ES2199999T3 - Procedimiento para el cultivo de macrofagos. - Google Patents

Abstract

SE DESCUBRE UN METODO PARA CULTIVAR CELULAS PRESENTES EN SUSPENSION QUE CONSISTE EN COLOCAR LAS CELULAS, UNO O MAS REACTIVOS, Y UN MEDIO DE CULTIVO EN RECIPIENTES ESTERILES SEPARADOS CONECTADOS JUNTOS Y HERMETICAMENTE SELLADOS MEDIANTE TUBERIAS ESTERILES QUE POSEEN DISPOSITIVOS DE CONTROL DE FLUJO QUE PUEDEN SER ABIERTOS Y CERRADOS MANUALMENTE, Y EN ABRIR Y CERRAR LOS DISPOSITIVOS DE CONTROL DE FLUJO COMO SE REQUIERA PARA TRANSFERIR EL CONTENIDO DE UN RECIPIENTE A OTRO, AISLANDO AL MISMO TIEMPO EL CONTENIDO DE LOS RECIPIENTES DEL AMBIENTE EXTERNO. EL METODO ES PARTICULARMENTE UTIL PARA CULTIVAR MACROFAGOS EN UNA ATMOSFERA COMPLETAMENTE CONTROLADA SELLADA HERMETICAMENTE DE LA ATMOSFERA EXTERIOR.

Description

Procedimiento para el cultivo de macrófagos.

La presente invención se refiere a un procedimiento y un sistema para cultivar células. El procedimiento y el sistema son particularmente útiles para el crecimiento de macrófagos a partir de sangre humana, por lo que se describen a continuación en esta solicitud.

Los macrófagos, denominados células fagocíticas, fagocitan y digieren eritrocitos viejos y dañados, bacterias y otras partículas microscópicas. Se ha descubierto que los macrófagos también desempeñan un importante papel en la reparación de heridas. Producen sustancias que estimulan la proliferación de fibroblastos, la síntesis de colágeno de los fibroblastos y otros elementos necesarios para la curación de heridas. Por ejemplo, se ha descubierto que la reparación de heridas se puede acelerar en los ratones adultos mediante la aplicación de macrófagos procedentes de fluidos peritoneales de ratones jóvenes (D. Danon, M.A. Kowatch y G.S. Roth, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, pp. 2018-2020, marzo 1989).

El documento US 5.236.716 describe un concentrado de plaquetas, que contiene una densidad inferior a 10^{6} leucocitos, obtenido a partir de una unidad de sangre total en un sistema cerrado de bolsas múltiples de sangre, en un tiempo aproximadamente inferior a las ocho horas posteriores a la extracción de la unidad de sangre total del humano. El concentrado se almacena en una bolsa de plaquetas fabricada de cloruro de polivinilo y plastificada con uno del grupo de plastificantes compuesto por trimetilo de trioctilo y etileno de acetato vinilo.

El documento US 5.070.012 describe un procedimiento utilizado para estudiar un elemento regulador de un sistema regulador de la iniciación transcripcional en una célula viable de mamífero que consta de un complejo de expresión de tipo no silvestre, que comprende una región reguladora de la iniciación transcripcional que comprende, a su vez, una secuencia reguladora de interés y un gen estructural que codifica beta-galactosidasa. Esta beta-galactosidasa emplea como sustrato una beta-galactosidil éter de un compuesto fenólico fluorescente que libera un producto fluorescente en la hidrólisis de dicho éter. El procedimiento comprende: introducir sustancialmente de manera irreversible el sustrato en la célula a través de una solución hipotónica a una temperatura que oscila entre 25ºC y 40ºC; incubar la célula a una temperatura aproximadamente inferior al punto de congelación de la membrana; y detectar el producto fluorescente en la célula como un indicador de la actividad de dicho elemento regulador.

Chockri y col. (Anticancer Research 12:2257-2260, 1992) describen un procedimiento para la preparación de macrófagos mediante el cultivo de monocitos en un medio de cultivo que contiene 1,25-dihidroxivitamina D3 y GM-CSF. Existen evidencias de que los macrófagos obtenidos por este procedimiento presentan: (a) un incremento del 20-30% de la actividad citotóxica sin interferón gamma (IFN-\gamma) con respecto a los macrófagos normales, (b) un aumento aproximado del 20-40% de la actividad citotóxica con interferón gamma (IFN-\gamma) respecto a los macrófagos normales o (c) una prolongación de la desactivación de la actividad citotóxica como respuesta a la activación con una cantidad de interferón gamma (IFN-\gamma) tal que, tras 60 h de activación con IFN-\gamma, la actividad citotóxica es igual o superior al 30%, comparada con la máxima actividad citotóxica que presentan los macrófagos debido a la activación con IFN-\gamma, considerada la actividad citotóxica como el porcentaje de inhibición resultante de la incorporación de [30H] timidina por células tumorales diana (células U 937).

El resumen número de acceso 88-193673, del Índice Mundial de Patentes Derwent afirma que el documento JP 63-130600 describe una célula tipo macrofágica derivada de una célula humana que se cultiva con una sustancia de activación macrofágica. Según informa el documento, la célula tipo macrofágica se prepara in vitro a partir del cultivo de un monocito de eritrocito periférico, tejido macrofágico, una célula precursora de macrófagos (por ejemplo: célula
HL-60, célula THP-1 de célula Mono-1-207) y agentes que actúan en la diferenciación celular (por ejemplo: forbol éster, diterpenoides, etc.). La sustancia de activación macrofágica es comúnmente un derivado de la vitamina A (por ejemplo: ácido de la vitamina A, alcohol de la vitamina A, acetato de la vitamina A, etc.), DMSO, hidrocortisona, lipopolisacárido, etc..

Los presentes procedimientos de obtención de macrófagos a partir de monocitos de la sangre conocidos gracias a la técnica anterior resultan complicados, caros, exigen mucho tiempo y son difíciles de aplicar sistemáticamente porque requieren mano de obra especializada, materiales caros no reutilizables y un equipo de laboratorio especializado. Asimismo, el desarrollo de estas técnicas conlleva un alto riesgo de contaminación durante la preparación, por lo que se requieren pruebas regulares que aseguren la ausencia de infección bacteriana en la suspensión de macrófagos resultante.

La presente invención tiene como uno de sus objetivos proveer un procedimiento y un sistema para el crecimiento de células, particularmente macrófagos, que presentan ventajas con respecto a lo arriba expuesto. El objeto de la presente invención consiste, concretamente, en proveer un procedimiento y un sistema para el crecimiento de células, particularmente macrófagos, que no requieran mano de obra especializada, materiales caros no reutilizables y un equipo de laboratorio especializado y que, en cierto modo, reduzcan considerablemente el riesgo de infección.

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para el cultivo de macrófagos caracterizado por las siguientes etapas: separar a partir de una cantidad inicial de sangre una fracción de leucocitos que incluye una mezcla de leucocitos y eritrocitos, cuya concentración de leucocitos es superior a la de la cantidad inicial de sangre; someter dicha fracción de leucocitos a un choque osmótico, más destructivo con los eritrocitos que con los leucocitos; restablecer la isotonicidad en dicha fracción de leucocitos; añadir la fracción de leucocitos a un medio de cultivo contenido en un envase para obtener una suspensión de leucocitos; e incubar dicho medio de cultivo.

En un aspecto, los macrófagos se cultivan sometiendo a los leucocitos, al menos, a un reactivo estéril y cultivando las células en un medio de cultivo estéril, lo que comprende: colocar en tres envases estériles separados las células en suspensión, al menos un reactivo y el medio de cultivo, interconectar los envases y sellar herméticamente sus contenidos de la atmósfera mediante tubos estériles que tienen dispositivos de control del flujo de fluido que pueden abrirse y cerrarse; y abrir y cerrar los mecanismos de control del flujo del fluido, según se requiera, para transferir los contenidos de un envase a otro mientras se aíslan del medio exterior los contenidos del envase.

La invención es particularmente útil para el cultivo de los macrófagos a partir de sangre.

El proceso completo puede llevarse a cabo, de este modo, en una atmósfera controlada totalmente y sellada herméticamente de la atmósfera exterior, por lo que existe bajo riesgo de infección y, por lo tanto, no se necesitan campanas extractoras estériles especiales, flujos laminares y herramientas estériles no reutilizables. Las pruebas que aseguran la ausencia de infección bacteriana no son cruciales. De hecho, no se detectó ningún caso de infección en las 150 preparaciones de macrófagos del procedimiento de la presente invención, en el que se probaba cada segunda y tercera preparación.

Se ha detectado que el hecho de someter la fracción de leucocitos a un choque osmótico y restablecer posteriormente la isotonicidad provoca la destrucción, de forma sustancial, de todos los eritrocitos y de un número escaso de leucocitos. El resultado es una suspensión que presenta una alta concentración de leucocitos apropiada para su cultivo en un envase que contiene un medio de cultivo. También se ha detectado que este tratamiento con choque osmótico de la fracción de leucocitos aumenta la diferenciación de monocitos en macrófagos, como se observa morfológicamente.

Preferentemente, la fracción de leucocitos se somete a un choque osmótico al mezclarla con un volumen de agua destilada quince veces superior a su volumen durante un periodo de 30-90 segundos, aunque se ha observado que un periodo de 60 segundos es particularmente efectivo. Asimismo, la isotonicidad se restablece preferentemente al añadir a la fracción de leucocitos una disolución hipertónica de 1/10 parte el volumen del agua destilada y diez veces la concentración de la disolución isotónica, preferiblemente una solución de NaCl al 9%.

Otra de las características importantes que presenta la invención es el hecho de que se añade un suero preparado a partir de la cantidad inicial de sangre a los leucocitos separados en el medio de cultivo. Este suero se prepara separando un volumen deseado de plasma a partir de la cantidad inicial de sangre, añadiendo un agente coagulante al plasma para producir suero y, finalmente, separando el suero del plasma coagulado. Anteriores procedimientos para la formación de macrófagos introducían suero fetal bovino o mezcla de suero humano. Estos procedimientos conllevan un cierto riesgo, puesto que el suero fetal bovino puede provocar la creación de anticuerpos contra este suero en el huésped tratado y la mezcla de suero humano aumenta la probabilidad de peligro de infección vírica. Estos peligros se evitan utilizando suero preparado a partir de la misma sangre de la que se extraen los leucocitos.

De acuerdo con otro aspecto más, la presente invención provee un aparato para el cultivo de células en suspensión, que someta a las células, al menos, a un reactivo estéril y que cultive las células en un medio de cultivo estéril, que comprenda: un primer envase preparado para recibir las células en suspensión, un segundo envase preparado para recibir, al menos, un reactivo y un tercer envase preparado para recibir el medio de cultivo. Los envases están interconectados y sellados herméticamente de la atmósfera mediante tubos estériles que poseen dispositivos de control del flujo de fluido que pueden abrirse y cerrarse, según se requiera, para transferir los contenidos de un contenedor a otro, mientras se aíslan los contenidos del envase del medio exterior.

Anteriormente se conocía, según lo arriba expuesto, que la reparación de heridas se podía acelerar en los ratones adultos mediante la aplicación de macrófagos procedentes de fluidos peritoneales de ratones jóvenes. Sin embargo, al solicitante no le consta que se conociera el uso de macrófagos procedentes de la sangre para su aplicación en el tratamiento terapéutico de un cuerpo vivo, particularmente, para la curación de heridas.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención, por tanto, prevé un procedimiento para el tratamiento terapéutico de un cuerpo vivo mediante la aplicación de macrófagos cultivados a partir de sangre.

Otras características y ventajas de la invención se muestran en la descripción del siguiente ejemplo específico de un procedimiento para el crecimiento de macrófagos de acuerdo con la presente invención, que utiliza un sistema como el ilustrado en el dibujo de la única figura adjunta.

El siguiente ejemplo describe un procedimiento para el crecimiento de macrófagos a partir de leucocitos contenidos en una cantidad de sangre humana obtenida del banco de sangre. El procedimiento descrito se lleva a cabo en un sistema totalmente cerrado que no expone ni las células ni los diferentes medios utilizados en el procedimiento al medio exterior. Antes del inicio del procedimiento, el sistema ilustrado en la figura se elabora organizando los siguientes envases en forma de bolsas de plástico flexibles (BP_{1}-BP_{8}): la bolsa de plástico BP_{1}, se utiliza para almacenar la cantidad inicial de sangre que se procesará, las bolsas de plástico BP_{2} y BP_{3}, que se utilizan para recibir una fracción de plasma y una fracción de leucocitos respectivamente, están separadas de la cantidad inicial de sangre contenida en la bolsa de plástico BP_{1} durante el procedimiento; las bolsas de plástico BP_{4}, BP_{5} y BP_{6} se utilizan para recibir 150 ml de agua destilada, 15 ml de una solución de NaCl al 9% y CaCl_{2} respectivamente, usados como reactivos durante el procedimiento; y la bolsa de plástico BP_{7} se utiliza para almacenar un medio de cultivo usado durante el procedimiento. Si se estima, se puede incluir una octava bolsa de plástico BP_{8} para almacenar también un medio de cultivo. Preferentemente, las bolsas de plástico BP_{7} y BP_{8} contienen un puerto de inyección PI (mostrado únicamente en la bolsa de plástico BP_{7}) que se utiliza para inyectar uno o más aditivos al medio de cultivo que contiene la bolsa, como se describe más detalladamente a continuación.

Todas las bolsas de plástico desde la BP_{1} hasta la PB_{8} están interconectadas mediante tubos generalmente designados con el número 2, que sellan herméticamente los contenidos de cada bolsa de la atmósfera. Los tubos ilustrados con el número 2 incluyen una pluralidad de válvulas manuales, en forma de pinzas correderas, que pueden cerrarse manualmente para aislar los contenidos de cada bolsa de las otras o abrirse manualmente para permitir la transferencia de contenidos de una bolsa a otra durante las distintas etapas del procedimiento. Así, se observa que el sistema ilustrado de bolsas de plástico BP_{1}-BP_{8}, interconectas mediante los tubos designados con el número 2 que tienen pinzas correderas, aísla todos los contenidos del envase del medio exterior, mientras que permite la transferencia de dichos contenidos de un envase a otro durante las diferentes etapas del procedimiento.

En primer lugar, se recoge una cantidad de sangre humana en la bolsa BP_{1} (que contiene una anticoagulante) por punción venosa en el banco de sangre, usando una aguja 4/0 estéril. Las bolsas BP_{2} y BP_{3} están inicialmente vacías. Las bolsas BP_{1}, BP_{2} y BP_{3} se introducen en un contenedor de la centrífuga, mientras que las bolsas restantes, de la BP_{4} a la BP_{6}, se introducen en el contenedor contrario de la centrífuga, con todas las bolsas interconectadas a través del tubo número 2 que tiene todas las pinzas correderas
(BC_{1}-BC_{9}) cerradas. Los dos contenedores de la centrífuga están equilibrados.

Durante cinco minutos, se centrifugan las bolsa a 2.500 r.p.m. (1.000 g). Esto provoca que la sangre contenida en la bolsa de plástico BP_{1} se separe en una fracción de plasma, en una fracción de leucocitos (capa leuco-plaquetaria) y en una fracción de eritrocitos. La fracción de plasma se transfiere a la bolsa BP_{2} tras la apertura de las pinzas correderas BC_{1} y BC_{2} y la compresión de la bolsa BP_{1}. Posteriormente, la fracción de leucocitos se transfiere a la bolsa BP_{3} tras la apertura de las pinzas correderas BC_{1}, BC_{4} y BC_{3}.

En esta etapa, una parte de la fracción del plasma se devuelve a la fracción de eritrocitos contenida en la bolsa de plástico BP_{1} tras la apertura las pinzas correderas BC_{3}, BC_{4} y BC_{1}. La bolsa BP_{1} puede, entonces, desconectarse cerca de la pinza corredera BC_{1} (una vez sellado herméticamente el tubo de plástico) y devolverse al banco de sangre para su uso.

La fracción de leucocitos que contiene la bolsa BP_{3} es una mezcla de leucocitos y eritrocitos, cuya concentración de leucocitos es superior a la de la cantidad inicial de sangre.

La fracción de leucocitos que se encuentra ahora en la bolsa BP_{3} se somete a un choque osmótico, más destructivo (lisis de choque) con los eritrocitos que con los leucocitos de la bolsa. Esto se produce mediante la transferencia de 150 ml de agua destilada de la bolsa BP_{4} a la bolsa BP_{3} gracias a la apertura de las pinzas correderas BC_{6}, BC_{5} y BC_{3}. Este proceso ha de realizarse lo más rápidamente posible, por lo que se coloca en plano la bolsa BP_{3} en una mesa y se presiona con una mano la bolsa BP_{4} para descargar el agua de esta bolsa en la bolsa BP_{3}, mientras que la otra mano se utiliza para mezclar el agua con la fracción de leucocitos de la bolsa BP_{3}. Esta mezcla se realiza en un periodo de tiempo que oscila entre
30-90 segundos, aunque se obtienen mejores resultados cuando se realiza durante 35 segundos. Como se ha indicado anteriormente, el hecho de someter la fracción de leucocitos, incluida en la bolsa BP_{3}, a un choque osmótico destruye la mayoría de los eritrocitos mediante una lisis de choque, por lo que se produce un aumento sustancial de la concentración de leucocitos contenida en la bolsa.

Tras esta etapa en la que se mezcla el agua destilada con la fracción de leucocitos en la bolsa BP_{3} durante exactamente 35 segundos, la solución de NaCl al 9% contenida en la bolsa BP_{5} se introduce en la bolsa de plástico BP_{3} mediante la apertura de las pinzas correderas BC_{7}, BC_{5} y BC_{3} y mediante el cierre de la pinza corredera BC_{6}, mientras que se presiona la bolsa BP_{5} para descargar su contenido en la bolsa BP_{3}. La solución de NaCl, que se introduce de esta forma en la bolsa BP_{3}, es una solución hipertónica que restablece la isotonicidad en la fracción de leucocitos de la bolsa BP_{3}.

Seguidamente, los 12 ml de la solución de CaCl_{2} 20mM contenidos en la bolsa BP_{6} se transfieren a la fracción de plasma contenida en la bolsa BP_{2} mediante la apertura de las pinzas correderas BC_{8}, BC_{5}, BC_{4} y BC_{2}, mientras que las pinzas correderas restantes permanecen cerradas. El CaCl_{2}, agente coagulante que permite la coagulación, inicia la coagulación del plasma. La fracción de plasma contenida en la bolsa BP_{2} puede colocarse dentro de un ultracongelador, mientras que el resto de las bolsas permanecen fuera, durante diez minutos y posteriormente se retira la bolsa. Este procedimiento causa la permeación de las plaquetas sanguíneas a través de la membrana y la liberación de los factores de crecimiento derivados de las plaquetas. La bolsa de plasma se coloca ahora en un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos para completar la coagulación. Si la coagulación no se completa en este tiempo, lo que se podrá apreciar por la apariencia de los contenidos de la bolsa, la bolsa se devuelve al baño de agua a 37ºC hasta que la coagulación se haya completado.

Las pinzas correderas BC_{7} y BC_{8} permanecerán cerradas y las bolsas BP_{5} y BP_{6} pueden retirarse una vez se ha sellado herméticamente el tubo de plástico cerca de las pinzas.

El sistema de bolsas se centrifuga posteriormente a 1.500 r.p.m. (580 g) durante cinco minutos. Esto sedimenta la parte coagulada de plasma en la bolsa BP_{2}, dejando el suero como sobrenadante. Asimismo, sedimenta los leucocitos en la bolsa BP_{3}. El líquido sobrenadante de esta segunda bolsa se transfiere a la bolsa BP_{4}, mediante la apertura de las pinzas correderas BC_{3}, BC_{5} y BC_{6}. La bolsa BP_{4}, que originariamente contenía el agua destilada, ahora se utiliza como un envase de residuos que recibe las células sometidas a choque lítico y hemolisado en el líquido transferido desde la bolsa BP_{3}, mientras que los leucocitos y el escaso número de eritrocitos que han resistido al choque osmótico permanecen en la bolsa BP_{3}.

El medio de cultivo que contiene la bolsa BP_{7} se transfiere ahora a la bolsa BP_{3} mediante la apertura de las pinzas correderas BC_{9}, BC_{5} y BC_{3} para resuspender los leucocitos en la bolsa BP_{3}. Los agregados celulares están dispersos como consecuencia de la manipulación de la bolsa BP_{3}, por lo que la suspensión se vuelve a transferir a la bolsa de cultivo BP_{7}.

El suero en la bolsa BP_{2} que ha sido separado mediante la centrifugación se introduce en el medio líquido de cultivo contenido en la bolsa BP_{7}, en una cantidad que constituye 10/100 partes del volumen del medio de cultivo. Preferentemente, se utiliza el medio de cultivo RPMI (Rosewell Park Memorial Institute). Si, por ejemplo, la bolsa de cultivo BP_{7} contiene 60 ml de RPMI, se añaden a esta bolsa aproximadamente 6 ml de suero procedente de la bolsa de plasma BP_{2}. Este proceso se realiza mediante la apertura de las pinzas correderas BC_{2}, BC_{4}, BC_{5} y BC_{9}. En esta etapa, las bolsas BP_{2} y BP_{3} pueden desconectarse sellando el tubo de plástico cerca de la pinza corredera BC_{5}.

El puerto inyector PI de la bolsa BP_{7} que contiene un medio de cultivo se limpia posteriormente con etanol y se inyecta una mezcla de antibióticos compuesta por penicilina y estreptomicina que incluye un tampón (HEPES) mediante una jeringa de 5 ml con una aguja 18G a través del puerto de inyección PI. La jeringa se retira, pero la aguja permanece en el puerto de inyección PI y se utiliza para inyectar aire esterilizado en la bolsa BP_{7} mediante el uso de una bomba de hinchar que inyecta el aire a través de un filtro de 0,2 micras de poro hasta que la bolsa alcanza un grosor aproximado de 3 cm a 4 cm.

El anterior procedimiento, hasta este punto, normalmente dura tres horas aproximadamente. La bolsa de cultivo se introduce posteriormente en una incubadora a 37ºC durante al menos diez horas, preferiblemente veinte horas.

Tras la incubación, el sobrenadante de la bolsa de cultivo BP_{7} se transfiere a la bolsa de plástico vacía PB_{4}, que sirve como un envase de residuos. El contenido de la bolsa de cultivo BP_{7} está formado ahora, en su gran mayoría, por células adherentes. Estas células son leucocitos o monocitos que ya han adquirido las características morfológicas de los macrófagos como, por ejemplo, células ahusadas, células triangulares y pseudópodos emitidos por las células.

Posteriormente, se introducen en la bolsa de cultivo BP_{7} aproximadamente 10 ml de medio de cultivo fresco a 37ºC, que procede de la bolsa de cultivo BP_{8}, y las células adherentes de esta primera bolsa se limpian inclinando la bolsa varias veces para separar las células que están sedimentadas pero no adheridas. Este líquido limpiador se transfiere después a la bolsa BP_{4} o "envase de residuos". El procedimiento de limpieza se repite.

Se estima el número de macrófagos que se adhieren en la superficie interna de la bolsa de plástico BP_{7} mediante un microscopio invertido (objetivo 20\times, ocular 15\times). Con este aumento, el número de macrófagos contenidos en la bolsa equivale a aproximadamente 40.000 veces el número de macrófagos observados dentro del campo del microscopio (es decir, existen aproximadamente 40.000 campos de microscopio en la superficie interna de la bolsa BP_{7}, en este caso particular). Así, si el campo contiene 400 macrófagos, por ejemplo, se puede estimar que existen aproximadamente dieciséis millones de macrófagos en el interior de la bolsa. El líquido limpiador se transfiere ahora a la bolsa BP_{4}.

Si se desea obtener aproximadamente dos millones de macrófagos por mililitro, se transferirán aproximadamente 8 ml de RPMI de la bolsa BP_{8} a la bolsa PB_{7}.

En esta etapa, la bolsa de cultivo PB_{7} se coloca en un plato frío metálico a una temperatura de aproximadamente 4ºC, lo que provoca que los macrófagos adheridos se separen de la superficie interna de la bolsa BP_{7}. La separación de los macrófagos se acelera mediante la aplicación de un plato de vidrio que comprime la bolsa entre el plato de vidrio y el plato frío, mientras que los dos platos y, por lo tanto, la bolsa situada en medio, se inclinan hacia atrás y hacia adelante varías veces para producir una agitación mecánica del líquido contenido en la bolsa. Este procedimiento dura aproximadamente 30 minutos.

Las células pueden retirarse entonces de la bolsa utilizando una jeringa y una aguja estériles no reutilizables a través del puerto de inyección PI. Se pueden utilizar algunas gotas para el contaje de los macrófagos y, de acuerdo con los resultados obtenidos, los macrófagos pueden concentrarse, si se requiere, en un tubo de ensayo estéril y no reutilizable mediante centrifugación.

Aunque el procedimiento anterior describe un ejemplo de un método para la formación de macrófagos a partir de sangre humana, es necesario precisar que el método puede incluir variaciones. Por ejemplo, se pueden utilizar otras soluciones hipertónicas diferentes del NaCl, otros agentes coagulantes diferentes del CaCl_{2} y otros medios de cultivo líquidos diferentes del RPMI. Además, se pueden utilizar otras técnicas para la separación inicial de los leucocitos como, por ejemplo, la filtración o la leucoforesis. Se ha descubierto también que durante el periodo de incubación (al menos diez horas, preferentemente 20-24 horas) a 37ºC, un aumento de la temperatura hasta los 41ºC durante una hora como mínimo (preferentemente 1,5 horas) durante la primera parte del periodo de incubación, produce un "choque de calor" que acelera la diferenciación de los monocitos en macrófagos.

Otra variación podría consistir en la inclusión de una mezcla de CO_{2} al 5% en el aire esterilizado que se introduce en la bolsa de cultivo, en lugar de aire simple. Además, el sistema de bolsas puede estar fabricado por subsistemas de bolsas interconectadas como sea necesario mediante un Dispositivo de Conexión Estéril. Por ejemplo, el sistema colector de sangre (BP_{1}-BP_{3}) podría estar conectado al sistema de bolsas de procesamiento de los macrófagos (BP_{4}-BP_{8}) tras las separación de los leucocitos en la bolsa BP_{3} y desconexión de la bolsa de eritrocitos BP_{1}.

También además, aunque la invención ha resultado ser particularmente útil para la formación de macrófagos, ha de apreciarse que la técnica y el sistema que utilizan envases, tubos y pinzas correderas que permiten que los contenidos de los diferentes envases sean transferidos, como se requiera, en un sistema cerrado sellado herméticamente, puede resultar ventajoso para el cultivo de otros tipos celulares sin riesgo de resultar infectados por la atmósfera externa. Los tubos utilizados pueden interconectarse mediante conectores convencionales, tales como las rosetas u otros conectores multipuerto.

Además, ciertos aspectos de la invención pueden utilizarse independientemente de otros aspectos. Por ejemplo, el procedimiento de crecimiento de macrófagos arriba descrito que emplea una técnica de sistema cerrado y de autosuero puede utilizar otras técnicas diferentes a las de choque osmótico (por ejemplo, exposición hipertónica, metales pesados, etc.) para inducir la diferenciación de los monocitos en macrófagos. La invención también puede utilizarse para el crecimiento de otros tipos celulares distintos de los macrófagos.

Claims (9)

1. Un procedimiento para el cultivo de macrófagos caracterizado por las siguientes etapas: separar a partir de una cantidad inicial de sangre una fracción de leucocitos que incluye una mezcla de leucocitos y de eritrocitos cuya concentración de leucocitos es superior a la de la cantidad inicial de sangre; someter dicha fracción de leucocitos a un choque osmótico, más destructivo con los eritrocitos que con los leucocitos; restablecer la isotonicidad en dicha fracción de leucocitos; añadir dicha fracción de leucocitos a un medio de cultivo contenido en un envase para obtener una suspensión de leucocitos; e incubar dicho medio de cultivo.

2. El procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el suero preparado a partir de dicha cantidad inicial de sangre se añade a dicha fracción de leucocitos después de que la isotonicidad ha sido restablecida y antes de que la fracción de leucocitos haya sido incubada en un medio de cultivo.

3. El procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque dicho suero se prepara separando, a partir de dicha cantidad inicial de sangre, una fracción de plasma, añadiendo un agente coagulante a dicha fracción de plasma para producir dicho suero y separando dicho suero del plasma coagulado.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 caracterizado porque la cantidad inicial de sangre, cada fracción separada de ésta, y cada reactivo utilizado en el procedimiento están contenidos en envases separados, los cuales están interconectados y sellados herméticamente de la atmósfera mediante tubos que tienen pinzas que pueden cerrarse y abrirse manualmente para permitir la transferencia de contenidos de un envase a otro y para aislar, por tanto, todos los contenidos de los envases del ambiente exterior.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 caracterizado por someter a dichos leucocitos, al menos, a un reactivo estéril y cultivar estos leucocitos en un medio de cultivo estéril.

6. El procedimiento según la reivindicación 5 caracterizado por las etapas de colocar en tres envases estériles separados dichos leucocitos, al menos dicho reactivo y dicho medio de cultivo; interconectar dichos envases y sellar herméticamente sus contenidos de la atmósfera mediante un tubo estéril que tiene dispositivos de control de flujo del fluido que pueden abrirse y cerrarse; y abrir y cerrar dichos dispositivos de control de flujo del fluido, según se requiera, para transferir los contenidos de un envase a otro, mientras se aíslan del entorno exterior los contenidos del envase.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado por someter dicha fracción de leucocitos a un choque osmótico al mezclar la fracción de leucocitos con un volumen de agua destilada durante un periodo de 30-90 segundos, en el que el volumen del agua destilada es quince veces superior al volumen de la fracción de leucocitos.

8. El procedimiento según la reivindicación 7 caracterizado porque la isotonicidad de la fracción de leucocitos se restablece al añadir a la fracción de leucocitos una solución hipertónica de una décima parte el volumen del agua destilada y diez veces la concentración de la solución isotónica.

9. El procedimiento según la reivindicación 8 caracterizado porque la solución hipertónica comprende una solución de NaCl al 9%.