CN111073854A - 一种适用于脐血来源nk细胞的高效扩增工艺 - Google Patents

一种适用于脐血来源nk细胞的高效扩增工艺 Download PDF

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张扬
李陶
高力扬
张立忠
周晓宇
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明提供一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，所述的制备高效扩增工艺包括了采集脐血、添加试剂盒因子、离心、打匀、培养、转袋、增殖、收集冻存等工序。本发明在扩增NK细胞之前对脐血进行多项指标进行检测，确保脐血符合要求，在NK细胞扩增后进行二次检测，增强NK细胞的产品质量，整个高效扩增工艺操作简便，劳动强度小，制备成本低、扩增工艺易于掌握、制备效率高、制备数量大的优点。

Description

一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺
技术领域
本发明涉及NK细胞扩增技术领域，具体是一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺。
背景技术
NK细胞又称自然杀伤细胞(natural killer cell ,NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞，这种天然杀伤活性无需抗原致敏，并且无MHC限制性。它能自己识别和攻击外来病毒、癌细胞和异常细胞，一旦被激活，通过释放颗粒酶和穿孔素等杀伤性介质及分泌大量细胞因子直接攻击靶细胞，或通过抗体依赖的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，或通过诱导Fas/Fasl和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (Trail)分子使靶细胞凋亡。目前NK细胞的来源主要是靠自体和异源供给，自体NK细胞作用有限，在能够表达HLA的癌细胞面前无法发挥杀伤作用，而且人体自身NK细胞数量有限，NK细胞处于不同的发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型及功能均存在很大的差异。以往的异源NK细胞主要是来源于外周血、骨髓、胚胎和胎盘，不仅难收集供者，且由于分离其他免疫细胞的成本极高，这些都限制了NK细胞在临床中上大规模运用，因此，随时可以进行配型的脐血成为了制备NK细胞的最新来源，现有的脐血制备NK细胞的制备过程中存在着工艺复杂、操作不便、制备效率低、制备数量小的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有脐血制备NK细胞的制备过程中存在着工艺复杂、操作不便、制备效率低、制备数量小的问题，提供一种制备成本低、制备工艺易于掌握、操作方便、制备效率高、制备数量大的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：
一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；
二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；
三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息（如姓名、性别、年龄、等信息）和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；
四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-3次，用封口膜封口，37℃培养箱内包被2h；
五、用2支50ml离心管离心全血，800g×15min离心，用10ml移液管收集脐血血浆，其余血浆56℃水浴灭活30min，放置-20℃10min后再次离心处理，1100g×15min离心，取上清血浆做好标记待用；
六、取步骤五中离心后下部细胞部分，加入D-PBS至50ml打匀；
七、准备两支50ml的高效离心管，各加入12.5ml人淋巴细胞分离液，200g×2min离心，使分离液完全处于隔膜下方且没有气泡，将打匀的细胞缓慢均匀的加入到2个50ml离心管中，800g×15min离心；
八、取分离后的白膜细胞层（新手离心后隔板上的细胞都是所需细胞,待熟练后可舍弃部分细胞），加入到50ml离心管中，加入未加因子的培养基至50ml，吹打均匀，600g×10min离心；
九、步骤八中上部分离出的PBMC用未加任何因子的NK-EX培养基混匀成细胞悬液40ml，细胞悬液中加入相应试剂盒因子，取出包被好的T175瓶，用吸管吸出其中的包被液体，吸的过程中不要碰包被面，加入10ml血浆，加入40ml细胞悬液，用酒精棉球擦拭瓶口和封口膜并用封口膜封口，置于37℃，5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养；
十、NK培养液配制方法：增殖培养基为每瓶1000ml NK-EX培养基加入相应试剂盒因子；活化培养基为每500ml增殖培养基中加入本试剂盒一支相应试剂盒因子；先使用活化培养基，再使用增殖培养基；
十一、第4天：加入40ml活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十二、第6天：加入70ml NK活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十三、第8天转袋：NK细胞在T175培养瓶中培养一段时间，细胞数达到一定数量便要将细胞转入到一个培养袋中继续进行培养，如果还没有到8天，细胞数量已经很多，且培养基已经变黄，则可以先扩一瓶，到第8天时候再进行转袋，转袋时候2袋转到一个袋子内；
（1）从培养箱中拿出培养NK细胞的T175瓶标记为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，显微镜下观察细胞状态和数量，观察过之后将其放在超净工作台内操作，用酒精棉球擦拭瓶口，并将其中的培养液倒入备好的T175培养瓶中标记为
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，将剩余血浆全部倒入该培养瓶内，用移液管吸10ml 活化培养基于培养瓶
Figure 56405DEST_PATH_IMAGE002
内，并不断吹洗瓶的内壁10-20次，如此反复3次，直到把瓶内壁上的大部分细胞吹掉，并把培养液加入到培养瓶
Figure 723009DEST_PATH_IMAGE004
中；
（2）准备一个50ml注射器，检查是否漏气，去除针头和推进器，用镊子夹着注射器放在补液架上；
（3）拿一个血培养袋平铺在超净台内，用酒精棉球擦拭培养袋的进样口管，用镊子打开盖子，将进样管连在50ml注射器上，打开止液夹，加入约100ml活化培养基检测袋子是否漏液；
（4）检测完毕，加入瓶
Figure 801824DEST_PATH_IMAGE004
中的细胞悬液，在该培养瓶内加入新鲜培养液洗一下瓶子，洗液倒入培养袋内，清洗两次；
（5）细胞悬液倒入细胞袋内之后开始加入新鲜的培养基，加入剩下的所有活化培养基。
（6）加入培养基完成之后，排干净进样管内的液体，关闭止液夹，盖上进样管的盖子，用酒精棉球擦拭盖子周围和封口膜，并用封口膜封该培养袋进液管口，放到37度5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养；
十四、第10天：观察细胞生长状态以及细胞的数量，数量达到一定程度，且培养基明显变黄，需要补液500ml，此时加入的是增殖培养基；
（1）将培养袋平铺于超净工作台上，50ml注射器检漏并留管体，置于补液架上；
（2）用镊子撕掉培养袋进液口封口膜，用酒精棉球消毒并打开进液口盖子。
（3）将进液口与注射器进口连接。
（4）将活化培养基（已配）倒入注射器管中，打开进液管上的止液夹，倒入500ml培养液（此时培养袋中共1L培养液）。
（5）拔掉进液管，排净管内液体，关闭止液夹，用镊子盖上盖子，酒精棉擦拭消毒，封口膜封口。
十五、第13天：视细胞生长状态，每个培养袋补加NK增殖1000ml，混匀，取出30ml培养液，送检第三方做细菌，真菌，支原体，内毒素检测同时做好自检；
十六、第16天：收集NK细胞悬液，计数冻存。
所述的步骤二中母体完整的病毒检测体检报告是指对乙肝五项、HCV、 HTLV、HIV、EBV、CMV、梅毒螺旋进行检测的结果。
所述的步骤五中取5ml脐血血浆送第三方检测。
所述的步骤九中加入细胞悬液的整个过程中保持T175瓶包被面处于湿润状态。
所述的步骤十四的第四步中，培养袋内共1L培养液。
所述的步骤十五中的第三方检测是指细菌、真菌、支原体、内毒素检测
有益效果：本发明在扩增NK细胞之前对脐血进行多项指标进行检测，确保脐血符合要求，在NK细胞扩增后进行二次检测，增强NK细胞的产品质量，整个高效扩增工艺操作简便，劳动强度小，制备成本低、扩增工艺易于掌握、制备效率高、制备数量大的优点。
具体实施方式
一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：
一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；
二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；
三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息（如姓名、性别、年龄、等信息）和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；
四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-3次，用封口膜封口，37℃培养箱内包被2h；
五、用2支50ml离心管离心全血，800g×15min离心，用10ml移液管收集脐血血浆，其余血浆56℃水浴灭活30min，放置-20℃10min后再次离心处理，1100g×15min离心，取上清血浆做好标记待用；
六、取步骤五中离心后下部细胞部分，加入D-PBS至50ml打匀；
七、准备两支50ml的高效离心管，各加入12.5ml人淋巴细胞分离液，200g×2min离心，使分离液完全处于隔膜下方且没有气泡，将打匀的细胞缓慢均匀的加入到2个50ml离心管中，800g×15min离心；
八、取分离后的白膜细胞层（新手离心后隔板上的细胞都是所需细胞,待熟练后可舍弃部分细胞），加入到50ml离心管中，加入未加因子的培养基至50ml，吹打均匀，600g×10min离心；
九、步骤八中上部分离出的PBMC用未加任何因子的NK-EX培养基混匀成细胞悬液40ml，细胞悬液中加入相应试剂盒因子，取出包被好的T175瓶，用吸管吸出其中的包被液体，吸的过程中不要碰包被面，加入10ml血浆，加入40ml细胞悬液，用酒精棉球擦拭瓶口和封口膜并用封口膜封口，置于37℃，5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养；
十、NK培养液配制方法：增殖培养基为每瓶1000ml NK-EX培养基加入相应试剂盒因子；活化培养基为每500ml增殖培养基中加入本试剂盒一支相应试剂盒因子；先使用活化培养基，再使用增殖培养基；
十一、第4天：加入40ml活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十二、第6天：加入70ml NK活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十三、第8天转袋：NK细胞在T175培养瓶中培养一段时间，细胞数达到一定数量便要将细胞转入到一个培养袋中继续进行培养，如果还没有到8天，细胞数量已经很多，且培养基已经变黄，则可以先扩一瓶，到第8天时候再进行转袋，转袋时候2袋转到一个袋子内；
（1）从培养箱中拿出培养NK细胞的T175瓶标记为
Figure 768643DEST_PATH_IMAGE002
，显微镜下观察细胞状态和数量，观察过之后将其放在超净工作台内操作，用酒精棉球擦拭瓶口，并将其中的培养液倒入备好的T175培养瓶中标记为
Figure 9131DEST_PATH_IMAGE004
，将剩余血浆全部倒入该培养瓶内，用移液管吸10ml 活化培养基于培养瓶
Figure 428611DEST_PATH_IMAGE002
内，并不断吹洗瓶的内壁10-20次，如此反复3次，直到把瓶内壁上的大部分细胞吹掉，并把培养液加入到培养瓶
Figure 779958DEST_PATH_IMAGE004
中；
（2）准备一个50ml注射器，检查是否漏气，去除针头和推进器，用镊子夹着注射器放在补液架上；
（3）拿一个血培养袋平铺在超净台内，用酒精棉球擦拭培养袋的进样口管，用镊子打开盖子，将进样管连在50ml注射器上，打开止液夹，加入约100ml活化培养基检测袋子是否漏液；
（4）检测完毕，加入瓶
Figure 132442DEST_PATH_IMAGE004
中的细胞悬液，在该培养瓶内加入新鲜培养液洗一下瓶子，洗液倒入培养袋内，清洗两次；
（5）细胞悬液倒入细胞袋内之后开始加入新鲜的培养基，加入剩下的所有活化培养基。
（6）加入培养基完成之后，排干净进样管内的液体，关闭止液夹，盖上进样管的盖子，用酒精棉球擦拭盖子周围和封口膜，并用封口膜封该培养袋进液管口，放到37度5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养；
十四、第10天：观察细胞生长状态以及细胞的数量，数量达到一定程度，且培养基明显变黄，需要补液500ml，此时加入的是增殖培养基；
（1）将培养袋平铺于超净工作台上，50ml注射器检漏并留管体，置于补液架上；
（2）用镊子撕掉培养袋进液口封口膜，用酒精棉球消毒并打开进液口盖子。
（3）将进液口与注射器进口连接。
（4）将活化培养基（已配）倒入注射器管中，打开进液管上的止液夹，倒入500ml培养液（此时培养袋中共1L培养液）。
（5）拔掉进液管，排净管内液体，关闭止液夹，用镊子盖上盖子，酒精棉擦拭消毒，封口膜封口。
十五、第13天：视细胞生长状态，每个培养袋补加NK增殖1000ml，混匀，取出30ml培养液，送检第三方做细菌，真菌，支原体，内毒素检测同时做好自检；
十六、第16天：收集NK细胞悬液，计数冻存。
所述的步骤二中母体完整的病毒检测体检报告是指对乙肝五项、HCV、 HTLV、HIV、EBV、CMV、梅毒螺旋进行检测的结果。
所述的步骤五中取5ml脐血血浆送第三方检测。
所述的步骤九中加入细胞悬液的整个过程中保持T175瓶包被面处于湿润状态。
所述的步骤十四的第四步中，培养袋内共1L培养液。
所述的步骤十五中的第三方检测是指细菌、真菌、支原体、内毒素检测。
上面结合实施例对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的操作工艺包括以下步骤：
一、超净台/生物安全柜提前开紫外消毒30min,并提前开空调机组30min；
二、工作人员消毒灭菌后入洁净区；
三、采70ml脐血，将其放至标本传递窗，检查是否有母体完整的病毒检测体检报告，若没有病毒体检报告，则要需要送脐血血浆到质检中心作以上的病毒检测，核对血袋上相应的信息和采集表上信息是否一致，并观察包装情况、血样有没有异常情况，经核对合格后可进行下一步操作；
四、用5ml移液管吸取18mlD-PBS加入T175培养瓶中，再加入相应试剂盒因子，用移液管吸取T175培养瓶中的D-PBS洗试剂盒2-3次，用封口膜封口，37℃培养箱内包被2h；
五、用2支50ml离心管离心全血，800g×15min离心，用10ml移液管收集脐血血浆，其余血浆56℃水浴灭活30min，放置-20℃10min后再次离心处理，1100g×15min离心，取上清血浆做好标记待用；
六、取步骤五中离心后下部细胞部分，加入D-PBS至50ml打匀；
七、准备两支50ml的高效离心管，各加入12.5ml人淋巴细胞分离液，200g×2min离心，使分离液完全处于隔膜下方且没有气泡，将打匀的细胞缓慢均匀的加入到2个50ml离心管中，800g×15min离心；
八、取分离后的白膜细胞层（新手离心后隔板上的细胞都是所需细胞,待熟练后可舍弃部分细胞），加入到50ml离心管中，加入未加因子的培养基至50ml，吹打均匀，600g×10min离心；
九、步骤八中上部分离出的PBMC用未加任何因子的NK-EX培养基混匀成细胞悬液40ml，细胞悬液中加入相应试剂盒因子，取出包被好的T175瓶，用吸管吸出其中的包被液体，吸的过程中不要碰包被面，加入10ml血浆，加入40ml细胞悬液，用酒精棉球擦拭瓶口和封口膜并用封口膜封口，置于37℃，5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养；
十、NK培养液配制方法：增殖培养基为每瓶1000ml NK-EX培养基加入相应试剂盒因子；活化培养基为每500ml增殖培养基中加入本试剂盒一支相应试剂盒因子；先使用活化培养基，再使用增殖培养基；
十一、第4天：加入40ml活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十二、第6天：加入70ml NK活化培养基，加入10ml血浆，加入相应试剂盒因子；
十三、第8天转袋：NK细胞在T175培养瓶中培养一段时间，细胞数达到一定数量便要将细胞转入到一个培养袋中继续进行培养；
（1）从培养箱中拿出培养NK细胞的T175瓶标记为
Figure 558588DEST_PATH_IMAGE001
，显微镜下观察细胞状态和数量，观察过之后将其放在超净工作台内操作，用酒精棉球擦拭瓶口，并将其中的培养液倒入备好的T175培养瓶中标记为
Figure 988432DEST_PATH_IMAGE002
，将剩余血浆全部倒入该培养瓶内，用移液管吸10ml 活化培养基于培养瓶
Figure 698899DEST_PATH_IMAGE001
内，并不断吹洗瓶的内壁10-20次，如此反复3次，直到把瓶内壁上的大部分细胞吹掉，并把培养液加入到培养瓶
Figure 974023DEST_PATH_IMAGE002
中；
（2）准备一个50ml注射器，检查是否漏气，去除针头和推进器，用镊子夹着注射器放在补液架上；
（3）拿一个血培养袋平铺在超净台内，用酒精棉球擦拭培养袋的进样口管，用镊子打开盖子，将进样管连在50ml注射器上，打开止液夹，加入约100ml活化培养基检测袋子是否漏液；
（4）检测完毕，加入瓶
Figure 86335DEST_PATH_IMAGE002
中的细胞悬液，在该培养瓶内加入新鲜培养液洗一下瓶子，洗液倒入培养袋内，清洗两次；
（5）细胞悬液倒入细胞袋内之后开始加入新鲜的培养基，加入剩下的所有活化培养基；
（6）加入培养基完成之后，排干净进样管内的液体，关闭止液夹，盖上进样管的盖子，用酒精棉球擦拭盖子周围和封口膜，并用封口膜封该培养袋进液管口，放到37度5%二氧化碳饱和湿度培养箱中培养；
十四、第10天：观察细胞生长状态以及细胞的数量，数量达到一定程度，且培养基明显变黄，需要补液500ml，此时加入的是增殖培养基；
（1）将培养袋平铺于超净工作台上，50ml注射器检漏并留管体，置于补液架上；
（2）用镊子撕掉培养袋进液口封口膜，用酒精棉球消毒并打开进液口盖子；
（3）将进液口与注射器进口连接；
（4）将活化培养基倒入注射器管中，打开进液管上的止液夹，倒入500ml培养液；
（5）拔掉进液管，排净管内液体，关闭止液夹，用镊子盖上盖子，酒精棉擦拭消毒，封口膜封口；
十五、第13天：视细胞生长状态，每个培养袋补加NK增殖1000ml，混匀，取出30ml培养液，送检第三方做检测同时做好自检；
十六、第16天：收集NK细胞悬液，计数冻存。
2.根据权利要求1所述的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的步骤二中母体完整的病毒检测体检报告是指对乙肝五项、HCV、 HTLV、HIV、EBV、CMV、梅毒螺旋进行检测的结果。
3.根据权利要求1所述的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的步骤五中取5ml脐血血浆送第三方检测。
4.根据权利要求1所述的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的步骤九中加入细胞悬液的整个过程中保持T175瓶包被面处于湿润状态。
5.根据权利要求1所述的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的步骤十四的第四步中，培养袋内共1L培养液。
6.根据权利要求1所述的适用于脐血来源NK细胞的高效扩增工艺，其特征在于，所述的步骤十五中的第三方检测是指细菌、真菌、支原体、内毒素检测。
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