JPH08510118A

JPH08510118A - 新規なマクロファージ、その製造方法、及び医薬組成物の活性物質としてのその用途

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Publication number: JPH08510118A
Application number: JP6524843A
Authority: JP
Inventors: チョクリ，モハメッド; バルトラン，ジャック
Original assignee: I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Current assignee: I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Priority date: 1993-05-18
Filing date: 1993-05-18
Publication date: 1996-10-29
Anticipated expiration: 2018-10-06
Also published as: DE9390311U1; CA2163218A1; AU701147B2; US5662899A; WO1994026875A1; CA2163218C; AU8050494A; JP3454825B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、以下の特性：ＩＦＮ−γの非存在下での細胞障害活性が、標準的マクロファージと比較して、約２０〜３０％増強され、そして好ましくは約７０％である；ＩＦＮ−γの存在下での細胞障害活性が、標準的なマクロファージと比較して、約２０〜約４０％増強され、そして好ましくは約９３％である；ＩＦＮ−γによる活性化に応答する、細胞障害活性の不活性化までの時間の延長が、ＩＦＮ−γによる活性化の６０時間後に、マクロファージの細胞障害活性が、ＩＦＮ−γによる活性化に起因してそれが示した最大細胞障害活性と比べて、その３０％又はそれ以上、好ましくは約５５％であるような比率である（該細胞障害活性は、標的腫瘍細胞、詳細にはＵ９３７細胞による³Ｈチミジン取り込みの阻害のパーセントとして測定する）；の少なくとも一つを有するマクロファージに関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なマクロファージ、その製造方法、及び医薬組成物の活性物質としてのその用途技術分野本発明は、新規なマクロファージ、その製造方法、及び医薬組成物の活性物質としてのその用途に関する。背景技術細胞障害性白血球（ＮＫ、Ｔリンパ球、単球−マクロファージ）は、腫瘍に対する宿主側の防御において、強力なエフェクターである。現在では、自己由来のエフェクター細胞の殺腫瘍効力の、in vitroにおける拡張及び亢進、並びにそれに引き続く宿主側へのその再注入が、現在、局所又は全身的養子免疫療法において用いられている（Rosenberg et al.:進行ガン患者１５７人のＬＡＫ細胞及びＩＬ２又はＩＬ３単独を用いた治療に関する推移報告 N．Engl．J．Med．316： 889，1990。Rosenberg et al.：転移性メラノーマ患者の免疫療法における腫瘍浸潤性リンパ球及びＩＬ２の使用 N．Engl．J．Med．319：1676，1990。Lacern a et al.：リンホカインにより活性化されたキラー細胞及びＩＦＮ−γにより活性化されたキラーリンパ球を用いたガンの養子免疫療法 Pharm．Ther．38：453 ，1988）。マクロファージは、抗腫瘍性反応において、中心的役割を有し、免疫強化物質により、新生物細胞に対して活性を有するように活性化することができる（Adam s D．and Hamilton T.：腫瘍細胞傷害のためのマクロファージの活性化：エフェクターのメカニズム及びその調節 In Heppner & Fulton（eds），Macrophages and cancer．CRC Press ，1988，p．27。Fidler I.：マクロファージ及び転移。ガン療法への生物学的アプローチ Cancer Res．45：4714，1985）。ネズミのモデルでは、腫瘍に局所的に投与された活性化マクロファージにより、腫瘍の成長が阻害され、転移が減少することが、証明されている（Bartholeyn s et al.：ガンの免疫療法：培地中で増殖した活性化マクロファージによる実験的アプローチ Cancer Detect． & Prev．12：413，1988。Chokri et al．：ＬＰＳ、ＴＮＦ、ＩＦＮ及び活性化マクロファージの抗腫瘍効果：相乗作用及び組織分布 Anticancer Res．9：1185，1989）。ヒトの血液より単離した単球は、疎水性バッグ中で７日間培養することによって、in vitroにおいてマクロファージに分化させることができる（Chokri et al.:ＬＰＳ、ＴＮＦ、ＩＦＮ及び活性化マクロファージの抗腫瘍効果：相乗作用及び組織分布 Anticancer Res．9：1 185，1989）。これらのマクロファージは、ＩＦＮ−γの存在下で培養後、活性化され、in vitroでは、多数のヒト腫瘍に対し、またはヌードマウスに移植された腫瘍に対し、殺腫瘍性を示すようになる（活性化マクロファージキラー：ＭＡＫ）（Andreesen et al.：ヒト単球のマクロファージへの分化に関する表面表現型の分析 J．Leuk．Biol．47；490，1990。Dumont et al.：養子移入に関し、多量に産生されたヒトマクロファージの抗腫瘍活性の調節 Eur．J．Cancer 24 ：1691，1988）。ＭＡＫの養子移入は、異なる研究者達により、ストラスブルグ、フライブルグ及びパリにおいて、転移性ガン患者を対象に、自己由来のＭＡＫ１０⁸〜２×１０⁹個を全身的又は腹腔内に注入することによって、第Ｉ相臨床試験に供された（Andreesen et al.：循環単球からin vitroにおいて生成させた腫瘍細胞障害性マクロファージの養子移入：ガン免疫療法に対する新しいアプローチ Cancer Res．50：7450，1990。Bartholeyns et al.活性化マクロファージによる固形ガンの養子免疫療法：実験及び臨床結果 Anticancer Res．11:1201，199 1。Lopez et al.：養子免疫療法を考慮した、ＩＦＮ−γ活性化マクロファージ産生のための、ガン患者の白血球搬出法生成物から得た単球のエルトリエーションによる一段階分離 J．Immunotherapy，11：209，1992。Faradji et al.:非小細胞肺ガン患者における、ex-vivoにおいて活性化された血液由来マクロファージの静脈内注入の第Ｉ相試験：毒性及び免疫調節効果Cancer Immunol．Immunoth er．33：319，1991）。軽度の発熱及び寒けなど、軽微な副作用はあったが、その臨床的耐性は優れていた。最大耐性投与量は、一回の血球アフェレーシスから生成されたＭＡＫの数が限られているために、求めることはできなかった。従って、より多量のＭＡＫを得ることが、臨床試験及び療法において、最適な抗腫瘍効力を確認するために、求められている。通常の培地中で従来このようにして調製されてきたマクロファージは、約４０％未満の収量で、得られる。しかし、in vivoにおける有効性を高め、そして次回のマクロファージ投与を遅らせるために、より高い細胞障害活性を示すマクロファージが求められている。発明の開示本発明の目的の一つは、標準的なマクロファージを超える、より高い細胞障害活性を有するマクロファージを提供することである。本発明の別の目的は、細胞障害活性の不活性化の速度が、標準的マクロファージと比較して、より緩徐であるマクロファージを、提供することである。本発明の更に別の目的は、標準的マクロファージと比較して、改良された細胞障害活性を有し、その細胞障害活性の不活性化速度がより緩徐である、マクロファージの調製を可能とする新規培地を提供することである。本発明の目的は、以下の特性のうち少なくとも１つを有するマクロファージにより達成される。 − ＩＦＮ−γによる活性化を受けない状態での細胞障害活性が、標準的マクロファージと比較して、約２０〜３０％増強されており、そして好ましくは約７０％である； − ＩＦＮ−γによる活性化により、その細胞障害活性が、標準的なマクロファージと比較して、約２０〜約４０％増強されており、そして好ましくは約９３％である； − ＩＦＮ−γの活性化に応答する、細胞障害活性の不活性化時間の延長が、ＩＦＮ−γによる活性化の６０時間後では、細胞障害活性が、ＩＦＮ−γにより活性化された後のマクロファージの示す最大細胞障害活性と比べて、その３０％又はそれ以上であり、好ましくは約５５％であるような割合である（該細胞障害活性は、標的腫瘍細胞、詳細にはＵ９３７細胞による³Ｈチミジン取り込みの阻害のパーセントとして測定する）「標準的マクロファージ」との用語は、実施例の箇所で定義するような標準培地中での単球の培養により得られるものに相当する。「細胞障害活性」は、標的腫瘍細胞、詳細にはＵ９３７細胞による³Ｈチミジン取り込みの阻害のパーセントとして測定するものであり、その測定のための試験については、以下に述べる：分化したマクロファージを、０．２ml中、１ウエル当り１０⁴個の割合で、９６ウエルのフラットマイクロタイタープレートに接種した。ＣＯ₂ ５％を含む加湿大気中、３７℃で２時間培養後、培地を除去し、ｒｈｕＩＦＮ−γ ２５０U/ mlを含有するか、又は含有しないＩＭＤＭ＋５％ヒトＡＢ血清と置換し；プレートを更に一夜培養した。洗浄後、各ウエルに、新しい培地（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ）０．２ml中のＵ９３７腫瘍細胞１０４個を加えた。２４時間接触させた後、０．１μCiのトリチウム含有チミジンを、各ウエルに加え、更に２４時間培養した。細胞を集め、ファイバーグラスフィルターを用い、取り込まれた放射活性物質の測定を、β線を計数することによって行った。腫瘍細胞のチミジン取り込みの阻害パーセントは、式：（式中、ｃｐｍＴ＝対照の腫瘍細胞中の放射活性ｃｐｍＴＭ＝腫瘍細胞＋マクロファージ混合培地中の放射活性）に従って、計算することができた。このような方法により、本発明記載のマクロファージの抗腫瘍活性の主要な３つの型、つまり細胞溶解、細胞停止及び食作用を調べることができることは注目すべきことである。マクロファージはヒト被験者由来のものであって、健康な者、又は各種疾患に罹患している患者、のいずれから由来したものでもよい。例として、健康な被験者の単球の培養物に由来する標準的マクロファージの、本来の細胞障害活性（つまりＩＦＮ−γによる活性化は受けていない）は、約４５％であるが、本発明マクロファージの場合では、約７０％であり、そしてＩＦＮ−γによる活性化後は、標準的マクロファージの細胞障害活性は、約７６％である一方、本発明のマクロファージの場合は、約９３％である。細胞障害活性の同様の増強が、患者より得られたマクロファージについても、得られる。不活性化時間の動力学については、以降に記載する表Ｉに、標準的マクロファージ及び本発明のマクロファージの場合の、上述した活性測定に関する結果を要約する。上述の特性により、該細胞障害活性から本発明のマクロファージの有利さを考慮すると、活性が５０％以下である場合には、治療においては有用でないと考えられる。本発明マクロファージは、３日又は４日ごとの投与ではなく、週１回の投与を可能にするものである。好ましい実施態様によると、本発明のマクロファージは、以下の特徴： − その大きさが、約１０〜約２０μｍである； − プラスチック表面に付着する； − 生存率は、好ましくは約７０％以上である； − 食作用特性を示す； − その表面に、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＭＡＸ１、ＨＬＡＤＲなどの分化抗原を有する； − その細胞障害活性が、約５０％以上である； − 本発明マクロファージは、好都合には、細菌及び生物学的夾雑物を含まない；を有する。マクロファージの大きさが、２０μm以上である場合は、相互に融合して、その役割が明確には理解されていない巨大細胞を形成する傾向にあることを、意味する；大きさが、１０μm以下である場合は、マクロファージが、十分には分化していないことを、意味する。その大きさは、チャンネライサー（Channelyser：Coulter Margency、フランス）により、測定することができる。プラスチック表面に対する付着性は、産生されたマクロファージを３０分間培養後、ペトリ皿を用いて確認することができる（付着％）。生存率は、培養終了時の生存細胞数であり、この生存率は、好ましくは約７０％以上であり、トリパンブルー排除により測定する。食作用性は、Stevenson and Fauciが、Manual of Macrophages methodology； Marcel Dekker，N.Y．pp．75-80，1981に記載したように、ラテックスビーズ又はデキストラン粒子の摂取により、確認することができる。ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＭＡＸ１、ＨＬＡＤＲなどの表面分化抗原は、標準的マクロファージと比較して、同様又は高レベルで、発現される；これは、フローサイトメトリーにより測定することができる。以降に記載する表IIには、異なる条件下で得られた表現型の結果を示す。この表から、本発明のマクロファージは、新しい特性を有するが、マクロファージの主な機能は、細胞障害活性の増加を除いて、変わっていないと結論することができる。しかし、トランスフェリン受容体であるＣＤ７１は、ビタミンＤ₃＋ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー剌激因子）の存在下では低下し、これは、マクロファージの活性化亢進状態と相関する。ＣＤ７１の発現は、実施例の箇所に記載したように、求める。細胞障害活性は、Ｕ９３７細胞について測定し、マクロファージとＵ９３７の比率は、１／１とする。本発明のマクロファージは、好都合には、ウイルス、細菌、真菌及び生物学的夾雑物を含まない。本発明は、また、上記において定義したようなマクロファージを調製する方法であって、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中で、単球を培養することからなる方法に関する。より詳細には、本発明の方法は、単球及びリンパ球の両方を、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中、分化マクロファージを得るのに十分な時間、好ましくは約６〜７日間、培養し、可能であれば、単球より得られるマクロファージ、及びリンパ球を、ＩＦＮ−γにより活性化し、そしてＩＦＮ−γによる活性化の前又は後、好ましくはＩＦＮ−γによる活性化の後に、リンパ球とマクロファージを分離して、マクロファージを回収することからなる。好ましい実施態様によると、本発明の方法は、以下の工程： − 健康な被験者又はガン患者の血液から、血球アフェレーシスにより、白血球を単離して、血球アフェレーシス生成物（つまり濃縮白血球）を得、 − 例えば血球アフェレーシス生成物の遠心分離により、血小板を除去して、白血球を豊富に含む生成物を得、 − 白血球を豊富に含む生成物中、単核細胞を一方に、及び夾雑物である赤血球及び顆粒球をもう一方に分離し、 − 単核細胞（単球＋リンパ球）を、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中で、約６〜７時間培養して、分化マクロファージを得、 − 該マクロファージ及びリンパ球を、ＩＦＮ−γにより、約１６時間〜約２４時間活性化し、 − 活性化されたマクロファージを、リンパ球から、例えばエルトリエーション（水簸：elutriation）により分離する、からなる。リンパ球は、単球類から、培養工程前に分離してもよい。リンパ球は、培養後及びＩＦＮ−γによる活性化前に、マクロファージと分離してもよい。好都合には、マクロファージとリンパ球は、ＩＦＮ−γによる活性化後に、互いに分離する。本発明の方法においては、ビタミンＤ₃を、１０^-10〜約１０^-7、好ましくは約１０^-8Ｍの濃度で使用する。本発明の方法においては、ＧＭ−ＣＳＦを、約５０〜約１０００U/ml、特に約１００〜約５００U/mlの濃度で使用する。本発明の方法においては、培地は、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ又はＤＭＥＭである。これらの培地は、市販されており、入手可能である。好都合には、培地は、インドメタシン（又は別のシクロ−オキシゲナーゼ阻害剤）及び／又はシメチジン（ヒスタミンＨ₂アンタゴニスト）を含有する。本発明のマクロファージを調製する好都合な方法は、以下のとおりである：血球アフェレーシス Cobe2997又はDideco Vivacell持続フロー血球分離装置を用い、血球アフェレーシスにより、健康な被験者又はガン患者より得た末梢血から、白血球を単離する。夾雑した血小板を減少させるために、血球アフェレーシス生成物を、２８０ｇで１０分間遠心分離する。血小板を豊富に含む血漿を除去し、白血球ペレットを、グルコース０．１％、ＰＯ₃ＨＮａ₂・２Ｈ₂Ｏ０．１７％、ＰＯ₃Ｈ₂Ｎａ０．２７％、ＮＨ₄Ｃｌ０．１４％、ＮａＣｌ０．７８％を含有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中（solution TS745、laboratoire Bruneau、Fra nce）に再懸濁する。白血球を豊富に含む得られたペレットは、白血球を平均（７〜９）×１０⁹個含有する（単核細胞を５０％含む）。単核細胞の単離 COBE2991又は比重１．０７７のFicoll Paque（Pharmacia）を用いたStericell 細胞処理装置を用いて、１０００ｇで１５分間遠心分離することによって、ヒト単核細胞を、赤血球及び夾雑物である顆粒球から分離する。リン酸緩衝食塩水（カルシウム及びマグネシウムを含まない）中、３回洗浄後、チャンネライサー分析（Coulter Margency、France）により示されるように、純度約５０％で単球が得られる。培養単核細胞を、テフロン又はポリプロピレン製疎水性バッグ（Dupont-J．BIO、l ife cell-Travenol stericell-TERUMO）中、３７℃で、５％ＣＯ₂及び９５％加湿大気中、７日間培養することによって、分化ヒトマクロファージを得る。全単核細胞を、Iscove修飾培地（ＩＭＤＭ、Gibco）又は同等の、ペニシリン（１００UI/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）、Ｌ−グルタミン（２mM、Gib co）、ピルビン酸（２mM、Gibco）、インドメタシン（５×１０^-6M、Sigma）、シメチジン（１０^-6〜１０^-9 M）、メルカプトエタノール（３×１０^-5M、Gibco）、非必須アミノ酸（１％、G ibco）、及び自己由来又はＡＢ血清２〜５％を補給した培地中、５ｘ１０⁶個/ml の割合で接種する。ＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml、Shering）及び／又は１，２５ −ジヒドロキシビタミンＤ₃（コレカルシフェロール１０^-8M、Roche、Basel、Sw iss）を、比較実験において添加した。マクロファージの細胞障害性の活性化は、ＩＦＮ−γ（Boehringer、Ingelhei m、ＦＲＧ）２５０U/mlの存在下で、更に１６〜１８時間培養することによって行った。エルトリエーション７日間の培養及び活性化後に得られる分化マクロファージを、５５０ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを、グルコース０．１％、ＰＯ₃ＨＮａ₂・２Ｈ₂Ｏ０．１７％、ＰＯ₃Ｈ₂Ｎａ０．２７％、ＮＨ₄Ｃｌ０．１４％、ＮａＣｌ０．７８％を含有し、２％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、ＣＮＴＳ−France）を添加したリン酸緩衝食塩水（solution TS745、laboratoire Bruneau、France ）に再懸濁する。次に細胞を、Andreesen et al．（Cancer Res.，50，1990）により記載されたようなＪ５．０ローター及び４０mlのエルトリエーションチャンバーを装備した Beckmann J6 ME遠心分離機を用いて、エルトリエーションに付す。分化マクロファージを、一定のローター速度で、流速を増大させながら、集める。本発明の方法により、約４０％以上、そして好ましくは約７６％の収率で、マクロファージを得ることができるが、この収率は、得られた生存しているマクロファージと出発時の単球の比率である。この収率は、細胞計数及びチャンネライサーにより求めることができる。好ましい実施態様によると、本発明の方法は、死んだ腫瘍細胞を、単球と同時に培地中に加えるものであり、両細胞とも、好ましくは、同一患者由来のものであり、その比率は、好ましくは、１ml当り、死んだ腫瘍細胞約１００万個であり、該死んだ腫瘍細胞は、マクロファージと同時に処理される。死んだ腫瘍細胞は、次に、白血球と同時に、約１×１０⁶/mlの量で、処理することができ、ＩＦＮ−γによる活性化後又は前、そして好ましくはＩＦＮ−γによる活性化後に、例えばリンパ球と同時に、マクロファージから分離することができる。本方法により、腫瘍に対して特異的であり、これらの特異的腫瘍細胞を、in v ivoにおいて非常に効率よく殺すマクロファージ及びリンパ球を得ることができる。本発明は、また、上記において定義した方法により得られるマクロファージに関する。本発明は、また、上記において定義したマクロファージを、活性物質として含有する医薬組成物に関する。本発明は、また、単球が、成長及び分化して、本発明のマクロファージとなるために必要である成分、並びにビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地に関する。本発明のマクロファージは： − 夾雑物を含まないリンパ球及び単球の回収のための手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液、そして可能であればマクロファージの保存に適切である手段； − １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する、単球及び可能であればリンパ球のための培地を調製する手段；及び − 可能であればＩＦＮ−γ；を含むキットの一部であることができる。本発明の好都合な実施態様によると、本キットは、以下： − 血液を回収及び遠心分離して、白血球濃縮物を得るための手段； − リンパ球及び単球を、その他の白血球細胞から分離し、そして夾雑物である赤血球細胞を除去するための手段； − 補助成分、特に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦ、並びに可能であればインドメタシン及び／又はシメチジンを含む、マクロファージ及び可能であればリンパ球用の培地； − リンパ球をマクロファージから分離するための手段； − マクロファージ保存のための適切な手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液； − 可能であればＩＦＮ−γ；を含むものである。実施例として、好都合なキットは、以下の要素：１−血球アフェレーシスキット（Fenwal）、２−移送バッグ（R 20-21-Fenwal）、３−Ficollグラジエント（グラジエント／洗浄処理装置セット、Stericell-Teru mo）又は血球処理装置（Cobe 912-647-819）による遠心分離キット、４−エルトリエーションキット（Macopharma）５−移送パックユニット２Ｌ（Travenol-4R2041）、６−細胞培養用疎水性バッグ（Teflon，J．BIO- lifecell、Tranvenol-Stericel l、Terumo）、７−インジェクションバッグ（Travenol）、８−リン酸緩衝食塩水（solution TS745 Laboratoires Bruneau）、９−Ficoll-Paque（Pharmacia）、１０−ヒトアルブミン溶液（Biotransfusion）、１１−培地（IMDM-Gibco）１２−ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、１３−Ｌ−グルタミン（Gibco）、１４−非必須アミノ酸（Gibco）、１５−ピルビン酸（Gibco）、１６−インドメタシン（Sigma）、１７−メルカプトエタノール（Gibco）、１８−ＧＭ−ＣＳＦ（Shering）、１９−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（Roche、Basel、Swiss）２０−ＩＦＮ−γバイアル（Boehringer）からなる。本発明は、また、本発明によるマクロファージ、及びリンパ球を含有する、養子免疫療法における同時、個別又は連続的使用のための組み合わせ製剤としての製品に関する。好都合な実施態様によると、上記において定義した本発明生成物は、マクロファージ及びリンパ球を、細胞数で表して、少なくとも¹/₃〜²/₃の比率で含有することを特徴とする。この実施態様においては、マクロファージ及びリンパ球の両方を、患者に注射する。これは： − エルトリエーションの工程を省略して、マクロファージ及びリンパ球を＊ＩＮＦ−γによる活性化後注射するか；＊若しくはＩＦＮ−γ及びＩＬ−２による同時活性化の後に注射するか、又は − マクロファージ類を、培養後、しかし活性化前に互いに分離し、マクロファージをその後にＩＦＮ−γにより活性化し、リンパ球をその後にＩＬ−２により活性化すること；を意味するものである。本発明は、また、本発明のマクロファージの抗原、及び該マクロファージにより標的とされる腫瘍細胞の抗原を認識することのできる二重特異的抗体に関する。二重特異的抗体は、Chokri et al．Res．Immunol．143（1992）に記載されているように調製することができる。二重特異的抗体は、また、本発明のマクロファージと同時に注射することができ、又は注射前にマクロファージと共に前培養することができる。本発明は、また、ガンを治療するための方法であって、本発明のマクロファージの適量、好ましくはマクロファージ約２×１０⁹〜約５×１０⁹個を、投与することからなる方法に関する。本発明によるガン治療のための方法は、リンパ球約４×１０⁹〜約１０×１０⁹ 個を投与することからなる。本発明のマクロファージは、また、核酸及び／又は薬物のベクターとして使用することもできる。従って本発明は、外来性核酸及び／又は薬物を含有するマクロファージを含む。外来性核酸を含有するマクロファージについては、マクロファージを調製する。トランスフェクションにより、サイトカイン若しくは欠損タンパク質、又は腫瘍抗原をコードするＤＮＡを、マクロファージ内に組み込み、患者への注射前に、それがマクロファージに発現されているかどうかを確認する。マクロファージの生存期間が長いため、組み込まれたタンパク質遺伝子のin v ivoにおける発現が可能である。図面の説明図１は、本発明のマクロファージの産生図を示す。健康な被験者又は患者から採取した末梢血を、血球アフェレーシスに付し（Ｉ）、それにより血球アフェレーシス生成物を得る。該血球アフェレーシス生成物を、Ficollにより遠心分離し、洗浄して（II）、単核細胞（単球＋リンパ球）を得る。該単核細胞を、ここに定義するような、健康な被験者又は患者より採取した自己由来の血清を含有する適切な培地中で培養する（III）。単核細胞の培養により、細胞懸濁液を得、これを、活性化し（IV）、活性化後に、エルトリエーション（Ｖ）の工程を行い、それにより本発明のマクロファージを得、次にこれを、患者又は健康な被験者に再注射する。それぞれの工程に使用する材料は、以下のとおりである：（Ｉ）：血球アフェレーシス用バッグ：ＡＣＤ溶液：カルシパリン：緩衝食塩水（II）：血球処理装置−処理セット：Ficoll-Paque ：移送バッグ（III）：培養バッグ：Iscove変性ダルベッコ培地：Ｌ−グルタミン：非必須アミノ酸：ピルビン酸：ＧＭ−ＣＳＦ：ジヒドロキシビタミンＤ₃ ：β−メルカプトエタノール：ストレプトマイシン：インドメタシン：ＣＯ₂ （IV）：インターフェロン−γ （Ｖ）：ヒトアルブミン溶液：注射バッグ実施例Ｉ）材料及び方法単核細胞の単離正常血小板を有する被験者より得た白血球を、（COBE 2997又はDideco Vivace ll連続的細胞分離機を用いて）末梢血液の血球アフェレーシスにより単離した。輸血用血小板を集めた後、濃縮白血球であるアフェレーシス残渣を、再懸濁した。ヒト単核細胞を、比重１．０７７のFicoll Paque（Phamacia）を用いたCOBE 2 921細胞処理装置により、１０００ｇで１５分間遠心分離することによって集めた。カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水中で３回洗浄後、チャンネライサー分析（Coulter Margency、France）に示されるように、単球含有率３０〜５０％の単核細胞を得た。培養単核細胞を、テフロンバッグ（Dupont-J．BIO，Les Ulis）中、３７℃で、５％ＣＯ₂、９５％加湿大気中、７日間培養することによって、分化ヒトマクロファージを得た。ペニシリン（１００u.i./ml）、ストレプトマイシン（１００μg /ml）、Ｌ−グルタミン（２mM、Gibco）、ピルビン酸（２mM、Gibco）、インドメタシン（５×１０^-6M、Sigma）、メルカプトエタノール（３×１０^-5M、Gibco）、非必須アミノ酸（２％、Gibco）及び５％ＡＢ血清を補給したIscove変性ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Gibco）中に、単核細胞全部を、１ml当り５×１０⁶個の割合で接種した。この培地は、上記において既に述べたような「標準マクロファージ」を得ることを可能にする標準培地と定義する。ＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml、Be hring）及び／又は１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ₃（コレカルシフェロール１０^-8M、Roche、Basel、スイス）は、比較実験において添加した。マクロファージの細胞障害活性の活性化は、ＩＦＮ−γ（Boehringer、Ingelheim、FRG）２５０U/mlの存在下で更に１８時間培養することによって行った。培地及び細胞製剤は、ＬＰＳを、１ml当り０．０２i.u.以下含んでいた。エルトリエーション７日間の培養及び活性化後に得られた単核細胞又は分化マクロファージを、５５０ｇで遠心分離し、得られたペレットを、グルコース０．１％、ＰＯ₃ＨＮａ₂・２Ｈ₂Ｏ０．１７％、ＰＯ₃Ｈ₂Ｎａ０．２７％、ＮＨ₄Ｃｌ０．１４％、ＮａＣｌ０．７％（solution TS745 Laboratoire Bruneau，92，France）を含有し、ヒト血清アルブミン２％（ＨＳＡ、ＣＮＴＳ−France）を含むリン酸緩衝食塩水中に、再懸濁した。細胞を、次に、Lopez et al により既に記載されているようにエルトリエーションに付した（養子免疫療法のための、ＩＦＮ−γ 活性化マクロファージ産生のための、ガン患者由来の白血球搬出生成物より得た単球の、エルトリエーションによる一工程分離。J.Immunotherapy,11：209，1992）。「ローターオフ」分固として採取される、分化マクロファージのために用いたエルトリエーション法は、Andreesenにより記載された、一定のローター速度で、流速を増加させる方法である（Andreesen et al.、循環単球由来のin vitroにおいて生成された腫瘍細胞障害性マクロファージの養子移入：ガン免疫療法への新たなアプローチ。Cancer Res．50：7450，1990）。フローサイトメトリーマクロファージ集団の表現型の分析を、タンパク質に対するネズミモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより行い、ＦＩＴＣ複合体により検出した。ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ７１抗体は、DAKO（Versailles，France）より、抗ＨＬＡＤＲ抗体は、COULTER（Margency，France）より得、抗ＣＤ６４（CNTS ，France）、及び分化マクロファージの膜抗原を認識するMax-1抗体（Andressen et al.，ヒト単球のマクロファージへの分化に関する表面表現型分析、J．Leuk ．Biol．47：490，1990）は、Dr．Emmrich（Erlangen，Germany）から贈与されたものである。要約すると、０．２％ウシ血清アルブミンのリン酸緩衝食塩水中、細胞５×１０⁵〜１０⁶個を、ＦＩＴＣ標識した、若しくは非標識のモノクローナル抗体又はアイソタイプ免疫グロブリンコントロールの存在下、氷上で３０分間保った。洗浄後、間接的蛍光抗体法のために、細胞を更に、ＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ′）２ヤギ抗ネズミＩｇＧ（Immunotech.）に、氷上、２５分間曝した。洗浄後、細胞を、フローサイトメトリー（EPICS Profile、Coulter）により分析した。獲得ゲート（acquisition gate）は、大きな細胞の主要集団周辺に設定した。腫瘍標的ヒト組織球細胞系Ｕ９３７を、ウシ胎児血清（FCS，Gibco）１０％を含むＩＭＤＭ中で培養した持続系として、懸濁液中に保持し、細胞障害性試験における標的として、指数増殖の間使用した。 In vitro抗腫瘍性試験分化マクロファージを、９６ウエルのフラットマイクロタイタープレートに、１ウエル当り０．２ml中、１０⁴個の割合で接種した。３７℃で、ＣＯ₂ ５％を含む加湿大気中、２時間培養後、培地を除去し、ｒｈｕＩＦＮ−γ２５０U/ml を含有するか、又は含有しないＩＭＤＭ＋５％ヒトＡＢ血清と置換し；プレートを更に一夜培養した。洗浄後、新しい培地（ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ）０．２ml に含有させたＵ９３７腫瘍細胞１０⁴個を、それぞれのウエルに加えた。２４時間の接触後、０．１μCiのトリチウム処理チミジンをそれぞれのウエルに加えて、更に２４時間培養した。細胞を集め、ファイバーグラスフィルター上で、取り込まれた放射活性の測定を、β線を計数することによって行った。腫瘍細胞によるチミジン取り込みの阻害パーセントは、式：（式中、ｃｐｍＴ＝対照の腫瘍細胞中の放射活性ｃｐｍＴＭ＝腫瘍細胞＋マクロファージ混合培養物中の放射活性）により算出した。 II）結果単核細胞の７日間の分化後の、マクロファージの形態変化を伴う巨大細胞の回収１週間培養後の単核細胞の回収率は、ＧＭ−ＣＳＦ又は（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃ の添加による変性を、顕著には受けていなかった。対照的に、マクロファージの形態変化を伴う巨大細胞の量は、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で、著しく増大していた（表III）。ＧＭ−ＣＳＦの添加により、マクロファージの回収率が、有意に（ｐ＜０．００１）増大した（１２種類の異なる培養標本の結果）。（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃を培地に添加しても、マクロファージの量は、増加しなかった；しかし、ＧＭ−ＣＳＦ＋ビタミンＤ₃の組み合わせにより、再現可能な高収率で、マクロファージが得られた（表III）。表IIIは、収率及び細胞障害活性に関して得られた結果をまとめて示すものであり；最後の欄は、本発明のマクロファージに対応する。ＧＭ−ＣＳＦ及び（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃の存在下又は非存在下において産生されるＭＡＫの表現型。７日間にわたる培養及びＩＦＮ−γによる活性化により、特異的分化抗原（Ｍａｘ−１、ＣＤ６４、ＨＬＡ−ＤＲ）の主な発現により示されるように、単核細胞を、マクロファージに十分に分化させた（表II）。ＧＭ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ＋（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃の存在下で減少した（ｐ＜０．０５）トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）の発現以外は、抗原の表現型に変化は観察されなかった。ＣＤ７１のこの低下は、巨大分化細胞と関連して観察された。直接的及び間接的蛍光に用いた、対照非関連Ｉｇは、巨大細胞のそれぞれ５％未満及び１０％未満を標識した。以降に記載する表IIは、各種条件下で得られたマクロファージの表現型に関する結果をまとめて示すものであり；最後の欄は、本発明のマクロファージに対応する。値は、５回の異なる実験における平均値及び標準誤差である。マクロファージの機能：抗腫瘍活性培地中で分化したマクロファージは、ＩＦＮ−γに曝されない場合には（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃＋ＧＭ−ＣＳＦの存在下で産生されたマクロファージがＵ９３７細胞の増殖を自発的に阻害した以外は、高度な自発的抗腫瘍活性を示さなかった。ＩＦＮ−γによる１８時間の活性化後、ＭＡＫ細胞は、異なる培養条件下で、 in vitroにおいて抗腫瘍作用を有するようになった。ビタミンＤ₃＋ＧＭ−ＣＳＦの存在下で分化させたマクロファージについては、高度な抗腫瘍活性が、より再現可能に得られた（表III）。ＩＦＮ−γによるマクロファージ活性化の動力学標準的条件下で分化させたマクロファージは、ＩＦＮ−γ２５０U/mlとの接触１８時間後に、抗腫瘍能を呈するように活性化された；この抗腫瘍活性は、時間と共に緩やかに低下して、３〜４日後に対照値に達した。これらのマクロファージは、２５０U/mlのＩＦＮ−γに再び曝すことによって、高度の抗腫瘍活性を示すまで、十分に再活性化することができた。ＧＭ−ＣＳＦ＋（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃の存在下で分化させたマクロファージは、対照群よりも高い抗腫瘍活性を示した；ＩＦＮ−γ２５０U/mlによる活性化後、培地中２−３日後経過しても、マクロファージは、その抗腫瘍活性を高レベルに保持していた。活性化６０時間後でさえも、Ｕ９３７腫瘍細胞によるチミジン取り込みの阻害は、マクロファージについて２８±３％であったのに比して、ＧＭ−ＣＳＦと（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃に曝したマクロファージについては、５４± ２％であった（ｐ＜０．０１、３回の実験の平均）。このように培養したマクロファージを、ｒｈＩＦＮ−γ２５０U/mlに新たに曝すことによって、抗腫瘍効果が、エフェクター／腫瘍比１／１において、Ｕ９３７細胞によるチミジン取り込みが８０％以上阻害されるまで増大した（３種類の異なる実験の平均値）。以下に記載する表Ｉには、動力学と関連した結果をまとめて示し、標準的マクロファージ及び本発明のマクロファージを比較した。示した結果は、３回の実験の平均である。この表においては、０時間では、ＩＦＮ−γによる活性化は認められない；１８時間：ＩＦＮ−γによる活性化の開始から１８時間後、すなわち活性化の終了時に相当する；マクロファージは、ＩＦＮ−γの影響下にはない；４０時間：ＩＦＮ−γによる活性化開始後４０時間；６５時間：ＩＦＮ−γによる活性化開始後６５時間。ＩＦＮ−γによる活性化の後に、最大の細胞障害活性が得られ、これは約１６時間から約２４時間の間持続することが認められた。

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の特性： − ＩＦＮ−γの非存在下での細胞障害活性が、標準的マクロファージと比較して、約２０〜３０％増強され、そして好ましくは約７０％である； − ＩＦＮ−γの存在下での細胞障害活性が、標準的なマクロファージと比較して、約２０〜約４０％増強され、そして好ましくは約９３％である； − ＩＦＮ−γの活性化に応答する、細胞障害活性の不活性化時間の延長が、ＩＦＮ−γによる活性化の６０時間後に、マクロファージの細胞障害活性が、ＩＦＮ−γによる活性化に起因してそれが示す最大細胞障害活性と比べて、その３０％以上、好ましくは約５５％であるような比率である（該細胞障害活性は、標的腫瘍細胞、特にＵ９３７細胞による³Ｈチミジン取り込み阻害のパーセントとして測定する）；の少なくとも一つを有するマクロファージ。２．以下の特徴： − その大きさが、約１０〜約２０μｍである； − プラスチック表面に付着する； − 生存率が、約７０％以上である； − 食作用特性を示す； − その表面に、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＭＡＸ１、ＨＬＡＤＲなどの分化抗原を有する；及び − その細胞障害活性が、約５０％以上である；を有する請求の範囲第１項記載のマクロファージ。３．１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中で、単球を培養することからなる、請求の範囲第１又は第２項記載のマクロファージを調製する方法。４．単球及びリンパ球の両方を、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地中で、分化マクロファージを得るのに十分な時間、好ましくは約６〜７日間、培養し、可能であれば、単球より得られるマクロファージ、及びリンパ球を、ＩＦＮ−γにより活性化し、そしてＩＦＮ−γによる活性化の前又は後、好ましくはＩＦＮ−γによる活性化後に、リンパ球からマクロファージを分離して、マクロファージを回収することからなる請求の範囲第３項記載の方法。５．ビタミンＤ₃を、１０^-10〜約１０^-7、好ましくは約１０^-8Mの濃度で使用する請求の範囲第３又は第４項記載の方法。６．ＧＭ−ＣＳＦを、約５０〜約１０００U/ml、特に約１００〜約５００U/ml の濃度で使用する請求の範囲第３〜第５項のいずれか１項記載の方法。７．培地が、ＲＰＭＩ、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ又はＤＭＥＭである請求の範囲第３〜第６項のいずれか１項記載の方法。８．培地が、インドメタシン及び／又はシメチジンを含有する請求の範囲第３〜第７項のいずれか１項記載の方法。９．マクロファージの収率が、約４０％以上、そして好ましくは約７６％である請求の範囲第３〜第８項のいずれか１項記載の方法。 10．死んだ腫瘍細胞を、好ましくは、１ml当り死んだ腫瘍細胞約１００万個の割合で、マクロファージと同時に培地中に加える方法であって、ここで、両細胞は、好ましくは同一患者由来のものであり、該腫瘍細胞が、マクロファージと同時に処理される、請求の範囲第３〜第８項のいずれか１項記載の方法。 11．請求の範囲第３〜第１０項のいずれか１項記載の方法により得ることのできるマクロファージ。 12．活性物質として、請求の範囲第１、第２又は第１１項のいずれか１項記載のマクロファージを含有する、医薬組成物。 13．単球が成長及び分化して、請求の範囲第１、第２又は第１１項記載のマクロファージとなる際に必要である成分、及び、さらにビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地。 14．− 夾雑物を含まないリンパ球及び単球の回収のための手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液、及び可能であればマクロファージの保存に適切である手段； − 単球、及び可能であればリンパ球のための、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地を調製する手段； − 可能であればＩＦＮ−γ；を含有するキット。 15．− 血液を回収及び遠心分離して、白血球濃縮物を得るための手段； − リンパ球及び単球を、その他の白血球細胞から分離し、そして夾雑物である赤血球細胞を除去するための手段； − 補助成分、特に１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃及びＧＭ−ＣＳＦ、並びに可能であればインドメタシン及び／又はシメチジンを含む、マクロファージ、及び可能であればリンパ球のための培地； − リンパ球をマクロファージから分離するための手段； − マクロファージ保存のための適切な手段； − 適切な緩衝液及び洗浄液； − 可能であればＩＦＮ−γ；を含有する請求の範囲第１４項記載のキット。 16．細胞停止療法において、同時に、個別に又は連続して使用するための組み合わせ製剤としての、請求の範囲第１、第２又は第１１項のいずれか１項記載のマクロファージ、及びリンパ球を含有する製品。 17．マクロファージ及びリンパ球を、細胞数で表わして、少なくとも１／２〜２／３の比率で含有することを特徴とする請求の範囲第１５項記載の製品。 18．請求の範囲第１、第２又は第１１項のいずれか１項記載のマクロファージの抗原、及び該マクロファージにより標的とされる腫瘍細胞の抗原を認識することのできる二重特異的抗体。 19．ガンを治療するための方法であって、請求の範囲第１、第２又は第１１項のいずれか１項記載のマクロファージの適量、好ましくはマクロファージ約２× １０⁹〜約５×１０⁹個を、投与することからなる方法。 20．リンパ球約４×１０⁹〜約１０×１０⁹個を投与することからなる請求の範囲第１９項記載のガン治療のための方法。 21．外来性核酸及び／又は薬物を含有する請求の範囲第１、第２又は第１１項のいずれか１項記載のマクロファージ。