DE9390311U1 - Neue Makrophagen mit Eignung als Wirkstoffe von pharmazeutischen Zusammensetzungen - Google Patents

Neue Makrophagen mit Eignung als Wirkstoffe von pharmazeutischen Zusammensetzungen

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Description

NEUE MAKROPHAGEN MIT EIGNUNG ALS WIRKSTOFFE VON
PHARMAZEUTISCHEN ZUSAMMENSETZUNGEN
Technischer Bereich
Die Erfindung bezieht sich auf neue Makrophagen, die insbesondere als Wirkstoffe von pharmazeutischen
Zusammensetzungen geeignet sind.
Stand der Technik
Zytotoxische Leukozyten (NK-Zellen, T-Lymphozyten, Monozyten-Makrophagen) sind hochwirksame Effektoren im Abwehrkampf des Wirtes gegen Tumore. Erweiterung und Erhöhung des tumoriziden Potentials der autologen Effektorzellen in vitro und ihre anschließende Reinfusion in den Wirt werden zur Zeit in der lokalen und systemischen Adoptiv-Immunotherapie benutzt (Rosenberg et al.: Progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using LAK cells and JL2 or IL 3 alone). N. Engl. J. Med. 316: 889, 1990; Rosenberg et al.: Use of tumor infiltrating lymphocytes and IL2 in the immunotherapy of patients with metastatic melanoma (Verwendung von ramorinfiltrierenden Lymphozyten und TL2 in der Immunotherapie von Patienten mit metastatischem Melanom). N. Engl. J. Med. 319: 1676,1990; Lacema et al.: Adoptive cancer immunotherapy utilizing lymphokine activated killer cells and IFN-Gamma activated killer lymphocytes Pharm. Ther. 38:
453, 1988).
Makrophagen spielen bei der Antitumorantwort eine zentrale Rolle und können gegen neoplastische Zellen durch Immunopotenzierer aktiviert werden (Adams D und Hamilton T.: Activation of macrophages for tumor cell kill: effector mechanism and regulation. In: Heppner & Fulton (Hsg.), Macrophages and cancer, CRC Press, 1988, S. 27; Fidler L: Macrophages and metastases. A biological approach to cancer therapy, Cancer Res. 45: 4714,1985).
Bei Mäusen wurde nachgewiesen, daß aktivierte Makrophagen, die lokal in den Tumor eingegeben wurden, das Tumorwachstum verhinderten und die Metastasenentwicklung verminderten (Bartholeyns et al.: Immunotherapy of cancer:
experimental approach with activated macrophages proliferating in culture, Cancer Detect. & Prev. 12: 413, 1988; Chokri et al.: Antitumoral effect of LPS, TFN, IFN and activated macrophages: synergism and tissue distribution, Anticancer Res. 9: 1185, 1989). Human-Monozyten, die aus Blut abgesondert wurden, konnten in vitro durch eine 7-tägige Kultur in hydrophoben Beuteln zu Makrophagen differenziert werden (Chokri et al.: Antitumoral effect of LPS, TFN, IFN and activated macrophages: synergism and tissue distribution, Anticancer Res. 9: 1185, 1989). Nach Inkubation in Gegenwart von IFN-Gamma wurden diese Makrophagen in bezug
auf eine Reihe von Humantumoren in vitro oder in bezug auf Tumoren, die nackten Mäusen eintransplantiert wurden, aktiviert und tumorizid (Makrophagen-aktivierte Killer-Zellen = MAK) (Andreesen et al.: Surface phenotype analysis of human monocytes to macrophages differentiation, J. Leuk. Biol. 47: 490, 1990; Dumont et al.: Control of the antitumoral activity of human macrophages produced in large amount in view of adoptive transfer, Eur. J. Cancer 24: 1691, 1988).
Die Adoptivübertragung von MAK-Zellen wurde von verschiedenen Forschern in Straßburg, Freiburg und Paris Therapiestudien in der Phase I unterworfen, und zwar bei Patienten mit metastatischem Krebs, denen 10° bis 2 &khgr; 10° autologe MAK-Zellen systematisch oder intraperitoneal infundiert wurden (Andreesen et al.: Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating monocytes: a new approach to cancer immunotherapy, Cancer Res. 50: 7450, 1990; Bartholeyns et al: Adoptive immunotherapy of solid tumors with activated macrophages: experimental and clinical results, Anticancer Res. 11: 1201, 1991; Lopez et al.: One step separation by elutriation of monocytes from leukapheresis products of cancer patients for production of IFN-Gamma activated macrophages in
^ view of adoptive immunotherapy, J. Immunotherapy, 11: 209, 1992; Faradji et al:
Phase I trial of FV infusion of ex-vivo activated blood derived macrophages in patient with non small cell lung cancer: toxicity and immunomodulatory effects, Cancer Immunol. Immunother. 33: 319, 1991).
Die klinische Verträglichkeit war ausgezeichnet, mit geringen
Nebenwirkungen, wie geringes Fieber und leichtes Frösteln. Die maximal tolerierte Dosis konnte wegen der begrenzten Anzahl von MAK-Zellen, die durch eine Zytapherese erzeugt wurden, nicht ermittelt werden.
Die Wiedergewinnung von großen Mengen an MAK-Zellen ist daher für die optimale Antitumorwirksamkeit bei Therapiestudien und bei der Therapie eine
Notwendigkeit.
Cv Die Makrophagen, die wie bisher in herkömmlichen Kulturmedien präpariert
wurden, ergeben einen Ertrag, der weniger als 40 % beträgt.
Es besteht jedoch die Notwendigkeit, daß die Makrophagen eine höhere zytotoxische Aktivität aufweisen, um die Wirksamkeit in vivo zu erhöhen und dementsprechend die nächste Verabreichung von Makrophagen hinauszuschieben.
Offenlegung der Erfindung
Es ist eines der Ziele der Erfindung, Makrophagen zur Verfugung zu stellen, die im Vergleich zu Standard-Makrophagen eine höhere zytotoxische Aktivität haben.
Es ist ein anderes Ziel der Erfindung, Makrophagen zur Verfugung zu
stellen, bei denen die Kinetik der Deaktivierung der toxischen Aktivität im Vergleich zu Standard-Makrophagen langsamer ist.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, ein neues Kulturmedium zur Verfugung zu stellen, das es ermöglicht, Makrophagen zu präparieren, die im Vergleich zu
Standard-Makxophagen eine höhere zytotoxische Aktivität und eine langsamere Deaktivierungs-Kinetik der zytotoxischen Aktivität haben.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung werden durch Makrophagen erreicht, die wenigstens eine der nachstehenden Eigenschaften haben:
- ihre zytotoxische Aktivität ohne Aktivierung durch IFN-Gamma ist um etwa 20 bis 30 % im Vergleich zu Standard-Makrophagen erhöht, und sie beträgt vorzugsweise etwa 70 %;
- ihre zytotoxische Aktivität ist nach Aktivierung durch IFN-Gamma weiter um etwa 20 bis 40 % im Vergleich zu Standard-Makrophagen erhöht, und sie beträgt vorzugsweise etwa 93 %;
- die Verlängerung der Deaktivierungszeit der zytotoxischen Aktivität als Antwort auf eine Aktivierung durch IFN-Gamma steht in einem Verhältnis derart, daß nach 60 Stunden Aktivierung durch EFN-Gamma die zytotoxische Aktivität höher ist als 30 % oder gleichwertig ist mit 30 %, vorzugsweise etwa 55 %, und zwar im Vergleich zu der maximalen zytotoxischen Aktivität, die von Makrophagen auf Grand einer Aktivierung durch IFN-Gamma gezigt wird, wobei die vorerwähnte zytotoxische Aktivität als der Prozentsatz der Hemmung der 3-H-Thymidin-Einbau durch Zielturmorzellen, insbesondere U-937-Zellen, gemessen wird.
Der Ausdruck "Standard-Makrophagen" entspricht denjenigen, die durch Kultur von Monozyten mit einem Standardmedium erhalten werden, wie es in dem Beispielteil definiert wird.
Die "zytotoxische Aktivität" enspricht derjenigen, die als der Prozentsatz der Hemmung der 3-H-Thymidin-Einbau durch Zieltumorzellen, insbesondere U-937-Zellen, gemessen wird, und ein Test für diese Messung wird nachstehend gegeben:
Differenzierte Makrophagen werden auf flache Mikrotiterplatten mit 96 Mulden geimpft, und zwar 104 Makrophagen/Mulde in 0,2 ml. Nach 2 Stunden fnkubation bei 37 0C in 5 % CO2 feuchter Luft wurde das Medium entfernt und durch IMDM + 5
&ngr; % hu-AB-Serum ersetzt, das 250 E/ml von rhu-IFN-Gamma enthielt oder nicht
enthielt; die Platten wurden weiter über Nacht inkubiert. Nach Waschen wurden jeder Mulde 104 U-937-Turnorzellen in 0,2 ml frischem Medium (IMDM + 10 % FCS) hinzugefügt. Nach 24stündigem Kontakt wurde jeder Mulde 0,1 &mgr;Ci von mit Tritium markierten Thymidin für eine weitere Inkubation von 24 Stunden hinzugefügt.
Die Zellen wurden entnommen, und die Bestimmung der eingebauten Radioaktivität auf den Faserglasfiltern wurde mit Beta-Zählung ausgeführt. Der Prozentsatz der Hemmung der Thymidin-Einbau durch Tumorzellen konnte nach der folgenden Formel berechnet werden:
(cpmT - cpmTMD &khgr; 100
cpmT
40
wobei gilt: cpmT = Radioaktivität in Kontrolltumorzellen,
■I
I 'V
cpmTM = Radioaktivität in Mischkultur Tumorzellen + Makrophagen.
Es ist zu bemerken, daß es diese Methoden ermöglichen, die drei Hauptarten
der Antitumoraktivität der Makrophagen zu bestimmen, die in der Erfindung beschrieben werden, d. h.: Zytolyse, Zytostase und Phagozytose. Die Makrophagen stammen von menschlichen Probanden, die gesund sind oder Patienten sind, die an verschiedenen Krankheiten leiden.
Zum Beispiel zeigen Standard-Makrophagen, die aus Monozyten-Kulturen von gesunden Probanden stammen, eine spontane zytotoxische Aktivität (d. h. ohne Aktivierung durch IFN-Gamma) von etwa 45 %, im Gegensatz zu etwa 70 % im Falle der erfindungsgemäßen Makrophagen; und nach EFN-Gamma-Aktivierung bieten Standard-Makrophagen eine zytotoxische Aktivität von etwa 76 %, im Gegensatz zu etwa 93 % im Falle der erfindungsgemäßen Makrophage.
,·:;, Eine ähnliche Erhöhung der zytotoxischen Aktivität wird mit Makrophagen
erhalten, die von Patienten stammen.
Was die Kinetik der Deaktivierungszeit betrifft, enthält die Tabelle I die Ergebnisse relativ zu der Messung der Aktivität, wie sie "oben in dem Fall der Standard-Makrophagen und der erfindungsgemäßen Makrophagen beschrieben wurde.
Aus den oben erwähnten Eigenschaften gehen die Vorteile der erfindungsgemäßen Makrophagen hervor, wobei wir wissen, daß eine zytotoxische Aktivität unterhalb von 50 % für therapeutische Zwecke nutzlos ist.
Die erfindungsgemäßen Makrophagen sind derart, daß sie eine wöchentliche Behandlung, statt einer Behandlung alle drei bis vier Tage, ermöglichen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung haben die erfindungsgemäßen Makrophagen die folgende Eigenschaften:
- ihre Größe beträgt von etwa 10 bis etwa 20 &mgr;&idiagr;&eegr;;
- sie haften an Kunstharzflächen ;
- ihre Lebensfähigkeit ist vorzugsweise höher als etwa 70 % ;
- sie weisen eine Phagozytose-Eigenschaft auf;
- sie weisen auf ihrer Oberfläche Differenzieningsantigene, wie CD64, CD68, MAXI, HLADR auf;
- ihre zytotoxische Aktivität ist größer als etwa 50 % ;
- die erfindungsgemäßen Makrophagen sind vorteilhafterweise frei von Bakterien- und biologischen Verunreinigungen.
Wenn die Größe der Makrophagen größer als 20 &mgr;&idiagr;&eegr; ist, bedeutet das, daß sie miteinander fusionieren und Riesenzellen bilden, deren Rolle nicht eindeutig bekannt ist; wenn sie kleiner als 10 &mgr;&idiagr;&eegr; sind, bedeutet das, daß die Makrophagen nicht gut differenziert sind.
Die Größe kann mit einem Channelyser (Coulter Margency -Frankreich)
55··.
gemessen werden. »·* ** ** *""*
Die Eigenschaft des Haftens an Kunstharzflächen kann mit Petrischalen (Prozentuale Haftung) nach 30 Minuten der Inkubation der erzeugten Makrophagen bestätigt werden.
Die Lebensfähigkeit ist die Anzahl der lebenden Zellen am Ende der' Kultur, und die Lebensfähigkeit ist vorzugsweise höher als etwa 70 % und wird mit Trypanblau-Exklusion gemessen.
Die Phagozytose-Eigenschaft kann durch Stoffaufnahme von Latexperlen oder Dextranteilchen (30 Minuten bis 1 Stunde Inkubation) geprüft werden, wie von Stevenson und Fauci in Manual of Macrophages methodology, Marcel Dekker, N. Y-, Seiten 75-80, 1981, beschrieben.
Die Oberflächen-Differenzierungsantigene, wie CD64, CD68, MAXI, HLADR, werden in bezug auf die Standard-Makrophagen auf einem ähnlichen oder höheren Niveau ausgedrückt; das kann mit Impulszytophotometrie gemessen werden. Tabelle &Pgr; weiter unten enthält die Ergebnisse der Phänotypen, die bei verschiedenen Bedingungen erhalten werden.
Aus dieser Tabelle kann geschlossen werden, daß die erfindungsgemäßen !5 Makrophagen neue Eigenschaften haben, aber ohne Veränderung ihrer
Hauptfunktionen, mit Ausnahme der Erhöhung der zytotoxischen Aktivität.
Jedoch ist der CD71, der Transferrin-Rezeptor, in Gegenwart von VitD3 +
GM-CSF herabgesetzt, was mit einem fortgeschrittenen Aktivierungsstatus der Makrophagen in Wechselwirkung steht. Die CD71-Expression wird wie im &ogr; Beispielteil beschrieben bestimmt.
Die zytotoxische Aktivität wird mit U-937-Zellen bestimmt, wobei das Verhältnis von Makrophagen zu U-937-Zellen 1: 1 beträgt.
Die erfindungsgemäßen Makrophagen sind vorteilhafterweise frei von Viren-, Bakterien-, Fungi- und biologischen Verunreinigungen.
Die erfindungsgemäßen Makrophagen können durch die nachfolgend beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Ein Verfahren zum Präparieren von Makrophagen, wie oben definiert, umfaßt die Züchtung von Monozyten in einem Kulturmedium, das l,25-dihydroxy-D3-Vitamin und GM-CSF enthält.
Im besonderen umfaßt das Verfahren die Züchtung von
sowohl Monozyten als auch Lymphozyten in einem Kulturmedium, das 1,25-dihydroxy-D3-Vitamin und GM-CSF enthält, für eine Zeit die ausreichend ist um
differenzierte, Makrophagen zu erhalten, vorzugsweise für etwa 6 bis 7 Tage, möglicherweise aktivierung der Makrophagen, die sich aus den Monozyten und Lymphozyten ergeben, mit IFN-Gamma, und das Trennen der Makrophagen von den Lymphozyten, vor oder nach der Aktivierung mit IFN-Gamma, vorzugsweise nach der IFN-Gamma-Aktivierung, und die Wiedergewinnung der Makrophagen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung umfaßt das Verfahren die folgende Schritte:
- Absonderung von Leukozyten aus dem Blut von gesunden Probanden oder
krebskxanken Patienten durch Zytapherese, um Zytapherese-Produkte (d.h. konzentrierte Leukozyten) zu erhalten,
- Entfernen von Thrombozyten, z. B. durch Zentrifugieren der Zytapherese-Produkte, um ein leukozytenangereichertes Produkt zu erhalten,
- Trennung in die leukozytenangereicherten Produkte der mononuklearen Zellen auf der einen Seite und in die verunreinigenden Erythrozyten und Granulozyten auf der anderen Seite,
- Züchtung der mononuklearen Zellen (Monozyten + Lymphozyten) in einem Kulturmedium, das l,25-dihydroxy-D3-Vitamin und GM-CSF enthält, für 6 bis 7
Tage, um differenzierte Makrophagen zu erhalten,
- Aktivierung der Makrophagen und Lymphozyten durch IFN-Gamma für etwa 16 Stunden bis etwa 24 Stunden,
- Trennung der aktivierten Makrophagen von den Lymphozyten z. B. durch Elution.
Die Lymphozyten können von den Monozyten vor dem Züchtungsschritt getrennt werden.
Die Lymphozyten können von den Makrophagen nach der Züchtung und vor der EFN-Gamma-Aktivierung getrennt werden. Vorteilhafterweise werden die Makrophagen und Lymphozyten nach der rFN-Gamma-Aktivierang von einander getrennt.
In dem Verfahren wird D3-Vitamin in einer Konzentration
von 10" 10 bis etwa 10~7, vorzugsweise von etwa 10~8 M verwendet.
In dem erfahren wird GM-CSF in einer Konzentration von etwa 50 bis etwa 1000 E/ml, insbesondere von etwa 100 bis etwa 500 E/ml verwendet.
In dem r- Verfahren besteht das Kulturmedium aus RPMI, EMDM, MEM oder DMEM.
Diese Kulturmedien stehen handelsüblich zur Verfugung.
Vorteilhafterweise enthält das Kulturmedium Indomethacin (oder einen — anderen Zyklo-Oxygenase-Inhibitor) oder/und Cimetidin (ein Histamin-H2-Antagonist).
Ein vorteilhaftes Verfahren für, das Präparieren der erfindungsgemäßen Makrophagen besteht aus folgendem:
Zytapherese
Leukozyten von gesunden Probanden oder von krebskranken Patienten werden aus peripherem Blut durch Zytapherese mit Hilfe des Durchfluß-Blutzellentrenngeräts Cobe 2997 oder des Durchfluß-Blutzellentrenngeräts Dideco Vivacell abgesondert. Das Zytapherese-Produkt wird 10 Minuten lang bei 280 g zentrifugiert, um die Thrombozytenverunreinigung herabzusetzen. Das thrombozytenangereicherte Plasma wird entfernt, und das Leukozytenpellet wird in
einer Phospatpufferlösung (PBS) resuspendiert, die 0,1 % Glukose, 0,17 % PO3H2Na, 2R2O, 0,27 % PO3H2Na, 0,14 % NH4Cl, 0,78 % NaCl (Lösung TS745, Laboratoire Bruneau, Frankreich) enthält.
Das angereicherte Leukozytenpellet wird mit einem Durchschnitt von 7 bis 9 &khgr; 10^ Leukozyten (50 % der mononuklearen Zellen) erhalten.
Absonderung von mononuklearen Zellen
Humane mononukleare Zellen werden von Erythrozyten und von verunreinigenden Granulozyten durch 15minütige Zentrifugation bei 1000 g mit einem Zellprozessor COBE 2991 oder Stericell, unter Benutzung von Ficoll Paque mit Dichte 1,077 (Pharmacia), getrennt. Nach 3 Waschungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium wurden die Monozyten mit etwa 50 % Reinheit erhalten, wie mit Channelyser-Analyse (Coulter Margency, Frankreich) nachgewiesen.
Kultur
Differenzierte Human-Makrophagen werden durch eine 7tägige Kultur in
hydrophoben Beuteln aus Teflon oder Polypropylen (Dupont - J. BIO, life cell Travenol, stericell - TERUMO) bei 37 0C und 5 % CO2 , 95 % Luftfeuchtigkeit erhalten. Die gesamten mononuklearen Zellen werden zu 5,10^ Zellen/ml auf Iscovemodifiziertes Medium (MDM, Gibco) oder gleichwertiges Medium geimpft, ergänzt durch Penizillin (100 LE./ml), Streptomycin (100 &mgr;^/&idiagr;&eegr;&idiagr;), L-Glutamin (2 mM, Gibco), Pyruvinsäure (2 mM, Gibco), Indomethacin (5,10~6 M, Sigma), Cimetidin (&Igr;&Ogr;"6 bis &Igr;&Ogr;"9 M), Merkaptoäthanol (3,10-5 M, Gibco), nicht essentielle Aminosäuren (1 %, Gibco) und 2 - 5 % autologes Serum oder AB-Serum. Der Zusatz von GM-CSF (500 E/ml, Shering) und / oder l,25-dihydroxy-Vit-D3 (Cholecalciferol 10"° M, Roche, Basel, Schweiz) wurde in einem Vergleichsversuch vorgenommen.
Aktivierung der Makrophagen zu Zytotoxizität wurde durch eine weitere 16-C: bis 18 stündige Kultur in Gegenwart von 250 E/ml IFN-Gamma (Boehringer,
Ingelheim, Deutschland) ausgeführt.
30
Elution
Die differenzierten Makrophagen, die nach 7tägiger Kultur und nach Aktivierung erhalten werden, werden bei 550 g 10 Minuten lang zentrifugiert, und das
&Lgr; Pellet wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, die 0,1 % Glukose,
0,17 % PO3HNa2, 2H2O, 0,27 % PO3H2Na, 0,14 % NH4CI, 0,78 % NaCl (Lösung TS745 Laboratoire Bruneau, Frankreich) und 2 % Humanserumalbumin (HSA. CNTS, Frankreich) enthält.
Die Zellen werden dann der Elution mit Hilfe einer Beckman-J6-ME-Zentrifuge unterworfen, die mit einem J5.0 Rotor und einer 40 ml Elutionskammer ausgestattet ist, wie von Andreesen et al. (Cancer Res., 50, 1990) beschrieben.
Die differenzierten Makrophagen werden bei konstanter Rotorgeschwindigkeit
und steigender Durchflußrate gesammelt.
Das - · Verfahren ermöglicht es, einen Ertrag von
Makrophagen zu erhalten, der größer als etwa 40 % ist, und vorzugsweise etwa 76 % beträgt, wobei der vorerwähnte Ertrag das Verhältnis zwischen den lebenden Makrophagen und den Ausgangsmonozyten darstellt. Dieser Ertrag kann durch Zellzählung und mit einem Channelyser bestimmt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrung ist das -- Verfahren derart, daß dem Kulturmedium gleichzeitig mit den Monozyten abgetötete Tumorzellen hinzugefügt werden, wobei beide ZeUarten vorzugsweise von dem gleichen Patienten stammen, vorzugsweise im Verhältnis von etwa 1 Millionen abgetöteter Tumorzellen / ml, wobei die vorerwähnten abgetöteten Turmorzellen zur gleichen Zeit wie die Makrophagen verarbeitet werden.
Die abgetöteten Tumorzellen können dann gleichzeitig mit den Leukozyten
verarbeitet werden, in einer Menge von etwa 1 &khgr; 1O^ /ml, und sie können von den Makrophagen getrennt werden, zum Beispiel zur gleichen Zeit wie die Lymphozyten, nach der IFN-Gamma-Aktivierung oder vor der IFN-Gamma-Aktivierung, und vorzugsweise nach der IFN-Gamma-Aktivierung.
Dieses Verfahren erlaubt es, Makrophagen und Lymphozyten zu erhalten, die für den Tumor spezifisch sind und in vivo diese spezifischen Tumorzellen sehr wirksam abtöten.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Makrophagen, die nach dem oben definierten Verfahren erhalten werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die als Wirkstoff Makrophagen enthalten, wie sie oben definiert werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Kulturmedium, das die Elemente enthält, die für das Wachstum und die Differenzierung der Monozyten zu erfindungsgemäßen Makrophagen notwendig sind, und das zusätzlich D3-Vitamin und GM-CSF enthält.
Die efindungemäßen Makrophagen können Bestandteil eines Kits sein, der folgendes enthält: -
- Mittel für die Wiedergewinnung von Lymphozyten und Monozyten, die frei von Verunreinigungen sind;
- geeignete Puffer- und Waschlösungen, und möglicherweise entsprechende Mittel für die Konservierung der Makrophagen;
- Mittel für das Präparieren eines Kulturmediums für die Monozyten und möglicherweise die Lymphozyten, und das l,25-dihydroxy-Vitamin-D3 und GM-CSF enthält;
- möglicherweise IFN-Gamma.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung enthält der Kit folgendes:
- Mittel für die Wiedergewinnung und Zentrifugierung von Blut, um ein
Leukozytenkonzentrat zu erhalten;
- Mittel für das Trennen von Lymphozyten und Monozyten von den anderen Leukozyten und Mittel für das Entfernen verunreinigender Erythrozyten;
- Kulturmedium für Makrophagen und möglicherweise Lymphozyten, mit Ergänzungen, und insbesondere l,25-dihydroxy-Vitamin-D3 und GM-CSF und möglicherweise Indomethacin und / oder Cimetidin;
- Mittel für das Trennen der Lymphozyten von Makrophagen;
- Geeignete Mittel für die Konservierung von Makrophagen;
- geeignete Puffer- und Waschlösungen;
- möglicherweise EFN-Gamma.
Ein vorteilhafter Kit enthält zum Beispiel folgende Elemente:
1 - Zytapherese-Kit (Fenwal),
2 - Übertragungsbeutel (R 20-21, Fenwal)
3 - Satz für Zentrifugierung im Ficoll-Gradient (Gradient / wash processor set Stericell, Terumo) oder Bluzellen-Prozessor (Cobe 912-647-819),
4 - Elution-Kit (Macopharma),
5 - Übertragungspackung, Unit 2L (Travenol, 4R2041),
6 - Hydrophobe Beutel für Zellkultur (Teflon, J. BIO - lifecell, Travenol-
Stericell, Terumo),
7 - Injektionsbeutel (Travenoi),
8 - phosphatgepufferte Kochsalzlösung
(Lösung TS745, Laboratoires Bruneau),
9 - Ficoll-Paque (Pharmacia),
10 - Humanalbuminlösung (Biotransfusion),
11 - Kultua),rmedium (IMDM, Gibco),
12 - Penizillin / Streptomycin (Gibco),
13 - L-Glutamin (Gibco),
14 - nicht essentielle Aminosäuren (Gibco),
15 - Pyruvinsäure (Gibco),
16 - Indomethacin (Sigm . ~~
17 - Merkaptoäthanol (Gibco),
18 - GM-CSF (Shering),
19 - l,25-dihydroxy-Vit-D3 (Roche, Basel, Schweiz)
20 - Ampulle EFN-Gamma (Boehringer).
Die Erfindung bezieht sich auch auf Produkte, die erfindunsgemäßen Makrophagen und Lymphozyten als ein kombiniertes Präparat enthalten, für die gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verwendung in der Adoptiv-Immontherapie.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführung sind die Produkte dieser Erfindung, wie sie oben definiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Makrophagen und die Lymphozyten in einem Verhältnis von wenigstens 1 : 3 bis 2 : 3, als Anzahl der
Zellen ausgedrückt, enthalten.
In dieser Ausführung werden die Makrophagen und die Lymphozyten beide einem Patienten injiziert. Das kann bedeuten, daß:
- entweder der Elutionsschritt annulliert wird und die Makrophagen und Lymphozyten injiziert werden
* nach IFN-Gamma-Aktivierung;
* oder nach gleichzeitiger IFN-Gamma- und EL-2-Aktivierung;
- oder die Makrophagen nach der Kultur, aber vor der Aktivierung, von einander getrennt werden, wobei die Makrophagen anschließend mit IFN-Gamma aktiviert werden und die Lymphozyten anschließend mit IL-2 aktiviert werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf bispezifische Antikörper, die in der Lage sind, ein Antigen eines erfindungsgemäßen Makrophagen und ein Antigen einer Turmorzelle, auf die von der vorerwähnten Makrophage gezielt wird, zu erkennen.
Die bispezifischen Antikörper können präpariert werden, wie in Chokri et al., Res. Immunol. 143 (1992) beschrieben.
Die bispezifischen Antikörper können zur gleichen Zeit wie die Makrophagen gemäß der Erfindung injiziert werden, oder sie können mit den Makrophagen vor der Injizierung vorinkubiert werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Methode zur Behandlung von Krebs, die aus der Verabreichung einer geeigneten Menge von erfindungsgemäßen Makrophagen, und vorzugsweise in einer Menge von etwa 2 &khgr; 10^ bis etwa 5 &khgr; 10^ Makrophagen, besteht.
Eine erfindungsgemäße Methode zur Behandlung von Krebs umfaßt die Verabreichung von Lymphozyten in einer Menge von etwa 4 &khgr; 10^ bis etwa 10 &khgr; 10^ Lymphozyten.
Die efmdungemäßen Makrophagen können auch als Nukleinsäure und / oder Arzneimittelvektoren verwendet werden. Die Erfindung umfaßt daher Makrophagen, die exogene Nukleinsäuren und / oder Arzneimittel enthalten.
Hinsichtlich Makrophagen, die exogene Nukleinsäuren enthalten, sind die Makrophagen präpariert. Durch Transfektion ist der DNA-Code für ein Zytokin oder für ein defektes Protein oder ein Tumorantigen in die Makrophagen integriert, und es wird geprüft, daß er auf den Makrophagen ausgedrückt ist, ehe er einem Patienten injiziert wird.
Das lange Überleben der Makrophagen erlaubt die In-vivo-Expression der integrierten Proteingene.
Beschreibung der Abbildung
Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung der Erzeugung von Makrophagen gemäß der Erfindung.
Peripheres Blut wird einem gesunden Probanden oder einem Patienten entnommen, das der Zytapherese (I) unterworfen wird, die es ermöglicht, ein
Zytapherese-Produkt zu erhalten.
Vorerwähntes Zytaphorese-Produkt wird in FicoU zentrifugiert und gewaschen (&Pgr;), um mononukleare Zellen (Monozyten + Lymphozyten) zu ergeben.
Vorerwähnte mononukleare Zellen werden in einem entsprechenden Kulturmedium, wie hierin definiert, gezüchtet (III), das autologes Serum von einem gesunden Probanden oder von dem Patienten enthält.
Die Kultur der mononuklearen Zellen ergibt eine zelluläre Suspension, die aktiviert wird (IV), und nach der Aktivierung wird ein Schritt der Elution (V) ausgeführt, der es ermöglicht, efindungemäßen Makrophagen zu erhalten, die dann dem Patienten oder dem gesunden Propanden reinjiziert werden.
Die Materialien für jeden der Schritte können folgende sein: (I) : Zytapheresebeutel,
: ACD-Lösung,
: Calciparin,
: gepufferte Kochsalzlösung,
(&Pgr;) : Blutzellen-Prozessor-Verfahrenssatz,
: Ficol-Paque,
: Transferbeutel,
(IE) : Kultur-Beutel,
: Iscove modified Dulbecco medium (IMDM)
: L-Glutamin,
: nicht essentielle Aminosäuren,
: Pyruvinsäure,
: GM-CSF,
: Dihydroxy-Vitamin-D3,
: Beta-Merkaptoäthanol
: Streptomycin,
: Indomethacin,
: CO2,
(IV) : Interferon-Gamma,
(V) : Humanalbuminlösung,
: Injektionsbeutel.
BEISPIEL
I) Material und Methoden
Absonderung von mononuklearen Zellen. Leukozyten von Probanden mit normalen Thrombozyten wurden aus peripherem Blut durch Zytapherese (mit Hilfe
des Durchflußblutzellentrenngeräts COBE 2997 oder Dideco Vivacell) abgesondert.
■Nach Entnahme der Thrombozyten für Zwecke der Bluttransfusion, wurden die konzentrierten Leukozyten-Zytaphereserückstände resuspendiert. Humane mononukleare Zellen wurden durch 15minütige Zentrifugation bei 1000 g mit einem Zellprozessor COBE 2921 unter Benutzung von Ficoll Paque mit Dichte 1,077 (Pharmacia) abgetrennt. Nach 3 Waschungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium wurden mononukleare Zellen erhalten, die 30 bis 50 % Monozyten enthielten, wie mit Channelyser-Analyse (Coulter Margency, Frankreich) nachgewiesen.
Kultur. Differenzierte Humanmakrophagen wurden durch eine 7tägige Kultur von mononuklearen Zellen in Teflon-Beuteln (Dupont - J. BIO, Les Ulis) bei 37 "C und 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit erhalten. Die gesamten mononuklearen Zellen werden zu 5,10^ Zellen/ml auf Iscove-modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM, Gibco) geimpft, ergänzt durch Penizillin (100 LEVmI), Streptomycin (100 &mgr; g/ml), L-Glutamin (2 mM, Gibco), Pyruvinsäure (2 mM, Gibco), Indomethacin (5,1(H> M, Sigma), Merkaptoäthanol (3,10"^ M, Gibco), nicht essentielle Aminosäuren (2 %, Gibco) und 5 % AB-Serum. Es ist zu bemerken, daß dieses Medium als Standardmedium definiert wird, das es ermöglicht, "Standard-Makrophagen", wie oben bereits erwähnt, zu erhalten. Der Zusatz von GM-CSF (500 E/ml, Bering) und / ' oder 1,25-dihydroxy-Vit-D3 (Cholecalciferol 10"8 M, Roche, Basel, Schweiz) wurde in einem Vergleichsversuch vorgenommen. Aktivierung der Makrophagen zu Zytotoxizität wurde durch eine weitere 18stündige Kultur in Gegenwart von 250 E/ml IFN-Gamma (Boehringer, Ingelheim,' Deutschland) ausgeführt. Das Kulturmedium wie auch die Zellpräparationen enthielten weniger als 0,02 LE. LPS / ml.
Elution. Die mononuklearen Zellen oder die differenzierten Makrophagen, die nach 7tägiger Kultur und nach Aktivierung erhalten werden, wurden bei 550 g zentrifugiert, und das Pellet wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert, die 0,1 % Glukose, 0,17 % PO3HNa2, 2H2O, 0,27 % PO3H2Na, 0,14 % NH4Cl, 0,7 % NaCl (Lösung TS745 Laboratoire Bruneau, 92, Frankreich) und 2 % Humanserumalbumin (HSA, CNTS, Frankreich) enthält. Die Zellen werden dann der Elution unterworfen, wie früher von Lopez et al. beschrieben (One step Separation by elutriation of monocytes from leukapheresis products of cancer patients for production of IFN-Gamma activated macrophages in view of adoptive immunotherapy, J. Immunotherapy, 11: 209, 1992). Die Elutionsmethode, die für differenzierte Makrophagen benutzt wurde, die als Fraktion bei "Rotor aus" abgetrennt wurden, war diejenige, die von Andreesen bei konstanter Rotorgeschwindigkeit und steigender Durchflußrate beschrieben wurde (Andreesen et al.: Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating monocytes: a new approach to cancer immunotherapy, Cancer Res. 50: 7450, 1990).
Impulszytophotometrie. Die Phänotypanalyse der Makrophagenpopulationen wurde durch Impulszytophotometrie mit monoklonalen Maus-Antikörpern ausgeführt,
die gegen Membranproteine gerichtet und durch FITC-Konjugate nachgewiesen wurden. Die Antikörper CD3, CD 14, CD71 waren von DAKO (Versailles, Frankreich), anti-HLADR von COULTER (Margency, Frankreich), anti-CD64 (CNTS, Frankreich) und Max-1, der ein Membranantigen der differenzierten Makrophagen erkennt (Andreesen et al.: Surface phenotype analysis of human monocytes to macrophages differentiation, J. Leuk. Biol. 47: 490, 1990), war ein Geschenk von Dr. Emmrich (Erlangen, Deutschland). Kurz gesagt: 5,105 bis 10^ Zellen in Rinder-Serumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden auf Eis 30 Minuten lang in Gegenwart von FFTC-markierten und unmarkierten monoklonalen Antikörpern oder den typengleichen Immunoglobulinkontrollen inkubiert. Für indirekte Immunfluoreszenz-Untersuchungen wurden die Zellen nach Waschen weiter FITC-konjugiertem F-(ab')2-Ziegen-anti-Maus-IgG (Immunotech) 25 Minuten lang auf Eis ausgesetzt. Die Zellen wurden nach Waschen mit Impulszytophotometrie (EPICS Profile, Coulter) analysiert. Das Annahme-Gate wurde auf die Hauptpopulation großer Zellen eingestellt.
Tumorziele^ Die Human-Histiozyten-Zell-Linie U937 wurde als eine kontinuierliche Linie in Suspension gehalten, die in IMDM mit 10 % Kalbsfetusseram (FCS, Gibco) gezüchtet und während des exponentiellen Wachstums als Ziel in der Zytotoxizitätsprüfung verwendet wurde.
In-vitro-Antitumor-Püfung. Differenzierte Makrophagen werden auf flache Mikrotiterplatten mit 96 Mulden geimpft, und zwar \Φ Makrophagen/Mulde in 0,2 ml. Nach -2 Stunden Inkubation bei 37 0C in 5 % CO2 feuchter Luft wurde das Medium entfernt und durch 3MDM + 5 % hu-AB-Serum ersetzt, das 250 E/ml von rhu-IFN-Gamma enthielt oder nicKt enthielt; die Platten wurden weiter über Nacht inkubiert. Nach Waschen wurden jeder Mulde 1O^ U-937-Tumorzellen in 0,2 ml frischem Medium (IMDM + 10 % FCS) hinzugefügt. Nach 24stündigem Kontakt wurde jeder Mulde 0,1 &mgr; Ci von mit Tritium markierten Thymidin für eine weitere Inkubation von 24 Stunden hinzugefügt.
Die Zellen wurden entnommen, und die Bestimmung der eingebauten Radioaktivität auf den Faserglasfiltern wurde mit Beta-Zählung ausgeführt. Der Prozentsatz der Hemmung der Thymidin-Einbau durch Tumorzellen konnte nach der folgenden Formel berechnet werden: '
■V
fcpmT - cpmTM) &khgr; 100
■ ' cpmT
wobei gilt: cpmT = Radioaktivität in Kontrolltumorzellen,
cpmTM = Radioaktivität in Mischkultur Tumorzellen + Makrophagen.
II) Ergebnisse
Wiedergewinnung großer Zellen mit Makrophagen-Morphologie nach 7 Tagen
der Differenzierung von mononuklearen Zellen. Die Wiedergewinnung von mononuklearen Zellen nach einwöchiger Züchtung war durch den Zusatz von GM-CSF oder (OH)2VitD3 nicht merkbar verändert. Im Gegensatz hierzu war die Menge
der großen Zellen mit Makrophagen-Morphologie in Gegenwart von GM-CSF stark vergrößert (Tabelle &Igr;&Pgr;). Der Zusatz von GM-CSF erhöhte die Makrophagen-Wiedergewinnung (Ergebnis von 12 verschiedenen Kulturen) beträchtlich (p<0,001).
Der Zusatz von (OH)2"VitD3 zur Kultur vergrößerte nicht die Menge der Makrophagen; die Kombination von GM-CSF + VitD3 ermöglichte jedoch einen
reproduzierbaren höheren Ertrag von Makrophagen (Tabelle &Igr;&Pgr;).
10
Tabelle III stellt die Ergebnisse zusammen, die hinsichtlich des Ertrages und der zytotoxischen Aktivität erhalten wurden; die letzte Spalte entspricht den erfindungsgemäßen Makrophagen.
Tabelle &Egr;&Pgr;
Durchschnittliche Wiedergewinnung und Antitumorpotenz von MAK-Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen erzeugt wurden
MAK Standard +VkD3 +GM-CSF +VitD3
medium + GM-CSF
(a) Ertrag nach 37 ±7 36 + 7 69+10* 76+11*
7 Tagen
(b) zytotoxische
Aktivität:
- IFN-Gamma 45 + 9 59 ± 14 44 ± 5 71 ± 5*
+ IFN-Gamma 76 ±5 76 + 7 76 ±5 93 ± 2*
(a) Prozentsatz der Makrophagen zur Anzahl der ausgeimpften Monozyten und Standardfehler für 12 Bestimmungen. ·
(b) Prozentsatz der Inhibition von 3H-Thymidin-Einbau durch U937-Zellen, Durchschnitt und Standardfehler für 8 verschiedene Präparate mit je 5 Bestimmungen; (*<0,05 durch Studenten, Vergleichswerte mit Standardmedium).
Phänotyp von MAK-Zellen, der in Gegenwart oder Abwesenheit von_GM- CSF und von (OH)2VitDß erzeugt wird^ Mononukleare Zellen werden nach 7 Tagen Kultur und Aktivierung mit IFN-Gamma vollständig zu Makrophagen differenziert, wie durch die bedeutende Expression von spezifischen Differenzierungsantigenen
(Max-l, CD64, HLA-DR) gezeigt wird (Tabelle II). Es wurde keine Änderung der Phänotypen des Antigens beobachtet, ausgenommen für die Expression des Transferrin-Rezeptors (CD71), der in Gegenwart von GM-CSF oder von GM-CSF + (OH)2VitD3 vermindert wurde (p<0,05). Diese Verminderung von CD71 wurde in Verbindung mit großen differenzierten Zellen beobachtet. Nicht-relevantes-Kontroll-Ig, das für direkte bzw. indirekte Fluoreszenzuntersuchungen benutzt wurde, ergab weniger als'5 % bzw. weniger als 10 % der großen Zellen.
Nachstehende Tabelle &Pgr; faßt die Ergebnisse zusammen, die den Phänotyp der Makrophagen betreffen, die unter verschiedenen Bedingungen erhalten wurden; die letzte Spalte entspricht den erfindungsgemäßen Makrophagen.
Tabelle &Pgr;
Phänotyp der MAK-Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen erzeugt wurden
Standard + GM-CSF +VitD3 GM-CSF+ VitD3
CD3 25 + 8 13 ±4 19 + 7 17 ±2
CD14 91 ±6 95 + 6 85 ±10 93+11
CD71 83 ±11 59 ±22 81 + 16 46 ±17
HLA-DR 94 + 3 96 + 2 94 ± 4 95+1
MAX-I 89 ±9 84 + 6 89 ± 10 79 ± 7
CD64 95 ±4 96 ±4 96 ±4 98 ±1
(FC-Gamma-RI)
Die Werte sind Durchschnittswerte und Standardfehler für fünf verschiedene Versuche.
Funktionalität der Makrophagen: Antitumoraktivität. Makrophagen, die in
Kultur differenziert wurden, drückten keine hohe spontane Antitumoraktivität aus, wenn sie nicht EFN-Gamma ausgesetzt wurden, ausgenommen die Makrophagen, die in Gegenwart von (OH^VkD3 + GM-CSF erzeugt wurden, die spontan die Proliferation von U937-Zellen hemmten. Nach 18stündiger Aktivierung durch IFN-Gamma zeigten die MAK-Zellen in vitro unter den verschiedenen Kulturbedingungen Antitumoraktivität. Die höhere Antitumoraktivität wurde reproduzierbarer bei Makrophagen erreicht, die in Gegenwart von VitD3 + GM-CSF differenziert wurden
(Tabelle &Pgr;&Igr;).
Kinetik der Makrophagenaktivierung durch IFN-Gamma. Makrophagen, die
unter Standardbedingungen differenziert wurden, wurden nach 18 Stunden Kontakt mit 250 E/ml IFN-Gamma für Antitumorfunktionen aktiviert; diese Antitumoraktivität fiel dann im Laufe der Zeit langsam ab und erreichte nach 3 bis 4 Tagen Kon troll werte. Diese Makrophagen konnten durch erneutes Aussetzen gegenüber 250 E/ml EFN-Gamma vollständig auf. hohe Antitumoraktivität reaktiviert werden.
Makrophagen, die sich in Gegenwart von GM-CSF + (OH)2VitD3
differenzierten, hatten eine höhere Antitumoraktivität als die Kontrollen; nach Aktivierung durch 250 E/ml IFN-Gamma behielten sie diese Antitumoraktivität in Kultur auf einem hohen Niveau bei, sogar nach 2 bis 3 Tagen. In der Tat war die Inhibition der Thymidineinbau durch U937-Zellen 60 Stunden nach der Aktivierung für Makrophagen 28 ± 3 %, verglichen mit 54 + 2 % für Makrophagen, die GM-CSF und (OH)2VitD3 ausgesetzt wurden (p<0,01 Durchschnittswert für 3 Versuche). Ein erneutes Aussetzen dieser kultivierten Makrophagen gegenüber 250 E/ml rh-IFN-Gamma erhöhte die Antitumorpotenz auf mehr als 80 % Inhibition von Thymidin-Aufnahme durch U937-Zellen,- in.einem Verhältnis von 1 : 1 von Effektor : Tumor (Durchschnittswert für 3 Versuche).
Nachstehende Tabelle I faßt die Ergebnisse zusammen, die sich auf die Kinetik beziehen, und vergleicht die Standard-Makrophagen mit den erfindungsgemäßen Makrophagen.
Tabelle I
Kinetik der Makrophagen-Deaktivierung nach 18stündiger IFN-Gamma-Aussetzung
Zeit (Stunden) nach Prozentuale Inhibition der 3-H-Thymidin-
IFN-Gamma-Aktivierung Einbau durch U937-Zellen
0 18 40 65
Standard- Erfindungsgemäßen
Makrophagen Makrophagen
17 ±2 43 ± + 3
55 ±5 73 ± + 3
31±7 53 ± + 2
28 ±3 54 ++ 2
Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte für drei Versuche.
In dieser Tabelle gilt:
. Zeit 0: Es besteht keine IFN-Gamma-Aktivierung;
. Zeit 18: 18 Stunden nach dem Beginn der IFN-Gamma-Aktivierung, das entspricht dem Ende der Aktierung; die Makrophagen befinden sich nicht mehr in der Gegenwart von IFN-Gamma;
. Zeit 40: 40 Stunden nach dem Beginn der IFN-Gamma-Aktivierung;
. Zeit 65: 65 Stunden nach dem Beginn der IFN-Garnma-Aktivierung.
Es ist zu bemerken, daß die maximale zytotoxische Aktivität nach einer weiteren Aktivierung durch EFN-Gamma, die etwa 16 bis 24 Stunden dauert, erhalten wird.

Claims (18)

1. Makrophagen, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens eine der nachstehenden Eigenschaften haben:
- ihre zytotoxische Aktivität ohne EFN-Gamma ist um etwa 20 bis 30 % im Vergleich zu Standard-Makrophagen erhöht, und sie beträgt vorzugsweise etwa 70 %;
- ihre zytotoxische Aktivität mit IFN-Gamma ist um etwa 20 bis 40 % in bezug auf Standard-Makrophagen erhöht, und sie beträgt vorzugsweise etwa 93 %;
- die Verlängerung der Deaktivierung der zytotoxischen Aktivität als Antwort auf eine Aktivierung durch IFN-Gamma steht in einem Verhältnis derart, daß nach 60 Stunden Aktivierung durch &Ggr;&Rgr;&Ngr;-Gamma die zytotoxische Aktivität höher ist als 30 % oder gleichwertig ist mit 30 %, vorzugsweise etwa 55 % ist, im Vergleich zu der maximalen zytotoxischen Aktivität, die von Makrophagen auf Grund einer Aktivierung durch IFN-Gamma geboten wird, wobei die vorerwähnte zytotoxische Aktivität als der Prozentsatz der Hemmung der 3-H-Thymidin-Einbau durch Zielturmorzellen, insbesondere U-937-Zellen, gemessen wird.
2. Makrophagen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Eigenschaften haben:
- ihre Größe beträgt von etwa 10 bis etwa 20 &mgr;&pgr;&agr;;
- sie haften an Kunstharzflächen;
- ihre Lebensfähigkeit ist vorzugsweise höher als etwa 70 %;
- sie weisen eine Phagozytose-Eigenschaft auf;
- sie weisen auf ihrer Oberfläche Differenzierungsantigene, wie CD64, CD68, MAXI, HLADR auf;
- ihre zytotoxische Aktivität ist größer als etwa 50 %.
Telefon: 0 89-5446 90 t00446.2361@COmDUSerVe.COm Dresdner Bank (München) Kto. 3939 844 (SLZ 700 800 00)
&bull; »I..... .J ,* Deutsche Sank (München) Kto. 2861060 (BLZ 700 70010)
Telefax (G3): 0 89-53 26 11 !(QiJring" jrtttoöilcti^n phase; maifcox Postbank (München) Kto. &bgr;7&ogr;-43-&bgr;&ogr;4 (blz 7oo ioo so)
Telefax (G4): 0 89-53 29 09 50 cnecK will'be 6Wy ttvice"a week) sanwa Bank (Düssetdorf) &kgr;&iacgr;&ogr;. soo 047 (blz 301307 00)
3. Makrophagen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Züchtung von Monozyten in einem Kulturmedium erhältlich sind, das l,25-dihydroxy-D3-Vitamin und GM-CSF enthält.
4. Makrophagen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich sind durch Züchtung von sowohl Monozyten als auch Lymphozyten in einem Kulturmedium, das l,25-dihydroxy-D3-Vitamin und GM-CSF enthält, für eine Zeit, die ausreichend ist, um differenzierte Makrophagen zu erhalten, vorzugsweise für etwa 6 bis 7 Tage, möglicherweise Aktivierung der Makrophagen, die sich aus den Monozyten und Lymphozyten ergeben, durch IFN-Gamma,
und Trennen der Makrophagen von den Lymphozyten vor oder 15
nach der Aktivierung durch IFN-Gamma, vorzugsweise nach der IFN-Gamma-Aktivierung, und Wiedergewinnung der Makrophagen.
5. Makrophagen nach einem der Ansprüche 3 oder 4,
dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich sind, indem D3- _._ __
Vitamin m einer Konzentration von 10 xu bis etwa 10 ', vorzugsweise von etwa 10~8 M, verwendet wird.
6. Makrophagen nach einem der Ansprüche 3 bis *5,
dadurch gekennzeich-net, daß sie erhältlich sind, indem GM-25
CSF in einer Konzen-tration von 50 bis etwa 1000 E/ml, insbesondere von etwa 100 bis 500 E/ml, verwendet wird.
7. Makrophagen nach einem der Ansprüche 3 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich sind, indem ein oU
Kulturmedium aus RPMI, IMDM, MEM oder DMEM verwendet wird.
8. Makrophagen nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich sind, indem ein Kulturmedium verwendet wird, das Indomethacin oder/und Cimetidin enthält.
9. Makrophagen nach einem der Ansprüche 3 bis 8, erhältlich durch ein Verfahren, dessen Ertrag von Makrophagen größer als etwa 40 % ist, und vorzugsweise etwa 76 %
beträgt.
5
10. Makrophagen nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhältlich sind, indem dem Kulturmedium gleichzeitig mit den Makrophagen abgetötete Tumorzellen hinzugefügt werden, wobei beide Zellarten vorzugsweise von dem gleichen Patienten stammen, vorzugsweise im Verhältnis von etwa 1 Million abgetöteter Tumorzellen / ml, wobei die vorerwähnten abgetöteten Tumorzellen zur gleichen Zeit wie die Makrophagen verarbeitet werden, und wobei die Expression der Tumorantigene auf den Makrophagen geprüft wird, ehe sie einem Patienten injiziert werden.
11. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff Makrophagen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 enthalten.
12. Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß es Elemente, die für das Wachstum und die Differenzierung von
Monozyten zu Makrophagen nach den Ansprüchen 1 bis 10 25
notwendig sind, enthält, und daß es zusätzlich D3-Vitamin und GM-CSF enthält.
13. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er enthält:
- Mittel für die Wiedergewinnung von Lymphozyten und Monozyten, die frei von Verunreinigungen sind;
- entsprechende Puffer- und Waschlösungen, und möglicherweise entsprechende Mittel für die Konservierung von Makrophagen;
- Mittel für das Präparieren eines Kulturmediums 35
für die Monozyten und möglicherweise die Lymphozyten, das l,25-dihydroxy-Vitamin-D3 und GM-CSF enthält;
-A-
- möglicherweise IFN-Gamma.
14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß
er enthält:
- Mittel für die Wiedergewinnung und Zentrifugierung von Blut, um ein Leukozytenkonzentrat zu erhalten;
- Mittel für das Trennen von Lymphozyten und Monozyten von den anderen Leukozyten und Mittel für das Entfernen verunreinigender Erythrozyten;
- Kulturmedium für Makrophagen und möglicherweise Lymphozyten, mit Ergänzungen, und insbesondere 1,25-dihydroxy-Vitamin-D3 und GM-CSF und möglicherweise Indomethacin und/oder Cimetidin;
- Mittel für das Trennen der Lymphozyten von 15
Makrophagen;
- geeignete Mittel für die Konservierung von Makrophagen;
- geeignete Puffer- und Waschlösungen,
- möglicherweise IFN-Gamma;
- Mittel für die Expression von Tumorantigenen durch die Makrophagen.
15. Produkte, dadurch gekennzeichnet, daß sie Makrophagen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10
enthalten, und Lymphozyten, als ein kombiniertes Präparat für die gleichzeitige, getrennte oder sequentielle Verwendung in zytostatischer Therapie.
16. Produkte nach Anspruch 14, dadurch gekennzeich-30
net, daß sie die Makrophagen und Lymphozyten in einem Verhältnis von wenigstens 1:3 bis 2:3, als Anzahl der Zellen ausgedrückt, enthalten.
17. Bispezifische Antikörper, dadurch gekennzeichnet, 35
daß sie in der Lage sind, ein Antigen eines Makrophagen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10 und ein
Antigen einer Tumorzelle, auf das von der vorerwähnten Makrophage gezielt wird, zu erkennen.
18. Makrophagen nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie exogene Nukleinsäuren und/oder Drogen enthalten.
&iacgr;&ogr; /4
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