JPH10502257A - 細胞、特にマクロファージを培養する方法、及びシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞、一つ以上の試薬、及び培養液のそれぞれを、手動で開閉できる流体流動調節器を備えた無菌の管で密封された別々の、連結無菌容器中に設置し、該流体流動調節器を開閉して、該容器の内容物を外部環境と単離しつつ、該無菌容器中の内容物を別の容器へ必要に応じて移すことで、浮遊液中に存在する細胞を培養する方法。この方法は、マクロファージを、外的環境より密封した環境を完全に制御することで、マクロファージを培養するのに特に有益である。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞、特にマクロファージを培養する方法、及びシステム 本発明は細胞を培養する方法、及びシステムに関する。本方法及び本システム は、ヒトの血液よりマクロファージを増殖させるのに特に有益であり、よって以 下にはこの応用に関して記載する。 マクロファージはその名のごとく、古くなって悪化（deteriorate）した赤血 球、細菌、及びその他の微視的粒子を貧食して消化する、食細胞である。マクロ ファージは、創傷の回復において重要な役割を演ずることが分かっている。マク ロファージは。線維芽細胞の増殖、及び線維芽細胞によるコラ−ゲンの合成を刺 激する物質、並びに創傷の治癒に必要なその他の要素を産生する。例えば、老齢 のマウスでは、若年のマウスの腹膜液由来のマクロファージを創傷へ与えること で、創傷の回復が促進することが分かっている（D．Danon，M.A．Kowatch and G .S．Roth，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．86，pp2018-2020，March 1989） 。 マクロファージを血液中の単球より調整する現在の方法は複雑であり、また費 用がかさみ、時間がかかり、更に定型的に応用することが難しいが、これはかな り専門的な作業と、高価な使い捨て用の物質、及び専門化した実験室設備が必要 になるからである。更に、現在の技術では、調整中の汚染の危険性がかなり高く 、そのため、得られるマクロファージの浮遊液中に細菌感染がないことを確認す るための定期的試験が必要になる。 本発明の目的は、細胞、特にマクロファージを増殖させる方法、及びシステム を提供することにあり、これには上記したような利点がある。より特異的には、 本発明の目的は細胞、特にマクロファージを増殖させる方法であって、専門的な 作業、高価な使い捨て用の物質や、専門的な実験室を必要とせず、感染の危険性 をかなり低減する、上記の方法、及びを提供することにある。 本発明の一つの側面によれば、細胞を少なくとも一つの無菌の試薬に供し、無 菌の培養液中で該細胞を培養することにより、浮遊液中に存在する細胞を培養す る方法であって、以下の工程を具備した方法が提供される： 上記した、浮遊液中の細胞、少なくとも一つの試薬、及び培養液をそれぞれ 別々の無菌の容器へ入れる工程； 該容器をともに連結し、尚且つ開閉が可能である流体流動調節器を備えた無 菌の管で、該容器中の内容物を大気より密封する工程； 該流体流動調節器を開閉して、該容器の内容物を外部環境から単離しつつ、 一つの容器から別の容器へその内容物を移す工程。 本発明は、血液よりマクロファージを培養するのに特に有益である。 完全なプロセスが、上記のように外部環境より密封され、完全に制御された環 境下で行なわれるので、感染の危険性はほとんどなく、よって無菌フ−ド（ster ile hoods）、ラミナ−フロ−、及び無菌の使い捨て用具は必要ない。細菌感染 がないことを確かめる為の試験は、重要ではない。実際、第二次または第三次調 整物を試験している本発明の方法にそって調整した、１５０のマクロファージ調 整物では一つも感染の事実がなかった。 本発明の別の側面において、以下の工程を具備した、マクロファージ培養方法 が提供される： 血液の初期量中においてよりも白血球の濃度がかなり高い、白血球および赤 血球の混合物を有する、白血球画分を、血液の初期量より分離する工程； 赤血球に対するほうが白血球に対するよりも破壊的である浸透圧ショックを 、該白血球画分（バフィーコート、buffy coat）にかける工程； 該白血球画分中に等張性を再確立する工程； 該白血球画分を容器中の培養液に加える工程； 該培養液を該白血球画分とインキュベーションする工程。 白血球画分を浸透圧ショックにかけて、次いでその中の等張性を再確立するこ と で、実質的に全ての赤血球を破壊するが、白血球はほとんど破壊せず、結果とし て培養液を有する容器中で培養するのに適切な高濃度の白血球を有する浮遊液が 得られることが分かっている。該白血球画分中の単球を上記の浸透圧ショックで 処理すると、分化を促進することが形態学的に確証づけられた。 好ましくは、１５倍量の蒸留水と３０−９０秒間混合することにより、該白血 球画分を浸透圧ショックにかけるが、６０秒間が特に効果的であることが分かっ ている。該白血球画分へ、１０分の１量の蒸留水を使用して、等張性溶液の１０ 倍濃度、好ましくはＮａＣｌの９％溶液を加えることにより等張性もまた再確立 される。 本発明の更に重要な特徴によると、血液の初期量より調整される血清が、培養 液中にある分離した白血球に加えられる。この血清は、所望の量の血漿を血液の 初期量から分離し、該血漿へ凝固因子を加えて血清を調整し、次いで凝固した血 漿より血清を分離することにより調整される。マクロファージを調整する以前の 方法では、コウシ胎仔血清またはプ−ルしたヒトの血清を取り入れていたが、該 コウシ胎仔血清は、治療宿主中でこの血清に対しての抗体を産生してしまう危険 性があり、プ−ルしたヒトの血清は、ウイルス感染の危険性が加わる可能性を上 昇させる。以上の危険性は、白血球を分離したのと同じ血液から調整した血清を 使用することにより回避される。 本発明の更に別の側面によると、細胞を少なくとも一つの無菌の試薬に供し、 該細胞を無菌の培養液で培養することで、浮遊液中に存在する細胞を培養する装 置であって、 浮遊液中の該細胞を入れる第一の容器； 上記の少なくとも一つの試薬を入れる第二の容器；及び、 上記の培養液を入れる第三の容器； を具備している上記の装置であり、該容器はともに連結されていて、尚且つ容器 の内容物を外部環境より単離しつつ、一つの容器から別の容器へその内容物を移 すために、必要に応じて開閉できる流体流動調節器を有する管で密封された、上 記の装置が提供される。 上記したように、老齢のマウスでは、その創傷へ若年のマウスの腹膜液由来の マクロファージを適用することで、創傷の回復が促進されることが以前より知ら れていたが、出願人の知るかぎりにおいて、血液由来のマクロファージを生体の 治療的措置、特に創傷の治癒に使用することは知られていなかった。 よって、本発明の更に別の側面によれば、生体に対して血液より培養したマク ロファージを適用することで生体に治療的措置をとる方法が提供される。 本発明の更なる特徴及び利点は、以下に記載してある、本願に伴った唯一の図 面で例示されたシステムを使用した、マクロファージの増殖方法の特異的な例か ら明らかであろう。 以下の例は、血液バンクから得られたヒトの血液中に含まれる白血球から、マ クロファージを増殖させる工程を記載している。記載されている方法は、完全に 封鎖されているシステムで、細胞、または該方法に関わる種々の溶液を外部環境 へ露出することなしに行なわれる。該方法を開始する前に、以下の容器をフレキ シブルなプラスチック性の袋（ＰＢ₁−ＰＢ₈）の形態で提供することにより、図 面に例示されている該システムを構成する： 処理する血液の初期量を入れておくためのプラスチック性袋ＰＢ₁； 上記工程中、プラスチック性袋PB1より分離されている、血漿画分及び白血 球画分のそれぞれを受けるための、プラスチック性袋ＰＢ₂及びＰＢ₃； 上記工程中、試薬として使用する、蒸留水（１５０ｍｌ）、９％のＮａＣｌ 溶液（１５ｍｌ）、及びＣａＣｌ₂をそれぞれ入れるための、プラスチック性袋 ＰＢ₄，ＰＢ₅，及びＰＢ₆； 該工程中に使用する培養液を入れるためのプラスチック性袋ＰＢ₇。必要な らば、第八のプラスチック性袋ＰＢ₈が、培養液を入れるために含まれていても よい。好ましくは、プラスチック性袋ＰＢ₇及び/またはＰＢ₈は、以下に詳しく 記載されるようにして、一つ以上の添加物をその袋の中の培養液へ加えるための 注入口ＩＰ（プラスチック性袋ＰＢ₇においてのみ示されている）を包含してい る。 全てのプラスチック性袋ＰＢ₁−ＰＢ₈は、それぞれの袋の内容物を外部環境よ り密封する、管（慨して２と記載されている）により、互いに接続されている。 例示されている管２は、手動で閉じてそれぞれの袋の内容物を外部環境より封鎖 できるか、または手動で開けて一つの袋から別の袋へその内容物を、該方法の種 々の段階で移すための、複数の手動バルブを、スライドクランプＳＣ₁−ＳＣ₁₀ の形態で包含している。よって、スライドクランプＳＣ₁−ＳＣ₁₀を有する管で 互いに接続されている、プラスチック性袋ＰＢ₁−ＰＢ₈の例示されたシステムは 、全ての容器の内容物を外部環境より単離しつつ、一つの容器から別の容器へそ の内容物を、該方法の種々の段階において移すことを許容する。 ヒト血液は、まず無菌のニ−ドル４による血液バンクの静脈穿刺により袋ＰＢ₁ （抗凝結剤を含む）に回収される。袋ＰＢ₂及びＰＢ₃は、始めは空である。３ つの袋ＰＢ₁、ＰＢ₂、及びＰＢ₃は、遠心用の一つの容器へ入れられ、残りの袋 ＰＢ₄−ＰＢ₈は遠心用の反対側の容器へ入れられ、全ての袋は管２でつながれ、 全てのスライドクランプＣＣ₁−ＣＣ₉は閉じられている。二つの遠心用容器は釣 り合っている。 袋を２，５００ｒｐｍ（１０００Ｘｇ）で５分間遠心する。これによりプラス チック性袋の中の血液が、血漿画分、白血球画分（バフィ−コ−ト）、及び赤血 球画分に分離する。スライドクランプＳＣ₁及びＳＣ₂を開いた後で、袋PB1を圧 縮して血漿画分を袋ＰＢ₂へ移す。次いでスライドクランプＳＣ₁，ＳＣ₄、及び ＳＣ₃を開けた後に、白血球画分を袋ＰＢ₃へ移す。 この段階で、スライドクランプＳＣ₃、ＳＣ₄、及びＳＣ₁を開いた後に、血漿 画分の一部をプラスチック袋ＰＢ₁中の赤血球画分へ戻す。袋ＰＢ₁は次いで、ス ライドクランプＳＣ₁の近くで連絡切断して（プラスチック管を封鎖した後に） 、使用するために血液バンクへ戻してもよい。 ここで袋ＰＢ₃にある白血球画分は、白血球と赤血球との混合物であるが、血 液の 初期量中においてよりも高い白血球濃度を有している。 ここで袋ＰＢ₃にある白血球画分は、その袋中の白血球に対するよりも赤血球 に対してより破壊的である浸透圧ショック（ショック分解）に供される。これは 、スライドクランプＳＣ₆、ＳＣ₅、及びＳＣ₃を開けて、袋ＰＢ₄中の蒸留水（１ ５０ｍｌ）を袋PB3へ移すことにより行える。これは袋ＰＢ₃をテ−ブル上で平た んにして置き、一方の手で袋ＰＢ₄を潰して水をその袋から袋ＰＢ₃へ放出させ、 もう一方の手で袋ＰＢ₃中の白血球画分と水とを混合させることにより、できる だけ速く行うべきである。この混合は３０から９０秒間で行なわれ、最もよい結 果は、３５秒間で行ったときであった。上記したように、これは袋ＰＢ₃中の白 血球画分を浸透圧に供して、ショック分解により赤血球の大部分を破壊し、それ によってその袋内の白血球画分の濃度を実質的に上昇させている。 すなわちこの時点において、蒸留水を袋ＰＢ₃中の白血球画分とちようど３５ 秒間混合した後に、スライドクランプＳＣ₇、ＳＣ₅、およびＳＣ₃を開け、スラ イドクランプＳＣ₆を閉じ、袋ＰＢ₅を搾り出してその内容物を袋ＰＢ₃へ放出さ せることにより、袋ＰＢ₅中の９％ＮａＣｌ溶液を、プラスチック性袋ＰＢ₃へ導 入する。よって、高浸透圧性溶液であるＮａＣｌ溶液が袋ＰＢ₃へ導入され、、 袋ＰＢ₃中の白血球画分の等張性が再確立される。 この段階で、スライドクランプＳＣ₈、ＳＣ₅、ＳＣ₄、及びＳＣ₂を開け、その 他のクランプを全て閉じることにより、袋ＰＢ₆中にある１２ｍｌの２０ｍＭ Ｃ ａＣｌ₂溶液を、袋ＰＢ₂中の血漿画分へ移す。凝固させる因子であるＣａＣｌ₂ は、血漿の凝固を開始する。次いで、ＰＢ₂中の血漿画分は、残りの袋を外に吊 るしている間に、ディ−プフリ−ザ−１０分間に置き、その後に取り出した。こ の方法は、血液の血小板を、その膜に関して浸透化させ、血小板由来成長ホルモ ンを放出させる。血漿の袋を３７℃の湯浴に３０分間置いて凝固を完結させた。 この時までに凝固が完全に起きなかった場合は（起きたかどうかは袋の内容物の 様相から明らかである）、袋を３７℃の湯浴へ戻して凝固を完結させる。 次いでスライドクランプＳＣ₇及びＳＣ₈を閉じて、クランプの近くのプラスチ ックの管を密封した後に、袋ＰＢ₅、及びＰＢ₆を次いで取り除くことができる。 培養液袋ＰＢ₇の注入口ＩＰを次いで、エタノ−ルで洗浄し、ペニシリン及び ストレプトマイシンの抗生物質混合液を含有する緩衝液（hepes）を、５ｍｌシ リンジと１８Ｇニ−ドルを使用して、注入口ＩＰより注入する。シリンジを取り 除くがニ−ドルは注入口に残して無菌の空気を袋ＰＢ₇へ注入するのに使用する が、これは空気を０．２ミクロンの孔のフィルタを通して注入する膨張ポンプを 、袋が厚さ３から４ｃｍになるまで使用して行う。 ここまでの手順は通常で、約３時間かかる。培養袋を次いで３７℃の培養器へ 導入して、少なくとも１０時間、好ましくは２０時間そこに維持する。 インキュベーション後、培養袋ＰＢ₇の上清を、シンク用の空のプラスチック 袋ＰＢ₄へ移す。培養袋ＰＢ₇はここで、実質的に付着性細胞のみを含んでいる。 その細胞は白血球または単球で、すでにマクロファージの形態学的特徴、すなわ ち、紡錘状の細胞、三角形の細胞、及び細胞より突出している偽足を獲得してい る。 ３７℃で約１０ｍｌの新鮮な培養液を、次いで培養袋ＰＢ₈より培養袋ＰＢ₇へ 導入し、袋を数回傾けることにより、後者の袋内の付着性細胞を穏やかに洗浄し 、沈殿したが接着していない細胞を剥離する。この洗浄液を注いで「シンク」用 の袋ＰＢ₄へ移す。洗浄工程を繰り返す。 プラスチック性袋の内面に付着するマクロファージの数は、倒置型顕微鏡（対 物２０、接眼１５）により推定する。この倍率では、袋中のマクロファージの数 は、顕微鏡視野内で観察されたマクロファージの数の約４０，０００倍に等しい （すなわち、この特異的な場合には、袋PB7中の内面上には、４０，０００倍の 顕微鏡視野がある）。故に、例えばもし該視野に４００のマクロファージが含ま れているとすると、約１６００万のマクロファージが該袋中に存在すると推定で きる。洗浄液をここで袋ＰＢ₄へ移す。 もし１ｍｌ当たり約２００万のマクロファージが必要ならば、約８ｍｌのＲＰ ＭＩを袋ＰＢ₈より袋ＰＢ₇へ移す。 この段階では、培養袋ＰＢ₇を、温度が４℃の金属性の冷板にあてる。これに より付着性のマクロファージが袋ＰＢ₇の内面より剥離される。マクロファージ の剥離を促進するために、ガラス板を該袋にかぶせて、該袋を該ガラス板と冷板 とで挟みこみ、上記の二つの板及びその間の袋を前後に数回傾けて、該袋内の液 体に機械的震盪を与える。この工程は約３０分間かかる。 ここで使い捨ての無菌のシリンジ、及びニ−ドルを使用して、注入口ＩＰを経 由して該細胞を袋より取り出す。二、三滴を使ってマクロファージの数の計測を 行うことができ、その結果により、必要ならば無菌で使い捨て可能な管を使用し た遠心によりマクロファージを濃縮してもよい。 上記した工程は、ヒト血液からマクロファージを調整する方法の一つの例を記 述するが、これに関しての多くの変種を作成することが可能であることは認識さ れるであろう。例えば、ＮａＣｌ以外の高浸透圧液、ＣａＣｌ₂以外の凝固剤、 及びＲＰＭＩ以外の液体培地を使用することができる。更に、例えば濾過やロイ コ泳動（leucophoresis）等のその他の技術によって、白血球を初期分離を行う ことができる。更に３７℃でのインキュベーション期間（少なくとも１０時間、 好ましくは２０−２４時間）の初期段階の間に、少なくとも１時間（好ましくは １.５時間）、温度が４１℃まで上昇すると、単球をマクロファージに分化させ るのを加速させる「熱ショック」が作りだされる。 別の変法は、単純な空気の代わりに、無菌の空気中の５％ＣＯ₂混合物を培養 袋へ導入することを包含する。更に、この袋のシステムは、必要に応じて無菌接 続装置で連結されている、袋サブシステムで構成されていてもよい。たとえば、 血液回収システムＰＢ₁−ＰＢ₃は、袋ＰＢ₃中での白血球分離と赤血球の袋ＰＢ₁ の連結切断の後で、マクロファージ処理システムである袋ＰＢ₄−ＰＢ₈に連結さ せてもよい。 更に、本発明はマクロファージを作り出すのに特に有益であることが判明した が、一方で容器、管、及び必要に応じて該容器の種々の内容物を、密封された閉 じた系に移すことが可能なスライドクランプを使用した技術とシステムは、外部 環境からの感染の危険をおかすことなく、その他のタイプの細胞を培養するのに も有益に使用することが可能である。使用する管は、ロゼット（rosettes）やそ の他のマルチポ−トコネクタ等の通常のコネクタにより、ともに連結される。 また更に、本発明のある種の側面は、その他の側面とは独立して使用すること が可能である。例えば、上記したようにしてマクロファージを増殖させる方法で ある、自己血清、及び閉じた系の技術は、単球のマクロファージへの分化を誘導 するために、浸透圧ショック以外の技術を使用することができる（例えば高浸透 圧露出、重金属など）。本発明はまた、マクロファージ以外のその他のタイプの 細胞を増殖させるのに使用することができる。 本発明に関する、多くの、その他の変法、修飾、及び適用は、明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．浮遊液中に存在する細胞を培養する方法であって、該細胞を少なくとも一 つの無菌の試薬に供して、無菌培養液中で細胞を培養する方法であり、以下の工 程を具備した方法： 該細胞、少なくとも一つの該試薬、及び該培養液を三つの別個の無菌容器に 入れる工程； 開閉可能な流量制御器を有する無菌の管で該容器を互いに接続して、その内 容物を外部環境より密封する工程； 該流体流動調節器を必要に応じて開閉して、該容器の内容物をその外的環境 より単離しつつ該内容物を別の容器へ移す工程。 ２．前記の細胞が血液より培養したマクロファージである、請求項１に記載の 方法。 ３．前記のマクロファージが以下の工程により培養される、請求項２に記載の 方法： 赤血球/白血球混在物を含み、白血球濃度が血液の初期量中におけるときよ りも高い白血球画分を、第一容器中にある血液の初期量より分離する工程； 白血球に対するよりも赤血球に対して、より破壊的な浸透圧ショックを起こ す第二容器中の試薬へ、該白血球画分を供する工程； 該白血球画分中で等張性を再確立する工程； 該白血球画分を、第三容器中の培養液に加える工程；及び 該培養液をインキュベーションする工程。 ４．前記の白血球画分が第四の容器へ分離され、第五の容器中の高浸透圧性の 溶液を、第四の容器中の該白血球画分へ導入することにより、該白血球細胞中の 前記等張性が再確立され、前記の全ての容器が、流体流動調節器を有する無菌の 管でつながれている、請求項３に記載の方法。 ５．等張性が再確立された後であって、該白血球画分が培養液でインキュベー ションされる前に、血液の初期量からの血清が、前記の白血球分画へ加えられる 、請求項４に記載の方法。 ６．前記の血清が、前記の血液の初期量、及び血漿成分より分離して調整され る方法であり、第六の容器から凝固させる因子を該血漿画分に加えて、該血清を 作り出し、その凝固した血漿より血清を分離する、請求項５に記載の方法。 ７．前記の容器全てが、フレキシブルなプラスチック性の袋であり、また前記 の流体流動調節器がスライドクランプである、請求項１乃至６に記載の方法。 ８．以下の工程を具備した、マクロファージ培養方法： 白血球および赤血球の混合物を有し、血液の初期量中においてよりも白血球 の濃度が高い白血球画分を、血液の初期量より分離する工程； 赤血球に対するほうが白血球に対するよりも破壊的である浸透圧ショックを 、該白血球画分にかける工程； 該白血球画分中に等張性を再確立する工程； 該白血球画分を培養液に加える工程； 該培養液をインキュベーションする工程。 ９．蒸留水と３０から９０秒間撹拌することにより、前記の白血球画分を浸透 圧ショックにかける、請求項８に記載の方法。 １０．前記の白血球画分に高浸透圧性溶液を加えることにより、該白血球画分 の等張性が再確立される、請求項８又は９に記載の方法。 １１．等張性が再確立された後であって、かつ前記の白血球画分を培養液中で インキュベーションする前に、前記の血液の初期量より調整した血清が、前記の 白血球画分へ加えられる、請求項８−１０の何れか一項に記載の方法。 １２．前記の血清が、前記の血液の初期量、及び血漿画分から分離して調整さ れ、該血漿画分に凝固因子を加えて前記の血清を作りだし、該血清を凝固した血 漿より分離する、請求項１１に記載の方法。 １３．前記の白血球画分、及び培養液を容器でインキュベーションし、該容器 をインキュベーション後に冷却した板に接触させて、該容器の内面よりマクロフ ァージを剥離させやすくする、請求項８−１２の何れか一項に記載の方法。 １４．前記の血液の初期量、それより分離した各画分、前記の方法中で使用さ れる各試薬が別々の容器に含まれ、該容器が全て連結されていて、クランプを有 する管で外部環境より密封され、該クランプは一つの容器から別の容器へその内 容物を移すために手動で開閉可能であり、それによって容器中の全ての内容物を 外部環境より単離する、請求項８−１３の何れか一項に記載の方法。 １５．前記の容器が全てフレキシブルなプラスチック性の袋であり、前記の管 がフレキシブルなプラスチック性の管であり、該クランプがスライドクランプで ある、請求項１４に記載の方法。 １６．以下の工程を具備した、マクロファージを増殖させる方法： 血液の初期量より白血球を分離する工程； 該血液の初期量より血清を調整する工程； 該白血球及び血清を、培養液へ加える行程； 該培養液をインキュベーションする工程。 １７．前記の血清が、前記の血液の初期量、及び血漿画分より分離して調整さ れ、該血漿画分に凝固因子を加えて前記の血清が調整され、該血清が凝固した該 血漿より調整される、請求項１６に記載の方法。 １８．以下の工程により、前記の白血球が、前記の血液の初期量より分離され る、請求項１７に記載の方法： 白血球と赤血球との混合物を含み、血液の初期量中におけるよりも白血球の 濃度が高い白血球画分を、前記の血液の初期量より分離する工程； 該白血球画分を、白血球に対するよりも赤血球に対してより破壊的である浸 透圧ショックにかける工程； 該白血球画分中で等張性を再確立する工程。 １９．前記の白血球が第一の容器に分離され、前記の血漿が第二の容器に分離 され、前記の培養液が第三の容器に分離され、全ての容器が連結され、尚且つク ランプを有する管で大気より密封され、該クランプは一つの容器から別の容器へ その内容物を移すために手動で開閉が可能であり、それにより該容器中の全ての 内容物を外部環境より単離できる、請求項１７または１８に記載の方法。 ２０．前記の容器が全てフレキシブルなプラスチック性の袋で、前記の管がフ レキシブルなプラスチック性の管で、前記のクランプがスライドクランプである 、請求項１９に記載の方法。 ２１．浮遊液中に存在する細胞を、少なくとも一つの無菌の試薬に供し、該細 胞を無菌の培養液中でインキュベーションし、該細胞を培養する装置であって、 浮遊液中の該細胞を入れる第一の容器； 前記の少なくとも一つの試薬を入れる第二の容器；及び、 前記の培養液を入れる第三の容器； を具備し、該容器の全てがともに連結されていて、尚且つ流体流動調節器を有す る無菌の管で大気より密封されていて、該流体流動調節器は容器の内容物を外部 環境より分離しつつ、一つの容器から別の容器へその内容物を移すために必要に 応じて開閉が可能である、上記の装置。 ２２．前記の容器がフレキシブルなプラスチック性の袋で、前記の管がフレキ シブルなプラスチック管で、前記の流体流動調節器がスライドクランプである、 請求項２１に記載の装置。 ２３．生体を治療する方法であって、血液から培養したマクロファージを該生 体へ適用する上記の方法。 ２４．前記のマクロファージを前記生体の創傷に適用して、該創傷の治癒を促 進する、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記のマクロファージを、請求項２−２１の何れか一項に記載の方法に より作成する、請求項２３または２４に記載の方法。