DE69530795T2

DE69530795T2 - Verfahren zur Kultivierung von Makrophagen

Info

Publication number: DE69530795T2
Application number: DE69530795T
Authority: DE
Inventors: David Danon
Original assignee: CROTTY DAPHNA
Current assignee: CROTTY DAPHNA
Priority date: 1994-07-03
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2015-07-01
Also published as: EP0804072A4; JPH10502257A; IL110195A; EP0804072B1; CA2194270A1; ES2199999T3; AU684655B2; IL110195A0; CA2194270C; EP0804072A1; WO1996001045A1; DE69530795D1; AU3001995A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein System zum Kultivieren von Zellen. Das Verfahren und das System sind besonders nützlich zum Aufziehen von Makrophagen aus menschlichem Blut und werden daher nachfolgend im Bezug auf diese Anwendung beschrieben.
Makrophagen, nämlich phagozytische Zellen phagozytieren und verdauen alte und degradierte Erythrozyten, Bakterien und andere mikroskopische Partikel. Es ist festgestellt worden, dass sie eine bedeutende Rolle in der Wundreparatur spielen. Sie erzeugen Substanzen, die die Vermehrung von Fibroblasten stimulieren, die Synthese von Kollagen durch Fibroblasten und andere Elemente, die zur Wundheilung notwendig sind. Beispielsweise ist festgestellt worden, dass die Wundreparatur in alten Mäusen durch Anwendung von Makrophagen beschleunigt werden könnte, die von Peritonealflüssigkeit von jungen Mäusen gewonnen werden (D. Danon, M. A. Kowatch und G. S. Roth, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86, S. 2018-2020, März 1989).
Die US-P-S 236 716 lehrt ein Thrombozyten-Konzentrat, das weniger als 10⁶ Leukozyten enthält und hergestellt wird aus einer Einheit einer Vollblutprobe in einem geschlossenen Mehrfach-Blutbeutelsystem in weniger als etwa 8 Stunden erzeugt werden kann, nach das Vollblut von einem Menschen entnommen wurde, wobei das Konzentrat in einem Thrombozyten-Aufbewahrungsbeutel, enthalten ist, der aus Polyvinylchlorid hergestellt ist, das mit einem der Weichmacher aus der Gruppe von Trioctyltrimellitat und Ethylenvinylacetat plastifiziert wurde.
Die US-P-S 070 012 lehrt ein Verfahren zum Untersuchen eines regulatorischen Elements eines Regulationssystems für den Transkriptionsstart in einer vermehrungsfähigen Mammalia-Zelle, worin die Zelle ein Non-Wildtyp-Expressionskonstrukt aufweist, das einen Regulationsbereich für einen Transkriptionsstart hat, der eine Regulationssequenz aufweist, die von Interesse ist, sowie ein Strukturgen, welches β-Galactosidase codiert, worin bei der β-Galactosidase als ein Substrat ein β-Galactosidylether einer fluoresziierenden phenolischen Verbindung eingesetzt wird, die ein Fluoreszensprodukt bei Hydrolyse des Ethers erzeugt, welches Verfahren umfasst: weitgehend irreversibles Einführen des Substrats in eine solche Zelle in einer hypotonischen Lösung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 25°C bis 40°C; Inkubieren der Zelle bei einer Temperatur unterhalb etwa des Gefrierpunktes der Membran; sowie Detektieren des Fluoreszensproduktes in der Zelle als ein Maß für die Aktivität des regulatorischen Elementes.
Chockri et al. offenbaren in Anticancer Research, 12: 2257-2260, (1992) ein Verfahren zum Präparieren von Makrophagen durch Kultivieren von Monozyten in einem Kulturmedium, das 1,25-Dihydroxy-D3-Vitamin und GM-CSF enthält. Die auf diese Weise erhaltenen Makrophagen sollen angeblich entweder verfügen über (a) eine zytotoxische Aktivität ohne Interferon-gamma (IFN-γ), erhöht um 20 bis 30% im Bezug auf Standardmakrophagen, (b) zytotoxische Aktivität mit IFN-γ, erhöht um etwa 20 bis 40% im Bezug auf Standard-Makrophagen, oder (c) Ausdehnung der Desaktivierung der zytotoxischen Aktivität in Reaktion auf Aktivierung von IFN-γ in einem solchen Verhältnis, das nach 60 Stunden Aktivierung mit IFN-γ die zytotoxische Aktivität größer oder gleich 30% im Vergleich zur maximalen zytotoxischen Aktivität ist, die von Makrophagen in Folge einer IFN-γ-Aktivierung geboten wird, wobei die zytotoxische Aktivität als der prozentuale Anteil der Hemmung des 30H-Thymidin-Einbaus durch Target-Tumorzellen (U 937-Zellen) gemessen wird.
Die nach dem Derwent World Patents Index, Ref. Nr. 88-193673, offenbart die JP-P-63-130600 eine Makrophagen-ähnliche Zelle, die von einer Human-Zelle deriviert ist und mit einer Makrophagen-aktivierenden Substanz kultiviert wird. Die Makrophagen-ähnliche Zelle wird nach dem Referat von einer Kultur von einem Monozyt von peripheren Blutzellen hergestellt, Gewebe-Makrophagen, Makrophagen-Präkursorzelle (z. B. HL-60-Zelle, THP-1-Zelle von Mono-1-207-Zelle) und zwar in vitro mit Differenzierungs-Derivierungsmitteln (z. B. Phorbolester, Diterpenoiden, usw.). Makrophagen-aktivierende Substanz soll ein Vitamin A-Derivat sein (z. B. Vitamin A-Säure, Vitamin A-Alkohol, Vitamin A-Acetat, usw.); DMSO, Hydrocortison, Lipopolysaccharid, usw.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen von Makrophagen aus Blut-Monozyten, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, sind kompliziert, kostspielig, zeitaufwendig und routinemäßig schwer anzuwenden, da sie einen erheblichen spezialisierten Arbeitsaufwand erfordern, kostspielige Materialien für den einmaligen Gebrauch und spezialisierte Laboreinrichtungen. Darüber hinaus bringen diese Methoden ein erhebliches Risiko der Kontamination während der Herstellung mit sich und erfordern daher ein regelmäßiges Überprüfen, um die Abwesenheit einer bakteriellen Infektion in der resultierenden Suspension von Makrophagen sicherzustellen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines Verfahrens und Systems zum Aufziehen von Zellen und speziell von Makrophagen, die in Bezug auf die vorgenannten Punkte über Vorteile verfügen. Spezieller besteht die Aufgabe der Erfindung in der Gewährung eines Verfahrens und eines Systems zum Aufziehen von Zellen und speziell Makrophagen, die keine spezialisierte Arbeitskraft erfordern, kostspielige Materialien für den einmaligen Gebrauch oder ein spezialisiertes Laboratorium und die in einer Hinsicht die Infektionsgefahr erheblich verringern.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Kultivieren von Makrophagen gewährt, gekennzeichnet durch die Schritte des Abtrennens einer Leukozytenfraktion von einer Anfangsmenge Blut, wobei die Leukozytenfraktion eine Mischung von Leukozyten und Erythrozyten mit einer höheren Konzentration von Leukozyten enthält als die Anfangsmenge Blut; die Leukozytenfraktion einem osmotischen Schock aussetzen, der für die Erythrozyten in höherem Maße zerstörend ist als für die Leukozyten; Wiederherstellen der Isotonie in der Leukozytenfraktion; Zusetzen der Leukozytenfraktion zu einem Kulturmedium in einem Behälter, um eine Suspension von Leukozyten zu erhalten; sowie Inkubieren des Kulturmediums.
In einem der Aspekte werden die Makrophagen dadurch kultiviert, dass die Leukozyten mindestens einem sterilen Reagens ausgesetzt werden und die Zellen in einem sterilen Kulturmedium aufgezogen werden, umfassend: Einbringen der. Zellen in Suspension, das mindestens eine Reagens und das Kulturmedium in drei separate sterile Behälter geben; die Behälter miteinander verbinden und ihre Inhaltsstoffe gegenüber der Atmosphäre mit Hilfe steriler Schlauchleitungen hermetisch abschließen, die Vorrichtungen zur Regelung der Flüssigkeitsströmung aufweisen und die geöffnet und geschlossen werden können; und Öffnen und Schließen der Vorrichtungen zur Regelung der Flüssigkeitsströmung nach Erfordernis, um die Inhaltsstoffe von einem Behälter zum Anderen zu übertragen, während die Behälterinhaltsstoffe gegenüber der äußeren Umgebung isoliert sind.
Die Erfindung ist besonders nützlich für das Kultivieren von Makrophagen aus Blut.
Da somit das gesamte Verfahren in einer vollständig kontrollierten Atmosphäre ausgeführt werden kann, die gegenüber der Außenatmosphäre hermetisch abgeschlossen ist, besteht wenig Infektionsrisiko und damit kein Erfordernis für spezielle sterile Hauben, laminare Strömungen und sterile Werkzeuge für den einmaligen Gebrauch. Das Überprüfen zur Gewährleistung des Fehlens einer bakteriellen Infektion ist nicht der entscheidende Punkt. Tatsächlich ist kein Fall von Infektion in 150 Präparaten von Makrophagen nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung festgestellt worden, wo jedes zweite oder dritte Präparat überprüft wurde.
Es ist festgestellt worden, dass das Aussetzen der Leukozytenfraktion an einem osmotischen Schock und der Wiederherstellung der Isotonie darin weitgehend alle Erythrozyten zerstört und sehr viel weniger Leukozyten, so dass das Ergebnis eine Suspension ist, die über eine hohe Konzentration von Leukozyten verfügt, die zur Kultivierung in einem Behälter mit einem Kulturmedium geeignet sind. Es ist ebenfalls festgestellt worden, dass diese osmotische Schockbehandlung der Monozyten in der Leukozytenfraktion deren Differenzierung in Makrophagen verstärkt, was morphologisch bestätigt ist.
Bevorzugt wird die Leukozytenfraktion einem osmotischen Schock dadurch unterworfen, dass sie mit dem 15-fachen Volumen destillierten Wasser für eine Dauer von 30 bis 90 Sekunden gemischt wird, wobei eine Dauer von 60 Sekunden als besonders wirksam ermittelt wurde. Die Isotonie wird vorzugsweise auch dadurch wieder hergestellt, dass der Leukozytenfraktion eine hypertonische Lösung eines Zehntel des Volumens des verwendeten destillierten Wassers zugesetzt wird und der 10-fachen Konzentration der isotonischen Lösung, vorzugsweise eine 9%ige Lösung von NaCl.
Nach einem weiteren bedeutenden Merkmal der Erfindung wird ein aus der Anfangsmenge des Bluts hergestelltes Serum den abgetrennten Leukozyten im Kulturmedium zugesetzt. Dieses Serum wird hergestellt, indem ein gewünschtes Volumen eines Plasmas von der Anfangsmenge des Bluts abgetrennt wird, dem Plasma ein Gerinnungsmittel zugesetzt wird, um das Serum zu erzeugen, und anschließend das Serum von dem geronnenen Plasma abgetrennt wird. Prozeduren bekannter Ausführung zum Herstellen von Makrophagen führten fötales Kälberserum oder gepooltes Humanserum ein, wobei jedoch die Gefahr besteht, dass fötales Kälberserum Antikörper gegen dieses Serum in dem behandelten Wirt erzeugen kann und das gepoolte Humanserum die Wahrscheinlichkeit einer hinzukommenden Gefahr einer viralen Infektion erhöht. Diese Gefährdungen werden unter Verwendung von Serum vermieden, das aus dem gleichen Blut hergestellt wird, aus dem die Leukozyten abgetrennt worden sind.
Nach noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Apparat zum Kultivieren von Zellen gewährt, die in einer Suspension vorliegen, indem die Zellen mit mindestens einem sterilen Reagens zusammengebracht werden und die Zellen in einem sterilen Kulturmedium kultiviert werden, welches Verfahren umfasst: einen ersten Behälter zum Aufnehmen der Zellen in Suspension; einen zweiten Behälter zum Aufnehmen des mindestens einen Reagens; und einen dritten Behälter zum Aufnehmen des Kulturmediums; wobei die Behälter untereinander verbunden und gegenüber der Atmosphäre hermetisch abgeschlossen sind durch sterile Schlauchleitung, die über Vorrichtungen zur Regelung der Flüssigkeitsströmung verfügt und die nach Erfordernis geöffnet und geschlossen werden können, um die Inhaltsstoffe von einem Behälter zum anderen zu übertragen, während die Behälterinhaltsstoffe gegenüber der äußeren Umgebung isoliert werden.
Obgleich, wie vorstehend ausgeführt, bisher bekannt war, dass eine Wundreparatur bei alten Mäusen durch Aufbringung von Makrophagen auf deren Wunden beschleunigt werden kann, die von peritonealen Flüssigkeiten junger Mäuse stammen, war nach dem Wissen des Anmeldere die Verwendung von Blut stammenden Makrophagen für die therapeutische Behandlung eines Lebendkörpers und speziell für die Wundheilung nicht bekannt.
Nach noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren für die therapeutische Behandlung eines Lebendkörpers durch Aufbringen von Makrophagen gewährt, die aus Blut kultiviert wurden.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden anhand der nachfolgenden Beschreibung eines speziellen Beispiels für ein Verfahren zum Aufziehen von Makrophagen nach der vorliegenden Erfindung offensichtlich, indem ein System zur Anwendung gelangt, wie es in der einzigen beigefügten Zeichnung veranschaulicht wird.
Mit dem folgenden Beispiel wird eine Prozedur zum Aufziehen von Makrophagen aus Leukozyten beschrieben, die in einer Menge menschlichen Blutes enthalten sind, das von der Blutbank erhalten wurde. Die beschriebene Prozedur wird in einem vollständig abgeschlossenen System ausgeführt, ohne dass die Zellen oder die verschiedenen Medien, die bei der Prozedur beteiligt sind, der äußeren Umgebung ausgesetzt sind. Vor Beginn der Prozedur wird das in der Zeichnung veranschaulichte System zusammengestellt, indem die folgenden Behälter in Form flexibler Kunststoffbeutel PB₁ –PB₈ bereitgestellt werden: Kunststoffbeutel PB₁ zur Aufnahme der Anfangsmenge des Blutes, das verarbeitet werden soll; die Kunststoffbeutel PB₂ und PB₃ zur Aufnahme einer Plasmafraktion bzw. einer Leukozytenfraktion, die während der Prozedur von der Anfangsblutmenge in Kunststoffbeutel PB₁ getrennt sind; Kunststoffbeutel PB₄ , PB₅ und PB₆ zur Aufnahme von destilliertem Wasser (150 ml), einer 9%igen Lösung von NaCl (15 ml) bzw. CaCl₂, die während der Prozedur als die Reagentien verwendet werden; und Kunststoffbeutel PB₇ , der ein Kulturmedium enthält, das in der Prozedur verwendet werden soll. Nach Erfordernis kann ein achter Kunststoffbeutel PB₈ einbezogen werden, der ebenfalls ein Kulturmedium enthält. Bevorzugt enthalten Kunststoffbeutel PB₇ und/oder PB₈ eine Injektionsöffnung IP (lediglich in Kunststoffbeutel PB₇ dargestellt) zum Injizieren von einem oder mehreren Additiven in das Kulturmedium in dem Beutel, wie nachfolgend spezieller beschrieben werden wird.
Alle Kunststoffbeutel PB₁ , bis PB₈ sind untereinander mit Hilfe von Schlauchleitungen verbunden, die allgemein mit 2 bezeichnet werden und die die Inhaltsstoffe jedes Beutels gegenüber der Atmosphäre hermetisch abschließen.
Die dargestellten Schlauchleitungen 2 schließen eine Vielzahl manueller Absperrvorrichtungen in Form von Schiebeklemmen SC₁-SC₁₀ ein, die von Hand geschlossen werden können, um die Inhaltsstoffe jedes Beutels gegenüber den anderen abzuschließen, oder von Hand geöffnet werden können, um den Transport der Inhaltsstoffe von einem Beutel zum anderen während der verschiedenen Stufen der Prozedur zu erlauben. Somit lässt sich erkennen, dass das veranschaulichte System von Kunststoffbeuteln PB₁ bis PB₈ , die über die Schlauchleitungen 2 miteinander verbunden sind, die über die Schiebeklemmen SC₁-SC₁₀ verfügen, alle Behälterinhaltsstoffe gegenüber der äußeren Umgebung isoliert, während der Transport der Inhaltsstoffe von einem Behälter zum anderen während der verschiedenen Stufen der Prozedur ermöglicht wird.
Zunächst wird durch Venenpunktion in der Blutbank unter Verwendung einer sterilen Nadel 4 eine Mengen von Humanblut in dem Beutel PB₁ (der eine gerinnungshemmende Substanz enthält) aufgenommen. Die Beutel PB_γ und PB₃ sind anfangs leer. Die drei Beutel PB₁ , PB₂ und PB₃ werden in einen Behälter einer Zentrifuge gegeben, während die übrigen Beutel PB₄ bis PB₈ in den gegenüberliegenden Behälter der Zentrifuge gegeben werden und alle Beutel über Schlauchleitung 2 miteinander verbunden sind und alle Schiebeklemmen SC₁- SC₉ geschlossen sind. Die zwei Zentrifugenbehälter sind ausbalanciert.
Die Beutel werden für 5 min bei 2.500 U/min (1.000 g) zentrifugiert. Dieses hat zur Folge, dass das Blut in dem Kunststoffbeutel PB₁ in eine Plasmafraktion, eine Leukozytenfraktion (Leukozytenmanschette) und eine Erythrozytenfraktion aufgetrennt wird. Die Plasmafraktion wird in den Beutel PB₂ transportiert, nachdem Schiebeklammern SC₁ und SC₂ geöffnet und Beutel PB₁ zusammengedrückt wurden. Danach wird die Leukozytenfraktion in den Beutel PB₃ transportiert, nachdem die Schiebeklemmen SC₁, SC₄ und SC₃ geöffnet worden sind.
Bei diesem Schritt wird ein Teil der Plasmafraktion zu der Erythrozytenfraktion im Kunststoffbeutel PB₁ zurückgeführt, nachdem Schiebeklemmen SC₃, SC₄ und SC₁ geöffnet worden sind. Beutel PB₁ kann sodann nahe der Schiebeklemme SC₁ abgetrennt (nach dem Abschließen der Kunststoffrohrleitung) und zur Verwendung zur Blutbank zurückgeführt werden.
Die Leukozytenfraktion, die sich jetzt im Beutel PB₃ befindet, ist eine Mischung von Leukozyten mit Erythrozyten, hat jedoch eine höhere Konzentration an Leukozyten als die Anfangsblutmenge.
Die Leukozytenfraktion, die jetzt im Beutel PB₃ ist, wird einem osmotischen Schock unterworfen, der für die roten Blutkörperchen stärker zerstörend ist (Schock-Lyse) als für die weißen Blutkörperchen in diesem Beutel. Dieses erfolgt dadurch, dass destilliertes Wasser (150 ml) in Beutel PB₄ zu Beutel PB₃ geführt wird, indem Schiebeklemmen SC₆, SC₅ und SC₃ geöffnet werden. Dieses sollte so rasch wie möglich ausgeführt werden, indem Beutel PB₃ flach auf einen Tisch gelegt wird, mit der einen Hand Beutel PB₄ zusammengedrückt wird, um das Wasser aus diesem Beutel in Beutel PB₃ zu verdrängen, und indem die andere Hand zum Mischen des Wassers mit der Leukozytenfraktion in Beutel PB₃ verwendet wird. Dieses Mischen erfolgt für eine Dauer zwischen 30 bis 90 Sekunden, wobei die besten Ergebnisse dann erhalten werden, wenn dieses für 35 Sekunden erfolgt. Wie vorstehend ausgeführt, wird dadurch die Leukozytenfraktion im Beutel PB₃ einem osmotischen Schock unterworfen, der größte Teil der roten Blutkörperchen durch Schock-Lyse zerstört, wodurch die Konzentration der weißen Blutkörperchen im Inneren dieses Beutels stark erhöht wird.
An dieser Stelle, d. h. nachdem das destillierte Wasser mit der Leukozytenfraktion in Beutel PB₃ für exakt 35 Sekunden gemischt worden ist, wird die 9%ige NaCl-Lösung in Beutel PB₅ in den Kunststoffbeutel PB₃ eingeführt, indem Schiebeklemmen SC₇, SC₅ und SC₃ geöffnet und Schiebeklemme SC₆ geschlossen werden und Beutel PB₅ zusammengedrückt wird, um seinen Inhalt in Beutel PB₃ zu überführen. Die auf diese Weise in den Beutel PB₃ eingeführte NaCl-Lösung, die eine hypertonische Lösung ist, stellt die Isotonie in der Leukozytenfraktion in Beutel PB₃ wieder her.
Zu diesem Zeitpunkt werden die 12 ml der 20 mM CaCl₂-Lösung in Beutel PB₆ zu der Plasmafraktion in Beutel PB₂ überführt, indem Schiebeklemmen SC₈, SC₅, SC₄ und SC₂ geöffnet werden und alle anderen Klemmen geschlossen sind. Das CaCl₂, ein die Gerinnung ermöglichendes Mittel, startet die Gerinnung des Plasmas. Die Plasmafraktion in PB₂ kann sodann in einen Tiefgefrierer gebracht werden, während der Rest der Beutel für 10 min außen hängen bleibt und sodann entfernt wird. Diese Prozedur bewirkt die Permeation der Thrombozyten im Bezug auf die Membranen und die Freisetzung der Thrombozyten-derivierten Wachstumsfaktoren. Der Plasmabeutel wird nun in ein 37°C-Wasserbad für 30 min gegeben, um die Gerinnung zu vervollständigen. Sofern die Gerinnung zu diesem Zeitpunkt nicht vollständig ist, was anhand des Aussehens des Beutelinhalts erkennbar wäre, wird der Beutel in das 37°C-Wasserbad zurückgegeben, bis die Gerinnung vollständig ist.
Schiebeklemmen SC₇ und SC₈ werden sodann geschlossen und die Beutel PB₅ und PB₆ können anschließend entnommen werden, nachdem die Kunststoffschläuche an den Klemmen abgeschlossen worden sind.
Das Beutelsystem wird sodann bei 1.500 U/min (580 g) für 5 min zentrifugiert. Dieses bringt den geronnenen Teil des Plasmas in Beutel PB₂ zum Absetzen und hinterlässt das Serum als Überstand. Ebenfalls werden die Leukozyten in Beutel PB₃ zum Absetzen gebracht. Die überstehende Flüssigkeit in dem letzteren Beutel wird in Beutel PB₄ übertragen, indem Schiebeklemmen SC₃, SC₅ und SC₆ geöffnet werden. Beutel PB₄ , der ursprünglich das destillierte Wasser enthielt, dient jetzt als ein Abfluss zur Aufnahme der durch Schock lysierten Zellen und des Hämolysats in der Flüssigkeit, die von Beutel PB₃ übertragen wurde, während die Leukozyten und die wenigen Erythrozyten, die den osmotischen Schock überstanden haben, in Beutel PB₃ verbleiben.
Das Kulturmedium in Beutel PB₇ wird jetzt nach Beutel PB₃ übertragen, indem Schiebeklemmen SC₉, SC₅ und SC₃ geöffnet werden, um die Leukozyten in Beutel PB₃ erneut zu suspendieren. Durch Manipulieren von Beutel PB₃ werden Zellaggregate dispergiert und die Suspension sodann in die Kultur von Beutel PB₇ übertragen.
Das durch die Zentrifugation abgetrennte Serum in Beutel PB₂ wird in das flüssige Kulturmedium in Beutel PB₇ in einer Menge eingeführt, die 10 bis 100% des Volumens des Kulturmediums ausmacht. Vorzugsweise ist das Kulturmedium ein solches von RPMI (Rosewell Park Memorial Institute). Wenn sich beispielsweise 60 ml RPMI in der Kultur von Beutel PB₇ befinden, werden diesem Beutel aus dem Plasma in Beutel PB₂ näherungsweise 6 ml. Dieses erfolgt dadurch, dass Schiebeklemmen SC₂, SC₄, SC₅ und SC₉ geöffnet werden. An dieser Stufe können die Beutel PB₂ und PB₃ voneinander getrennt werden, indem die Kunststoffrohrleitung in der Nähe der Schiebeklemme SC₅ abgeschlossen wird.
Die Injektionsöffnung IP für das Kulturmedium in Beutel PB₇ wird sodann mit Ethanol gereinigt und eine antibiotische Mischung von Penicillin plus Streptomycin, die einen Puffer (HEPES) enthält, mit Hilfe einer 5 ml Spritze mit einer 18G-Nadel über die Injektionsöffnung IP eingeführt. Die Spritze wird abgezogen, wobei die Nadel jedoch in der Injektionsöffnung IP zurückbleibt und zum Injizieren von sterilisierter Luft in Beutel PB₇ mit Hilfe einer Pumpe zum Aufpumpen verwendet wird, die Luft durch ein 0,2 μm-Porenfilter injiziert, bis der Beutel eine Dicke von etwa 3 cm bis 4 cm erreicht.
Die vorstehend ausgeführte Prozedur dauert bis zu dieser Stelle in der Regel etwa 3 Stunden. Der Beutel mit der Kultur wird sodann in einen 37°C-Inkubator gegeben und dort für mindestens 10 Stunden und bevorzugt etwa 20 Stunden belassen.
Nach der Inkubation wird der Überstand der Kultur in Beutel PB₇ in den leeren Kunststoffbeutel PB₄ gebracht, der als ein Abfluss dient. Die Kultur in Beutel PB₇ enthält jetzt weitgehend ausschließlich die anhaftenden Zellen. Diese sind die weißen Blutkörperchen oder Monozyten, die bereits morphologische Eigenschaften von Makrophagen angenommen haben, z. B. spindelförmige Zellen, dreieckige Zellen und Pseudopodien, die aus den Zellen herausragen.
Sodann werden aus der Kultur in Beutel PB8 in die Kultur von Beutel PB7 etwa 10 ml frisches Kulturmedium bei 37°C eingeführt und die anhaftenden Zellen in dem letzteren Beutel leicht gespült, indem der Beutel mehrere Male gekippt wird, um ein Ablösen der Zellen zu bewirken, die sedimentiert sind, jedoch nicht anhaften. Diese Spülflüssigkeit wird sodann in Beutel PB4 als "Abfluss" übertragen. Die Spülprozedur wird wiederholt.
Die Zahl der Makrophagen, die an der Innenseite des Kunststoffbeutels PB₇ anhaften, werden unter einem Le-Chatelier-Mikroskop (Objektiv 20, Okular 15) geschätzt. Bei dieser Vergrößerung ist die Zahl der Makrophagen in dem Beutel gleich etwa dem 40.000-fachen der Zahl der im Mikroskopfeld beobachteten Makrophagen (d. h. es befinden sich etwa 40.000 Mikroskopfelder auf der Innenseite des Beutels PB₇ in diesem speziellen Fall). Wenn das Feld beispielsweise somit 400 Makrophagen enthält, lässt sich schätzen, dass es etwa sechzehn Million Makrophagen im Inneren des Beutels gibt. Die Spülflüssigkeit wird jetzt in den Beutel PB₄ übertragen.
Sofern angestrebt wird, über etwa zwei Millionen Makrophagen pro Milliliter zu verfügen, würde man 8 Milliliter RPMI in den Beutel PB₇ aus Beutel PB₈ übertragen.
In dieser Stufe wird die Kultur in Beutel PB₇ auf eine kalte Metallplatte bei einer Temperatur von etwa 4°C gebracht. Dieses bewirkt, dass die anhaftenden Makrophagen sich von der Innenseite von Beutel PB₇ lösen. Um das Ablösen der Makrophagen zu beschleunigen, wird über den Beutel eine Glasplatte gelegt, um den Beutel sandwichartig zwischen Glasplatte und der kalten Platte zu bringen, während die zwei Platten und der Beutel dazwischen mehrere Male vor und zurück gekippt werden, um eine mechanische Bewegung der Flüssigkeit im Inneren des Beutels zu erzeugen. Diese Prozedur nimmt etwa 30 min in Anspruch.
Die Zellen können jetzt aus dem Beutel unter Verwendung einer sterilen Spritze für den Einmalgebrauch und einer Nadel über die Injektionsöffnung IP entfernt werden. Zum Zählen der Makrophagen können wenige Tropfen verwendet werden und die Makrophagen entsprechend den Ergebnissen nach Erfordernis durch Zentrifugation in einem sterilen Reagensglas für den Einmalgebrauch konzentriert werden.
Während die vorstehend ausgeführte Prozedur lediglich eines der Beispiele für ein Verfahren zum Erzeugen von Makrophagen aus menschlichem Blut beschreibt, wird davon ausgegangen, dass zahlreiche Variationen ausgeführt werden können. Beispielsweise können andere hypertonische Lösungen als , NaCl, andere Gerinnungsmittel als CaCl₂ und ein anderes flüssiges Kulturmedium als RPMI verwendet werden. Es ließen sich auch andere Methoden für die erste Abtrennung der Leukozyten anwenden, z. B. durch Filtration oder mit Hilfe der Leukophorese. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass, wenn während der Inkubationsdauer (mindestens 10 Stunden und bevorzugt 20 bis 24 Stunden) bei 37°C und wenn die Temperatur bis 41°C für mindestens eine Stunde (vorzugsweise 1,5 Stunden) während des ersten Teils der Inkubationsdauer erhöht wird, ein "Hitzeschock" erzeugt wird, der die Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen beschleunigt.
Eine andere Variation wäre die Einbeziehung einer Mischung von 5% CO₂ in die sterilisierte Luft, die anstelle einfacher Luft in die Kultur in dem Beutel eingeführt wird. Außerdem könnte das Beutelsystem auch aus Beutel-Untersystemen aufgebaut werden, die nach Erfordernis untereinander über eine "Sterile Connection Device" verbunden sind. Beispielsweise könnte das Blutaufnahmesystem PB₁ –PB₃ mit dem System zur Verarbeitung der Makrophagen der Beutel PB₄ –PB₈ nach Abtrennung der Beutel verbunden werden, während sich Zellen in Beutel PB₃ befinden, und nach Abtrennung der roten Zellen in Beutel PB₁ .
Während sich die Erfindung als besonders nützlich zur Erzeugung von Makrophagen erwiesen hat, ist ferner davon auszugehen, dass die Methode und das System der Verwendung von Behältern, Schlauchleitungen und Schiebeklemmen, mit denen es möglich ist, die Inhaltsstoffe der verschiedenen Behälter nach Wunsch in einem geschlossenen hermetisch versiegelten System zu übertragen, vorteilhaft zum Kultivieren anderer Arten von Zellen ohne Gefahr einer Infektion aus der umgebenden Atmosphäre angewendet werden können. Die Schlauchleitungen, die verwendet werden, können miteinander mit Hilfe konventioneller Verbindungsvorrichtungen verbunden werden, wie beispielsweise Rosetten oder andere Verbindungsorgane mit mehrfachen Öffnungen.
Außerdem lassen sich bestimmte Aspekte der Erfindung unabhängig von anderen Aspekten anwenden. Beispielsweise könnten bei der Methode des Aufziehens von Makrophagen mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Eigenserum-Methode im geschlossenen System andere Methoden als der osmotische Schock (z. B. hypertonische Exponierung, Schwermetalle, usw.) zum Auslösen der Differenzierung der Monozyten zu Makrophagen angewendet werden. Die Erfindung könnte auch zum Aufziehen anderer Arten von Zellen als Makrophagen angewendet werden.

Claims

Verfahren zum Kultivieren von Makrophagen, gekennzeichnet durch die Schritte des Abtrennens einer Leukozytenfraktion von einer Anfangsmenge Blut, wobei die Leukozytenfraktion eine Mischung von Leukozyten und Erythrozyten mit einer höheren Konzentration von Leukozyten enthält als die Anfangsmenge Blut; die Leukozytenfraktion einem osmotischen Schock aussetzen, der für die Erythrozyten in höherem Maße zerstörend ist als für die Leukozyten; Wiederherstellen der Isotonie in der Leukozytenfraktion; Zusetzen der Leukozytenfraktion zu einem Kulturmedium in einem Behälter, um eine Suspension von Leukozyten zu erhalten; sowie Inkubieren des Kulturmediums.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das aus der Anfangsmenge Blut hergestellte Serum der Leukozytenfraktion zugegeben wird, nachdem die Isotonie wiederhergestellt worden ist und bevor die Leukozytenfraktion in einem Kulturmedium inkubiert worden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum hergestellt wird, indem von der Anfangsmenge Blut außerdem eine Plasmafraktion abgetrennt wird; Zusetzen eines Gerinnungsmittels zu der Plasmafraktion, um das Serum zu erzeugen und Abtrennen des Serums von dem geronnenen Plasma.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Anfangsmenge Blut, jede davon abgetrennte Fraktion und jedes in dem Verfahren zur Anwendung gelangte Reagens in einem separaten Behälter enthalten sind, wobei die Behälter alle untereinander verbunden und gegenüber der Atmosphäre hermetisch abgeschlossen sind, und zwar mit Hilfe von Schlauchleitung, die über Klemmvorrichtungen verfügt, die von Hand geöffnet und geschlossen werden können, um eine Übertragung der Inhaltsstoffe von einem Behälter zum anderen zu ermöglichen und dadurch alle Inhaltsstoffe der Behälter gegenüber der äußeren Umgebung zu isolieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Leukozyten mindestens einem sterilen Reagens unterworfen werden und die Leukozyten in einem sterilen Kulturmedium kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch die Schritte des Einbringens der Leukozyten, des mindestens einen Reagens und des Kulturmediums in 3 separate sterile Behälter; Verbinden der Behälter untereinander und hermetisches Abschließen ihrer Inhaltsstoffe gegenüber der Atmosphäre durch sterile Schlauchleitung, die Vorrichtungen zur Regelung der Flüssigkeitsströmung aufweist und die geöffnet und geschlossen werden können; und Öffnen und Schließen der Vorrichtungen zur Regelung der Flüssigkeitsströmung nach Erfordernis, um die Inhaltsstoffe von einem Behälter zum anderen zu übertragen, während die Behälterinhaltsstoffe gegenüber der äußeren Umgebung isoliert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Leukozytenfraktion einem osmotischen Schock unterworfen wird, indem die Leukozytenfraktion mit einem Volumen von destilliertem Wasser für eine Dauer zwischen 30 und 90 Sekunden gemischt wird, wobei das Volumen des destillierten Wassers das 15-fache von dem der Leukozytenfraktion beträgt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Isotonie der Leukozytenfraktion wiederhergestellt wird, indem eine hypertonische Lösung von einem Zehntel des Volumens des destillierten Wassers und die 10-fache Konzentration der isotonischen Lösung zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die hypertonische Lösung eine 9%ige Lösung von NaCl umfasst.