16天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約17天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約18天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約19天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約20天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約21天。
在一些態樣中，高血鉀性培養基不為低滲的。在一些態樣中，高血鉀性培養基不為等滲的。在一些態樣中，高血鉀性培養基不為高滲的。
在一些態樣中，異質TIL群體包含CD4 +TIL及CD8 +TIL。在一些態樣中，異質TIL群體係自個體獲得之一或多個腫瘤樣品獲得。自個體獲得之任何腫瘤樣品可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，腫瘤樣品包含腫瘤活體組織切片。在一些態樣中，腫瘤活體組織切片包含鑽孔活體組織切片。在一些態樣中，腫瘤樣品包含在腫瘤切除手術期間獲得之腫瘤組織。在一些態樣中，腫瘤樣品包含核心針活體組織切片。在一些態樣中，腫瘤樣品係自發炎腫瘤( 例如包含大量TIL之腫瘤)收集。
在一些態樣中，將腫瘤樣品平鋪且經受初始TIL培養。在一些態樣中，初始TIL培養包括在代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)中培養腫瘤樣品。自腫瘤樣品擴增TIL之任何方法可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，在平鋪及初始TIL培養之前將腫瘤樣品分級分離。在一些態樣中，初始TIL培養持續至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天、至少約26天、至少約27天或至少約28天。在一些態樣中，初始TIL培養持續至少約14天至約19天。在一些態樣中，初始TIL培養持續至少約14天。
在一些態樣中，與初始TIL培養前CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)對非CD8 +TIL之比例相比，在初始TIL培養後CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例增加。在一些態樣中，CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)對非CD8 +TIL之比例增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍或至少約100倍。在一些態樣中，CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)對非CD8 +TIL之比例增加至少約50倍。
在一些態樣中，在培養異質TIL群體後，群體中至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之TIL係CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)。在一些態樣中，在培養異質TIL群體後，群體中至少約50%之TIL係CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)。在一些態樣中，在培養異質TIL群體後，群體中至少約25%之TIL係CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)。在一些態樣中，在培養異質TIL群體後，群體中至少約75%之TIL係CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL及/或幹細胞樣CD8+ TIL)。
在一些態樣中，在初始TIL培養後刺激或活化TIL。在刺激TIL期間可使用擴增及/或刺激TIL之任何方法。在一些態樣中，在初始TIL培養後刺激TIL。在一些態樣中，藉由使TIL經受TRANSACT™ TIL擴增、TIL快速擴增方案或其組合來刺激TIL。在一些態樣中，在本文所揭示之高血鉀性培養基中刺激TIL。
在一些態樣中，相對於使用習用方法(例如在具有小於約40 mM鉀離子之培養基中)培養之細胞群體，使用本文所揭示之方法培養之免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的幹細胞樣TIL數量 。在一些態樣中，相對於起始細胞群體，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))展現增加的幹細胞樣細胞所特有之標記物表現。在一些態樣中，起始細胞群體包含自人類個體獲得之細胞。在一些態樣中，起始細胞群體包含自人類個體獲得之TIL。
增加的細胞多能性可使用任何方法來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由抗體染色、然後藉由設門流式細胞術來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由自噬通量來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由葡萄糖攝取來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由脂肪酸攝取來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由粒線體生物質來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由RNA量化/表現分析( 例如微陣列、qPCR (TaqMan)、RNA-Seq.、單細胞RNA-Seq.或其任何組合)來量測。在一些態樣中，細胞幹性係藉由代謝分析( 例如轉錄物與其連接) ( 例如Seahorse代謝分析、細胞外酸化速率分析(ECAR)；氧消耗速率分析(OCR)；備用呼吸量分析；及/或粒線體膜電位分析)來量測。在一些態樣中，幹性係使用一或多種 活體內功能分析( 例如分析細胞持久性、抗腫瘤能力、抗腫瘤清除率、病毒清除率、多能性、細胞介素釋放、細胞殺傷或其任一組合)。
在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))之分化狀態之特徵在於增加的表現低分化細胞典型標記物之細胞數。在一些態樣中，幹細胞樣免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數增加之特徵在於的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數增加，該等免疫細胞表現T N及/或T SCM細胞典型標記物。在一些態樣中，幹細胞樣免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數增加之特徵在於免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數增加，該等免疫細胞表現T SCM細胞典型標記物。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞表現CD45RA。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞表現CCR7。在一些態樣中，TIL群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞表現CD62L。在一些態樣中，TIL群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞表現CD28。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞表現CD95。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))為CD45RO 低。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))不表現CD45RO。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD45RA +、CCR7 +及CD62L +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +及CD62L +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的表現TCF7之細胞數。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))表現CD3。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD3 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD3 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +、TCF7 +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))表現CD27。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD27 +、CD3 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +CD62L +、TCF7 +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數，該等免疫細胞為CD8 +、CD27 +、CD3 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +CD62L +、TCF7 +。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的T SCM細胞數。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的T N細胞數。在一些態樣中，免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))群體展現增加的T SCM及T N細胞數。在一些態樣中，細胞群體展現增加的幹細胞樣TIL數。
在一些態樣中，培養物中之幹細胞樣免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數相對於培養前之幹細胞樣免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，培養物中之幹細胞樣免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數相對於培養前之幹細胞樣免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))數增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍或至少約20倍。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))後，幹細胞樣CD8 +TIL ( 例如幹細胞樣腫瘤反應性CD8+ TIL)佔培養物中CD8 +TIL總數之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%、至少約15%。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，幹細胞樣TIL佔培養物中TIL總數之至少約10%至至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，幹細胞樣TIL佔培養物中CD8 +TIL總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，幹細胞樣TIL佔培養物中CD4 +TIL總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，培養物中TIL總數之至少約10%至至少約40%係CD39 -/CD69 -TIL。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，培養物中TIL總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%係CD39 -/CD69 -TIL。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，培養物中TIL總數之至少約10%至至少約70%係CD39 -/TCF7 +TIL。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，培養物中TIL總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%係CD39 -/TCF7 +TIL。在一些態樣中，TIL係CD4 +T細胞。在一些態樣中，TIL係CD8 +TIL。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養之免疫細胞( 例如TIL， 例如CD8 +TIL ( 例如腫瘤反應性CD8+ TIL))之授受性轉移後，與使用習用培養條件培養之細胞相比，所轉移細胞展現減少的細胞耗竭。在一些態樣中，在所培養TIL之授受性轉移後，與使用習用培養條件培養之TIL相比，所轉移CD8 +富集之TIL在 活體內持續更長時間段。該增加的持久性係指TIL浸潤於腫瘤微環境中且在其中發揮作用之能力、抵抗耗竭之能力以及確保反應之持續擴增及耐久性之幹性之持久性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之免疫細胞(例如T細胞)係幹細胞樣細胞。該等細胞能夠自我更新、增殖及分化。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之免疫細胞(例如T細胞)係亦表現效應物樣標記物之幹細胞樣細胞。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之免疫細胞(例如T細胞)係亦維持靶向及殺傷腫瘤細胞能力之幹細胞樣細胞。
在一些態樣中，與使用習用培養條件培養之TIL相比，所轉移CD8 +富集之TIL具有更大的 活體內功效， 例如腫瘤殺傷活性。在一些態樣中，與使用習用培養條件培養之細胞相比，在個體中需要更低劑量之根據本文所揭示之方法培養之CD8 +富集之TIL來引發反應， 例如減小的腫瘤體積。
在一些態樣中，在代謝再程式化培養基(例如本文所揭示之高血鉀性培養基)中培養TIL以進行整個 離體培養， 例如自首次平鋪腫瘤樣品之時間至整個擴增過程，且直至投與。在一些態樣中，將TIL在本文所揭示之培養基中培養擴增之持續時間。
在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含粒線體燃料。在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約5 mM或至少約10 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含至少約1.0 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。
在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含糖分解介導之代謝之抑制劑，例如激酶抑制劑，例如磷酸肌醇3-激酶抑制劑。在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含磷脂醯肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑，例如艾德拉尼(idelalisib， 例如CAL-101；Selleckchem)。在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約5 mM或至少約10 mM艾德拉尼。在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)包含至少約1.0 mM艾德拉尼。
在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)進一步包含以下中之一或多者：(i)一或多種細胞擴增劑、(ii)鈉離子、(iii)一或多種糖、(iv)鈣離子及(v)一或多種細胞介素。 II.A. 鉀
本揭示案之一些態樣係關於 離體或 活體外培養TIL之方法，其包括將異質TIL群體置於代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)中。本揭示案之一些態樣係關於增加CD8 +TIL之數量或百分比之 離體或 活體外方法，其包括在代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)中培養異質TIL群體。本揭示案之其他態樣係關於製備CD8 +富集之腫瘤浸潤淋巴球(TIL)群體之方法，其包括在代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)中 離體或 活體外培養異質TIL群體。在一些態樣中，鉀離子之濃度為至少約30 mM至至少約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、至少約85 mM、至少約90 mM、至少約95 mM或至少約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為至少約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約45 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、至少約85 mM、至少約90 mM、至少約95 mM或至少約100 mM、至少約105 mM、至少約110 mM、至少約115 mM、至少約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM、約90 mM、約95 mM、約100 mM、約105 mM、約110 mM、約115 mM、約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約85 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約75 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約65 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約55 mM或約40 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約100 mM、約50 mM至約95 mM、約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約100 mM、約55 mM至約95 mM、約55 mM至約90 mM、約55 mM至約85 mM、約55 mM至約80 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約65 mM或約55 mM至約60 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約100 mM、約60 mM至約95 mM、約60 mM至約90 mM、約60 mM至約85 mM、約60 mM至約80 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約70 mM或約60 mM至約65 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約100 mM、約65 mM至約95 mM、約65 mM至約90 mM、約65 mM至約85 mM、約65 mM至約80 mM、約65 mM至約75 mM或約65 mM至約70 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約100 mM、約70 mM至約95 mM、約70 mM至約90 mM、約70 mM至約85 mM、約70 mM至約80 mM或約70 mM至約75 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約100 mM、約75 mM至約95 mM、約75 mM至約90 mM、約75 mM至約85 mM或約75 mM至約80 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約100 mM、約80 mM至約95 mM、約80 mM至約90 mM或約80 mM至約85 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約100 mM、約85 mM至約95 mM或約85 mM至約90 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約90 mM。在一些態樣中，培養基係高滲的。在一些態樣中，培養基係等滲的。在一些態樣中，培養基包含至少約50 mM鉀離子及小於約90 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約40 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約41 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約41 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約42 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約42 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約43 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約43 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約44 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約44 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約45 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約45 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約46 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約46 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約47 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約47 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約48 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約48 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約49 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約49 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約51 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約51 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約52 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約52 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約53 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約53 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約54 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約54 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約56 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約56 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約57 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約57 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約58 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約58 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約59 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約59 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約61 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約61 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約62 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約62 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約63 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約63 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約64 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約64 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約66 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約66 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約67 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約67 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約68 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約68 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約69 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約69 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約71 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約71 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約72 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約72 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約73 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約73 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約74 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約74 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約76 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約76 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約77 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約77 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約78 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約78 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約79 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約79 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約81 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約81 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約82 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約82 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約83 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約83 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約84 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約84 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約86 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約86 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約87 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約87 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約88 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約88 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約89 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約89 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約91 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約91 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約92 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約92 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約93 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約93 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約94 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約94 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約95 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約96 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約96 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約97 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約97 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約98 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約98 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約99 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約99 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM，且NaCl之濃度小於約90 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM，且NaCl之濃度小於約90 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM，且NaCl之濃度小於約90 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM，且NaCl之濃度小於約80 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約90 mM，且NaCl之濃度小於約70 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約80 mM，且NaCl之濃度小於約70 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約90 mM，且NaCl之濃度小於約60 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM，且NaCl之濃度小於約90 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM，且NaCl之濃度小於約85 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM，且NaCl之濃度小於約80 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM，且NaCl之濃度小於約75 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM，且NaCl之濃度小於約70 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM，且NaCl之濃度小於約65 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM，且NaCl之濃度小於約60 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM，且NaCl之濃度小於約55 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM，且NaCl之濃度小於約50 mM至約45 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM，且NaCl之濃度小於約45 mM至約40 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM，且NaCl之濃度小於約40 mM至約35 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM，且NaCl之濃度小於約35 mM至約30 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM，且NaCl之濃度小於約30 mM至約25 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM，且NaCl之濃度小於約25 mM至約20 mM。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約40 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約41 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約41 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約42 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約42 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約43 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約43 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約44 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約44 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約45 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約45 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約46 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約46 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約47 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約47 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約48 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約48 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約49 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約49 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約50 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約51 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約51 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約52 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約52 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約53 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約53 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約54 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約54 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約55 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約56 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約56 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約57 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約57 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約58 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約58 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約59 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約59 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約60 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約61 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約61 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約62 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約62 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約63 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約63 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約64 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約64 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約65 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約66 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約66 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約67 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約67 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約68 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約68 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約69 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約69 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約70 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約71 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約71 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約72 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約72 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約73 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約73 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約74 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約74 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約75 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約76 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約76 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約77 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約77 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約78 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約78 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約79 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約79 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約80 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約81 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約81 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約82 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約82 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約83 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約83 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約84 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約84 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約85 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約86 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約86 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約87 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約87 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約88 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約88 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約89 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約89 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約90 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約91 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約91 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約92 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約92 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約93 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約93 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約94 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約94 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約95 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約96 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約96 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約97 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約97 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約98 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約98 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約99 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約99 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約100 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約101 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約101 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約102 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約102 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約103 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約103 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約104 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約104 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約105 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約106 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約106 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約107 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約107 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約108 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約108 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約109 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約109 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約110 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約111 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約111 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約112 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約112 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約113 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約113 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約114 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約114 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約115 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約116 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約116 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約117 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約117 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約118 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約118 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約119 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約119 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約120 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約120 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約121 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約121 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約122 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約122 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約123 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約123 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約124 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約124 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約125 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約125 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約126 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約126 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約127 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約127 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約128 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約128 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約129 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約129 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約130 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約130 mM，其中培養基中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，包含高濃度鉀離子之高血鉀性培養基可藉由在培養基中添加足量鉀鹽來製備。在一些態樣中，鉀鹽之非限制性實例包括三氯一胺鉑酸鉀、五水氯釕酸鉀、雙(草酸)鉑酸鉀(II)二水合物、硫酸氫鉀、硼氫化鉀、溴化鉀、碳酸鉀、氯化鉀、鉻酸鉀、重鉻酸鉀、氰化銀鉀、氰化亞金鉀、氟化鉀、氟硫酸鉀、六氯銥酸鉀、六氯鋨酸鉀、六氯鈀酸鉀、六氯鉑酸鉀、六氯錸酸鉀、六氰鉻酸鉀、六氰高鐵酸鉀、六氰釕酸鉀(II)水合物、六氟銻酸鉀、六氟鎳酸鉀、六氟磷酸鉀、六氟鈦酸鉀、六氟鋯酸鉀、六氫銻酸鉀、六碘鉑酸鉀、六碘錸酸鉀、氫氧化鉀、碘酸鉀、碘化鉀、錳酸鉀、偏釩酸鉀、鉬酸鉀、硝酸鉀、亞硝基二磺酸鉀、鋨酸鉀(VI)二水合物、五氯亞硝基釕酸鉀、高氯酸鉀、高錸酸鉀、高釕酸鉀、過硫酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、焦磷酸鉀、硒氰酸鉀、硒氰酸鉀、錫酸鉀三水合物、硫酸鉀、碲酸鉀水合物、亞碲酸鉀、四硼酸鉀四水合物、四溴金酸鉀、四溴鈀酸鉀、四氯鈀酸鉀、四氯鉑酸鉀、四氰鈀酸鉀、四氰鉑酸鉀、四氟硼酸鉀、四硝基鉑酸鉀、連四硫酸鉀、對甲苯硫代磺酸鉀及羥基檸檬酸三鉀單水合物。在一些態樣中，鉀鹽包括氯化鉀(KCl)。在一些態樣中，鉀鹽包括葡萄糖酸鉀。在某些態樣中，鉀鹽包括檸檬酸鉀。在某些態樣中，鉀鹽包括羥基檸檬酸鉀。在一些態樣中，鉀鹽包括本文所揭示鉀鹽中任一者之組合。 II.B. 細胞擴增劑
在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)進一步包含細胞擴增劑。如本文所用之「細胞擴增劑」係指促進所培養免疫細胞( 例如TIL)之 活體外及/或 離體生長及增殖之劑， 例如小分子、多肽或其任一組合。在一些態樣中，細胞擴增劑包括PI3K抑制劑。在一些態樣中，培養基進一步包含AKT抑制劑。在一些態樣中，培養基進一步包含PI3K抑制劑及AKT抑制劑。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括LY294002。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括IC87114。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括艾德拉尼(參見例如Peterson等人， Blood Adv. 2(3):210-23 (2018))。在一些態樣中，培養基進一步包含GSK3B抑制劑。在一些態樣中，GSK3B抑制劑包括TWS119。在一些態樣中，培養基進一步包含ACLY抑制劑。在一些態樣中，ACLY抑制劑包括羥基檸檬酸三鉀單水合物。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括羥基檸檬酸鹽。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括匹替利司。在一些態樣中，PI3K抑制劑包括CAL-101。在一些態樣中，AKT抑制劑包括MK2206、A443654或AKTi-VIII (CAS 612847-09-3)。 II.C. 鈉
在一些態樣中，代謝再程式化培養基(例如高血鉀性培養基)進一步包含鈉離子( 例如NaCl)。在一些態樣中，代謝再程式化培養基包含濃度小於約115 mM之鈉離子( 例如NaCl)。在一些態樣中，代謝再程式化培養基包含濃度為40 mM至約80 mM之鈉離子( 例如NaCl)。
在一些態樣中，藉由自包含較高鈉離子( 例如NaCl)濃度之基礎培養基開始並稀釋溶液以達到鈉離子( 例如NaCl)之目標濃度來達到鈉之目標濃度。在一些態樣中，藉由藉由添加一或多種鈉鹽( 例如更多NaCl)升高鈉離子( 例如NaCl)之濃度來達到鈉之目標濃度。鈉鹽之非限制性實例包括(偏)高碘酸鈉、酒石酸砷鈉水合物、疊氮化鈉、苄氧化鈉、溴化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、鉻酸鈉、環己烷丁酸鈉、乙硫醇鈉、氟化鈉、氟磷酸鈉、甲酸鈉、六氯銥酸鈉(III)水合物、六氯銥酸鈉(IV)六水合物、六氯鉑酸鈉(IV)六水合物、六氯銠酸鈉(III)、六氟鋁酸鈉、六氟銻酸鈉(V)、六氟砷酸鈉(V)、六氟高鐵酸鈉(III)、六氟磷酸鈉、六氟矽酸鈉、六羥基鉑酸鈉(IV)、六偏磷酸鈉、二氟化氫鈉、硫酸氫鈉、氰胺化氫鈉、氫氧化鈉、碘化鈉、偏硼酸鈉四水合物、偏矽酸鈉九水合物、偏釩酸鈉、鉬酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、草酸鈉、過硼酸鈉單水合物、過碳酸鈉、高氯酸鈉、高碘酸鈉、高錳酸鈉、高錸酸鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、硒酸鈉、亞硒酸鈉、錫酸鈉、硫酸鈉、亞碲酸鈉、四硼酸鈉、四氯鋁酸鈉、四氯金酸鈉(III)、四氯鈀酸鈉(II)、四氯鉑酸鈉(II)、硫代磷酸鈉、硫代硫酸鈉、硫代硫酸鈉五水合物、氧氟化釔鈉、三偏磷酸鈉及其任一組合。在一些態樣中，鈉鹽包括氯化鈉(NaCl)。在一些態樣中，鈉鹽包括葡萄糖酸鈉。在某些態樣中，鈉鹽包括碳酸氫鈉。在某些態樣中，鈉鹽包括羥基檸檬酸鈉。在某些態樣中，鈉鹽包括磷酸鈉。
在一些態樣中，鈉離子( 例如NaCl)之濃度小於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈉離子( 例如NaCl)之濃度隨著鉀離子之濃度增加而減小。在一些態樣中，鈉離子( 例如NaCl)之濃度為約25 mM至約115 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約25 mM至約100 mM、約30 mM至約40 mM、約30 mM至約50 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約80 mM、約40 mM至約50 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約80 mM、約50 mM至約55 mM、約50 mM至約60 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約80 mM、約55 mM至約60 mM、約55 mM至約65 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約80 mM、約60 mM至約65 mM、約60 mM至約70 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約80 mM、約70 mM至約75 mM、約70 mM至約80 mM或約75 mM至約80 mM。在某些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約40 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約50 mM至約85 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約55 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約30 mM至約35 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約35 mM至約40 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約40 mM至約45 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約45 mM至約50 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約80 mM至約85 mM。
在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM或約90 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約40 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約45 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約50 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約55 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約60 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約65 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約70 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約75 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如NaCl)之濃度為約80 mM。
在一些態樣中，培養基包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約40 mM至約80 mM鈉離子(例如NaCl)。
在一些態樣中，培養基包含約50 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約55 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約60 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約65 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約65 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約66 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約67 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約68 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約69 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約71 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約72 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約73 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約74 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約75 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約65 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約65 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約65 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約75 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約75 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約75 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如NaCl)。
在一些態樣中，培養基包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約30 mM至約109 mM NaCl，其中NaCl之濃度(mM)等於或低於(135 - 鉀離子濃度)。在一些態樣中，培養基包含約40 mM鉀離子及小於或等於約95 mM NaCl ( 例如約95 mM、約94 mM、約93 mM、約92 mM、約91 mM、約90 mM、約85 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約45 mM鉀離子及小於或等於約90 mM NaCl ( 例如約90 mM、約89 mM、約88 mM、約87 mM、約86 mM、約85 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約50 mM鉀離子及小於或等於約85 mM NaCl ( 例如約85 mM、約84 mM、約83 mM、約82 mM、約81 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約55 mM鉀離子及小於或等於約80 mM NaCl ( 例如約80 mM、約79 mM、約78 mM、約77 mM、約76 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約60 mM鉀離子及小於或等於約75 mM NaCl ( 例如約75 mM、約74 mM、約73 mM、約72 mM、約71 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約65 mM鉀離子及小於或等於約70 mM NaCl ( 例如約70 mM、約69 mM、約68 mM、約67 mM、約66 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及小於或等於約70 mM NaCl ( 例如約65 mM、約64 mM、約63 mM、約62 mM、約61 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約75 mM鉀離子及小於或等於約60 mM NaCl ( 例如約60 mM、約59 mM、約58 mM、約57 mM、約56 mM、約55 mM、約50 mM、約45 mM或約40 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約80 mM鉀離子及小於或等於約55 mM NaCl ( 例如約55 mM、約54 mM、約53 mM、約52 mM、約51 mM、約50 mM、約45 mM、約40 mM或約35 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約85 mM鉀離子及小於或等於約50 mM NaCl ( 例如約50 mM、約49 mM、約48 mM、約47 mM、約46 mM、約45 mM、約40 mM、約35 mM或約30 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約90 mM鉀離子及小於或等於約45 mM NaCl ( 例如約45 mM、約44 mM、約43 mM、約42 mM、約41 mM、約40 mM、約35 mM、約30 mM或約25 mM NaCl)。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約60 mM NaCl。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約61 mM NaCl。在一些態樣中，培養基包含約70 mM鉀離子及約62 mM NaCl。
在一些態樣中，培養基包含約50 mM鉀離子及約75 mM NaCl。在一些態樣中，培養基係低滲的。在一些態樣中，培養基係等滲的。
本揭示案之一些態樣係關於培養細胞、 例如多潛能、多能及/或免疫細胞( 例如T細胞、NK細胞及/或TIL)之方法，其包括將細胞置於包含以下之培養基中：(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約100 mM之NaCl。本揭示案之某些態樣係關於培養T細胞之方法，其包括將T細胞置於包含以下之培養基中：(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約90 mM之NaCl。 II.D. 糖
在一些態樣中，代謝再程式化培養基(MRM) (例如高血鉀性培養基)包含糖。在一些態樣中，MRM係低滲的。在一些態樣中，MRM係等滲的。在一些態樣中，藉由自包含較高糖濃度之基礎培養基開始並稀釋溶液以達到糖之目標濃度來達到糖之目標濃度。在一些態樣中，藉由添加糖升高糖之濃度直至達到期望濃度來達到糖之目標濃度。
在一些態樣中，糖係單糖、二糖或多糖。在一些態樣中，糖選自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或其任一組合。在一些態樣中，糖係葡萄糖。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約30 mM至至少約100 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約30 mM至至少約100 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，MRM係低滲的。在一些態樣中，MRM係等滲的。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，MRM包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約24 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度小於約24 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度大於約10 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約5 mM至約20 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約20 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約10 mM至約5 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約5 mM至約20 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約20 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約15 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約14 mM至約14.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約14.5 mM至約15 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約15 mM至約15.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約15.5 mM至約16 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約16 mM至約16.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約16.5 mM至約17 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約17 mM至約17.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約17.5 mM至約18 mM。
在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM，為約10.5 mM、約11 mM、約11.5 mM、約12 mM、約12.5 mM、約13 mM、約13.5 mM、約14 mM、約14.5 mM、約15 mM、約15.5 mM、約16 mM、約16.5 mM、約17 mM、約17.5 mM、約18 mM、約18.5 mM、約19 mM、約19.5 mM、約20 mM、約20.5 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。
在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約6 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約7 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約8 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約9 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約10.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約11 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約11.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約12 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約12.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約13 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約13.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約14 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約14.5 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約15 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約15.4 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約15.9 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約16.3 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約16.8 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約17.2 mM。在一些態樣中，糖( 例如葡萄糖)之濃度為約17.7 mM。 II.E. 鈣
在一些態樣中，MRM (例如高血鉀性培養基)包含鈣離子。在一些態樣中，藉由自包含較高鈣離子濃度之基礎培養基開始並稀釋溶液以達到鈣離子之目標濃度來達到鈣之目標濃度。在一些態樣中，藉由添加一或多種鈣鹽升高鈣離子之濃度來達到鈣之目標濃度。鈣鹽之非限制性實例包括溴化鈣、碳酸鈣、氯化鈣、氰胺化鈣、氟化鈣、氫化鈣、氫氧化鈣、碘酸鈣、碘化鈣、硝酸鈣、亞硝酸鈣、草酸鈣、高氯酸鈣四水合物、磷酸二氫鈣、磷酸鈣、硫酸鈣、硫氰酸鈣四水合物、羥基磷灰石及其任一組合。在一些態樣中，鈣鹽包括氯化鈣(CaCl 2)。在一些態樣中，鈣鹽包括葡萄糖酸鈣。
在一些態樣中，鈣離子之濃度小於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈣離子之濃度大於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈣離子之濃度大於約0.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約2.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約2.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約2.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度小於約1.0 mM。
在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.8 mM、約0.4 mM至約2.7 mM、約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約0.8 mM至約0.9 mM、約0.8 mM至約1.0 mM、約0.8 mM至約1.1 mM、約0.8 mM至約1.2 mM、約0.8 mM至約1.3 mM、約0.8 mM至約1.4 mM、約0.8 mM至約1.5 mM、約0.8 mM至約1.6 mM、約0.8 mM至約1.7 mM、約0.8 mM至約1.8 mM、約0.9 mM至約1.0 mM、約0.9 mM至約1.1 mM、約0.9 mM至約1.2 mM、約0.9 mM至約1.3 mM、約0.9 mM至約1.4 mM、約0.9 mM至約1.5 mM、約0.9 mM至約1.6 mM、約0.9 mM至約1.7 mM、約0.9 mM至約1.8 mM、約1.0 mM至約1.1 mM、約1.0 mM至約1.2 mM、約1.0 mM至約1.3 mM、約1.0 mM至約1.4 mM、約1.0 mM至約1.5 mM、約1.0 mM至約1.6 mM、約1.0 mM至約1.7 mM、約1.0 mM至約1.8 mM、約1.1 mM至約1.2 mM、約1.1 mM至約1.3 mM、約1.1 mM至約1.4 mM、約1.1 mM至約1.5 mM、約1.1 mM至約1.6 mM、約1.1 mM至約1.7 mM、約1.1 mM至約1.8 mM、約1.2 mM至約1.3 mM、約1.2 mM至約1.4 mM、約1.2 mM至約1.5 mM、約1.2 mM至約1.6 mM、約1.2 mM至約1.7 mM、約1.2 mM至約1.8 mM、約1.3 mM至約1.4 mM、約1.3 mM至約1.5 mM、約1.3 mM至約1.6 mM、約1.3 mM至約1.7 mM、約1.3 mM至約1.8 mM、約1.4 mM至約1.5 mM、約1.4 mM至約1.6 mM、約1.4 mM至約1.7 mM、約1.4 mM至約1.8 mM、約1.5 mM至約1.6 mM、約1.5 mM至約1.7 mM、約1.5 mM至約1.8 mM、約1.6 mM至約1.7 mM、約1.6 mM至約1.8 mM或約1.7 mM至約1.8 mM。
在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約0.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM至約1.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM至約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM至約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM至約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.3 mM至約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.4 mM至約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.5 mM至約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.7 mM至約1.8 mM。
在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.8 mM。
在一些態樣中，MRM包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約0.5 mM至約2.8 mM鈣離子。在一些態樣中，MRM包含約40 mM至約90 mM鉀離子、NaCl及約0.5 mM至約2.8 mM鈣離子；其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。 II.F. 細胞介素
在一些態樣中，MRM包含細胞介素。在一些態樣中，MRM係低滲的。在一些態樣中，MRM係等滲的。在一些態樣中，細胞介素係選自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及其任一組合。在一些態樣中，MRM不包含IL-2。在一些態樣中，MRM包含IL2及IL21。在一些態樣中，MRM包含IL2、IL21及IL15。
細胞介素可在任一點添加至MRM中。在一些態樣中，細胞介素係在將TIL ( 例如腫瘤樣品)添加至培養基中之前添加至MRM中。在一些態樣中，在包含以下之MRM中培養TIL ( 例如腫瘤樣品)：(i)本文所揭示濃度之鉀，及(ii)整個TIL培養(包括擴增)中之細胞介素。在一些態樣中，在包含以下之MRM中培養TIL ( 例如腫瘤樣品)：(i)本文所揭示濃度之鉀，及(ii)整個TIL擴增中之細胞介素。
在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子及(ii) IL-15。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子及(ii) IL-15。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-15。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子及(ii) IL-21。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子及(ii) IL-21。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-21。在一些態樣中，MRM不包含IL-7及/或IL-15。
在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)大於40 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約50 mM鉀離子、(ii) NaCl及(iii) IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM不包含IL-7及/或IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含約50 ng/mL至約600 ng/mL、約50 ng/mL至約500 ng/mL、約50 ng/mL至約450 ng/mL、約50 ng/mL至約400 ng/mL、約50 ng/mL至約350 ng/mL、約50 ng/mL至約300 ng/mL、約100 ng/mL至約600 ng/mL、約100 ng/mL至約500 ng/mL、約100 ng/mL至約450 ng/mL、約100 ng/mL至約400 ng/mL、約100 ng/mL至約350 ng/mL、約100 ng/mL至約300 ng/mL、約200 ng/mL至約500 ng/mL、約200 ng/mL至約450 ng/mL、約200 ng/mL至約400 ng/mL、約200 ng/mL至約350 ng/mL、約200 ng/mL至約300 ng/mL、約250 ng/mL至約350 ng/mL、約300 ng/mL至約600 ng/mL、約300 ng/mL至約500 ng/mL、約300 ng/mL至約450 ng/mL、約300 ng/mL至約400 ng/mL、約300 ng/mL至約350 ng/mL、約250 ng/mL至約300 ng/mL或約275 ng/mL至約325 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，MRM包含至少約50 ng/mL、至少約60 ng/mL、至少約70 ng/mL、至少約80 ng/mL、至少約90 ng/mL、至少約100 ng/mL、至少約110 ng/mL、至少約120 ng/mL、至少約130 ng/mL、至少約140 ng/mL、至少約150 ng/mL、至少約160 ng/mL、至少約170 ng/mL、至少約180 ng/mL、至少約190 ng/mL、至少約200 ng/mL、至少約210 ng/mL、至少約220 ng/mL、至少約230 ng/mL、至少約240 ng/mL、至少約250 ng/mL、至少約260 ng/mL、至少約270 ng/mL、至少約280 ng/mL、至少約290 ng/mL、至少約300 ng/mL、至少約310 ng/mL、至少約320 ng/mL、至少約330 ng/mL、至少約340 ng/mL、至少約350 ng/mL、至少約360 ng/mL、至少約370 ng/mL、至少約380 ng/mL、至少約390 ng/mL、至少約400 ng/mL、至少約410 ng/mL、至少約420 ng/mL、至少約430 ng/mL、至少約440 ng/mL、至少約450 ng/mL、至少約460 ng/mL、至少約470 ng/mL、至少約480 ng/mL、至少約490 ng/mL、至少約500 ng/mL、至少約510 ng/mL、至少約520 ng/mL、至少約530 ng/mL、至少約540 ng/mL、至少約550 ng/mL、至少約560 ng/mL、至少約570 ng/mL、至少約580 ng/mL、至少約590 ng/mL或至少約600 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約50 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約60 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約70 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約73.6 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約75 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約80 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約90 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約100 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約200 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約400 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約500 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約600 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，MRM包含至少約1500 IU/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含約1500 IU/mL至約12,000 IU/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約1500 IU/mL、至少約1600 IU/mL、至少約1700 IU/mL、至少約1800 IU/mL、至少約1900 IU/mL、至少約2000 IU/mL、至少約2100 IU/mL、至少約2200 IU/mL、至少約2300 IU/mL、至少約2400 IU/mL、至少約2500 IU/mL、至少約2600 IU/mL、至少約2700 IU/mL、至少約2800 IU/mL、至少約2900 IU/mL、至少約3000 IU/mL、至少約3100 IU/mL、至少約3200 IU/mL、至少約3300 IU/mL、至少約3400 IU/mL、至少約3500 IU/mL、至少約3600 IU/mL、至少約3700 IU/mL、至少約3800 IU/mL、至少約3900 IU/mL、至少約4000 IU/mL、至少約4100 IU/mL、至少約4200 IU/mL、至少約4300 IU/mL、至少約4400 IU/mL、至少約4500 IU/mL、至少約4600 IU/mL、至少約4700 IU/mL、至少約4800 IU/mL、至少約4900 IU/mL、至少約5000 IU/mL、至少約5100 IU/mL、至少約5200 IU/mL、至少約5300 IU/mL、至少約5400 IU/mL、至少約5500 IU/mL、至少約5600 IU/mL、至少約5700 IU/mL、至少約5800 IU/mL、至少約5900 IU/mL、至少約6000 IU/mL、至少約6100 IU/mL、至少約6200 IU/mL、至少約6300 IU/mL、至少約6400 IU/mL、至少約6500 IU/mL、至少約6600 IU/mL、至少約6700 IU/mL、至少約6800 IU/mL、至少約6900 IU/mL、至少約7000 IU/mL IL-2、至少約7100 IU/mL、至少約7200 IU/mL、至少約7300 IU/mL、至少約7400 IU/mL、至少約7500 IU/mL、至少約7600 IU/mL、至少約7700 IU/mL、至少約7800 IU/mL、至少約7900 IU/mL或至少約8000 IU/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約3000 IU/mL IL-2。在一些態樣中，如本文所述，在第二培養( 例如REP培養)期間在MRM中培養TIL，其中MRM包含約3000 IU/mL。在一些態樣中，MRM包含至少約6000 IU/mL IL-2。在一些態樣中，如本文所述，在初始培養期間在MRM中培養TIL，其中MRM包含約6000 IU/mL。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含約0.1 ng/mL至約30 ng/mL、約1 ng/mL至約30 ng/mL、約1 ng/mL至約25 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約5 ng/mL至約30 ng/mL、約5 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約30 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL或約15 ng/mL至約30 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL、至少約20 ng/mL、至少約25 ng/mL、至少約30 ng/mL、至少約35 ng/mL或至少約40 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約1.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約2.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約3.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約4.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約5.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約6.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約7.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約8.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約9.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約10 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約15 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約25 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約35 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-7。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約1.3 ng/mL、至少約1.5 ng/mL、至少約1.7 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約2.3 ng/mL、至少約2.5 ng/mL、至少約2.7 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約3.3 ng/mL、至少約3.5 ng/mL、至少約3.7 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約4.3 ng/mL、至少約4.5 ng/mL、至少約4.7 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約5.3 ng/mL、至少約5.5 ng/mL、至少約5.7 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-7。在一些態樣中，培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約2.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約2.3 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約2.5 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約2.7 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約3.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約3.3 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約3.5 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約3.7 ng/mL IL-7。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.2 ng/mL、至少約0.3 ng/mL、至少約0.4 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約0.6 ng/mL、至少約0.7 ng/mL、至少約0.8 ng/mL、至少約0.9 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.2 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.3 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.5 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.6 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.7 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.8 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約0.9 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約1.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約2.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約3.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約4.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約5.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約6.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約7.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約8.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約9.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約10 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖及(v)約10 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子及約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約40 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2及(vi)約290 ng/mL IL-7。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2及(vi)約0.4 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子及約10 ng/mL IL-2、約1 ng/mL IL-7及約1 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2、(vi)約290 ng/mL IL-7及(vii)約0.4 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 5 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2及(vi)約30 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約290 ng/mL IL-7及(vi)約20 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約0.4 ng/mL IL-15及(vi)約20 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖及(v)約10 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl及約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約40 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約290 ng/mL IL-7；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2及(vi)約290 ng/mL IL-7。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2及(vi)約0.4 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl及約10 ng/mL IL-2、約1 ng/mL IL-7及約1 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2、約290 ng/mL IL-7及約0.4 ng/mL IL-15；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2、(vi)約290 ng/mL IL-7及(vii)約0.4 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100  mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl、約300 ng/mL IL-2及約30 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約300 ng/mL IL-2及(vi)約30 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl、約290 ng/mL IL-7及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約290 ng/mL IL-7及(vi)約20 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，MRM包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含大於40 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約45 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約50 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約55 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約60 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約65 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約70 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約75 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約80 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約85 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含至少約90 mM鉀離子、NaCl、約0.4 ng/mL IL-15及約20 ng/mL IL-21；其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。在一些態樣中，MRM包含(i)至少約70 mM鉀離子、(ii)約60 mM鈉(例如NaCl)、(iii)約1.4 mM鈣、(iv)約16 mM葡萄糖、(v)約0.4 ng/mL IL-15及(vi)約20 ng/mL IL-21。 II.G. T 細胞培養基 ( 例如代謝再程式化培養基 )
在一些態樣中，藉由將鉀離子添加至基礎培養基中來製備MRM。使用任一基礎培養基來培養免疫細胞( 例如T細胞、NK細胞及/或TIL)。
在一些態樣中，MRM進一步包含一或多種必需胺基酸。在一些態樣中，基礎培養基包含一或多種選自以下之必需胺基酸：L-精胺酸、L-胱胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-組胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸及L-麩醯胺酸或其任一組合。在一些態樣中，基礎培養基包含L-麩醯胺酸。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.01 mM之一或多種必需胺基酸。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM至約10 mM之一或多種必需胺基酸。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM至約10 mM、約0.01 mM至約9 mM、約0.01 mM至約8 mM、約0.01 mM至約7 mM、約0.01 mM至約6 mM、約0.01 mM至約5 mM、約0.01 mM至約4 mM、約0.01 mM至約3 mM、約0.01 mM至約2 mM、約0.01 mM至約1 mM、約0.1 mM至約10 mM、約0.1 mM至約9 mM、約0.1 mM至約8 mM、約0.1 mM至約7 mM、約0.1 mM至約6 mM、約0.1 mM至約5 mM、約0.1 mM至約4 mM、約0.1 mM至約3 mM、約0.1 mM至約2 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約9 mM、約1 mM至約8 mM、約1 mM至約7 mM、約1 mM至約6 mM、約1 mM至約5 mM、約1 mM至約4 mM、約1 mM至約3 mM或約1 mM至約2 mM之一或多種必需胺基酸。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.01 mM、至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約2 mM、至少約3 mM、至少約4 mM、至少約5 mM、至少約6 mM、至少約7 mM、至少約8 mM、至少約9 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM或至少約15 mM或至少約50 mM之一或多種必需胺基酸。
在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM、約0.05 mM、約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mM、約0.5 mM、約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM、約2.0 mM、約2.1 mM、約2.2 mM、約2.3 mM、約2.4 mM、約2.5 mM、約2.6 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約2.9 mM、約3.0 mM、約3.1 mM、約3.2 mM、約3.3 mM、約3.4 mM、約3.5 mM、約3.6 mM、約3.7 mM、約3.8 mM、約3.9 mM、約4.0 mM、約4.1 mM、約4.2 mM、約4.3 mM、約4.4 mM、約4.5 mM、約4.6 mM、約4.7 mM、約4.8 mM、約4.9 mM、約5.0 mM、約5.1 mM、約5.2 mM、約5.3 mM、約5.4 mM、約5.5 mM、約5.6 mM、約5.7 mM、約5.8 mM、約5.9 mM、約6.0 mM、約6.1 mM、約6.2 mM、約6.3 mM、約6.4 mM、約6.5 mM、約6.6 mM、約6.7 mM、約6.8 mM、約6.9 mM或約7.0 mM之一或多種必需胺基酸。
在一些態樣中，MRM包含L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含至少約0.01 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM至約10 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM至約10 mM、約0.01 mM至約9 mM、約0.01 mM至約8 mM、約0.01 mM至約7 mM、約0.01 mM至約6 mM、約0.01 mM至約5 mM、約0.01 mM至約4 mM、約0.01 mM至約3 mM、約0.01 mM至約2 mM、約0.01 mM至約1 mM、約0.1 mM至約10 mM、約0.1 mM至約9 mM、約0.1 mM至約8 mM、約0.1 mM至約7 mM、約0.1 mM至約6 mM、約0.1 mM至約5 mM、約0.1 mM至約4 mM、約0.1 mM至約3 mM、約0.1 mM至約2 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約9 mM、約1 mM至約8 mM、約1 mM至約7 mM、約1 mM至約6 mM、約1 mM至約5 mM、約1 mM至約4 mM、約1 mM至約3 mM或約1 mM至約2 mM L-麩醯胺酸。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.01 mM、至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約2 mM、至少約3 mM、至少約4 mM、至少約5 mM、至少約6 mM、至少約7 mM、至少約8 mM、至少約9 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM或至少約15 mM或至少約50 mM L-麩醯胺酸。
在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM、約0.05 mM、約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mM、約0.5 mM、約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM、約2.0 mM、約2.1 mM、約2.2 mM、約2.3 mM、約2.4 mM、約2.5 mM、約2.6 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約2.9 mM、約3.0 mM、約3.1 mM、約3.2 mM、約3.3 mM、約3.4 mM、約3.5 mM、約3.6 mM、約3.7 mM、約3.8 mM、約3.9 mM、約4.0 mM、約4.1 mM、約4.2 mM、約4.3 mM、約4.4 mM、約4.5 mM、約4.6 mM、約4.7 mM、約4.8 mM、約4.9 mM、約5.0 mM、約5.1 mM、約5.2 mM、約5.3 mM、約5.4 mM、約5.5 mM、約5.6 mM、約5.7 mM、約5.8 mM、約5.9 mM、約6.0 mM、約6.1 mM、約6.2 mM、約6.3 mM、約6.4 mM、約6.5 mM、約6.6 mM、約6.7 mM、約6.8 mM、約6.9 mM或約7.0 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.7 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.68 mM L-麩醯胺酸。
在一些態樣中，MRM包含約0.14 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.15 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.76 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.83 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.84 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.97 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約2.05 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約2.11 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約2.18 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約5.41 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約5.47 mM L-麩醯胺酸。在一些態樣中，MRM包含約＜ 0.10 mM L-麩醯胺酸。
在一些態樣中，MRM包含L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含至少約0.01 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM至約10 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM至約10 mM、約0.01 mM至約9 mM、約0.01 mM至約8 mM、約0.01 mM至約7 mM、約0.01 mM至約6 mM、約0.01 mM至約5 mM、約0.01 mM至約4 mM、約0.01 mM至約3 mM、約0.01 mM至約2 mM、約0.01 mM至約1 mM、約0.1 mM至約10 mM、約0.1 mM至約9 mM、約0.1 mM至約8 mM、約0.1 mM至約7 mM、約0.1 mM至約6 mM、約0.1 mM至約5 mM、約0.1 mM至約4 mM、約0.1 mM至約3 mM、約0.1 mM至約2 mM、約0.1 mM至約1 mM、約1 mM至約10 mM、約1 mM至約9 mM、約1 mM至約8 mM、約1 mM至約7 mM、約1 mM至約6 mM、約1 mM至約5 mM、約1 mM至約4 mM、約1 mM至約3 mM或約1 mM至約2 mM L-麩胺酸。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.01 mM、至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約2 mM、至少約3 mM、至少約4 mM、至少約5 mM、至少約6 mM、至少約7 mM、至少約8 mM、至少約9 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM或至少約15 mM或至少約50 mM L-麩胺酸。
在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM、約0.05 mM、約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mM、約0.5 mM、約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM、約2.0 mM、約2.1 mM、約2.2 mM、約2.3 mM、約2.4 mM、約2.5 mM、約2.6 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約2.9 mM、約3.0 mM、約3.1 mM、約3.2 mM、約3.3 mM、約3.4 mM、約3.5 mM、約3.6 mM、約3.7 mM、約3.8 mM、約3.9 mM、約4.0 mM、約4.1 mM、約4.2 mM、約4.3 mM、約4.4 mM、約4.5 mM、約4.6 mM、約4.7 mM、約4.8 mM、約4.9 mM、約5.0 mM、約5.1 mM、約5.2 mM、約5.3 mM、約5.4 mM、約5.5 mM、約5.6 mM、約5.7 mM、約5.8 mM、約5.9 mM、約6.0 mM、約6.1 mM、約6.2 mM、約6.3 mM、約6.4 mM、約6.5 mM、約6.6 mM、約6.7 mM、約6.8 mM、約6.9 mM或約7.0 mM L-麩胺酸。
在一些態樣中，MRM包含約0.15 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.17 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.18 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.19 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.85 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.86 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.9 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約0.95 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.06 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約1.09 mM L-麩胺酸。在一些態樣中，MRM包含約＜ 0.10 mM L-麩胺酸。
在一些態樣中，MRM包含二肽。在一些態樣中，MRM包含麩醯胺酸-麩醯胺酸(Gln-Gln)。在一些態樣中，MRM包含丙胺醯-麩醯胺酸(Ala-Gln)。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約0.1 mM至約50 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約0.1 mM至約40 mM、約0.1 mM至約35 mM、約0.1 mM至約30 mM、約0.1 mM至約25 mM、約0.1 mM至約20 mM、約1 mM至約20 mM、約2 mM至約20 mM、約3 mM至約20 mM、約4 mM至約20 mM、約5 mM至約20 mM、約6 mM至約20 mM、約7 mM至約20 mM、約8 mM至約20 mM、約9 mM至約20 mM、約10 mM至約20 mM、約1 mM至約10 mM、約2 mM至約10 mM、約3 mM至約10 mM、約4 mM至約10 mM、約5 mM至約10 mM、約6 mM至約10 mM、約7 mM至約10 mM、約8 mM至約10 mM或約9 mM至約10 mM二肽( 例如Ala-Gln)。
在一些態樣中，MRM包含至少約0.1 mM、至少約1.0 mM、至少約2 mM、至少約3 mM、至少約4 mM、至少約5 mM、至少約6 mM、至少約7 mM、至少約8 mM、至少約9 mM、至少約10 mM、至少約11 mM、至少約12 mM、至少約13 mM、至少約14 mM、至少約15 mM、至少約16 mM、至少約17 mM、至少約18 mM、至少約19 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM或至少約50 mM二肽( 例如Ala-Gln)。
在一些態樣中，MRM包含約1 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，基礎培養基包含約1.7 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約1.68 mM二肽( 例如Ala-Gln)。
在一些態樣中，MRM包含約6 mM、約6.1 mM、約6.2 mM、約6.3 mM、約6.4 mM、約6.5 mM、約6.6 mM、約6.7 mM、約6.8 mM、約6.9 mM、約7.0 mM、約7.1 mM或約7.2 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約6.8 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約6.81 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約6.9 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約6.96 mM二肽( 例如Ala-Gln)。在一些態樣中，MRM包含約7.0 mM二肽( 例如Ala-Gln)。
在一些態樣中，MRM包含小於約5 mM氨(NH 3)。在一些態樣中，MRM包含小於約4 mM、小於約3.5 mM、小於約3 mM、小於約2.5 mM、小於約2 mM、小於約1.5 mM、小於約1 mM、小於約0.5 mM、小於約0.4 mM、小於約0.3 mM、小於約0.2 mM或小於約0.1 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約0.01 mM氨至小於約2 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.9 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.8 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.7 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.6 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.5 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.4 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.3 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.2 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1.1 mM氨、約0.01 mM氨至小於約1 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.9 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.8 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.7 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.6 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.5 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.4 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.3 mM氨、約0.01 mM氨至小於約0.2 mM氨或約0.01 mM氨至小於約0.1 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約1.2 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約1.25 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約1.259 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約1.28 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約1.3 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約0.3 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約0.34 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約0.35 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約0.36 mM氨。在一些態樣中，MRM包含約0.37 mM氨。在一些態樣中，MRM包含小於約0.3 mM氨。在一些態樣中，MRM包含小於約0.29 mM氨。在一些態樣中，MRM包含小於約0.28 mM氨。在一些態樣中，MRM包含小於約0.278 mM氨。在一些態樣中，MRM不包含氨。
在一些態樣中，MRM包含乳酸鹽。在一些態樣中，MRM不包含乳酸鹽。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)進一步包含CD3促效劑及/或CD28促效劑。CD3促效劑及/或CD28促效劑可刺激在培養基中培養之TIL。在一些態樣中，CD3促效劑可為能夠結合至CD3複合物且活化CD3之任一分子。在一些態樣中，CD3促效劑係小分子。在一些態樣中，CD3促效劑係蛋白質。在一些態樣中，CD3促效劑係抗CD3抗體。如本文所用之術語「抗CD3抗體」係指針對T細胞中之CD3複合物之抗體或其變異體，例如單株抗體，且包括人類、人類化、嵌合或鼠類抗體。在一些態樣中，抗CD3抗體包括OKT-3 (亦稱為莫羅單抗(muromonab))及UCHT-1。其他抗CD3抗體包括例如維西珠單抗(visilizumab)、奧西珠單抗(otelixizumab)及特利珠單抗(teplizumab)。
術語「OKT-3」或「OKT3」係指針對成熟T細胞之T細胞抗原受體中之CD3受體之單株抗體或其生物類似物或變異體，包括人類、人類化、嵌合或鼠類抗體，且包括市售形式，例如OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3純，Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, Calif., USA)及莫羅單抗或其變異體、保守胺基酸取代、糖型或生物類似物。將能夠產生OKT-3之雜交瘤保藏在歐洲認證細胞培養物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures，ECACC)且指派目錄號86022706。亦將能夠產生OKT-3之雜交瘤保藏在美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)且指派ATCC登錄號CRL 8001。
在一些態樣中，CD28促效劑可為能夠活化CD28或其下游路徑之任一分子。在一些態樣中，CD28促效劑係小分子。在一些態樣中，CD28促效劑係蛋白質。在一些態樣中，CD28促效劑係抗 CD28抗體。如本文所用之術語「抗 CD28抗體」係指針對CD28且活化T細胞之抗體或其變異體，例如單株抗體，且包括人類、人類化、嵌合或鼠類抗體。在一些態樣中，抗CD28抗體包括目錄號100182-1 (BPS Bioscicence)、目錄號100186-1 (BPS Bioscience)。
在一些態樣中，CD3促效劑及CD28促效劑係一起添加至MRM中。在一些態樣中，CD3促效劑及CD28促效劑係以一種組合物同時添加至MRM中。在一些態樣中，CD3促效劑及CD28促效劑係按順序添加。在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含及/或補充有包含CD3促效劑及CD28促效劑之取代物，例如TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:100 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:150 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:200 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:250 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:300 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:350 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:400 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:450 TRANSACT™。在一些態樣中，MRM包含至少約1:500 TRANSACT™。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含及/或補充有TRANSACT™替代物。人工抗原呈遞細胞(aAPC) (例如經遺傳改造之人類K562 aAPC)可用於快速擴增TIL。在一些態樣中，aAPC係藉由用包含編碼CD70、CD80、CD86、41BB配位體及OX40配位體之基因之多順反子慢病毒載體轉導K562細胞來產生。K562細胞不表現HLA-A、HLA-B或HLA-DR分子，此使其在用上文所提及之共刺激配位體轉導時成為T細胞擴增之有力工具(參見例如Suhoski 等人，Molecular therapy, 2007)。在一些態樣中，二次TIL擴增及/或第三TIL擴增包括共培養TIL與aAPC + OKT3。在一些態樣中，二次TIL擴增及/或第三TIL擴增包括在OKT3 ( 例如至少約30 ng/mL OKT3)而非TRANSACT™存在下共培養TIL與經輻照之APC (例如PBMC)。在一些態樣中，免疫細胞(例如TIL)對進給細胞( 例如aAPC)之比率為至少約1:50、至少約1:100、至少約1:150、至少約1:200、至少約1:250、至少約1:300、至少約1:350、至少約1:400、至少約1:450或至少約1:500。在一些態樣中，免疫細胞(例如TIL)對進給細胞( 例如aAPC)之比率為至少約1:100。在一些態樣中，免疫細胞(例如TIL)對進給細胞( 例如aAPC)之比率為至少約1:200。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含及/或補充有CD27配位體(CD27L)。CD27配位體(CD70)能夠結合至其受體，且然後在結合後，受體能夠產生並長期維持T細胞免疫性。CD27係TNF受體超家族之成員。CD27係120 kDa之跨膜同二聚體磷酸糖蛋白，亦似乎具有共刺激作用。CD27L CD70係在T細胞及B細胞上因應抗原刺激表現之跨膜糖蛋白；因此，將其視為活化早期之標記物。在活體外，T細胞上之CD27及B細胞上之CD70的相互作用在增殖方面增強T細胞活化，但僅分泌相對較低量之IL-2。基因剔除小鼠之研究已顯示，CD27在原初T細胞活化中起次要作用，但對T細胞記憶之產生至關重要。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含約0.1 µg/ml至約50 µg/ml CD27L。在一些態樣中，MRM包含及/或補充有約0.1 µg/ml至約40 µg/ml、約0.1 µg/ml至約30 µg/ml、約0.1 µg/ml至約20 µg/ml、約0.1 µg/ml至約10 µg/ml、約0.1 µg/ml至約5 µg/ml、約1 µg/ml至約10 µg/ml、約2 µg/ml至約10 µg/ml、約3 µg/ml至約10 µg/ml、約4 µg/ml至約10 µg/ml、約5 µg/ml至約10 µg/ml、約1 µg/ml至約9 µg/ml、約1 µg/ml至約8 µg/ml、約1 µg/ml至約7 µg/ml、約1 µg/ml至約6 µg/ml、約1 µg/ml至約5 µg/ml、約3 µg/ml至約7 µg/ml、約4 µg/ml至約6 µg/ml、約3 µg/ml至約6 µg/ml或約4 µg/ml至約7 µg/ml CD27L。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含及/或補充有至少約0.1 µg/ml、至少約1 µg/ml、至少約2 µg/ml、至少約3 µg/ml、至少約4 µg/ml、至少約5 µg/ml、至少約6 µg/ml、至少約7 µg/ml、至少約8 µg/ml、至少約9 µg/ml、至少約10 µg/ml、至少約11 µg/ml、至少約12 µg/ml、至少約13 µg/ml、至少約14 µg/ml、至少約15 µg/ml、至少約16 µg/ml、至少約17 µg/ml、至少約18 µg/ml、至少約19 µg/ml、至少約20 µg/ml、至少約25 µg/ml、至少約30 µg/ml或至少約50 µg/ml CD27L。在一些態樣中，MRM包含及/或補充有至少約5 µg/ml CD27L。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含及/或補充有4-1BB配位體(4-1BBL)。4-1BBL (4-1BB配位體CD137L)發現於APC (抗原呈遞細胞)上且結合至4-1BB (亦稱為CD137)，其係屬於TNF超家族之2型跨膜糖蛋白受體，在活化T淋巴球上表現。4-1BB配位體可用於活化活體外T細胞。在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含約0.1 µg/ml至約50 µg/ml CD27L。在一些態樣中，MRM包含及/或補充有約0.1 µg/ml至約10 µg/ml、約0.1 µg/ml至約9 µg/ml、約0.1 µg/ml至約8 µg/ml、約0.1 µg/ml至約7 µg/ml、約0.1 µg/ml至約6 µg/ml、約0.1 µg/ml至約5 µg/ml、約0.1 µg/ml至約4 µg/ml、約0.1 µg/ml至約3 µg/ml、約0.1 µg/ml至約2 µg/ml、約0.1 µg/ml至約1 µg/ml、1 µg/ml至約10 µg/ml、約1 µg/ml至約5 µg/ml、約1 µg/ml至約4 µg/ml、約1 µg/ml至約3 µg/ml或約1 µg/ml至約2 µg/ml 4-1BBL。
在一些態樣中，MRM (例如二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)包含及/或補充有至少約0.1 µg/ml、至少約0.2 µg/ml、至少約0.3 µg/ml、至少約0.4 µg/ml、至少約0.5 µg/ml、至少約0.6 µg/ml、至少約0.7 µg/ml、至少約0.8 µg/ml、至少約0.9 µg/ml、至少約1 µg/ml、至少約1.1 µg/ml、至少約1.2 µg/ml、至少約1.3 µg/ml、至少約1.4 µg/ml、至少約1.5 µg/ml、至少約1.6 µg/ml、至少約1.7 µg/ml、至少約1.8 µg/ml、至少約1.9 µg/ml、至少約µg/ml、至少約2 µg/ml、至少約3 µg/ml、至少約4 µg/ml、至少約5 µg/ml或至少約10 µg/ml 4-1BBL。在一些態樣中，MRM包含及/或補充有至少約1 µg/ml 4-1BBL。
在一些態樣中，4-1BBL係與CD27L一起添加至MRM中。在一些態樣中，4-1BBL係與CD27L同時添加至MRM中。在一些態樣中，4-1BBL係與CD27L按順序添加至MRM中。在一些態樣中，擴增過程( 例如二次擴增及/或最終擴增)期間所用之MRM包含TRANSACT™、4-1BBL及CD27L。在一些態樣中，MRM包含至少約1:100 TRANSACT™、至少約1 µg/ml 4-1BBL及至少約5 µg/ml CD27L。在一些態樣中，擴增過程( 例如二次擴增及/或最終擴增)期間所用之MRM包含至少約1:100 TRANSACT™、至少約1 µg/ml 4-1BBL及至少約5 µg/ml CD27L。
在一些態樣中，MRM (例如初始TIL培養基、二次TIL擴增培養基及/或第三(或最終) TIL擴增培養基)係自選自以下之基礎培養基修改：平衡鹽溶液( 例如PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、達爾伯克氏改良伊格爾培養基(DMEM)、克里克氏培養基、最小必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培養基(GMEM)、α最小必需培養基(α MEM)、伊斯科夫改良達爾伯克氏培養基(IMDM)、M199、OpTmizer™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZER™完全培養基、IMMUNOCULT™ XF (STEMCELL™ Technologies)、IMMUNOCULT™ XF、AIM V、TEXMACS™培養基及其任一組合。在一些態樣中，基礎培養基係不含血清的。在一些態樣中，基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。舉例而言，在一些態樣中，基礎培養基包括補充有ICSR之OPTMIZER™完全培養基、補充有ICSR之AIM V、補充有ICSR之IMMUNOCULT™ XF、補充有ICSR之RPMI、補充有ICSR之TEXMACS™或其任一組合。在具體態樣中，基礎培養基包括OPTMIZER™完全培養基。在一些態樣中，適宜基礎培養基包括克里克氏培養基、OpTimizer® (CTS®)培養基、Stemline® T細胞擴增培養基(Sigma-Aldrich)、AIM V®培養基(CTS®)、TexMACS®培養基(Miltenyi Biotech)、ImmunoCult®培養基(Stem Cell Technologies)、PRIME-XV® T細胞擴增XSFM (Irvine Scientific)、伊斯科夫培養基及/或RPMI-1640培養基。
本揭示案包括含有基礎培養基、NaCl、KCl、鈣及葡萄糖之MRM，其中NaCl之濃度介於約40 mM與約80 mM之間，KCl之濃度介於40 mM與90 mM之間，鈣之濃度介於約0.5 mM與約2.8 mM之間，且葡萄糖之濃度介於約10 mM與約24 mM之間。
在一些態樣中，MRM進一步包含免疫細胞。在一些態樣中，免疫細胞包含TIL。
在一些態樣中，MRM進一步包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其任一組合。在一些態樣中，MRM進一步包含IL-2及IL-21。在一些態樣中，IL-2之濃度為約200 ng/ml至約400 ng/ml (例如約200 ng/ml、約300 ng/ml或約400 ng/ml)。在一些態樣中，IL-21之濃度為約20 ng/ml至約40 ng/ml (例如約20 ng/ml、約30 ng/ml或約40 ng/ml)。
在一些態樣中，MRM進一步包含約2.5%血清補充物(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher)、2 mM L-麩醯胺酸、2 mM L-glutamax、MEM非必需胺基酸溶液、Pen-strep、20μg/ml fungin™、丙酮酸鈉或其任一組合。在一些態樣中，MRM進一步包含O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，MRM進一步包含激酶抑制劑。
在一些態樣中，MRM進一步包含CD3促效劑。在一些態樣中，CD3促效劑係抗CD3抗體。在一些態樣中，抗CD3抗體包括OKT-3。
在一些態樣中，MRM進一步包含CD28促效劑。在一些態樣中，CD28促效劑係抗CD28抗體。在一些態樣中，MRM進一步包含CD27配位體(CD27L)。在一些態樣中，MRM進一步包含4-1BB配位體(4-1BBL)。
在一些態樣中，本揭示案包括包含本文所揭示MRM之細胞培養物、包含本文所揭示MRM之細胞袋或包含本文所揭示MRM之生物反應器。 II.H. 細胞
本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度大於5 mM之鉀離子之培養基中，如本文所揭示。本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度高於40 mM之鉀離子之培養基中，如本文所揭示。本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度為至少約50 mM之鉀離子之培養基中，如本文所揭示。本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度為至少約40 mM至至少約90 mM之鉀離子之培養基中，如本文所揭示。
本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度高於40 mM之鉀離子及濃度小於100 mM之NaCl的培養基中，如本文所揭示。本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度為至少約50 mM之鉀離子及濃度小於90 mM之NaCl的培養基中，如本文所揭示。本揭示案之一些態樣係關於培養TIL之方法，其包括將TIL置於包含濃度為至少約40 mM至至少約90 mM之鉀離子及濃度小於100 mM至50 mM之NaCl的培養基中，如本文所揭示。
置於MRM中之TIL可為自需要療法之個體收集及/或分離之TIL。在一些態樣中，置於培養基中之TIL在置於本文所揭示之MRM中之前已擴增。置於培養基中之TIL可稱為起始(初始， 即患者樣品、血球分離樣品、血沈棕黃層) TIL。自將其在本文所揭示之培養基中培養產生之TIL可稱為所得(所培養) TIL。
在一些態樣中，TIL存在於自個體獲得之腫瘤樣品中。因此，在一些態樣中，該方法包括將腫瘤樣品置於本文所揭示之MRM中。在標準TIL培養期間，將腫瘤樣品( 例如腫瘤活體組織切片或其片段)平鋪於初始TIL培養基中，且培養至少約14-19天。在一些態樣中，將腫瘤樣品( 例如腫瘤活體組織切片)在初始TIL培養中在MRM中培養至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天。在一些態樣中，初始TIL培養持續約14天。在一些態樣中，初始TIL培養持續足夠天數直至產生約2×10 6至約10×10 6個細胞之細胞產量。
在一些態樣中，與初始TIL培養前CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例( 例如CD8 +TIL對CD4 +TIL之比例)相比，在初始TIL培養後CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例增加。在一些態樣中，與在基礎培養基或不包含增加的鉀離子濃度之培養基(對照培養基)中進行初始TIL培養後CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例( 例如CD8 +TIL對CD4 +TIL之比例)相比，在初始TIL培養後CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例增加。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約45倍或至少約50倍。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約40倍。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約50倍。
在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約125%、至少約150%、至少約175%、至少約200%、至少約250%、至少約300%、至少約350%、至少約400%、至少約450%或至少約500%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約20%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約40%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約60%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約80%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至少約100%。
在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約20%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約30%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約40%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約50%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約60%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約70%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約75%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約80%。在一些態樣中，CD8 +TIL之比例增加至培養物中TIL總數之至少約90%。
在一些態樣中，自人類個體分離腫瘤樣品。在一些態樣中，自人類個體分離起始腫瘤樣品，且將其中之TIL擴增用於同種異體細胞療法。在一些態樣中，自人類個體分離腫瘤樣品，且將其中之TIL擴增用於自體細胞療法。 II.I. TIL 分離、擴增及收穫
可根據本文所揭示之方法( 例如藉由在本文所述之培養基中培養及/或擴增TIL)來修改TIL分離、培養及/或擴增之任一方法。 II.I.1. 初始擴增
一般而言，自人類個體獲得之腫瘤樣品獲得TIL。可將自個體獲得腫瘤活體組織切片之任何方法用於本文所揭示之方法中，只要腫瘤樣品含有腫瘤及TIL之混合物即可。在一些態樣中，經由腫瘤切除分離腫瘤樣品。在一些態樣中，藉由針活體組織切片分離腫瘤樣品(參見例如美國公開案第US 2020/0277573號，其全文皆以引用方式併入本文中)。在一些態樣中，腫瘤樣品包含實體腫瘤，包括原發性腫瘤、侵入性腫瘤或轉移性腫瘤。在其他態樣中，腫瘤樣品包含液體腫瘤，例如自血液惡性病獲得之腫瘤。腫瘤可具有任一癌症類型，包括(但不限於)乳癌、胰臟癌、前列腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、腦癌、腎癌、胃癌、肝癌(包括但不限於肝細胞癌)及皮膚癌(包括但不限於鱗狀細胞癌、基底細胞癌及黑色素瘤)。在一些態樣中，腫瘤包括黑色素瘤。在一些態樣中，腫瘤包括結腸直腸癌。在一些態樣中，腫瘤包括胰臟癌。在一些態樣中，腫瘤包括頭頸癌。在一些態樣中，腫瘤包括子宮頸癌。在一些態樣中，腫瘤包括卵巢癌。在一些態樣中，將腫瘤樣品在TIL分離/擴增之前冷凍保存。在一些態樣中，腫瘤樣品係新鮮的， 例如未經冷凍保存。在一些態樣中，將腫瘤樣品直接置於MRM培養基中。
在一些態樣中，供體患者( 例如自其獲得腫瘤之個體)係未經治療的( 即，患者尚未接受用於治療腫瘤之先前療法)。在一些態樣中，供體患者已接受一或多種用於治療腫瘤之先前療法。在一些態樣中，個體已接受至少一種先前療法、至少兩種先前療法、至少三種先前療法或至少四種先前療法。在一些態樣中，個體對一或多種先前療法係再發或難治的。
在一些態樣中，個體已接受一或多種先前抗癌療法。在一些態樣中，先前抗癌療法包含標準護理療法。在一些態樣中，先前抗癌療法包含免疫療法。在一些態樣中，先前療法包含含有檢查點抑制劑之免疫療法。在一些態樣中，先前療法包含含有抗PD-1抗體、抗CTLA-4抗體、抗LAG-3抗體或其任一組合之免疫療法。
在一些態樣中，在切除腫瘤樣品之前，向個體投與增強TIL分離及/或擴增之一或多種療法。在一些態樣中，向個體投與激酶抑制劑或ITK抑制劑。激酶抑制劑及/或ITK抑制劑之實例可參見例如國際公開案第WO2019217753號，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，將激酶抑制劑及/或ITK抑制劑在初始擴增及/或第二擴增期間添加至培養基中。在一些態樣中，ITK抑制劑選自由以下組成之群：基於胺基噻唑之ITK抑制劑、基於苯并咪唑之ITK抑制劑、基於胺基嘧啶之ITK抑制劑、基於3-胺基吡啶-2-酮之ITK抑制劑、基於吲哚基吲唑之ITK抑制劑、基於吡唑基-吲哚之抑制劑、噻吩并吡唑抑制劑及靶向ATP口袋中之半胱胺酸-442之ITK抑制劑。在一些態樣中，ITK抑制劑選自由以下組成之群：依魯替尼(ibrutinib)、達沙替尼(dasatinib)、博舒替尼(bosutinib)、尼羅替尼(nilotinib)、埃羅替尼(erlotinib)、BMS509744、CTA056、GSK2250665A、PF06465469及其任一組合。
在一些態樣中，將腫瘤樣品切割成較小片段。在一些態樣中，一或多個較小片段為至少約1 mm 2、至少約1.5 mm 2、至少約2 mm 2、至少約2.5 mm 2、至少約3 mm 2、至少約3.5 mm 2、至少約4 mm 2、至少約4.5 mm 2、至少約5 mm 2、至少約5.5 mm 2、至少約6 mm 2或至少約6.5 mm 2。在一些態樣中，一或多個較小片段為至少約1 mm 3、至少約1.5 mm 3、至少約2 mm 3、至少約2.5 mm 3、至少約3 mm 3、至少約3.5 mm 3、至少約4 mm 3、至少約4.5 mm 3、至少約5 mm 3、至少約5.5 mm 3、至少約6 mm 3、至少約6.5 mm 3、至少約7 mm 3、至少約7.5 mm 3、至少約8 mm 3、至少約8.5 mm 3、至少約9 mm 3、至少約9.5 mm 3或至少約10 mm 3。在一些態樣中，藉由在酶培養基( 例如補充有麩胺酸鹽( 例如約2 mM)、慶大黴素(gentamicine， 例如約10 mcg/mL)、DNase ( 例如約30單位/mL)及膠原酶( 例如約1.0 mg/mL)之RPMI 1640緩衝液或MRM)中培養腫瘤樣品使腫瘤樣品經受酶消化。在一些態樣中，藉由以下方式產生腫瘤消化物：將腫瘤置於酶培養基中及/或使腫瘤機械解離( 即解聚) ( 例如約1分鐘)，然後在37℃.在5% CO 2中培育( 例如30分鐘)，然後在上述條件下重複機械解離及培育週期直至僅存在小組織片。在此過程結束時，若細胞懸浮液含有大量紅血球或死細胞，則可使用FICOLL具支鏈親水性多糖實施密度梯度分離以去除該等細胞。可在任一培養基中實施機械及/或酶解離。在一些態樣中，機械及/或酶解離係在本文所揭示之MRM培養基中實施。
在一些態樣中，機械解離包括將物理壓力施加至經切除腫瘤。在一些態樣中，機械解離包括重複物理壓力。在一些態樣中，每分鐘施加重複物理壓力至少約50次、至少約60次、至少約70次、至少約80次、至少約90次、至少約100次、至少約110次、至少約120次、至少約130次、至少約140次、至少約150次、至少約160次、至少約170次、至少約180次、至少約190次、至少約200次、至少約210次、至少約220次、至少約230次、至少約240次、至少約250次、至少約260次、至少約270次、至少約280次、至少約290次、至少約300次、至少約310次、至少約320次、至少約330次、至少約340次、至少約350次或至少約360次。在一些態樣中，每分鐘施加重複物理壓力至少約120至260次。在一些態樣中，施加重複物理壓力高達約6 N/cm 2、高達約5.5 N/cm 2、高達約5.0 N/cm 2、高達約4.5 N/cm 2、高達約4.0 N/cm 2、高達約3.5 N/cm 2、高達約3.0 N/cm 2。在一些態樣中，機械解離進行約90分鐘或更短時間、約85分鐘或更短時間、約80分鐘或更短時間、約75分鐘或更短時間、約70分鐘或更短時間、約65分鐘或更短時間、約60分鐘或更短時間、約55分鐘或更短時間或約50分鐘或更短時間。在一些態樣中，在室溫下施加機械解離。在一些態樣中，在小於室溫下施加機械解離。在一些態樣中，根據國際公開案第WO 2021/123832號中所揭示之方法及/或使用其中所揭示之裝置施加機械解離，該國際公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些態樣中，將腫瘤樣品( 即經切除腫瘤組織樣品或經解離腫瘤樣品)或其片段置於培養基( 例如本文所揭示之培養基)中，其中培養基進一步包含IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約4000 IU/ml IL-2、至少約4500 IU/ml IL-2、至少約5500 IU/ml IL-2、至少約6000 IU/ml IL-2或至少約6500 IU/ml IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約600 IU/ml IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約100 ng/mL IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約200 ng/mL IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約400 ng/mL IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約500 ng/mL IL-2。在一些態樣中，培養基包含至少約600 ng/mL IL-2。
在其他態樣中，將腫瘤樣品或其片段置於培養基( 例如本文所揭示之培養基)中，其中培養基進一步包含IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約10 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約15 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，培養基包含至少約30 ng/mL IL-21。
個別腫瘤片段可在單一培養室( 例如孔)中一起培養，或個別腫瘤片段可在單獨培養室( 例如孔)中培養。用於促進TIL自所培養腫瘤樣品逃逸之標準培養基包括補充有以下物質之RPMI 1640：Glutamax (Gibco/Tnvitrogen; Carlsbad, Calif.)、1×Pen-Strep (Gibco/Invitrogen; Carlsbad, Calif.)、50 μm 2-巰基乙醇(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, Calif.)、20 μg/ml慶大黴素(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, Calif.)及1 mM丙酮酸鹽(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, Calif.)。在一些態樣中，根據本揭示案來修改標準培養基。在一些態樣中，標準培養基包含補充有以下物質之CTS™ OpTimizer™：血清補充物(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher)、L-麩醯胺酸(Gibco)、L-glutamax (Gibco)、MEM非必需胺基酸溶液(Gibco)、Pen-strep (Gibco)、fungin™ (InvivoGen)、丙酮酸鈉(Gibco)、IL-2、IL-21、O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽(Sigma)或其任一組合。在一些態樣中，標準培養基包含補充有以下物質之CTS™ OpTimizer™：約2.5%血清補充物(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher)、約2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)、約2 mM L-glutamax (Gibco)、MEM非必需胺基酸溶液(Gibco)、Pen-strep (Gibco)、約20μg/ml fungin™ (InvivoGen)、丙酮酸鈉(Gibco)、約IL-2 (300 ng/mL)、約IL-21 (30 ng/ml)及約1 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽(Sigma)。
在一些態樣中，將腫瘤樣品或其片段在初始培養中培養至少約1週、至少約2週或至少約3週。在一些態樣中，將腫瘤樣品或其片段培養至少約2週。如本文所用之「腫瘤樣品」係指腫瘤組織及/或解聚的腫瘤組織( 即源自腫瘤組織之機械及/或化學解聚之細胞懸浮液)。在一些態樣中，將腫瘤樣品或片段在初始培養中培養約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天。
在一些態樣中，初始培養進一步包括使腫瘤樣品或片段與腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)促效劑接觸。在一些態樣中，TNFRSF促效劑包括4-1BB促效劑、OX40促效劑、CD27促效劑、GITR促效劑、HVEM促效劑、CD95促效劑或其任一組合。在一些態樣中，TNFRSF促效劑係美國公開案第US 2020/0121719 A1號中所揭示之任一TNFRSF促效劑，該美國公開案之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，初始培養進一步包括使腫瘤樣品或其片段與約10-500 ng/ml 4-1BB配位體接觸。在一些態樣中，初始培養進一步包括使腫瘤樣品或其片段與約50 ng/ml、約60 ng/ml、約70 ng/ml、約75 ng/ml、約80 ng/ml、約90 ng/ml、約100 ng/ml、約125 ng/ml、約150 ng/ml、約175 ng/ml、約200 ng/ml、約250 ng/ml、約300 ng/ml、約350 ng/ml、約400 ng/ml、約450 ng/ml、約500 ng/ml 4-1BB配位體接觸。在一些態樣中，初始培養進一步包括使腫瘤樣品或其片段與約100 ng/ml 4-1BB配位體接觸。在一些態樣中，在初始培養之約第4天、在初始培養之約第5天、在初始培養之約第6天或在初始培養之約第7天，使腫瘤樣品或其片段與4-1BB配位體接觸。在一些態樣中，在初始培養之約第5天，使腫瘤樣品或其片段與4-1BB配位體接觸。
在一些態樣中，初始培養進一步包括使腫瘤樣品或其片段與TRANSACT™接觸。在一些態樣中，初始培養進一步包括使腫瘤樣品或其片段與TRANSACT™ (1:200)接觸。在一些態樣中，在初始培養之約第4天、在初始培養之約第5天、在初始培養之約第6天或在初始培養之約第7天，使腫瘤樣品或其片段與TRANSACT™接觸。在一些態樣中，在初始培養之約第5天，使腫瘤樣品或其片段與TRANSACT™接觸。在一些態樣中，在初始培養之約第5天，使腫瘤樣品或其片段與4-1BB配位體及TRANSACT™接觸。
在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約1×10 5至至少約1×10 8個、至少約5×10 5至至少約1×10 8個、至少約1×10 6至至少約1×10 8個、至少約2×10 6至至少約1×10 8個、至少約3×10 6至至少約1×10 8個、至少約4×10 6至至少約1×10 8個、至少約5×10 6至至少約1×10 8個、至少約1×10 5至至少約5×10 7個、至少約5×10 5至至少約10×10 6個、至少約1×10 6至至少約10×10 6個、至少約2×10 6至至少約10×10 6個、至少約3×10 6至至少約10×10 6個、至少約4×10 6至至少約10×10 6個或至少約5×10 6至至少約10×10 6個細胞/所培養片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約2×10 6-10×10 6個細胞/片段。
在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約1×10 5個、至少約2×10 5個、至少約3×10 5個、至少約4×10 5個、至少約5×10 5個、至少約6×10 5個、至少約7×10 5個、至少約8×10 5個、至少約9×10 5個、至少約1×10 6個、至少約2×10 6個、至少約3×10 6個、至少約4×10 6個、至少約5×10 6個、至少約6×10 6個、至少約7×10 6個、至少約8×10 6個、至少約9×10 6個或至少約10×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約2×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約3×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約4×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約5×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約6×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約7×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約8×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約9×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，在初始培養物中培養腫瘤樣品或其片段直至初始培養物中之細胞產量達到至少約10×10 6個細胞/片段。在一些態樣中，使細胞( 例如TIL)在初始培養後通過篩濾器。在一些態樣中，使細胞( 例如TIL)在初始培養後通過至少約10 µm、至少約15 µm、至少約20 µm、至少約25 µm、至少約30 µm、至少約35 µm、至少約40 µm、至少約45 µm、至少約50 µm篩濾器。在一些態樣中，使細胞( 例如TIL)在初始培養後通過約40 µm篩濾器。 II.I.2. 二次擴增
在一些態樣中，使TIL經受二次擴增。在一些態樣中，在使TIL進行至二次擴增之前，篩選第一次擴增之TIL之腫瘤特異性細胞溶解活性。在一些態樣中，在進行至二次擴增之前，篩選TIL之一或多種生物標記物之表現。在一些態樣中，生物標記物包含一或多種基因之表現，該一或多種基因通常係由更原初之TIL( 例如CD8 +、CD27 +、CD3 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +、TCF7 +或其任一組合)表現。在一些態樣中，在進行至二次擴增之前，篩選TIL之PD-1表現。在一些態樣中，在使TIL進行至二次擴增之前，不對第一次擴增之TIL進行篩選。在一些態樣中，使在初始擴增中獲得之所有TIL經受二次擴增。在一些態樣中，在進行至二次擴增之前，匯集第一次擴增之TIL。
在一些態樣中，使用快速擴增方案(REP)使TIL經受二次擴增。參見例如Dudley等人， Science 298:850-54 (2002)；Dudley等人， J. Clin. Oncol. 23:2346-57 (2005)；Dudley等人， J. Clin. Oncol. 26:5233-39 (2008)；Riddell等人， Science 257:238-41 (1992)；及Dudley等人， J. Immunother. 26:332-42 (2003)，該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，使TIL在進給淋巴球及介白素-2 (IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21或其組合存在下使用非特異性T細胞受體刺激快速擴增。在某些態樣中，使TIL在IL-2、IL-15及IL-21存在下快速擴增。在一些態樣中，快速擴增期間培養基中IL-2之濃度低於初始培養期間培養基中IL-2之濃度。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度小於300 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約50 ng/ml、約55 ng/ml、約60 ng/ml、約65 ng/ml、約70 ng/ml、約73.6 ng/ml、約75 ng/ml、約80 ng/ml、約85 ng/ml、約90 ng/ml、約95 ng/ml、約100 ng/ml、約105 ng/ml、約110 ng/ml、約115 ng/ml、約120 ng/ml、約125 ng/ml、約130 ng/ml、約135 ng/ml、約140 ng/ml、約145 ng/ml、約150 ng/ml、約175 ng/ml、約200 ng/ml、約225 ng/ml、約250 ng/ml或約275 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約50 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約55 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約60 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約65 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約70 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約73.6 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約75 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約80 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約85 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約90 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約95 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-2之濃度為約100 ng/ml。
在一些態樣中，快速擴增期間培養基中IL-21之濃度低於初始培養期間培養基中IL-21之濃度。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度小於30 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約1 ng/ml、約2 ng/ml、約3 ng/ml、約4 ng/ml、約5 ng/ml、約6 ng/ml、約7 ng/ml、約8 ng/ml、約9 ng/ml、約10 ng/ml、約11 ng/ml、約12 ng/ml、約13 ng/ml、約14 ng/ml、約15 ng/ml、約16 ng/ml、約17 ng/ml、約18 ng/ml、約19 ng/ml、約20 ng/ml、約21 ng/ml、約22 ng/ml、約23 ng/ml、約24 ng/ml、約25 ng/ml、約26 ng/ml、約27 ng/ml、約28 ng/ml或約29 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約5 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約6 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約7 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約8 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約9 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約10 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約11 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約12 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約13 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約14 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-21之濃度為約15 ng/ml。
在一些態樣中，快速擴增期間培養基中IL-15之濃度為約0.1 ng/ml、約0.2 ng/ml、約0.3 ng/ml、約0.4 ng/ml、約0.5 ng/ml、約0.6 ng/ml、約0.7 ng/ml、約0.8 ng/ml、約0.9 ng/ml、約1.0 ng/ml、約1.1 ng/ml、約1.2 ng/ml、約1.3 ng/ml、約1.4 ng/ml、約1.5 ng/ml、約1.6 ng/ml、約1.7 ng/ml、約1.8 ng/ml、約1.9 ng/ml、約2.0 ng/ml、約2.25 ng/ml、約2.5 ng/ml、約2.75 ng/ml、約3.0 ng/ml、約3.5 ng/ml、約4.0 ng/ml、約4.5 ng/ml或約5.0 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.1 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.2 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.3 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.4 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.5 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.6 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.7 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.8 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約0.9 ng/ml。在一些態樣中，快速擴增期間IL-15之濃度為約1.0 ng/ml。
非特異性T細胞受體刺激物可包括 例如OKT3 ( 例如約30 ng/ml)，其係小鼠單株抗CD3抗體(可自Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.或Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany獲得)。在一些態樣中，藉由在T細胞生長因子(例如約200-400 IU/ml之T細胞生長因子，例如300 IU/ml IL-2或IL-15)存在下，用一或多種抗原(包括其抗原部分，例如抗原決定基，或可視情況地自載體表現之癌細胞，例如人類白血球抗原A2 (HLA-A2)結合肽，例如約0.3 μM MART-1:26-35 (27 L)或gp100:209-217 (210M)) 活體外刺激外周血液單核細胞(PBMC)來快速擴增TIL。在一些態樣中，藉由使用TRANSACT™刺激來擴增TIL。在一些態樣中， 活體外誘導之TIL係藉由用脈衝至表現HLA-A2之抗原呈遞細胞上之癌症之相同抗原刺激來快速擴增。在一些態樣中，可用輻照、自體淋巴球或用輻照HLA-A2+同種異體淋巴球及IL-2來刺激TIL。
在一些態樣中，在第二擴增期間藉由在包含TRANSACT™及視情況地4-1BBL及/或CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在第二擴增期間藉由在包含TRANSACT™、4-1BBL及CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在第二擴增期間藉由在包含至少約1:100 TRANSACT™、至少約1 µg/ml 4-1BBL及至少約5 µg/ml CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。
在一些態樣中，一或多個TIL在TIL擴增之前、期間或之後經遺傳修飾。TIL之遺傳修飾可使用此項技術中已知之任何方法來達成。在一些態樣中，使用Cas9核酸內切酶(CRISPR；參見例如US2017067021A1，其全文皆以引用方式併入本文中)、TALEN、鋅指核酸內切酶、位點定向誘變或其任一組合來修飾一或多個TIL。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以破壞或除去人類細胞介素誘導型含SH2蛋白(CISH；參見例如US10406177B2，其全文皆以引用方式併入本文中)之表現。在一些態樣中，一或多個TIL係使用AAV來修飾， 例如，一或多個TIL包含AAV。在一些態樣中，一或多個TIL係使用慢病毒或反轉錄病毒來修飾。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以表現外源經修飾或經改造之T細胞受體(TCR)。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以表現CD86。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以表現OX40L。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以表現4-1BBL。在一些態樣中，一或多個TIL經遺傳修飾以表現抗PD1抗體。
在一些態樣中，在進一步包含腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)促效劑之培養基中擴增TIL。任一TNFRSF促效劑可用於本文所揭示之方法中。TNFRSF促效劑之非限制性實例可參見例如US20200121719A1，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，TNFRSF促效劑係在初始培養後添加。在一些態樣中，TNFRSF促效劑係在第二及/或或最終擴增期間添加。
在一些態樣中，在進一步包含4-1BB促效劑之培養基中擴增TIL。任一4-1BB促效劑可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，4-1BB促效劑包括4-1BB抗體。4-1BB促效劑之非限制性實例可參見例如US20200032209A1，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，4-1BB促效劑係在初始培養後添加。在一些態樣中，4-1BB促效劑係在第二或最終擴增期間添加。
在一些態樣中，在第二擴增期間藉由在包含TRANSACT™及視情況地4-1BBL及/或CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在第二擴增期間藉由在包含TRANSACT™、4-1BBL及CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在第二擴增期間藉由在包含至少約1:100 TRANSACT™、至少約1 µg/ml 4-1BBL及至少約5 µg/ml CD27L之培養基中培養細胞來刺激TIL。
在一些態樣中，在進一步包含腺苷a2a受體拮抗劑之培養基中擴增TIL。任一腺苷a2a受體拮抗劑可用於本文所揭示之方法中。腺苷a2a受體拮抗劑之非限制性實例可參見例如US20210137930A1，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，腺苷a2a受體拮抗劑選自由以下組成之群：韋帕南特(vipadenant)、CPI-444 (西弗南特(ciforadenant))、SCH58261、ZM241385、SCH420814、SYN115、8-CSC、KW-6002、A2A受體拮抗劑1、ADZ4635、ST4206、KF21213、SCH412348及7MMG-49、或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥及其組合。在一些態樣中，腺苷a2a受體拮抗劑係在初始培養期間添加。在一些態樣中，腺苷a2a受體拮抗劑係在第二及/或或最終擴增期間添加。
在一些態樣中，在進一步包含AKT路徑抑制劑(AKTi)之培養基中擴增TIL。任一AKTi可用於本文所揭示之方法中。可用於本揭示案中之AKTi之非限制性實例可參見例如WO2020096927，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，AKTi選自由以下組成之群：阿氟色替(afuresertib)、優普色替(uprosertib)、帕他色替(ipatasertib)、AT7867、AT13148及其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。在一些態樣中，AKTi係mTOR抑制劑， 例如AZD8055或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。在一些態樣中，AKTi係PI3K抑制劑， 例如LY294002或其醫藥學上可接受之鹽、溶劑合物、水合物、共晶體或前藥。在一些態樣中，AKTi係在初始培養期間添加。在一些態樣中，AKTi係在第二及/或或最終擴增期間添加。
在一些態樣中，藉由使所擴增TIL與一或多個抗原呈遞細胞接觸來再活化或刺激所擴增細胞。任一抗原呈遞細胞可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，抗原呈遞細胞係經遺傳修飾之細胞。在一些態樣中，抗原呈遞細胞包含細胞表面上之腫瘤抗原或其片段。在一些態樣中，使所擴增TIL與在細胞表面上包含一種以上之腫瘤抗原或其片段之抗原呈遞細胞接觸。
在一些態樣中，抗原呈遞細胞(APC)經遺傳改造。在一些態樣中，APC經遺傳改造用於一或多個轉基因( 例如抗原或刺激信號)之可調諧表現。在一些態樣中，APC係根據WO2020/086742中所揭示之方法經遺傳改造，該文獻之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，APC經遺傳改造以表現一或多種刺激分子。在一些態樣中，APC經遺傳改造以表現CD86、OC40L、4-1BBL或其任一組合。在一些態樣中，APC係美國專利第US 10,415,015號中所揭示之APC，該美國專利之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約1×10 7至至少約50×10 7個、至少約2×10 7至至少約40×10 7個、至少約3×10 7至至少約30×10 7個、至少約4×10 7至至少約25×10 7個、至少約5×10 7至至少約20×10 7個、至少約1×10 7至至少約20×10 7個、至少約2×10 7至至少約20×10 7個、至少約3×10 7至至少約20×10 7個或至少約4×10 7至至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約5×10 7至至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約1×10 7個、至少約2×10 7個、至少約3×10 7個、至少約4×10 7個、至少約5×10 7個、至少約6×10 7個、至少約7×10 7個、至少約8×10 7個、至少約9×10 7個、至少約10×10 7個、至少約11×10 7個、至少約12×10 7個、至少約13×10 7個、至少約14×10 7個、至少約15×10 7個、至少約16×10 7個、至少約17×10 7個、至少約18×10 7個、至少約19×10 7個或至少約20×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約5×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約6×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約7×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次擴增中培養TIL直至二次TIL培養基中之細胞產量達到至少約8×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次擴增中培養TIL直至二次TIL培養基中之細胞產量達到至少約9×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約10×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約15×10 7個細胞。在一些態樣中，在二次TIL培養基中培養TIL直至二次擴增中之細胞產量達到至少約20×10 7個細胞。
在一些態樣中，使TIL經受最終擴增。在一些態樣中，最終擴增期間之培養基包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其組合。在某些態樣中，最終擴增期間之培養基包含IL-2、IL-15及IL-21。在一些態樣中，最終擴增期間培養基中IL-2之濃度低於初始培養期間培養基中IL-2之濃度。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度小於300 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約50 ng/ml、約55 ng/ml、約60 ng/ml、約65 ng/ml、約70 ng/ml、約73.6 ng/ml、約75 ng/ml、約80 ng/ml、約85 ng/ml、約90 ng/ml、約95 ng/ml、約100 ng/ml、約105 ng/ml、約110 ng/ml、約115 ng/ml、約120 ng/ml、約125 ng/ml、約130 ng/ml、約135 ng/ml、約140 ng/ml、約145 ng/ml、約150 ng/ml、約175 ng/ml、約200 ng/ml、約225 ng/ml、約250 ng/ml或約275 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約50 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約55 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約60 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約65 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約70 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約73.6 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約75 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約80 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約85 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約90 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約95 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-2之濃度為約100 ng/ml。
在一些態樣中，最終擴增期間培養基中IL-21之濃度低於初始培養期間培養基中IL-21之濃度。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度小於30 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約1 ng/ml、約2 ng/ml、約3 ng/ml、約4 ng/ml、約5 ng/ml、約6 ng/ml、約7 ng/ml、約8 ng/ml、約9 ng/ml、約10 ng/ml、約11 ng/ml、約12 ng/ml、約13 ng/ml、約14 ng/ml、約15 ng/ml、約16 ng/ml、約17 ng/ml、約18 ng/ml、約19 ng/ml、約20 ng/ml、約21 ng/ml、約22 ng/ml、約23 ng/ml、約24 ng/ml、約25 ng/ml、約26 ng/ml、約27 ng/ml、約28 ng/ml或約29 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約5 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約6 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約7 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約8 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約9 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約10 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約11 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約12 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約13 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約14 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-21之濃度為約15 ng/ml。
在一些態樣中，最終擴增期間培養基中IL-15之濃度為約0.1 ng/ml、約0.2 ng/ml、約0.3 ng/ml、約0.4 ng/ml、約0.5 ng/ml、約0.6 ng/ml、約0.7 ng/ml、約0.8 ng/ml、約0.9 ng/ml、約1.0 ng/ml、約1.1 ng/ml、約1.2 ng/ml、約1.3 ng/ml、約1.4 ng/ml、約1.5 ng/ml、約1.6 ng/ml、約1.7 ng/ml、約1.8 ng/ml、約1.9 ng/ml、約2.0 ng/ml、約2.25 ng/ml、約2.5 ng/ml、約2.75 ng/ml、約3.0 ng/ml、約3.5 ng/ml、約4.0 ng/ml、約4.5 ng/ml或約5.0 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.1 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.2 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.3 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.4 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.5 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.6 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.7 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.8 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約0.9 ng/ml。在一些態樣中，最終擴增期間IL-15之濃度為約1.0 ng/ml。
在一些態樣中，最終擴增包括刺激。在一些態樣中，刺激與二次擴增期間所用之刺激相同。在一些態樣中，在最終擴增期間藉由在包含TRANSACT™、4-1BBL、CD27L或其任一組合之MRM中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在最終擴增期間藉由在包含TRANSACT™及視情況地4-1BBL及/或CD27L之MRM中培養細胞來刺激TIL。在一些態樣中，在最終擴增期間藉由在包含至少約1:100 TRANSACT™、至少約1 µg/ml 4-1BBL及至少約5 µg/ml CD27L之MRM中培養細胞來刺激TIL。
在一些態樣中，在靜態GREX中實施最終擴增步驟。在一些態樣中，在攪拌罐中實施最終擴增。在一些態樣中，在生物反應器中實施最終擴增步驟。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9至至少約100×10 9個、至少約40×10 9至至少約90×10 9個、至少約40×10 9至至少約80×10 9個、至少約40×10 9至至少約70×10 9個、至少約40×10 9至至少約60×10 9個、至少約40×10 9至至少約50×10 9個、至少約10×10 9至至少約100×10 9個、至少約20×10 9至至少約100×10 9個、至少約30×10 9至至少約100×10 9個、至少約30×10 9至至少約50×10 9個或至少約35×10 9至至少約45×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9至至少約100×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9個、至少約45×10 9個、至少約50×10 9個、至少約55×10 9個、至少約60×10 9個、至少約65×10 9個、至少約70×10 9個、至少約75×10 9個、至少約80×10 9個、至少約85×10 9個、至少約90×10 9個、至少約95×10 9個或至少約100×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約40×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約50×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約60×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約70×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約80×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約90×10 9個細胞。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量達到至少約100×10 9個細胞。
在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約7天至至少約21天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約7天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約8天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約9天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約10天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約11天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約12天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約13天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約14天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約15天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約16天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約17天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約18天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約19天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約20天。在一些態樣中，繼續最終擴增直至最終TIL培養基中之細胞產量持續至少約21天。 II.I.3. 收穫及冷凍保存
在一些態樣中，收穫所擴增TIL。TIL可使用任一方法、包括藉由離心來收穫。在一些態樣中，TIL係使用自動化系統來收穫。細胞收穫機及/或細胞處理系統可自多種來源購得，且任何基於細胞之收穫機可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，細胞收穫機及/或細胞處理系統係基於膜之細胞收穫機。在一些態樣中，細胞收穫係使用細胞處理系統( 例如LOVO系統(Fresenius Kabi))來實施。在一些態樣中，細胞收穫機及/或細胞處理系統可在封閉無菌系統中實施細胞分離、洗滌、流體交換、濃縮及/或其他細胞處理步驟。
在一些態樣中，收穫係自封閉系統生物反應器實施。在一些態樣中，採用封閉系統進行TIL擴增。在一些態樣中，採用單一生物反應器。在一些態樣中，封閉系統生物反應器係單一生物反應器。在開放及封閉系統中 離體擴增TIL之方法之實例可參見例如美國專利第10,166,257號，其全文皆以引用方式併入本文中。
在一些態樣中，將所擴增TIL冷凍保存。TIL可使用任何方法冷凍保存。冷凍保存哺乳動物細胞(包括TIL)之多種方法已闡述於 例如(i) General Protocol for the Cryopreservation of Mammalian Cells, UNC (2007)， 可在unclineberger.org/tissueculture/protocols/general-protocol-for-the-cryopreservation-of-mammalian-cells/上獲得；及(ii) Clarke等人，Improved post-thaw recovery of peripheral blood stem/progenitor cells using a novel intracellular-like cryopreservation solution, Cytotherapy 2009-6-6， 可在sigmaaldrich.com/catalog/papers/19499402上獲得；該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。
在一些態樣中，根據以下方法培養TIL： (1) 自個體分離腫瘤樣品，且將腫瘤切割成片段及/或機械或化學解聚。 (2) 然後在初始培養物中培養所得腫瘤樣品或其片段，該初始培養物包含進一步補充有300 ng/mL或6000 IU/ml IL-2及30 ng/ml IL-21之本文所揭示之代謝再程式化培養基。 (3) 視情況地，在開始初始培養後第5天，使TIL與TRANSACT™ (1:200)及100 ng/mL 4-1BB配位體接觸，且然後將TIL再培養5-9天或直至達到約10 ×10 6至約200 × 10 6個細胞。然後匯集TIL。 (4) 然後將步驟3之至少0.5 × 10 6個TIL與100-200×過量之經輻照PBMC進給細胞混合且在補充有30 ng/ml抗CD3抗體( 例如OKT3)、75 ng/mL IL-2、10 ng/mL IL-21及0.4 ng/mL IL-15之培養基( 例如本文所揭示之代謝再程式化培養基)中培養。繼續此二次(REP)培養直至獲得TIL之治療有效量，如本文所述。 III. 本揭示案之組合物
本揭示案之一些態樣係關於包含TIL群體之組合物，該TIL群體富集CD8 +TIL。在一些態樣中，組合物包含根據本文所揭示之任一方法培養之TIL群體。在一些態樣中，至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約20%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約30%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約40%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約50%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約60%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約70%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約80%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約90%之TIL係CD8 +TIL。在一些態樣中，至少約95%之TIL係CD8 +TIL。
本揭示案之一些態樣係關於包含擴增TIL群體之組合物，其中與使用對照方法( 例如在包含濃度小於約5 mM之鉀離子之培養基中培養)擴增之TIL群體之純系多樣性相比，擴增TIL群體具有增加的純系多樣性。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性與腫瘤樣品中TIL之純系多樣性相同。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約95%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約90%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約85%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約80%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約75%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約70%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約60%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約50%。在某些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約40%。
在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.5，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.4，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.275，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.24，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.23，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.22，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.21，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.19，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.18，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.17，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.16，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.15，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.14，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.13，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.12，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.11，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.09，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.08，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.07，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.06，如藉由辛普森純系性所量測。在一些態樣中，擴增TIL群體之純系多樣性評分小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。
在一些態樣中，TIL展現指示低分化表型之一或多種生物標記物之表現增加。在一些態樣中，TIL展現增加的TCF7表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現TCF7表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現TCF7表現增加至少約40倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +TCF7 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係TCF7 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD45RO表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD45RO表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD45RO表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +CD45RO +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD45RO +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD62L表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD62L表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD62L表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +CD62L +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD62L +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD27表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +CD27 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD62L及CD27表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD62L及CD27表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +/ CD62L +/CD27 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD62L +CD27 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD28表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD28表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD28表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +/CD28 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD28 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD27及CD28表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27及CD28表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27及CD28表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +CD27 +CD28 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD28 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD27、CD28、PD1及CD103表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27、CD28、PD1及CD103表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27、CD28、PD1及CD103表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +CD27 +CD28 +PD1 +CD103 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD28 +PD1 +CD103 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD27、CD28、PD1及TCF7表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27、CD28、PD1及TCF7表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27、CD28、PD1及TCF7表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +CD27 +CD28 +PD1 +TCF7 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD28 +PD1 +TCF7 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD27、CD28、PD1、CD103及TCF7表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27、CD28、PD1、CD103及TCF7表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD27、CD28、PD1、CD103及TCF7表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +CD27 +CD28 +PD1 +CD103 +TCF7 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD27 +CD28 +PD1 +CD103 +TCF7 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD39表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD39表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD39表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +CD39 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD39 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD39及PD1表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD39及PD1表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD39及PD1表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +CD39 +PD1 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD39 +PD1 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的PD1表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現PD1表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現PD1表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之免疫細胞係CD8 +/PD1 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的PD1及CD27表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現PD1及CD27表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現PD1及CD27表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +PD1 +CD27 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係PD1 +CD27 +。
在一些態樣中，TIL展現增加的CD103表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD103表現增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現CD103表現增加至少約10倍。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%之TIL係CD8 +/CD103 +TIL。在一些態樣中，至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%之CD8 +TIL係CD103 +。
在一些態樣中，與根據習用方法培養之相當免疫細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有增加的低分化細胞數。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現增加的一或多種幹細胞樣表型典型標記物表現。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再程式化培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)群體與根據習用方法(例如在含有小於5 mM K +之培養基中)培養之相當細胞相比具有增加的效應物樣細胞數。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再程式化培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)群體與根據習用方法(例如在含有小於5 mM K +之培養基中)培養之相當細胞相比具有增加的幹細胞樣及效應物樣細胞數。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)與根據習用方法培養之細胞相比展現更大之增殖潛能。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)在移植至個體中後展現增加的 活體內活力。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現增加的細胞效力。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)展現減少的細胞耗竭。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)在移植至個體中後展現增加的 活體內持久性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)在移植至個體中後展現增加的 活體內活性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)在移植至個體中後展現更耐久之 活體內反應。在一些態樣中，個體係人類。
在一些態樣中，組合物中至少約5%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約10%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約15%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約20%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約25%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約30%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約35%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約40%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約45%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約50%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約55%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約60%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約65%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，組合物中至少約70%之TIL ( 例如CD8 +TIL)具有幹細胞樣表型。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL ( 例如CD8 +TIL)後，幹細胞樣TIL ( 例如CD8 +TIL)佔培養物中TIL ( 例如CD8 +TIL)總數之至少約10%至至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL ( 例如CD8 +TIL)後，幹細胞樣TIL ( 例如CD8 +TIL)佔培養物中TIL ( 例如CD8 +TIL)總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL ( 例如CD8 +TIL)後，幹細胞樣TIL ( 例如CD8 +TIL)佔培養物中CD8 +TIL總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。
在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約1.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約2.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約2.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約3.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約3.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約4.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之細胞數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約4.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約5.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約5.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約6.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約6.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之細胞數相比增加至少約7.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之細胞數相比增加至少約7.5倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約8.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL ( 例如CD8 +TIL)數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約9.0倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之細胞數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約10倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之細胞數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約15倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之細胞數與培養前組合物中之TIL ( 例如CD8 +TIL)數相比增加至少約20倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之TIL數相比增加至少約30倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之細胞數相比增加至少約40倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之TIL數相比增加至少約50倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之TIL數相比增加至少約75倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之TIL數相比增加至少約100倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之TIL數相比增加至少約500倍。在一些態樣中，組合物中具有幹細胞樣表型之TIL數與培養前組合物中之TIL數相比增加至少約1000倍。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL ( 例如CD8 +TIL)後，培養物中TIL ( 例如CD8 +TIL)總數之至少約10%至至少約70%係CD39 -/TCF7 +T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL ( 例如CD8 +TIL)後，培養物中TIL ( 例如CD8 +TIL)總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%係CD39 -/TCF7 +TIL ( 例如CD8 +TIL)。
在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之不表現CD45R0之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CCR7之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD62L之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現TCF7之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD3之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD27之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95及CD45RA之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA及CCR7之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95、CD45RA及CCR7之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA、CCR7及CD62L之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95、CD45RA、CCR7及CD62L之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27且為CD45RO 低之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27且為CD45RO 低之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27且不表現CD45RO之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27且不表現CD45RO之TIL。
在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之不表現CD39及CD69之TIL。在一些態樣中，細胞組合物包含增加的百分比之表現CD8且不表現CD39及CD69之TIL。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，培養物中TIL總數之至少約10%至至少約40%係CD39 -/CD69 -TIL。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養TIL後，培養物中TIL總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%係CD39 -/CD69 -TIL。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)表現至少兩種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)表現至少三種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)表現至少四種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)表現一或多種幹細胞樣標記物及至少兩種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約40%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約50%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約60%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約70%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約75%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約80%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約85%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約90%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約95%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約96%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約97%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約98%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，至少約99%之TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。
在一些態樣中，幹細胞樣標記物選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任一組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+及TCF7+或其任一組合。在一些態樣中，TIL表現CD45RO 低。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包括本文所列之一或多個基因作為基因印記之一部分( 參見上文； 參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21, 1552-1562 (2020))。在一些態樣中，效應物樣標記物選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任一組合。在一些態樣中，效應物樣標記物包括選自由以下組成之群之STAT靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任一組合。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係CD45RA+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係CD62L+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係TCF7+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之培養基中培養之TIL ( 例如CD8 +TIL)係CD45RA+、CD45RO 低、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。
在一些態樣中，TIL包含一或多種選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任一組合之標記物，及一或多種選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任一組合之標記物。在一些態樣中，TIL包含一或多種選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任一組合之標記物，及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，TIL包含一或多種幹細胞樣標記物，及一或多種選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任一組合之標記物。在一些態樣中，效應物樣標記物包括選自由以下組成之群之STAT靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任一組合。
在一些態樣中，表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL係T幹細胞/效應物(T SE)細胞。在一些態樣中，T SE細胞保持低分化狀態( 例如表現一或多種幹細胞樣標記物、能夠增殖、能夠分化或其任一組合)，且細胞具有效應功能( 例如表現一或多種效應物樣標記物、能夠靶向及/或殺傷腫瘤細胞、展現多功能性或其組合)。在一些態樣中，本文所揭示之T SE細胞表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，本文所揭示之T SE細胞表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，T SE細胞為CD45RO 低。
本揭示案之一些態樣係關於包含一或多個T SE細胞之擴增TIL群體。在一些態樣中，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約40%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約50%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約60%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約70%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約75%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約80%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約85%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約90%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約95%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約98%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，至少約99%之擴增TIL群體係T SE細胞。在一些態樣中，群體中約100%之擴增TIL群體係T SE細胞。
本揭示案之一些態樣係關於TIL，其表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，TIL表現至少兩種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，TIL表現至少三種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，TIL表現至少四種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。在一些態樣中，TIL表現一或多種幹細胞樣標記物及至少兩種效應物樣標記物。在一些態樣中，幹細胞樣標記物選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任一組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、TCF7+及其任一組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包括本文所列之一或多個基因作為基因印記之一部分( 參見上文；參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21, 1552-1562 (2020))。在一些態樣中，效應物樣標記物選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任一組合。在一些態樣中，TIL表現CD45RA+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，TIL表現CD62L+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，TIL表現TCF7+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，TIL表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，TIL表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，TIL表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、CD45RO 低、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。
本揭示案之一些態樣係關於包含TIL群體之細胞組合物，其中TIL群體包含(i)表現一或多種幹細胞樣標記物之第一TIL亞群(例如幹細胞樣TIL)及(ii)表現一或多種效應物樣標記物之第二TIL亞群(例如效應物樣TIL)，其中TIL群體包含與在對照培養基中培養之TIL群體相比較高百分比(即幹細胞樣TIL數/TIL總數)之表現一或多種幹細胞樣標記物之第一TIL亞群。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL產生該等細胞組合物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養之TIL具有增加的表現( 例如較高百分比之表現GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT及/或NKG7之TIL)及減少的表現( 例如較低百分比之表現IL-32之TIL)。NKG7最高之細胞已顯示為較佳殺手(Malarkannan等人，2020 Nat. Immuno.)，而IL-32較高之細胞已顯示具有活化誘導之細胞死亡(Goda等人，2006 Int. Immunol)。在一些態樣中，具有較高GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT及/或NKG7表現之TIL係表現效應物樣標記物之CD8+ TIL。在一些態樣中，具有較低IL-32表現之TIL係表現效應物樣標記物之CD8+ TIL。
本揭示案之一些態樣係關於細胞組合物，其包含表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL。本揭示案之一些態樣係關於細胞群體，其包含TIL， 例如表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL。在一些態樣中，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之細胞組合物包含表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL。
在一些態樣中，表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之TIL係T幹細胞/效應物(T SE)細胞。在一些態樣中，T SE細胞保持低分化狀態( 例如表現一或多種幹細胞樣標記物、能夠增殖、能夠分化或其任一組合)，且細胞具有效應功能( 例如表現一或多種效應物樣標記物、能夠靶向及/或殺傷腫瘤細胞或其組合)。在一些態樣中，本文所揭示之T SE細胞表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，本文所揭示之T SE細胞表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+及STAT3+。在一些態樣中，本文所揭示之T SE細胞表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。在一些態樣中，本文所揭示之T SE細胞表現CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、CD45RO 低、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+。本揭示案之一些態樣係關於包含一或多個T SE細胞之擴增TIL群體。在一些態樣中，至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約40%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約50%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約60%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約70%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約75%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約80%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約85%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約90%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約95%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約98%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，至少約99%之擴增TIL係T SE細胞。在一些態樣中，約100%之擴增TIL係T SE細胞。
在一些態樣中，TIL係經改造TIL。如本文所用之「經改造」TIL係指已以一定方式( 例如根據本文所揭示之方法)操縱、賦予TIL一或多種並非天然TIL所特有之物理及/或功能性質的TIL。舉例而言，在一些態樣中，經改造TIL可藉由修飾TIL以表現與細胞異源之一或多種蛋白質( 例如嵌合抗原受體或T細胞受體)來產生，以使得經改造TIL並非天然的。在一些態樣中，經改造TIL可藉由以特定方式(例如在高血鉀性培養基中培養)培養TIL來產生，其中所得經改造TIL具有一或多種在天然細胞中未顯示之物理及/或功能性質。
在一些態樣中，初始培養後之細胞組合物包含至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約10 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之細胞組合物包含約2 × 10 6至約10 × 10 6個、例如約2 × 10 6個、約3 × 10 6個、約4 × 10 6個、約5 × 10 6個、約6 × 10 6個、約7 × 10 6個、約8 × 10 6個、約9 × 10 6個或約10 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約2 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約3 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約3 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約4 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約4 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約5 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約5 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約6 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約6 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約7 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約7 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約8 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約8 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約9 × 10 6個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，初始培養後之組合物包含約9 × 10 6個細胞( 例如TIL)至約10 × 10 6個細胞( 例如TIL)。
在一些態樣中，第二TIL擴增後之細胞組合物包含至少約5 × 10 7個、至少約3 × 10 7個、至少約4 × 10 7個、至少約5 × 10 7個、至少約6 × 10 7個、至少約7 × 10 7個、至少約8 × 10 7個、至少約9 × 10 7個、至少約10 × 10 7個、至少約11 × 10 7個、至少約12 × 10 7個、至少約13 × 10 7個、至少約14 × 10 7個、至少約15 × 10 7個、至少約16 × 10 7個、至少約17 × 10 7個、至少約18 × 10 7個、至少約19 × 10 7個或至少約20 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之細胞組合物包含約5 × 10 7至約20 × 10 7個、例如約5 × 10 7個、約6 × 10 7個、約7 × 10 7個、約8 × 10 7個、約9 × 10 7個、約10 × 10 7個、約11 × 10 7個、約12 × 10 7個、約13 × 10 7個、約14 × 10 7個、約15 × 10 7個、約16 × 10 7個、約17 × 10 7個、約18 × 10 7個、約19 × 10 7個或約20 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約5 × 10 7至約6 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約6 × 10 7至約7 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約7 × 10 7至約8 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約8 × 10 7至約9 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約9 × 10 7至約10 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約10 × 10 7至約11 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約11 × 10 7至約12 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約12 × 10 7至約13 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約13 × 10 7至約14 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約14 × 10 7至約15 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約15 × 10 7至約16 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約16 × 10 7至約17 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約17 × 10 7至約18 × 10 7個細胞( 例如TIL)、約18 × 10 7至約19 × 10 7個細胞( 例如TIL)或約19 × 10 7至約20 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約5 × 10 7至約6 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約6 × 10 7至約7 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約7 × 10 7至約8 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約8 × 10 7至約9 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約9 × 10 7至約10 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約10 × 10 7至約11 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約11 × 10 7至約12 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約12 × 10 7至約13 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約13 × 10 7至約14 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約14 × 10 7至約15 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約15 × 10 7至約16 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約16 × 10 7至約17 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約17 × 10 7至約18 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約18 × 10 7至約19 × 10 7個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，第二擴增後之組合物包含約19 × 10 7至約20 × 10 7個細胞( 例如TIL)。
在一些態樣中，最終TIL擴增後之細胞組合物包含至少約40 × 10 9個、至少約50 × 10 9個、至少約60 × 10 9個、至少約70 × 10 9個、至少約80 × 10 9個、至少約90 × 10 9個或至少約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之細胞組合物包含約40 × 10 9至約100 × 10 9個、例如約40 × 10 9個、約50 × 10 9個、約60 × 10 9個、約70 × 10 9個、約80 × 10 9個、約90 × 10 9個或約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約40 × 10 9至約50 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約50 × 10 9至約60 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約60 × 10 9至約70 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約70 × 10 9至約80 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約80 × 10 9至約90 × 10 9個細胞( 例如TIL)或約90 × 10 9至約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約40 × 10 9至約50 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約50 × 10 9至約60 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約60 × 10 9至約70 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約70 × 10 9至約80 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約80 × 10 9至約90 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，最終擴增後之組合物包含約90 × 10 9至約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。
在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約2 × 10 9個、至少約3 × 10 9個、至少約4 × 10 9個、至少約5 × 10 9個、至少約6 × 10 9個、至少約7 × 10 9個、至少約8 × 10 9個、至少約9 × 10 9個或至少約1 × 10 10個或至少約10 × 10 10個或至少約15 × 10 10個或至少約20 × 10 10個或至少約25 ×10 10個或至少約30 × 10 10個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約2 × 10 9個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約5 × 10 9個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約9 × 10 9個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約1 × 10 10個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約10 × 10 10個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約20 × 10 10個CD8 +TIL。在一些態樣中，適於投與個體之細胞組合物包含至少約30 × 10 10個CD8 +TIL。
在一些態樣中，本文所揭示之方法產生組合物，其包含至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%活力之TIL。 IV. 治療方法
本揭示案之一些態樣係關於根據本文所揭示之任一方法培養之TIL群體。在一些態樣中，TIL係腫瘤浸潤T細胞。在一些態樣中，TIL包含CD4 +T細胞及CD8 +T細胞。在一些態樣中，TIL包含CD8 +T細胞。在一些態樣中，TIL富集腫瘤特異性TIL。在一些態樣中，TIL富集幹細胞樣TIL。
在一些態樣中，將包含TIL群體之組合物投與有需要之個體。在一些態樣中，將使用本文所揭示之方法製備之TIL投與個體來治療癌症， 例如腫瘤。在一些態樣中，治療方法包括向個體投與有效量之本揭示案之TIL組合物， 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或幹細胞樣TIL之TIL群體)的組合物。
本揭示案亦提供刺激個體對靶細胞群體或組織之T細胞介導之免疫反應的方法，其包括投與有效量之本揭示案之TIL組合物， 例如根據本文所揭示之方法製備之TIL群體， 例如富集CD8 +TIL之TIL群體。
在一些態樣中，以本揭示案之細胞組合物投與之TIL群體包含自體TIL。
在一些態樣中，該方法包括向個體投與至少約1 × 10 4個、至少約5 × 10 4個、至少約1 × 10 5個、至少約5 × 10 5個、至少約1 × 10 6個、至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個、至少約1 × 10 7個、至少約5 × 10 7個、至少約1 × 10 8個TIL。在一些態樣中，該方法包括向個體投與至少約1 × 10 4個、至少約5 × 10 4個、至少約1 × 10 5個、至少約5 × 10 5個、至少約1 × 10 6個、至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個、至少約1 × 10 7個、至少約5 × 10 7個、至少約1 × 10 8個、至少約1 × 10 9個、至少約2 × 10 9個、至少約3 × 10 9個、至少約4 × 10 9個、至少約5 × 10 9個、至少約6 × 10 9個、至少約7 × 10 9個、至少約8 × 10 9個、至少約9 × 10 9個、至少約1 × 10 10個、至少約10 × 10 10個、至少約15 × 10 10個、至少約20 × 10 10個、至少約25 ×10 10個或至少約30 × 10 10個細胞。在一些態樣中，細胞係TIL。在一些態樣中，TIL係CD8 +TIL。
在一些態樣中，該方法包括投與至少約10 × 10 9個、至少約20 × 10 9個、至少約30 × 10 9個、至少約40 × 10 9個、至少約50 × 10 9個、至少約60 × 10 9個、至少約70 × 10 9個、至少約80 × 10 9個、至少約90 × 10 9個或至少約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約10 × 10 9至約100 × 10 9個、例如約10 × 10 9個、約20 × 10 9個、約30 × 10 9個、約40 × 10 9個、約50 × 10 9個、約60 × 10 9個、約70 × 10 9個、約80 × 10 9個、約90 × 10 9個或約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約10 × 10 9至約20 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約20 × 10 9至約30 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約30 × 10 9至約40 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約40 × 10 9至約50 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約50 × 10 9至約60 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約60 × 10 9至約70 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約70 × 10 9至約80 × 10 9個細胞( 例如TIL)、約80 × 10 9至約90 × 10 9個細胞( 例如TIL)或約90 × 10 9至約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約10 × 10 9至約20 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約20 × 10 9至約30 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約30 × 10 9至約40 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約40 × 10 9至約50 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約50 × 10 9至約60 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約60 × 10 9至約70 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約70 × 10 9至約80 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約80 × 10 9至約90 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，該方法包括投與約90 × 10 9至約100 × 10 9個細胞( 例如TIL)。在一些態樣中，TIL係CD8 +TIL。
在一些態樣中，TIL係以至少約2:1、至少約2.5:1、至少約3:1、至少約3.5:1或至少約4:1之TIL對腫瘤細胞比率投與。在一些態樣中，TIL係以至少約2:1之TIL對腫瘤細胞比率投與。在一些態樣中，TIL係以至少約2.5:1之TIL對腫瘤細胞比率投與。在一些態樣中，TIL係以至少約3:1之TIL對腫瘤細胞比率投與。在一些態樣中，TIL係以至少約3.5:1之TIL對腫瘤細胞比率投與。在一些態樣中，TIL係以至少約4:1之TIL對腫瘤細胞比率投與。
在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，投與本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或幹細胞樣TIL))會減小個體之腫瘤體積。在一些態樣中，參考腫瘤體積係投與經改造細胞之前個體之腫瘤體積。在其他態樣中，參考腫瘤體積係未接受投與之相應個體之腫瘤體積。在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，個體之腫瘤體積在投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。
在一些態樣中，治療腫瘤包括減小個體之腫瘤重量。在一些態樣中，投與本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或幹細胞樣TIL))可在投與個體時減小個體之腫瘤重量。在一些態樣中，與參考腫瘤重量相比，腫瘤重量在投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，參考腫瘤重量係投與本揭示案之細胞組合物之前個體之腫瘤重量。在其他態樣中，參考腫瘤重量係未接受投與之相應個體之腫瘤重量。
在一些態樣中，將本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或幹細胞樣TIL))投與個體( 例如患有腫瘤)可增加個體之腫瘤及/或腫瘤微環境(TME)中TIL ( 例如CD8 +TIL)之數量及/或百分比。在一些態樣中，腫瘤及/或TME中TIL ( 例如CD8 +TIL)之數量及/或百分比與參考( 例如未接受本揭示案之細胞組合物之個體或投與本揭示案之細胞組合物之前的同一個體之相應值)相比，增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更大。
在一些態樣中，將本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或幹細胞樣TIL))投與個體( 例如患有腫瘤)相對於投與包含根據習用方法製備( 例如在不包含至少約40 mM至至少約90 mM、 例如至少50 mM之鉀離子濃度之培養基中培養)之細胞之相似細胞療法的個體免疫反應之持續時間，可增加個體免疫反應之持續時間。在一些態樣中，與參考( 例如投與包含根據習用方法製備( 例如在不包含至少50 mM鉀離子濃度之培養基中培養)之細胞之相似細胞療法的個體)相比，免疫反應之持續時間增加至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約100%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或至少約1000%或更大。在一些態樣中，與參考( 例如投與包含根據習用方法製備( 例如在不包含至少約40 mM至至少約90 mM、 例如至少50 mM鉀離子濃度之培養基中培養)之細胞之相似細胞療法的個體)相比，免疫反應之持續時間增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍或更大。
除上述外，投與本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或幹細胞樣TIL))可具有有助於腫瘤治療之其他效應。
如本文所述，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))可用於治療多種癌症類型， 例如衍生自包括以下之癌症之腫瘤：乳癌、頭頸癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎臟癌、胰臟癌、甲狀腺癌、食管癌、眼癌、胃(stomach、gastric)癌、胃腸癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。在一些態樣中，癌症包括實體腫瘤。在一些態樣中，癌症包括衍生自以下之實體腫瘤：黑色素瘤、結腸癌、肺癌、子宮頸癌、胃腸癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰臟癌、頭頸部小細胞癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、睪丸生殖細胞腫瘤、胃腺癌、皮膚黑色素瘤、間皮瘤、腎透明細胞癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、浸潤性乳癌、腎乳頭狀細胞癌、結腸腺癌或其任一組合。在一些態樣中，癌症包括黑色素瘤。在一些態樣中，癌症包括結腸直腸癌。在一些態樣中，癌症包括結腸癌。在一些態樣中，癌症包括胰臟癌。在一些態樣中，癌症包括頭頸癌。在一些態樣中，癌症包括子宮頸癌。在一些態樣中，癌症包括卵巢癌。在一些態樣中，癌症包括肺癌。在一些態樣中，癌症包括胃腸癌。在一些態樣中，癌症包括乳癌。在一些態樣中，癌症包括前列腺癌。在一些態樣中，癌症包括肝癌。在一些態樣中，癌症包括骨癌。在一些態樣中，癌症包括頭頸部小細胞癌。在一些態樣中，癌症包括肺鱗狀細胞癌。在一些態樣中，癌症包括肺腺癌。在一些態樣中，癌症包括胰腺癌。在一些態樣中，癌症包括頭頸部鱗狀細胞癌。在一些態樣中，癌症包括睪丸生殖細胞腫瘤。在一些態樣中，癌症包括胃腺癌。在一些態樣中，癌症包括皮膚黑色素瘤。在一些態樣中，癌症包括間皮瘤。在一些態樣中，癌症包括腎透明細胞癌。在一些態樣中，癌症包括子宮頸鱗狀細胞癌。在一些態樣中，癌症包括子宮頸內腺癌。在一些態樣中，癌症包括食管癌。在一些態樣中，癌症包括膀胱尿路上皮癌。在一些態樣中，癌症包括浸潤性乳癌。在一些態樣中，癌症包括腎乳頭狀細胞癌。在一些態樣中，癌症包括結腸腺癌。在一些態樣中，癌症包括子宮癌。在一些態樣中，癌症包括腦癌。在一些態樣中，癌症包括甲狀腺癌。在一些態樣中，癌症包括食管癌。在一些態樣中，癌症包括眼癌。在一些態樣中，癌症包括胃(stomach、gastric)癌。在一些態樣中，癌症包括胃腸癌。在一些態樣中，癌症包括肉瘤。在一些態樣中，癌症包括白血病。在一些態樣中，癌症包括淋巴瘤。在一些態樣中，癌症包括骨髓瘤。
因此，本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之黑色素瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之結腸直腸癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之結腸癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之胰臟癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之頭頸癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之子宮頸癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之卵巢癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之肺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之胃腸癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之乳癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之前列腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之肝癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之骨癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之頭頸部小細胞癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之肺鱗狀細胞癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之肺腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之胰腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之頭頸部鱗狀細胞癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之睪丸生殖細胞腫瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之胃腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之皮膚黑色素瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之間皮瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之腎透明細胞癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之子宮頸鱗狀細胞癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之子宮頸內腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之食管癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之膀胱尿路上皮癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之浸潤性乳癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之腎乳頭狀細胞癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之結腸腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之子宮癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之腦腫瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之食管癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之甲狀腺癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之眼癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之胃(stomach、gastric)癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之胃腸癌之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之肉瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之白血病之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之淋巴瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體之骨髓瘤之方法，其包括向個體投與本文所揭示之細胞組合物。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))可與其他治療劑( 例如抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在一些態樣中，治療本文所揭示腫瘤之方法包括投與本揭示案之細胞組合物與一或多種其他治療劑之組合。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))可與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多個元件。在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點抑制劑( 即阻斷經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。
可用於本發明方法中之免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括CTLA-4拮抗劑( 例如抗CTLA-4抗體)、PD1拮抗劑( 例如抗PD1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑( 例如抗TIM-3抗體)或其組合。在一些態樣中，檢查點抑制劑係PD1拮抗劑。在一些態樣中，檢查點抑制劑係抗PD1抗體。組合治療之全面及非限制性清單詳細揭示於本申請案別處。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係在投與其他治療劑之前或之後投與個體。在其他態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與其他治療劑同時投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))及其他治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物同時投與。在其他態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))及其他治療劑係作為單獨組合物同時投與。
在一些態樣中，個體係非人類動物，例如大鼠或小鼠。在一些態樣中，個體係人類。
在一些態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))可與其他治療劑( 例如抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在一些態樣中，治療本文所揭示腫瘤之方法包括向個體投與本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))與一或多種其他治療劑之組合。該等劑可包括例如化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任一組合。
在一些態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))可與標準護理治療( 例如手術、輻射及化學療法)組合使用。本文所述之方法亦可用作維持療法， 例如意欲防止腫瘤發生或復發之療法。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))可與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多個元件。該等組合之非限制性實例包括：增強腫瘤抗原呈遞之療法( 例如樹突細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod))； 例如藉由抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路徑及/或清除或阻斷Treg或其他免疫抑制細胞( 例如骨髓源性抑制細胞)來抑制負免疫調控之療法； 例如使用刺激CD-137、OX-40及/或CD40或GITR路徑及/或刺激T細胞效應功能之促效劑來刺激正免疫調控之療法；增加全身性抗腫瘤T細胞頻率之療法； 例如使用CD25拮抗劑( 例如達利珠單抗(daclizumab))或藉由 離體抗CD25珠粒清除來清除或抑制Treg (例如腫瘤中之Treg)之療法；影響腫瘤中之抑制骨髓細胞功能之療法；增強腫瘤細胞之免疫原性之療法( 例如蒽環)；另一授受性T細胞或NK細胞轉移，包括經遺傳改造之細胞， 例如經改造以表現嵌合抗原受體之細胞的CAR-T療法)；抑制代謝酶(例如吲哚胺雙加氧酶(IDO)、雙加氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法；逆轉/防止T細胞無反應性或耗竭之療法；觸發腫瘤位點之先天性免疫活化及/或發炎之療法；投與免疫刺激細胞介素；阻斷免疫阻抑性細胞介素；或其任一組合。
在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點抑制劑( 即阻斷經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。可用於本發明方法中之免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括CTLA-4拮抗劑( 例如抗CTLA-4抗體)、PD1拮抗劑( 例如抗PD1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑( 例如抗TIM-3抗體)或其組合。該等免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括以下：抗PD1抗體( 例如尼沃魯單抗(nivolumab，OPDIVO ®)、派姆單抗(pembrolizumab，KEYTRUDA ®；MK-3475)、匹利珠單抗(pidilizumab，CT-011)、PDR001、MEDI0680 (AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224 (GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210及其組合)；抗PD-L1抗體( 例如阿替珠單抗(atezolizumab，TECENTRIQ ®；RG7446；MPDL3280A；RO5541267)、德瓦魯單抗(durvalumab，MEDI4736、IMFINZI ®)、BMS-936559、阿維魯單抗(avelumab，BAVENCIO ®)、LY3300054、CX-072 (Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105及其組合)；及抗CTLA-4抗體( 例如伊匹單抗(ipilimumab，YERVOY ®)、曲美木單抗(tremelimumab，替西莫單抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015及其組合)。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與PD1拮抗劑組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與抗PD1抗體組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與尼沃魯單抗組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與派姆單抗組合投與個體。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與PD-L1拮抗劑組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與抗PD-L1抗體組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與阿替珠單抗組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與德瓦魯單抗組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與阿維魯單抗組合投與個體。
在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與CTLA-4拮抗劑組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與抗CTLA-4抗體組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與伊匹單抗組合投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與曲美木單抗組合投與個體。
在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點活化劑( 即促進經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。在一些態樣中，免疫檢查點活化劑包括OX40促效劑( 例如抗OX40抗體)、LAG-3促效劑( 例如抗LAG-3抗體)、4-1BB (CD137)促效劑( 例如抗CD137抗體)、GITR促效劑( 例如抗GITR抗體)、TIM3促效劑( 例如抗TIM3抗體)或其組合。在一些態樣中，其他治療劑包括細胞介素。在一些態樣中，細胞介素包括IL-2、Il-21、Il-7、Il-15或其任一組合。
在一些態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係在投與其他治療劑之前或之後投與個體。在其他態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與其他治療劑同時投與個體。在一些態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))及其他治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物同時投與。在其他態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))及其他治療劑係作為單獨組合物同時投與。在一些態樣中，本文所揭示之其他治療劑及細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係依序投與。
在一些態樣中，本文所揭示之細胞組合物( 例如包含根據本文所揭示之方法製備之TIL群體( 例如富集CD8 +TIL、幹細胞樣TIL、腫瘤特異性TIL及/或原初TIL))係與檢查點抑制劑(例如抗PD1抗體)組合投與個體。在一些態樣中，細胞組合物係在檢查點抑制劑(例如抗PD1抗體)之前投與。在一些態樣中，細胞組合物係在檢查點抑制劑(例如抗PD1抗體)之後投與。
在一些態樣中，在接受細胞組合物之前向個體投與淋巴清除療法。任一淋巴清除療法可用於本文所揭示之方法中。在一些態樣中，淋巴清除療法包含化學療法。在一些態樣中，淋巴清除療法包含環磷醯胺。在一些態樣中，淋巴清除療法包含氟達拉濱。在一些態樣中，淋巴清除療法包含環磷醯胺及氟達拉濱。在一些態樣中，淋巴清除療法係在細胞組合物之前至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天或至少約14天投與。 實例 實例 1. 方法
培養基製備：向T細胞條件化培養基(TCM)補充免疫細胞血清替代物(Thermo Fisher)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)、2 mM Glutamax (Gibco)、MEM非必需胺基酸溶液(Gibco)、丙酮酸鈉(Gibco)、IL-2, 200 IU/mL；IL-7 ,120 IU/ml；IL-15, 20 IU/ml。
對於低滲條件化培養基，藉由添加不含NaCl、葡萄糖及鈣之RPMI來調整含有不同濃度之鈉、鉀、葡萄糖及鈣之TCM培養基。將所定義不含NaCl之RPMI添加至TCM後，最終濃度介於以下範圍內：NaCl (40-80 mM)、KCl (40-80 mM)、鈣(0.5-2.8 mM)、葡萄糖(10-24 mM)及滲透壓(約250-260 mOsmol)。 參見 表 1。 表 1.含有不同濃度之鉀、鈉、葡萄糖及鈣之低滲條件化培養基
培養基 K (mM) NaCl (mM) 葡萄糖 (mM) Ca (mM) 滲透壓 (mOsmol) 張力 * (mOsmol)
基礎培養基 4 118.47 約24 mM 約2.8 mM 245 245
高K 80 mM 55.6 mM 15 mM 1.2 mM 約262.26 271.2
高K 75 59.3 15.4 1.3 約260 268.6
高K 70 63.9 15.9 1.4 約259.7 267.8
高K 65 67.6 16.3 1.5 約257.5 265.2
高K 60 72.2 16.8 1.6 約257.2 264.4
高K 55 76 17.2 1.7 約255.2 262
高K 50 80.5 17.7 1.8 約254.7 261
RPMI Gibco + ICSR 5.34 103 11.1 0.4 216.7
RPMI 1640 + 50 mM K+ 55.34 103          316.7
*張力係基於下式計算：2 × (K之濃度 + NaCl之濃度)
吾人亦藉由用不同鉀濃度維持恆定張力條件(250 mOsmol -低滲，280 mOsmol -等滲，320 mOsmol -高滲)來測試張力對T細胞之效應。低滲條件中之最終濃度為NaCl (35-75 mM)、KCl (50-90 mM)，等滲條件中之最終濃度為NaCl (50-90 mM)、KCl (50-90 mM)，高滲條件中之最終濃度為NaCl (70-110 mM)、KCl (50-90 mM)。 參見 表 2。 表 2.含有不同濃度之鉀及NaCl之低滲、等滲、高滲溶液
張力 * mOsmol K (mM) NaCl (mM)
低滲 250 50 75
60 65
70 55
80 45
90 35
等滲 280 50 90
60 80
70 70
80 60
90 50
高滲 320 50 110
60 100
70 90
80 80
90 70
* 張力係根據下式計算：張力 = ([K] + [NaCl]) × 2 其中「[K]」係培養基之鉀濃度且「[NaCl]」係培養基之氯化鈉濃度。
細胞培養及轉導：在T細胞條件化培養基-TCM、基礎培養基或低滲條件化培養基中用TransAct (Miltenyi)活化健康供體冷凍保存之人類CD4及CD8細胞。在TCM、基礎培養基或低滲條件化培養基中活化24小時後，用慢病毒粒子轉導T細胞以在Grex板(Wilson Wolf)中引入嵌合抗原受體(抗CD19 CAR)。在轉導後第二天，向T細胞補充新鮮培養基以稀釋TransAct且結束T細胞活化。端視細胞生長及密度，藉由抽出Grex板中之一半培養基向T細胞進給溫熱的2×細胞介素培養基。在第7天，將細胞收穫，計數且藉由流式細胞術分析幹性標記物之表現。
細胞內細胞介素分析：在第7天，將T細胞洗滌且置於對照培養基中並使其在布雷菲德菌素(brefeldin) A存在下經受5小時的豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)及離子黴素(ionomycin)再刺激以量測細胞內細胞介素IL-2、IFNγ及TNFα。在含有可固定活/死溶液之FACS緩衝液中用表面抗體染色對T細胞染色。在固定及透化後，用針對細胞內細胞介素之各別抗體對細胞染色。使用流式細胞術評價細胞內細胞介素表現之量化。
經由流式細胞術量測幹性表型 CAR 表現：在第7天，經由流式細胞術評價來自各別治療之活T細胞。首先用細胞染色緩衝液洗滌細胞且用抗CCR7在37℃下染色15分鐘。此後，將針對若干其他抗原之抗體(如下文所詳述)之2×主混合物添加至細胞中且在4℃下培育20分鐘。用細胞染色緩衝液洗滌細胞且用foxp3染色套組(ebioscience)根據製造商之方案透化。固定後，將細胞針對TCF7在4℃下染色20分鐘，此後藉由aurora (cytek)上之流式細胞術分析細胞。以下係用於評價幹性標記物之抗體之清單：CD8 (BD-#563795)、CD4 (BD-# 612936)、CD27 (BD-#612829)、CD3 (Thermo-# 612893)、CD28 (Biolegend- #302936)、CD62L、CAR-EGFR (Thermo-#352911)、CD45RO (BD#564290)、CD39 (Biolegend- #328236)、TCF7 (Cell signaling - #14456)、CCR7 (BD-#562381)、CD127 (Bio legend- #351324)、CD45RA (BD-#560673)。 實例 2. 製備培養基及培養 TIL 之方法
對照培養基：市售T細胞培養基( 例如CTS™ OpTimizer™、IMMUNOCULT™或TEXMACS™)。
代謝再程式化培養基 ( 「 MRM 」 )：使用不含NaCl之T細胞培養基來調整T細胞培養基之無機鹽離子濃度。MRM之最終濃度為以下：NaCl (40-80 mM)、KCl (40-90 mM)、鈣(0.5-2.8 mM)、葡萄糖(10-24 mM)及滲透壓(約250-340 mOsmol)。
用於初始培養以及二次及最終 TIL 擴增之 TIL 培養基製備：向 對照培養基或MRM補充2.5%血清補充物(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher)、2 mM L-麩醯胺酸(Gibco)、2 mM L-glutamax (Gibco)、MEM非必需胺基酸溶液(Gibco)、Pen-strep (Gibco)、20μg/ml fungin™ (InvivoGen)、丙酮酸鈉(Gibco)及1 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽(Sigma)。
初始 TIL 培養：圖1係大體上繪示本文所述培養TIL之方法之某些態樣之示意圖。將平均大小為1-10 mm 3之自多個腫瘤類型(結腸癌、肺癌、肝細胞癌、腎癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤及前列腺癌)手術切除之多個腫瘤接種於24孔板中之2 ml如上文所述之對照培養基或MRM中，二者皆補充有IL-2 (300 ng/mL)及IL-21 (30 ng/ml)。在熱夾套培育器中在含有5% CO 2之37℃培育器中培養腫瘤片段直至可見群落形成。每3天補足補充有IL-2 (300 ng/mL)及IL-21 (30 ng/ml)之新鮮培養基(對照或MRM)，此端視細胞之生長而定。此方法在初始培養結束時產生約2×10 6-10×10 6個細胞/片段之產量。使用於分析之細胞亞組通過40 µm篩濾器且使用多色彩流式細胞術使用多種生物標記物(包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA及TCF7)進行表型分型。
二次 TIL 擴增：當來自初始培養之細胞產量達到約2×10 6-10×10 6個細胞/所培養片段時(通常在約第14天至第19天)，藉由添加1:100 T細胞TRANSACT TM(Miltenyi Biotec)、5 µg/ml重組人類CD27配位體(R&D systems)及1 µg/ml重組人類4-1BB配位體/TNFSF9 (R&D systems)刺激在對照培養基或MRM中培養之TIL，兩種培養基皆補充有IL-2 (73.6 ng/ml)、IL-21(10 ng/ml)及IL-15 (0.4 ng/ml)。將細胞維持在培養物中直至獲得約5×10 7至20×10 7個細胞(在刺激後約7至11天)。在二次擴增時段結束時，使用多色彩流式細胞術使用多種生物標記物(包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA及TCF7)分析TIL。僅分析活細胞及CD3 +細胞。
最終 TIL 擴增：當培養物達到約5×10 7至20×10 7個細胞之產量時，將在對照培養基或MRM中培養之TIL轉移至補充有IL-2 (73.6 ng/ml)、IL-21(10 ng/ml)及IL-15 (0.4 ng/ml)之新鮮對照培養基。用1:100 TRANSACT TM(Miltenyi Biotec)、5μg/ml重組人類CD27配位體(R&D systems)及1μg/ml重組人類4-1BB配位體/TNFSF9 (R&D systems)第二次刺激TIL。在靜態GREX或攪拌罐中培養細胞直至達成約10×10 9-100×10 9個細胞/片段之產量(約14天)且用多色彩流式細胞術分析多種生物標記物，包括CD62L、CD27、CD28、CD45RO、CD39、TIM3、CD127、PD1、CD103、CD45RA及TCF7。為檢查細胞之多功能性，用PMA/離子黴素(1:500)將所得TIL刺激4小時且使用以下標記物實施細胞內染色：CD4、CD8、CD27、IL2、IFNγ、TNFα及TCF7。僅分析活細胞及CD3 +細胞。 實例 3. MRM 可擴增 CD8+ 、腫瘤反應性、低分化 TIL
使TIL如實例1中所述生長(圖1)。初始TIL培養(即14天)後，實施多參數流式細胞術以量化存在於細胞培養物中之CD4 +TIL及CD8 +TIL之百分比。與在對照培養基中培養之細胞相比，在MRM中培養之細胞顯著富集約20%-80%之CD8 +TIL (圖2A-2C及未顯示之數據)。儘管CD4 +TIL能夠根除實體腫瘤，但針對腫瘤之優異的細胞溶解活性主要由CD8 +TIL調介。腫瘤細胞主要表現I類MHC相關之腫瘤抗原，該等I類MHC相關之腫瘤抗原由CD8 +TIL識別。因此，在TIL療法輸注產品中具有較大的CD8+ TIL比例在治療上係有益的。與在對照培養基中培養之TIL相比，使用MRM培養TIL意外地富集CD8+ TIL (圖2C)。
在MRM中在初始培養結束時(約第14天)獲得之TIL亦展示腫瘤反應性TIL之若干細胞表面標記物( 例如CD39、CD103、CD226及/或PD1)之一致表現。與在對照培養基中培養之TIL相比，MRM中之初始培養產生CD39及PD1表現增強(大於20%)之TIL (圖2A-2B)。先前所用之方法顯示，PD1表現在PD1亞組中在初始TIL培養期間完全喪失，此指示腫瘤反應性TIL之不期望喪失(參見例如Poschke等人，Oncoimmunology 5(12):e1240859 (2016)；及Gros等人， JCI 124(5):2246-59(2014))。吾人觀察到，在T細胞刺激後維持PD1表現依賴於供體(數據未顯示)。對腫瘤反應性之其他標記物(包括CD39及CD103)之表現獲得相似之結果( 參見圖2A-2B及圖5A-5B及未顯示之數據)。然而，在整個TIL過程中維持在第14天時觀察到之純系譜(數據未顯示)。
在MRM中培養之CD4 +TIL及CD8 +TIL中，吾人亦觀察到PD1 (指示腫瘤反應性代謝狀態)及CD27之共表現(圖3A-3E)。在原初及記憶定型T細胞上組成型表現之CD27表現指示T細胞之幹細胞樣表型。先前報導指示，CD27表現在CD8 +T細胞中在T細胞刺激後之細胞擴增期間減少(參見例如Tran等人， J. Immunotherapy 31(8):742-51 (2008)；及Rosenberg等人， Clinical Cancer Research 17(13):4550-557 (2011)；Huang等人， J. Immunology 176(12):7726-35 (2006))。相反，本文所揭示之在MRM中培養之TIL在整個培養過程中保持CD27表現，此允許選擇性擴增幹細胞樣腫瘤反應性純系。如預期，並非所有CD27 +細胞皆在第14天時共表現PD1，此指示並非所有幹細胞樣細胞皆展示腫瘤反應性代謝狀態。
TIL之抗腫瘤功能及存活依賴於由TCR、細胞介素及共刺激受體接收之合併信號。該等信號中任一者之不充分暴露將導致TIL之無反應性及萎縮。先前所用之培養及擴增TIL之方法導致TIL中之CD27表現損失。然而，已顯示，在輸注產品中維持CD27表現之TIL (例如在最小擴增之TIL中)與授受性T細胞療法後之腫瘤消退相關(參見例如Tran等人， J. Immunotherapy 31(8):742-51 (2008)；及Rosenberg等人， Clinical Cancer Research 17(13):4550-557 (2011))。另外，共刺激受體( 例如CD27及CD28)之表現升高與 活體內治療功效相關(Tran等人， J. Immunotherapy 31(8):742-51 (2008)；Geltink等人，Cell 171, 385-397 (2017))。該等共刺激受體之表現亦與年輕TIL培養物相關聯之幹性及較長端粒長度相關。與先前所用之方法(例如對照培養基)相反，使用本文所述之MRM使具有CD27及CD28表現之TIL富集至若干腫瘤類型之TIL總數的約20%至約80% (圖4及未顯示之數據)。CD27及CD28之富集並非CD8 +T細胞亞組所獨有，且亦在CD4 +亞組中觀察到(數據未顯示)。
CD27及CD62L之表現與低分化T細胞相關聯且與將T細胞有效輸送至腫瘤組織及淋巴結相關。CD27、CD28及CD62L之表現亦與較長端粒長度相關，端粒長度間接與TIL之年齡及 活體內治療功效相關(參見例如Tran等人， J. Immunotherapy 31(8):742-51 (2008)；及Rosenberg等人， Clinical Cancer Research 17(13):4550-557 (2011))。然而，如本文所揭示在MRM中培養之TIL在整個過程中維持CD27及CD62L表現，此與最小培養之TIL之CD27及CD62L表現相似。吾人觀察到與在對照培養基中培養之CD27及CD62L表現相比，在MRM中培養之TIL中CD27及CD62L表現增加約50% (數據未顯示)。
認為調介免疫檢查點阻斷後之腫瘤消退之腫瘤反應性純系衍生自表現PD1及轉導因子TCF-7之CD8 +T細胞(Im等人， Nature537:417-21 (2016)；及Feldman等人， Cell 175(4):998-1013 (2018))。本文所揭示在MRM中培養之TIL展示腫瘤反應性TIL生物標記物(PD1及CD103)之富集，同時TCF7表現水準高4倍至50倍(圖5A-5C、圖6D、圖6H、圖10)。TCF7之表現指示更多幹細胞樣細胞。儘管表現PD1，但該等細胞在進一步刺激後保留增殖能力且維持低分化細胞(圖6A-6H)。 實例 4 ： MRM 保持 TIL 之腫瘤反應性
腫瘤在自然界中係異質的且通常含有諸如KRAS、P53及BRAF (公共新抗原)之基因之常見突變。如本文所揭示之使用MRM之方法富集識別該等新抗原之TIL。
自患有胰腺癌(其係主要具有含KRAS G12V、KRAS G12C及KRAS G12D突變之腫瘤細胞之癌症)之患者獲得腫瘤切除物。將上文所提及KRAS熱點突變之HPLC純化之9聚體、10聚體及25聚體肽純化且用於對自患者匹配之外周血單核球產生之不成熟樹突細胞(DC)進行脈衝。將該等肽匯集物脈衝之DC與自同一胰腺癌患者獲得之TIL共培養且根據上文實例中所述之方法培養。在MRM中培養TIL導致約30%之CD8 +T細胞與CD27、CD28、PD1及TCF-7顯著共表現 (圖7A-7H)。該等結果指示，本文所揭示之MRM保持識別公共抗原之腫瘤反應性TCR純系。
如預期，用野生型KRAS肽進行脈衝之TIL未產生KRAS特異性TIL之特異性擴增。然而，吾人一致地觀察到在MRM中培養之TIL之CD27、CD28、PD1及TCF7表現增加。該等結果指示，在MRM中培養細胞保持識別公共新抗原之TIL之生長及增殖(圖8A-8H)。
在此擴增過程期間維持CD8 +TIL及與腫瘤反應性相關之標記物(CD39及PD1)之優先富集(圖9A-9B)。該等結果顯示，MRM甚至在初始培養後仍進一步增強腫瘤反應性TIL中之PD1表現。另外，根據本文所揭示之方法在MRM中培養之TIL展現TCF7表現增加50倍以上，如藉由qPCR所量測(圖10)。該等數據與TCF7之作用一致，TCF7係再刺激後TIL之自我更新及增殖爆發所需之主轉錄調控劑。
據報導，TIL中CD103之表現與具有高突變抗原負荷之腫瘤中之TIL浸潤相關聯。除CD39及PD1表現外，吾人之數據證實，在MRM中擴增TIL會增加PD1 +CD39 +CD103 +細胞之數量(圖11A-11L)，同時亦增加幹性相關基因之表現。因此，在MRM中培養TIL可足以增加所得擴增之細胞產物中具有腫瘤反應性及高幹細胞樣細胞比例之細胞數。
本文所呈現之數據證實，在MRM中擴增TIL產生不僅幹性增加、且與腫瘤反應性相關之若干細胞表面標記物之表現亦增加的細胞群體。使用MRM之本文所述方法產生具有改良之治療產品之特徵及性質之TIL。 實例 5. 治療方法
用於輸注之TIL衍生自患者之自原發性或轉移性腫瘤或淋巴結切除之腫瘤。如上文實例1中所述，藉由將小腫瘤片段(約1-10 mm 3)平鋪於含有MRM之24孔板中來起始TIL培養。使該等片段生長直至獲得約2 × 10 6至約10 × 10 6個細胞/腫瘤片段(通常約2-3週)。將所有片段之所得細胞匯集且以2 × 10 6/孔之密度平鋪用於T細胞刺激，例如藉由添加TRANSACT™及視情況地CD27促效劑、41BB促效劑及/或OX-40促效劑。將細胞維持於培養物中直至獲得約5 × 10 7至約20 × 10 7個細胞。例如使用TRANSACT™及視情況地CD27促效劑、41BB促效劑及/或OX-40促效劑進一步刺激該等細胞以達成輸注產品之細胞數之約1000-2000倍增加(約1-150 × 10 9個TIL)。
在投與TIL輸注產品之前，向患者投與例如包含環磷醯胺及氟達拉濱之淋巴清除治療。除TIL輸注外，患者亦可在輸注如本文所揭示培養之TIL後接受抗PD1檢查點抑制劑(例如派姆單抗或尼沃魯單抗)。 實例 6. 純系多樣性之分析
為評價根據上文所揭示之方法在MRM中培養之TIL之純系多樣性，在對照培養基或代謝再程式化培養基(MRM)中培養腫瘤片段及自腫瘤片段獲得之TIL。使用DNeasy血液及組織套組(QIAGEN)自腫瘤及TIL樣品分離總基因體DNA且使用用於TCRβ及CDR3區域之Immuno-seq (Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)進行測序。
藉由辛普森純系性√∑pi2評價樣品之多樣性度量，其中 pi係給定樣品中純系 i之比例豐度。在腫瘤片段(「腫瘤」)、在對照培養基中培養之TIL (「對照」)及在MRM中培養之TIL (「MRM」)中檢查辛普森純系性及生產性重排(圖12)。在MRM中培養之TIL (擴增後)展示約0.04之辛普森純系性，此指示高純系多樣性，與在腫瘤片段中所見相似(圖12)。維持TCRβ多樣性代表保持浸潤腫瘤且具腫瘤反應性之TIL純系型。相反，在對照培養基中培養之TIL明顯丟失純系多樣性且展示約0.4之辛普森純系性(即明顯不太多樣之純系性，此指示許多腫瘤反應性純系在使用對照培養基之培養過程中丟失) (圖12)。
使用圖12中所呈現之數據產生差異豐度(DA)繪圖(ImmunoSeq, Adaptive Biotechnolgies)。該DA分析計算任一對樣品之TCR重疊(參見例如Emerson等人， J. Path.(2013)，其全文皆以引用方式併入本文中)、莫氏指數(Morisita’s Index)及雅卡爾指數(Jaccard Index)。該等繪圖顯示，與腫瘤對在MRM中擴增之TIL (圖13B)相比，純系之差異豐度在腫瘤對在對照培養基中擴增之TIL之間顯著不同(圖13A)。
與在對照培養基中培養之TIL相比，存在於腫瘤片段中之TIL譜在MRM過程中培養之TIL中高約4倍。在擴增時，TIL通常被具有優先增殖潛能之罕見純系型超越(該等純系在圖13A-13B中顯示沿y軸擴增)。相反，在MRM中培養之TIL顯示存在於腫瘤中之廣譜純系型之顯著較佳之保持及擴增。TIL群體之純系多樣性之保持及擴增對有效療法之最佳化至關重要。
為進一步分析TIL純系多樣性，比較初始腫瘤消化物中之前50種最具優勢之普遍TCR與在對照培養基對MRM中擴增之TIL。在MRM中培養保持優勢( 即普遍)及稀有TIL純系型。圖13D中之細胞系密度顯示，在MRM中擴增之大多數T細胞純系識別腫瘤抗原，而其在對照培養基中培養之T細胞純系中不識別腫瘤抗原(圖13C)。與在對照培養基中培養之T細胞純系相比，大多數優勢腫瘤純系係由在MRM中擴增之T細胞純系識別，如藉由圖13D之虛線上方之連接所指示(圖13C)。在前50種優勢腫瘤TCR中，與57%保持在MRM中培養之TIL中(圖13D)相比，2%保持在對照培養基中培養之TIL中(圖13C)。該等數據證實，MRM擴增之TIL比在對照培養基中擴增之TIL保留更真實的初始腫瘤TCR純系型表示。 實例 7. MRM 保持 TIL 之腫瘤反應性
評估使用本文所述之方法產生之TIL保持KRAS突變體反應性之能力。將在對照培養基或MRM中擴增之TIL與已用突變體KRAS肽進行脈衝之自體樹突細胞(DC)混合。10天後，使用DNeasy血液及組織套組(Qiagen)自TIL分離總基因體DNA且使用用於TCRβ及CDR3區域之Immuno-seq (Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)對TCR-Vb CDR3基元測序並分析。圖14顯示，在MRM中培養之TIL保持KRAS突變體反應性，而在對照培養基中培養之TIL無法保持KRAS突變體反應性。具體而言，在MRM中培養之TIL共享與在來自腫瘤片段之TIL中所見相似的CDR3胺基酸基元。在對照培養基中培養之TIL中未偵測到該等基元。因此，數據顯示，在MRM中培養保持原始腫瘤片段中所代表之TIL純系型。 實例 8. 使用 MRM 產生之 TIL 展示增加的腫瘤識別及腫瘤殺傷
獲得自黑色素瘤獲得之TIL且用如上文所述之對照培養基或MRM擴增。自體腫瘤細胞系衍生自與TIL相同之黑色素瘤樣品。簡言之，藉由酶消化黑色素瘤片段(使用膠原酶及DNAse)、平鋪所得單細胞懸浮液、然後使長出之細胞連續傳代來產生黑色素瘤細胞系。評價衍生自黑色素瘤之TIL因應黑色素瘤源性細胞系產生發炎性細胞介素之能力。將使用對照培養基或MRM產生之TIL與自體黑色素瘤細胞系共培養24小時。將來自自體黑色素瘤細胞系之100,000個腫瘤細胞平鋪於48孔板中之300 ul完全RPMI培養基(含有10% FBS)中且培育過夜。第二天，去除上清液且添加TIL (在腫瘤細胞不存在下平鋪一些TIL作為對照)。24 hr後，自孔收集培養基上清液且使用MSD量測所分泌干擾素γ及TNF-α。另外，將用MRM產生之TIL在對照培養基中培育過夜，且藉由MSD評價IL-2分泌。該等數據顯示，根據發炎細胞介素產生，使用MRM擴增之TIL展現顯著增加的對自體腫瘤細胞有反應之能力( 圖 15A-15B)。另外，使用MRM產生之TIL在穩態且無刺激下分泌顯著更多之IL-2，此指示該等細胞更適合。
亦評價衍生自黑色素瘤之TIL殺傷黑色素瘤源性細胞系之能力。藉由用胰蛋白酶剝離腫瘤細胞並藉由流式細胞術對活細胞計數來評價在共培養後剩餘之活腫瘤細胞數。基於此活腫瘤細胞計數，計算TIL之腫瘤殺傷% (正規化至未經歷TIL共培養之腫瘤細胞孔)。使用MRM產生之TIL顯示顯著較佳之殺傷腫瘤細胞之能力( 圖 15C)。
如上文所述重複上述實驗重複，然而，用W6/32抗體處理一些孔以阻斷I類HLA相互作用。 圖 15D展示，使用MRM產生之TIL識別自體腫瘤細胞依賴於I類HLA相互作用，此乃因阻斷I類會消除干擾素γ產生之增加。 實例 9. 離體腫瘤細胞之 TIL 清除率
將患者自體黑色素瘤腫瘤細胞以10,000個細胞/孔平鋪於xCELLigence阻抗分析孔板中。第二天，將在對照培養基或MRM中擴增之匹配TIL以不同的效應T細胞(E)對腫瘤細胞(T)比率(包括1:1、2:1及4:1)添加至板中。隨時間監測腫瘤細胞之TIL清除率。 圖 16顯示，在一系列相對劑量下，與在對照培養基中培養之TIL相比，在MRM中培養之TIL在 離體分析中展示優異的腫瘤細胞溶解，其中在MRM中培養之效應T細胞對腫瘤細胞之4:1比率產生完全腫瘤根除。 實例 10. 離體腫瘤細胞之 TIL 清除率
比較遵循標準TIL擴增方法產生之非小細胞肺癌(NSCLC) TIL與根據本文所揭示之方法在MRM中產生之TIL。儘管對照製程產生之TIL高度富集CD8+ T細胞，但該等細胞並不富集幹細胞樣CD8+CD39-CD69- T細胞群體，且表現低水準之中央記憶標記物及共刺激受體CD27 (圖17A-17D)。對照擴增製程產生具有富集之幹細胞樣CD8+CD39-CD69- T細胞及較高共刺激受體CD27表現之T細胞產物，但導致CD8+ T細胞之擴增減少。在MRM中培養之TIL產生具有增強的CD8+CD39-CD69-幹細胞樣T細胞豐度、中央記憶標記物(CD45RO+CD62L+)及顯著較高之共刺激受體CD27表現的高度富集之CD8+ T細胞群體(圖17E-17H)。該等標記物共同證實與臨床反應相關聯之幹細胞樣細胞之屬性。
具有增強的幹細胞樣性質(包括保留關鍵共刺激受體CD27、端粒延長、記憶細胞表型及存在富集有CD39 -/CD69 -CD8 +T細胞之細胞群體)之TIL產物與改良之臨床反應相關。T細胞之其他分化狀態相關之特徵(包括分泌多功能細胞介素及表現共刺激受體CD28之能力)亦與抗腫瘤效力相關聯。在MRM中擴增之TIL展現有利的表型屬性，包括與黑色素瘤、NSCLC及結腸直腸癌中之對照TIL擴增過程相比，增加的CD8 +CD39 -CD69 -T細胞豐度(圖18A-18C)。 實例 11. MRM 中之 TIL 培養
本文所呈現之數據顯示，在包含增加的鉀之培養基中培養TIL產生具有增加的CD8 +TIL擴增及增加的幹性之TIL群體，此係相對於在具有較低水準之鉀( 例如小於約40 mM鉀離子， 例如5 mM鉀離子)之培養基中培養之TIL而言。另外，數據表明，培養基中超高水準之鉀( 例如大於約80 mM、大於約90 mM或大於約100 mM鉀離子)可減少TIL產量，此可能歸因於TIL生長及擴增減少，數據未顯示。為進一步表徵MRM對TIL培養之效應，(1)將在初始擴增階段期間在對照培養基(包含55 mM鉀離子之等滲RPMI調配物)中培養TIL，然後在最終擴增階段期間在MRM培養基中培養，該MRM培養基包含介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之鉀離子及介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之NaCl；(2)將在初始擴增階段期間在MRM培養基中培養TIL，該MRM培養基包含介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之鉀離子及介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之NaCl，然後在最終擴增階段期間在對照培養基中培養；及(3)將在初始擴增階段期間在MRM培養基中培養TIL，該MRM培養基包含介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之鉀離子及介於50-70 mM之間之NaCl，然後在最終擴增階段期間在MRM培養基中培養，該MRM培養基包含介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之鉀離子及介於50-70 mM之間( 例如50 mM、55 mM、60 mM、65 mM或70 mM)之NaCl。在所有實驗中，初始培養條件將進一步包括6000 IU/mL IL-2，且最終培養條件將進一步包括3000 IU/mL IL-2。將表徵根據此方法培養之TIL之幹性及效應標記物之表現、細胞毒性及產量。 實例12 純系多樣性之分析
為評價根據上文所揭示之方法在MRM中培養之TIL之純系多樣性，在對照培養基或代謝再程式化培養基(MRM)中培養腫瘤片段及自腫瘤片段獲得之TIL。使用DNeasy血液及組織套組(QIAGEN)自腫瘤及TIL樣品分離總基因體DNA且使用用於TCRβ及CDR3區域之Immuno-seq (Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)進行測序。
藉由辛普森純系性√∑pi2評價非小細胞肺癌(NSCLC)及黑色素瘤樣品之多樣性度量，其中 pi係給定樣品中純系 i之比例豐度。對於NSCLC及黑色素瘤，在腫瘤片段(「腫瘤」)、在對照培養基中培養之TIL (「對照」)及在MRM中培養之TIL (「MRM」)中檢查辛普森純系性及生產性重排(分別為圖19A及圖19B)。在MRM中培養之TIL (擴增後)展示約0.28 (對於NSCLC)及約0.38 (對於黑色素瘤)之辛普森純系性，此指示高純系多樣性(圖19A及圖19B)。維持TCRβ多樣性代表保持浸潤腫瘤且具腫瘤特異性之TIL純系型。相反，在對照培養基中培養之TIL明顯丟失純系多樣性且展示約0.65 (對於NSCLC)及約0.8 (對於黑色素瘤)之辛普森純系性( 即明顯不太多樣之純系性，此指示許多腫瘤特異性純系在使用對照培養基之培養過程中丟失) (圖19A及圖19B)。 ***
應瞭解，意欲使用[實施方式]部分而非[發明內容]及[摘要]部分來解釋申請專利範圍。[發明內容]及[摘要]部分可闡述如本發明者所預期之本揭示案之一或多個但非所有例示性實施例，且因此不欲以任何方式限制本揭示案及所附申請專利範圍。
上文已藉助說明實施所指定功能及其關係之功能構建塊來闡述本揭示案。為便於描述，本文已任意定義該等功能構建塊之邊界。可定義替代邊界，只要所指定功能及其關係適當實施即可。
特定實施例之前述描述將如此充分地揭露本揭示案之一般性質，以致於在不背離本揭示案之一般概念之情況下，他人藉由應用此項技術中所熟知之知識、無需過多實驗即可容易地修改及/或改編該等特定實施例之各種應用。因此，基於本文所呈現之教示及指導，該等改編及修改意欲在所揭示實施例之等效物之含義及範圍內。應理解，本文之片語或術語係出於描述而非限制之目的，使得本說明書之術語或片語將由熟習此項技術者根據教示及指導來解釋。
本揭示案之廣度及範圍不應由任一上述例示性實施例限制，而應盡根據所附申請專利範圍及其等效內容來定義。
本申請案通篇中所引用之所有引用參考文獻(包括文獻參考文獻、美國或外國專利或專利申請案及網站)之內容皆以引用方式明確併入，如同其全文係出於任一目的而寫入本文一樣，其中引用之參考文獻亦如此。當出現任何不一致時，以本文字面揭示之材料為準。
圖1係大體顯示自腫瘤片段培養及擴增TIL之例示性製程之示意圖。 圖2A-2B係在T細胞條件化培養基( 例如CTS™ OpTimizer™；在本文中亦稱為「對照培養基」；圖2A)或代謝再程式化培養基(在本文中亦稱為「MRM」；圖2B)中初始培養後(第14天)，TIL之FACS細胞表型分型之圖形表示。圖2A及圖2B顯示，與在對照培養基中培養之TIL相比，在MRM中培養產生具有增強的CD39及PD1表現(大於20%)之TIL。圖2C係散佈圖，其顯示藉由在對照或MRM中培養來自不同腫瘤類型之TIL獲得之CD8 +細胞百分比的個體差異。每一連接點代表自同一樣品獲得之TIL，使得圖匯總13名患者之數據。星號指示，在對照培養基中培養後之平均CD8 +TIL百分比與在MRM中培養後之平均CD8 +TIL百分比顯著不同。該等數據顯示，與在對照培養基中培養TIL相比，在MRM中培養TIL可富集CD8 +T細胞。 圖3A-3E係基於在對照培養基(圖3A及圖3C)或MRM (圖3B及圖3D)中培養14天後，所培養CD4 +(圖3A-3B)及CD8 +(圖3C-3D) TIL之PD1及CD27的表現之FACS細胞表型分型之圖形表示。圖圖3C係散佈圖，其顯示藉由在對照或MRM中培養來自不同腫瘤類型之TIL獲得之CD27 +PD1 +細胞百分比的個體差異。每一連接點代表自同一樣品獲得之TIL，使得圖3C匯總9名患者之數據。星號指示，在對照培養基中培養後之平均CD27 +PD1 +TIL百分比與在MRM中培養後平均CD27 +PD1 +TIL百分比顯著不同。該等數據顯示，與在對照培養基中培養TIL相比，在MRM中培養TIL可富集CD27 +PD1 +T細胞。 圖4係圖形表示，其圖解說明藉由在初始培養後(第14天)在對照培養基或MRM中培養來自不同腫瘤類型之TIL獲得之CD27 +CD28 +細胞百分比的統計學上顯著之差異。每一連接點代表自同一樣品獲得之TIL，使得圖4匯總9名患者之數據。該等數據顯示，與在對照培養基中培養之TIL相比，在MRM中培養TIL可富集CD27 +CD28 +T細胞。 圖5A-5B係在對照培養基(圖5A)或MRM (圖5B)中培養(第14天)之TIL之FACS細胞表型分型之圖形表示，首先根據CD8或CD4表現設門，然後根據CD28及CD27表現設門，然後根據CD103及CD27表現設門，然後根據PD1及CD103表現設門且最後根據TCF7及CD27表現設門。圖5C係圖形表示，其圖解說明在對照培養基(1)或MRM (2)中初始培養後(約第14天)，TCF7 +TIL之平均螢光強度(MFI)。 圖6A-6H係在二次擴增後(約第21-26天)在對照培養基(圖6A-6D)或MRM (圖6E-6H)中擴增之TIL之FACS細胞表型分型之圖形表示，首先根據CD8或CD4表現設門(圖6A及圖6E)，根據CD8 +細胞上之CD28及CD27表現設門(圖6B及圖6F)，根據CD8 +細胞上之PD1及CD27表現設門(圖6C及圖6G)，且最後根據CD8 +細胞上之TCF7及CD39表現設門(圖6D及圖6H)。圖6B-6D及圖6F-6H係CD8 +細胞。 圖7A-7H係藉由在二次擴增後(約第21天)在對照培養基(圖7A-7D)或MRM (圖7E-7H)中與突變體KRAS脈衝之樹突細胞共培養擴增之CD8 +TIL之FACS細胞表型分型的圖形表示，首先根據CD8或CD4表現設門(圖7A及圖7E)，然後根據CD8 +細胞上之CD28及CD27表現設門(圖7B及圖7F)，然後根據CD8 +細胞上之PD1及CD27表現設門(圖7C及圖7G)，且最後根據僅PD1 +及CD27 +、PD1 +細胞上之TCF7及CD8表現設門(圖7D及圖7H)。圖7B-7D及圖7F-7H係CD8 +細胞。 圖8A-8H係藉由在二次擴增後(約第21天)在對照培養基(圖8A-8D)或MRM (圖8E-8H)中與野生型KRAS脈衝之樹突細胞共培養擴增之TIL之FACS細胞表型分型的圖形表示，首先根據CD8或CD4表現設門(圖8A及圖8E)，然後根據CD8 +細胞上之CD28及CD27表現設門(圖8B及圖8F)，然後根據CD8 +細胞上之PD1及CD27表現設門(圖8C及圖8G)，且最後根據僅PD1 +及CD27 +、PD1 +細胞上之TCF7及CD8表現設門(圖8D及圖8H)。圖8B-8D及圖8F-8H係CD8 +細胞。 圖9A-9B係在二次擴增後(約第21-26天)在對照培養基(圖9A)或MRM (圖9B)中培養之TIL之FACS細胞表型分型之圖形表示。 圖10係條形圖，其顯示在二次擴增後(約第21天)在對照培養基或MRM中培養之TIL中IL-2、B2M、GZMB、IFNγ及TCF7之基因表現的倍數變化(FC)。每一基因之表現正規化至在對照培養基中培養之TIL中之表現。 圖11A-11L係在二次擴增後(約第21-26天)在對照培養基(圖11A、圖11B、圖11E及圖11F)或MRM (圖11C、圖11D及圖11G-11L)中培養之CD4 +或CD8 +TIL之FACS細胞分選的圖形表示，根據PD1表現(圖11A-11D)或CD103表現(圖11E-11H)及CD39表現(圖11A-11H)設門。圖11I-11L顯示CD4 +TIL (圖11I及圖11K)及CD8 +TIL (圖11J及圖11L)之設門，對PD1及CD39表現設門(圖11I-11J)，然後根據CD45RO及CD103表現(圖11K-11L)設門。 圖12係條形圖，其圖解說明腫瘤片段(「腫瘤」)、使用對照培養基擴增之TIL (「對照」)及使用代謝再程式化培養基擴增之TIL (「MRM」)中免疫細胞之辛普森純系性值。 圖13A-13B係使用在對照培養基中擴增之TIL (圖13A)及在MRM中擴增之TIL (圖13B)的圖12中所呈現之數據產生之差異豐度(DA)圖。圖13C-13D係在對照培養基中(圖13C)或在MRM中(圖13D)培養之TIL群體中前50種優勢腫瘤TCR之腫瘤抗原識別的圖形表示。 圖14係顯示在MRM中培養之TIL之KRAS突變體活性的圖。 1SEQ ID NO: 6； 2SEQ ID NO: 1； 3SEQ ID NO: 7； 4SEQ ID NO: 8； 5SEQ ID NO: 9； 6SEQ ID NO: 10； 7SEQ ID NO: 11。 圖15A-15D係條形圖，其圖解說明使用對照培養基或MRM產生之TIL之腫瘤識別及腫瘤殺傷活性，如藉由所分泌IFN-γ (圖15A及圖15D)、所分泌IL-2 (圖15A)、所分泌TNF-α (圖15B)、腫瘤細胞殺傷百分比(圖15C)所證實。A= 使用對照培養基產生之TIL，且B=使用MRM產生之TIL (圖15A、圖15B及圖15D)；「對照TIL」 = 使用對照培養基產生之TIL，且「MRM TIL」 = 使用MRM產生之TIL (圖15C)；且「TC系」 = 腫瘤細胞系(圖15D)。 圖16係在與TIL接觸並共培養後(在箭頭所指示之時間下)， 離體培養之自體黑色素瘤腫瘤細胞隨時間之細胞溶解百分比之圖形表示。在對照培養基或MRM中培養TIL且以1:1效應T細胞(E)對腫瘤細胞(T)、2:1 E:T及4:1 E:T之比率將其添加至所培養腫瘤細胞中，如所指示。 圖17A-17H係圖形表示，其圖解說明使用對照製程(圖17A-17D)或MRM (17E-17H)擴增之NSCLC TIL中標記物基因之表現。在MRM中擴增之TIL展現優異的表型特徵，如藉由CD8+ T細胞分數、低CD39/CD69表現(圖17B及17D)、中央記憶(CD45RO+CD6L+；圖17C及17G)及高CD27表現(圖17D及17H)所量測。虛線突出顯示之框指示不利之表型，且實線突出顯示之框指示有利之表型。 圖18A-18C係圖形表示，其圖解說明自黑色素瘤(圖8A)、NSCLC (圖18B)或結腸直腸癌(圖18C)獲得之TIL中，T細胞隔室內CD39及CD69二者之CD8+ T細胞之負表現。自新鮮供應之人類腫瘤樣品起始培養且在對照或MRM條件下擴增細胞。在最終快速擴增製程(REP)後，分析TIL之T細胞隔室內CD39及CD69二者之CD8+ T細胞之負表現。對於每一分析，評價自黑色素瘤(n=6個獨立腫瘤)、NSCLC (n=5個獨立腫瘤)及結腸直腸癌(n=11個獨立腫瘤)擴增之TIL。藉由配對 t測試量測統計學顯著性。 *** p＜.001，* p＜.05。 圖19A及圖19B係條形圖，其圖解說明非小細胞肺癌(NSCLC) (圖19A)及黑色素瘤(圖19B)之腫瘤片段(「腫瘤」)、使用對照培養基擴增之TIL (「對照」)及使用代謝再程式化培養基擴增之TIL (「MRM」)中免疫細胞之辛普森純系性值。 
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Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (155)

  1. 一種 離體或 活體外培養腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之方法，其包括將異質TIL群體置於包含濃度為約30 mM至約100 mM之鉀離子之代謝再程式化培養基(「MRM」)中。
  2. 如請求項1之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後富集CD8 +TIL。
  3. 一種增加CD8 +TIL之數量或百分比之 離體或 活體外方法，其包括在包含濃度為約30 mM至約100 mM之鉀離子之MRM中培養異質TIL群體。
  4. 一種製備CD8 +富集之TIL群體之方法，其包括在包含濃度為約30 mM至約100 mM之鉀離子之MRM中 離體或 活體外培養異質TIL群體。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該異質TIL群體包含CD4 +TIL及CD8 +TIL。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該異質TIL群體係自個體獲得之一或多個腫瘤樣品獲得。
  7. 如請求項6之方法，其中該腫瘤樣品經受初始TIL培養。
  8. 如請求項7之方法，其中該初始TIL培養包括在該MRM中培養該腫瘤樣品。
  9. 如請求項8之方法，其中該MRM在該初始TIL培養期間進一步包含IL-2。
  10. 如請求項9之方法，其中該MRM在該初始TIL培養期間進一步包含IL-7、IL-15、IL-21或其任一組合。
  11. 如請求項8至10中任一項之方法，其中該MRM在該初始TIL培養期間包含IL-2及IL-21。
  12. 如請求項7至11中任一項之方法，其中該初始TIL培養持續至少約14-19天。
  13. 如請求項7至12中任一項之方法，其中該初始TIL培養持續至少約14天。
  14. 如請求項7至13中任一項之方法，其中與該初始TIL培養前CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例相比，在該初始TIL培養後CD8 +TIL對非CD8 +TIL之比例增加。
  15. 如請求項7至14中任一項之方法，其中在該初始TIL培養後刺激該等TIL。
  16. 如請求項15之方法，其中藉由將該等TIL與CD3促效劑及/或CD28促效劑一起培養來刺激該等TIL。
  17. 如請求項6至16中任一項之方法，其中該腫瘤樣品包含腫瘤活體組織切片。
  18. 如請求項6至17中任一項之方法，其中將該腫瘤樣品在培養之前片段化。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中在培養該異質TIL群體後，該群體中之該等TIL之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%係CD8 +TIL。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中在培養該異質TIL群體後，該群體中之該等TIL之至少約50%係CD8 +TIL。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該MRM進一步包含鈉離子、鈣離子、葡萄糖或其任一組合。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該MRM進一步包含細胞擴增劑。
  23. 如請求項22之方法，其中該細胞擴增劑包括GSK3B抑制劑、ACLY抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑或其任一組合。
  24. 如請求項23之方法，其中該PI3K抑制劑包括LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114或其任一組合。
  25. 如請求項24之方法，其中該AKT抑制劑包括MK2206、A443654、AKTi-VIII或其任一組合。
  26. 如請求項3至25中任一項之方法，其中鉀離子之濃度為至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、至少約85 mM、至少約90 mM、至少約95 mM或至少約100 mM。
  27. 如請求項3至26中任一項之方法，其中鉀離子之濃度為約30 mM至約100 mM、約30 mM至約90 mM、約30 mM至約80 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約50 mM、約40 mM至約100 mM、約40 mM至約90 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約60 mM或約40 mM至約50 mM。
  28. 如請求項1至27中任一項之方法，其中鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該MRM進一步包含鈉離子。
  32. 如請求項31之方法，其中該鈉離子之濃度為約25 mM至約100 mM。
  33. 如請求項31或32之方法，其中該鈉離子之濃度為約30 mM至約40 mM、約30 mM至約50 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約80 mM、約40 mM至約50 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約80 mM、約50 mM至約55 mM、約50 mM至約60 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約80 mM、約55 mM至約60 mM、約55 mM至約65 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約80 mM、約60 mM至約65 mM、約60 mM至約70 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約80 mM、約70 mM至約75 mM、約70 mM至約80 mM或約75 mM至約80 mM。
  34. 如請求項31至33中任一項之方法，其中該鈉離子之濃度為約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM或約80 mM。
  35. 如請求項31至34中任一項之方法，其中該鈉離子之濃度為約55 mM。
  36. 如請求項31至35中任一項之方法，其中該鈉離子之濃度為約60 mM。
  37. 如請求項31至36中任一項之方法，其中該鈉離子之濃度為約65 mM。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，其中該MRM進一步包含葡萄糖。
  39. 如請求項38之方法，其中葡萄糖之濃度大於約10 mM。
  40. 如請求項38或39之方法，其中葡萄糖之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中該葡萄糖之濃度為約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。
  42. 如請求項1至41中任一項之方法，其中該MRM進一步包含鈣離子。
  43. 如請求項42之方法，其中鈣離子之濃度大於約0.4 mM。
  44. 如請求項42或43之方法，其中鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約1.3 mM、約1.2 mM至約1.4 mM、約1.2 mM至約1.5 mM、約1.2 mM至約1.6 mM、約1.2 mM至約1.7 mM、約1.2 mM至約1.8 mM、約1.3 mM至約1.4 mM、約1.3 mM至約1.5 mM、約1.3 mM至約1.6 mM、約1.3 mM至約1.7 mM、約1.3 mM至約1.8 mM、約1.4 mM至約1.5 mM、約1.4 mM至約1.6 mM、約1.4 mM至約1.7 mM、約1.4 mM至約1.8 mM、約1.5 mM至約1.6 mM、約1.5 mM至約1.7 mM、約1.5 mM至約1.8 mM、約1.6 mM至約1.7 mM、約1.6 mM至約1.8 mM或約1.7 mM至約1.8 mM。
  45. 如請求項42至44中任一項之方法，其中鈣離子之濃度為約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該MRM包含約40 mM至約90 mM鉀離子及 (i)      約40 mM至約80 mM鈉離子； (ii)     約10 mM至約24 mM葡萄糖； (iii)    約0.5 mM至約2.8 mM鈣離子；或 (iv)    (i)-(iii)之任一組合。
  47. 一種擴增自人類個體獲得之TIL之方法，其包括： a. 在初始TIL培養基中培養該等TIL； b. 在二次TIL培養基中培養該等TIL； c. 在第三(或最終) TIL培養基中培養該等TIL， 其中該等初始TIL培養基、該等二次TIL擴增培養基及/或該等第三TIL擴增培養基係MRM。
  48. 如請求項47之方法，其中該等初始TIL培養基及該等二次TIL擴增培養基為高血鉀性且該等第三TIL擴增培養基不為高血鉀性。
  49. 如請求項47或48之方法，其中該等初始TIL培養基進一步包含IL-2。
  50. 如請求項49之方法，其中該等初始TIL培養基進一步包含IL-21。
  51. 如請求項47至50中任一項之方法，其中該等初始TIL培養基進一步包含T細胞補充物、血清替代物、麩醯胺酸、麩醯胺酸取代物(例如Glutamax (L-丙胺酸-L-麩醯胺酸))、非必需胺基酸、抗生素(例如青黴素(Penicillin)、鏈黴素(Streptomycin)或二者)、抗真菌劑(例如 Fungin™)及/或丙酮酸鈉。
  52. 如請求項47至51中任一項之方法，其中將該等TIL在該等初始TIL培養基中培養至少約1週、至少約2週或至少約3週。
  53. 如請求項47至52中任一項之方法，其中在該等初始TIL培養基中培養該等TIL直至該初始培養物中之細胞產量達到至少約1×10 5個、至少約2×10 5個、至少約3×10 5個、至少約4×10 5個、至少約5×10 5個、至少約6×10 5個、至少約7×10 5個、至少約8×10 5個、至少約9×10 5個、至少約1×10 6個、至少約2×10 6個、至少約3×10 6個、至少約4×10 6個、至少約5×10 6個、至少約6×10 6個、至少約7×10 6個、至少約8×10 6個、至少約9×10 6個或至少約10×10 6個細胞/片段。
  54. 如請求項47至53中任一項之方法，其中在(b)中之該等二次TIL培養基中或之前，用CD3促效劑、CD28促效劑或二者刺激該等TIL。
  55. 如請求項47至54中任一項之方法，其中在該等二次TIL培養基中或之前，用CD27促效劑進一步刺激該等TIL。
  56. 如請求項47至55中任一項之方法，其中在該等二次TIL培養基中或之前，用4-1BB促效劑進一步刺激該等TIL。
  57. 如請求項53至56中任一項之方法，其中在該刺激後，將該等TIL培養至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天、至少約21天、至少約22天、至少約23天、至少約24天、至少約25天或至少約26天。
  58. 如請求項47至57中任一項之方法，其中在該等二次培養基中培養該等TIL直至細胞產量達到至少約1×10 7個、至少約2×10 7個、至少約3×10 7個、至少約4×10 7個、至少約5×10 7個、至少約6×10 7個、至少約7×10 7個、至少約8×10 7個、至少約9×10 7個、至少約10×10 7個、至少約11×10 7個、至少約12×10 7個、至少約13×10 7個、至少約14×10 7個、至少約15×10 7個、至少約16×10 7個、至少約17×10 7個、至少約18×10 7個、至少約19×10 7個或至少約20×10 7個細胞。
  59. 如請求項47至58中任一項之方法，其中在該等第三TIL培養基中，用CD3促效劑、CD28促效劑、CD27促效劑及/或4-1BB促效劑刺激該等TIL。
  60. 如請求項59之方法，其中該等第三TIL培養基不為高血鉀性。
  61. 如請求項59或60之方法，其中將該等TIL在該等第三TIL培養基中培養至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、至少約14天、至少約15天、至少約16天、至少約17天、至少約18天、至少約19天、至少約20天或至少約21天。
  62. 一種增加腫瘤反應性TIL之方法，其包括： a. 將一或多個腫瘤片段在初始TIL培養基中培養長達約14至19天，該等初始TIL培養基為高血鉀性且包含 IL-2及視情況地IL-21，由此自該腫瘤片段獲得TIL； b. 在添加(i) CD3促效劑及(ii) CD28促效劑、CD27促效劑、4-1BB促效劑或其任一組合後，將該等TIL在二次TIL培養基中培養約7天至至少約14天，該等二次TIL培養基為高血鉀性； c. 在添加(i) CD3促效劑及(ii) CD28促效劑、CD27促效劑、4-1BB促效劑或其任一組合後，將該等TIL在第三TIL培養基中培養約14天至至少約21天，該等第三TIL培養基不為高血鉀性。
  63. 如請求項1至62中任一項之方法，其中相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後TIL群體中之TCF7表現，該等TIL在該MRM中培養後展現增加的TCF7表現。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後CD8 +CD62L +TIL之比例，該TIL群體在該MRM中培養後包含增加的CD8 +CD62L +TIL比例。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後CD8 +PD1 +TIL之比例，該TIL群體在該MRM中培養後包含增加的CD8 +PD1 +TIL比例。
  66. 一種免疫細胞之組合物，其包含根據請求項1至65中任一項之方法培養之一或多個CD8 +TIL。
  67. 如請求項66之組合物，其中該等免疫細胞之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%係CD8 +TIL。
  68. 一種包含免疫細胞群體之組合物，其中該等免疫細胞之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%係CD8 +TIL。
  69. 如請求項66至68中任一項之組合物，其中該等細胞之至少約50%係CD8 +TIL。
  70. 如請求項66至69中任一項之組合物，其中相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後免疫細胞群體中之TCF7表現，該等細胞在該MRM中培養後展現增加的TCF7表現。
  71. 如請求項66至70中任一項之組合物，其中該等免疫細胞之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%係CD8 +/CD62L +TIL。
  72. 如請求項66至71中任一項之組合物，其中在該初始TIL培養結束時獲得之該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係PD1 +。
  73. 如請求項66至72中任一項之組合物，其中在該初始TIL培養結束時獲得之該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD39 +。
  74. 如請求項66至73中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD27 +。
  75. 如請求項66至74中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD28 +。
  76. 如請求項66至75中任一項之組合物，其中在該初始TIL培養結束時獲得之該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係PD1 +CD39 +。
  77. 如請求項66至76中任一項之組合物，其中在該初始TIL培養結束時獲得之該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係PD1 +CD27 +。
  78. 如請求項66至77中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD27 +CD62L +。
  79. 如請求項66至78中任一項之組合物，其中在該初始TIL培養結束時獲得之該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD27 +CD28 +CD103 +PD1 +TCF7 +。
  80. 如請求項66至79中任一項之組合物，其包含至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個細胞。
  81. 如請求項66至80中任一項之組合物，其包含至少約1 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個CD8 +細胞。
  82. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包括向該個體投與TIL群體，其中根據請求項1至65中任一項之方法培養該TIL群體。
  83. 如請求項82之方法，其中該TIL群體富集CD8 +TIL。
  84. 如請求項82或83之方法，其中該TIL群體中該等TIL之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%係CD8 +TIL。
  85. 如請求項82至84中任一項之方法，其中該TIL群體中該等TIL之至少約50%係CD8 +TIL。
  86. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包括向個體投與如請求項66至71中任一項之組合物。
  87. 如請求項82至86中任一項之方法，其中該癌症包括實體腫瘤。
  88. 如請求項82至87中任一項之方法，其中該癌症包括衍生自以下之實體腫瘤：黑色素瘤、結腸癌、肺癌、子宮頸癌、胃腸癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、胰臟癌、頭頸部小細胞癌、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、睪丸生殖細胞腫瘤、胃腺癌、皮膚黑色素瘤、間皮瘤、腎透明細胞癌、子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌、食管癌、膀胱尿路上皮癌、浸潤性乳癌、腎乳頭狀細胞癌、結腸腺癌或其任一組合。
  89. 如請求項82至88中任一項之方法，其包括向該個體投與至少約2 × 10 9個、至少約3 × 10 9個、至少約4 × 10 9個、至少約5 × 10 9個、至少約6 × 10 9個、至少約7 × 10 9個、至少約8 × 10 9個、至少約9 × 10 9個或至少約1 × 10 10個或至少約10 × 10 10個或至少約15 × 10 10個或至少約20 × 10 10個或至少約25 ×10 10個或至少約30 × 10 10個細胞。
  90. 如請求項82至89中任一項之方法，其包括向該個體投與至少約1 × 10 9個、至少約3 × 10 9個、至少約4 × 10 9個、至少約5 × 10 9個、至少約6 × 10 9個、至少約7 × 10 9個、至少約8 × 10 9個、至少約9 × 10 9個或至少約1 × 10 9個CD8 +細胞。
  91. 如請求項82至90中任一項之方法，其進一步包括投與檢查點抑制劑。
  92. 如請求項91之方法，其中該檢查點抑制劑係在投與該細胞群體後投與該個體。
  93. 如請求項91或92之方法，其中該檢查點抑制劑包括CTLA-4拮抗劑、PD1拮抗劑、TIM-3拮抗劑或其組合。
  94. 如請求項91至93中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑包括抗CTLA-4抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗TIM-3抗體或其組合。
  95. 如請求項92至94中任一項之方法，其進一步包括投與檢查點活化劑。
  96. 如請求項90至95中任一項之方法，其中該檢查點抑制劑係在投與該TIL群體後投與該個體。
  97. 如請求項95或96之方法，其中該檢查點活化劑包括OX40促效劑、LAG-3促效劑、4-1BB (CD137)促效劑、GITR促效劑、TIM3促效劑或其組合。
  98. 如請求項95或96之方法，其中該檢查點活化劑包括抗OX40抗體、抗LAG-3抗體、抗CD137抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體或其組合。
  99. 如請求項92至98中任一項之方法，其進一步包括投與細胞介素。
  100. 如請求項99之方法，其中該細胞介素係在投與該TIL群體後投與該個體。
  101. 如請求項99或100之方法，其中該細胞介素係IL-2。
  102. 如請求項99至101中任一項之方法，其進一步包括在投與該細胞群體之前向該個體投與淋巴清除療法。
  103. 如請求項102之方法，其中該淋巴清除療法包含環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟達拉濱(fludarabine)或環磷醯胺及氟達拉濱二者。
  104. 如請求項1至65中任一項之方法，其中與置於對照培養基中之異質TIL群體之純系多樣性相比，該異質TIL群體在置於該MRM中後具有增加的純系多樣性。
  105. 如請求項1至65及104中任一項之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。
  106. 如請求項1至65、104及105中任一項之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後之純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性(Simpsons clonality)所量測。
  107. 如請求項1至65及104至106中任一項之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後之純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。
  108. 如請求項1至65及104至107中任一項之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後之純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。
  109. 如請求項1至65及104至108中任一項之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後之純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。
  110. 如請求項1至65及104至109中任一項之方法，其中該異質TIL群體在置於該MRM中後之純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。
  111. 如請求項66至81中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。
  112. 如請求項66至81及111中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。
  113. 如請求項66至81、111及112中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。
  114. 如請求項66至81及111至113中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。
  115. 如請求項66至81及111至114中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。
  116. 如請求項66至81及111至115中任一項之組合物，其中該等CD8 +TIL之純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。
  117. 一種擴增TIL群體，其純系多樣性係腫瘤樣品中TIL之純系多樣性的至少約99%至約100%、至少約98%至約100%、至少約97%至約100%、至少約96%至約100%、至少約95%至約100%、至少約94%至約100%、至少約93%至約100%、至少約92%至約100%、至少約91%至約100%、至少約90%至約100%、至少約85%至約100%、至少約80%至約100%、至少約75%至約100%、至少約70%至約100%、至少約65%至約100%、至少約60%至約100%、至少約55%至約100%、至少約50%至約100%、至少約45%至約100%或至少約40%至約100%。
  118. 一種擴增TIL群體，其純系多樣性評分小於約0.5、小於約0.45、小於約0.4、小於約0.35、小於約0.3、小於約0.275、小於約0.25、小於約0.225、小於約0.2、小於約0.175、小於約0.15、小於約0.125、小於約0.1、小於約0.075、小於約0.07、小於約0.06或小於約0.05，如藉由辛普森純系性所量測。
  119. 如請求項117或118之擴增TIL群體，其中該純系多樣性評分小於約0.3，如藉由辛普森純系性所量測。
  120. 如請求項117至119中任一項之擴增TIL群體，其中該純系多樣性評分小於約0.25，如藉由辛普森純系性所量測。
  121. 如請求項117至120中任一項之擴增TIL群體，其中該純系多樣性評分小於約0.2，如藉由辛普森純系性所量測。
  122. 如請求項117至121中任一項之擴增TIL群體，其中該純系多樣性評分小於約0.1，如藉由辛普森純系性所量測。
  123. 如請求項117至122中任一項之擴增TIL群體，其包含至少約2 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個細胞。
  124. 如請求項117至123中任一項之擴增TIL群體，其包含至少約1 × 10 6個、至少約3 × 10 6個、至少約4 × 10 6個、至少約5 × 10 6個、至少約6 × 10 6個、至少約7 × 10 6個、至少約8 × 10 6個、至少約9 × 10 6個或至少約1 × 10 7個CD8 +細胞。
  125. 如請求項117至124中任一項之擴增TIL群體，其中該等經擴增TIL之至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%或至少約80%係CD8 +TIL。
  126. 如請求項117至125中任一項之擴增TIL群體，其中該等經擴增TIL之至少約50%係CD8 +TIL。
  127. 如請求項117至126中任一項之擴增TIL群體，其中相對於在不為高血鉀性之對照培養基中培養後免疫細胞群體中之TCF7表現，該等經擴增TIL在該MRM中培養後展現增加的TCF7表現。
  128. 如請求項117至127中任一項之擴增TIL群體，其中該等經擴增TIL之至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%係CD8 +/CD62L +TIL。
  129. 如請求項124至128中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係PD1 +。
  130. 如請求項124至129中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD39 +。
  131. 如請求項124至130中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD27 +。
  132. 如請求項124至131中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD28 +。
  133. 如請求項124至132中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係PD1 +CD39 +。
  134. 如請求項124至133中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係PD1 +CD27 +。
  135. 如請求項124至134中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD27 +CD62L +。
  136. 如請求項124至135中任一項之擴增TIL群體，其中該等CD8 +TIL之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%或至少約50%係CD27 +CD28 +CD103 +PD1 +TCF7 +。
  137. 一種治療有需要之個體之癌症的方法，其包括投與如請求項111至116中任一項之組合物或如請求項117至136中任一項之擴增TIL群體。
  138. 如請求項66至81及111至116中任一項之組合物或如請求項117至136中任一項之擴增TIL群體，其包含表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之至少一種免疫細胞。
  139. 如請求項66至81、111至116及138中任一項之組合物或如請求項117至136及138中任一項之擴增TIL群體，其中該等幹細胞樣標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或其任一組合。
  140. 如請求項66至81、111至116、138及139中任一項之組合物或如請求項117至136、138及139中任一項之擴增TIL群體，其中該等效應物樣標記物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或其任一組合。
  141. 如請求項66至81、111至116、138及139中任一項之組合物或如請求項117至136、138及139中任一項之擴增TIL群體，其中組合物或群體中至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%之經擴增TIL包含表現一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物之至少一種免疫細胞。
  142. 一種TIL，其包含一或多種幹細胞樣標記物及一或多種效應物樣標記物。
  143. 如請求項142之TIL，其中該等幹細胞樣標記物包括CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+或其任一組合。
  144. 如請求項142或143之TIL，其中該等效應物樣標記物包括pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+或其任一組合。
  145. 一種擴增TIL群體，其包含如請求項142至144中任一項之TIL。
  146. 如請求項145之擴增TIL群體，其中該等經擴增TIL細胞之至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%包含如請求項142至144中任一項之TIL。
  147. 一種醫藥組合物，其包含如請求項142至144中任一項之TIL或如請求項145或146之擴增TIL群體及醫藥學上可接受之載劑。
  148. 一種治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包括向該個體投與如請求項142至144中任一項之TIL、如請求項145或146之擴增TIL群體或如請求項147之醫藥組合物。
  149. 如請求項148之方法，其中該疾病或疾患係癌症。
  150. 如請求項149之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、頭頸癌、子宮頸癌、卵巢癌及其任一組合。
  151. 一種製備如請求項142至144中任一項之TIL之方法，其包括在培養基中在適宜條件下培養免疫細胞。
  152. 如請求項1至65、82至110及137中任一項之方法、如請求項66至81、111至116及138至141中任一項之組合物或如請求項117至136中任一項之擴增TIL群體，其中該MRM包含NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度介於110 mM與140 mM之間。
  153. 如請求項1至65、82至110及137中任一項之方法、如請求項66至81、111至116及138至141中任一項之組合物或如請求項117至136中任一項之擴增TIL群體，其中相對於在對照培養基中培養後CD39 -/CD69 -TIL之比例，該TIL群體在該MRM中培養後包含增加的CD39 -/CD69 -TIL比例。
  154. 如請求項1至65、82至110及137中任一項之方法、如請求項66至81、111至116及138至141中任一項之組合物或如請求項117至136中任一項之擴增TIL群體，其中該TIL群體中TIL總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%係CD39 -/CD69 -。
  155. 如請求項7至65、82至110及137中任一項之方法，其中該初始培養持續至少約11天。
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