CN104928242A - 一种nk细胞的培养方法 - Google Patents

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武栋成
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Abstract

本发明公开了一种NK细胞的培养方法，包括以下步骤(1)从人外周血或脐带血中分离单个核细胞；(2)将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入CD3单克隆抗体，重组人白细胞介素2和自体血浆，培养3-5天；(3)加入重组人白细胞介素2和自体血浆，培养；(4)收获NK细胞。本发明提供的NK细胞培养方法降低了培养成本，保证了NK细胞的扩增倍数和细胞毒性，节省了操作时间的同时减少了操作失误的可能性，使NK细胞的获得效率更高且安全性更好。

Description

一种NK细胞的培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种NK细胞的培养方法。
背景技术
NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫调节细胞，起源于骨髓来源的CD34+造血祖细胞，无需有抗体存在或预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。随着对NK细胞识别人类肿瘤分子机制研究的深入，以NK细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗引起重视并取得重大进展。目前有关NK细胞在肿瘤免疫治疗的研究主要集中在自体NK细胞过继免疫治疗、异体NK细胞过继免疫治疗及基因修饰NK细胞免疫治疗等，并已取得显著成效。但如何在保证临床安全性的前提下提高NK细胞体外增殖效率和杀伤活性一直是科研工作者和临床医生共同探索研究的重点。
目前主要是从培养基和血清种类，细胞刺激因子，辅助饲养细胞等各方面探索NK细胞高效培养的捷径。体外NK细胞扩增培养体系中，常用培养基分别为CellGro SCGM，RPMI-1640培养基，无血清培养基(X-VIVO TM Serum-free Media)3大类。各培养基的使用效果证实CellGro SCGM培养基比RPMI-1640和X-Vivo10培养基能更有效支持NK细胞生长活化与扩增。已知IL-2、IL-15、IL-18和IL-12等细胞因子对NK细胞的活化与扩增非常重要，其中IL-15的作用尤为重要。IL-2是体外扩增NK细胞体系中最常用的细胞因子，可以在24h反应期内提高NK杀伤活性并刺激其增殖。近期Strivastava等研究证实IL-15单独或联合IL-2使用通常会导致最低限度NK细胞扩增(StrivastavaS，Lundqvist A，Childs RW.Cytotherapy，2008，10(8)：775-783)。大量研究证明细胞因子对NK细胞的活化和扩增是必要的，但是仅有细胞因子并不能刺激NK细胞达到最理想的增殖状态。Alici等在多发性骨髓瘤患者体外NK细胞扩增的研究中使用IL-2和OKT3作为其细胞刺激因子，细胞扩增明显(Alici E，Sutlu T，Bjork strand B，GilljamM，et al.Blood，2008，111(6)：3155-3162)。另外绝大多数研究人员认为NK细胞持续增殖需要在细胞因子的基础上增加额外刺激信号，比如同种异体单核细胞、自体淋巴细胞、促分裂素活性淋巴细胞、脐血间充质干细胞等辅助饲养细胞。目前多采用病毒转染的B淋巴细胞及肿瘤细胞作饲养细胞以提高NK细胞扩增倍数，但其安全性尚待探讨。
总体来说，目前的NK细胞扩增效果仍不能满足实际应用，且Cellgro培养基和IL-15的价格都非常昂贵，故一般在国内使用的培养基均为普遍可以用来培养免疫细胞的培养基，但细胞培养的效果奇差。如何找到一种成本低且操作便捷的NK细胞培养方法具有巨大的意义。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个目的在于提供了一种NK细胞的培养技术，旨在降低了NK细胞的培养成本。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从人外周血中分离单个核细胞；
(2)将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入CD3单克隆抗体，重组人白细胞介素2，自体血浆，培养3-5天；
(3)加入重组人白细胞介素2，自体血浆，培养；
(4)收获NK细胞。
另外，根据本发明上述实施例提供的一种NK细胞的培养方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，所述适合淋巴细胞培养的培养基为AIM-V培养基；X-VIVO 15培养基；H3培养基；GT-T551培养基；Alys-505N无血清培养基；RPMI1640+10％FBS培养基；AIM-V培养基；X-VIVO 15培养基和ALyS505NK培养基中的一种。
根据本发明的实施例，所述步骤(2)中CD3单克隆抗体的浓度为50～300ng/mL。
根据本发明的实施例，所述重组人白细胞介素-2的浓度为300-600U/mL。
根据本发明的实施例，所述自体血浆的浓度为0～5％。
根据本发明的实施例，所述步骤(3)中的培养为扩瓶培养。
根据本发明的实施例，所述步骤(3)中的培养为培养袋培养。
根据本发明的实施例，所述步骤(3)中的培养至少5天。
根据本发明的实施例，所述方法得到的细胞主要由表型为CD3-CD56+的自然杀伤细胞组成。
本发明的技术效果为：
1、本发明选用廉价的培养基培养单核细胞，大大降低了成本，同时还保证了NK细胞的扩增倍数和细胞毒性；
2、本发明仅用了两种细胞因子即CD3单克隆抗体和重组人白细胞介素2就实现了对NK细胞的激活和扩增。
3、本发明在不加入任何血清时，同样能实现对NK细胞的激活和扩增，还避免了过多外界物质的介入影响了NK细胞；
4、本发明操作简便，加入因子种类少，节省了操作时间的同时减少了操作失误的可能性，使细胞的获得效率更高且安全性更好。
总之，本发明提供的一种NK细胞培养方法既保证了NK细胞的扩增倍数和细胞毒性，又大大降低了NK细胞的培养成本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是血液来源的单核细胞未经诱导前NK含量图；
图2是本发明提供的一种NK细胞培养方法进行培养后达到的效应细胞图；
图3是常规方法进行培养后达到的效应细胞图。
图4是本发明与常规培养方法NK细胞扩增倍数的比较图。
图5是本发明与常规培养方法所得NK细胞对K562细胞杀伤性的比较图。
图6是使用本发明培养NK细胞的方法培养的NK细胞第5天的细胞图。
图7是使用本发明培养NK细胞的方法培养的NK细胞第10天的细胞图。
图8是使用本发明培养NK细胞的方法培养的NK细胞第15天的细胞图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
来自外周血液的NK细胞培养
材料与方法
本发明中用到的RPMI-1640培养基选自GIBCO公司，重组人IL-2从市场购买而来。
步骤a:自体血浆的制备
在生物安全柜中将注射器中的40mL-60mL抗凝全血平均分装到2支50mL无菌离心管中，用离心机离心，离心转速为2500rpm，离心10min，离心完成后吸取上层血浆，56℃，30min灭活补体，置于4℃水浴中放置15分钟，再用离心机离心，离心速度为2500rpm，离心20分钟，转移上清液至新的离心管。标记，置于-20℃冰箱中保存；
步骤b:单个核细胞的分离
向步骤a中所述的离心后未被吸取的血细胞中加入缓冲盐溶液25mL，稀释血细胞，边吹打边旋转离心管，混匀。取30mL混匀的稀释血缓慢加到装有淋巴细胞分离液的50mL离心管内。用离心机离心，离心转速为2100rpm离心30分钟；吸出白膜层至装有30mL缓冲盐溶液的离心管中，用离心机离心，离心速度为2100rpm，离心15分钟；
步骤c:离心洗涤、计数
将上述步骤b中得到的细胞悬液，弃上清，每管加5mL缓冲盐溶液，重悬细胞沉淀，并转移至一管，再吸取适量缓冲盐溶液漂洗各管后收集残留细胞，定容至30mL，留样计数。用离心机离心，离心转速1500rpm，离心10分钟；
步骤d:重悬细胞、接种
将上述步骤c中得到的细胞悬液，弃上清，取5mL用含有200ng/mL CD3单克隆抗体，500U/mL重组人IL-2的RPMI-1640培养基重悬细胞(调整细胞浓度至1-2x 106/mL)，加5％自体血浆，移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每瓶1*106/mL的密度，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中，孵育2小时；
在步骤d中对CD3单克隆抗体的浓度，培养基进行的选择和改变，其效果同实施例1区别不明显，具体的筛选条件见表1：
表1
步骤e:NK细胞的培养及鉴定
每天观察细胞状态，在培养的第5天，洗去CD3单抗，用NK培养液(含500U/mL的重组人IL-2)扩瓶或转袋；并补加5％自体血浆；之后每天观察细胞的生长情况，补充NK培养液(含500U/mL的重组人IL-2)，保证细胞生长密度在1-2*106个/mL。第0天、第5天、第10天、第15天、第20天分别测细胞数量和CD3-CD56+细胞比例，台盼蓝染色检测细胞活力，流式细胞仪检测NK细胞CD3-CD56+免疫表型标记；在培养的第10天和第15天，本法的NK效应细胞为常规方法培养的10倍以上。
细胞的第5天，第10天和第15天的生长情况详见图6，图7和图8。
实施例2：
常规方法的NK细胞培养
材料与方法
常规方法中用到的Cellgro SCGM serum-free medium培养基选自(Frei burg,Germany)公司，IL-15，重组人IL-2从市场购买而来。
步骤a至步骤c同实施例1
步骤d:重悬细胞、接种
将上述步骤c中得到的细胞悬液，弃上清，取5mL用含有10ng/mL的CD3单克隆抗体、10ng/mL IL-15和500U/mL重组人IL-2的CellGro培养基重悬细胞(调整细胞浓度至1-2x 106/ml)，加5％自体血浆，移入表面积为75平方厘米的培养瓶中，每瓶1*106/mL的密度，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中，孵育2小时；
步骤e:NK细胞的培养及鉴定
每天观察细胞状态，在培养的第5天，洗去CD3单抗，用NK培养液(含10ng/ml IL-15、500U/ml的重组人IL-2)扩瓶或转袋；并补加5％自体血浆；之后每天观察细胞的生长情况，补充NK培养液(含10ng/ml IL-15、500U/mL的重组人IL-2)，保证细胞生长密度在1-2*106个/mL。第20天收细胞并测CD3-CD56+细胞比例。
实施例3：本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较
分别在第0、5、10、15及20天从两组取培养细胞，用台盼蓝染色后计数，将计数当天的细胞总数除以培养前的细胞数(即第0天)，数值即为细胞的扩增倍数。以此方法可以动态比较两组细胞的扩增情况，结果如表2和图4所示：在培养的第5、10、15、20天，本法的NK细胞扩增倍数均显著高于常规组P＜0.01。
表2
培养天数(天) 0 5 10 15 20
常规组 1 8.6 35.2 65.7 84.6
实验组 1 12.3 71.2 139.5 225.3
实施例4：本方法与常规方法所得NK细胞对A549细胞杀伤活性的比较
以处于对数生长期的A549细胞作为靶细胞，将其调整为1×105/mL，将两种方法培养20天NK细胞作为效应细胞，按1:1、2:1、5:1和10:1的效靶比将效应细胞和靶细胞混合，同时设效应细胞孔、靶细胞孔，每组均设3个平行孔，每孔终体积为200μL，37℃、5％，CO2培养箱中孵育，12h后每孔加入20μ LCCK-8溶液，继续孵育4h，用酶标仪检测450nm时的OD值，按以下公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[1-(实验孔OD值-效应孔OD值/靶细胞孔OD值)]×100％结果如表3和图5所示，在不同效靶比，本方法所得NK细胞对A549细胞的杀伤活性均显著高于常规组(P＜0.01)。
表3
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种NK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)从人外周血或脐带血中分离单个核细胞；
(2)将单个核细胞接种到适合淋巴细胞培养的培养基中，加入CD3单克隆抗体，重组人白细胞介素2和自体血浆，培养3-5天；
(3)加入重组人白细胞介素2和自体血浆，培养；
(4)收获NK细胞。
2.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述适合淋巴细胞培养的培养基为AIM-V培养基；X-VIVO 15培养基；H3培养基；GT-T551培养基；Alys-505N无血清培养基；RPMI1640+10％FBS培养基；AIM-V培养基；X-VIVO 15培养基和ALyS505NK培养基中的一种。
3.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中CD3单克隆抗体的浓度为50～300ng/mL。
4.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述重组人白细胞介素-2的浓度为300-600U/mL。
5.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述自体血浆的浓度为0～5％。
6.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)的培养为扩瓶培养。
7.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)的培养为培养袋培养。
8.根据权利要求1所述的NK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的培养至少5天。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法得到的细胞主要由表型为CD3-CD56+的自然杀伤细胞组成。
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