JP2003508047A - 移植片−対−宿主疾患を抑制するサイトカイン、細胞およびマイトジェンの使用 - Google Patents
移植片−対−宿主疾患を抑制するサイトカイン、細胞およびマイトジェンの使用Info
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Abstract
Description
的な進歩は非近縁個体からの腎臓、心臓および肝臓を用いてなされてきた。しか
し、非近縁(あるいは同種異型)のドナーから造血幹細胞の移植はより複雑な努
力が必要である。あらゆる造血要素と免疫系を再生する能力をもつ多能性幹細胞
が、ひとつの個体由来の骨髄や末梢血液から採取され、別の個体に移植される。
しかし、ドナーとレシピエント間の組織適合性の相違が高頻度で移植関連の合併
症を来たし、さらに臓器移植法の利用を制限してきた(Forman et al., Blackwe
ll Scientific Publications 1994)。
とに、同種異型造血幹細胞移植の志願者は現在わずかしか居ない。こういった疾
病には、急性または慢性の白血病のような血液性悪性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄
形成異常症候群、リンパ腫、さらに再生不良性貧血またはサラセミアのような重
篤な貧血が挙げられる。
始まる。このことは、骨髄の血液構成要素をすべて効果的に破壊する高用量の化
学療法剤および放射線照射によって最も一般的に達せられる。ドナー幹細胞移植
のためにレシピエントの骨髄を準備することのほかに、調整療法は体内に残る多
くの悪性腫瘍を殺すのに役立つ。調整療法の完了とドナー幹細胞の植え付けの期
間はレシピエントにとって最も危険である。この期間中レシピエントは完全に免
疫不全状態にあり、生命を脅かす感染症に罹りやすくなっている。この弱みは、
移植されたドナー幹細胞が増殖し必要な白血球細胞および感染と戦うのに要する
免疫細胞に分化するまで持続する。
でいる。ドナー幹細胞が全く同じ双胎に由来するのでない限り、移植されたT細
胞はレシピエントの組織に敵対し、移植片−対−宿主疾患(GVHD)という致
命的な疾患を誘発する。これはドナーのTリンパ球がレシピエントの組織適合性
抗原を外来のものと認識し、これに対応して多臓器機能障害と破壊を引き起こす
からである。
同種異型の幹細胞の移植は、従来に比して非常に安全になっている。近縁でない
HLA適合ドナーから同種異型幹細胞の移植は、一般的に重篤でしばしば致命的
なGVHDによって悪化する。GVHDの脅威はドナー幹細胞がHLA不適合の
場合なお一層高い。
縁者を持っているので(Dupont, B., Immunol. Reviews 157:12, 1997)、HL
A適合で非近縁の移植術およびHLA不適合の移植術をより安全な方法とする必
要性は大きい。この問題を解決する原理的なアプローチはふたつある。一つは移
植片からTリンパ球の汚染を無くすこと、もう一つはT細胞がレシピエントを攻
撃できないようにT細胞を不活化することである。
成熟Tリンパ球を生体外で除去すると、主要組織適合性障害を克服してGVHD
を劇的に減少または防止することが明らかになった(Rodt, H., J. Immunol. 4:
25-29, 1974; Vallera et al., Transplantation 31:218-222, 1981)。しかし
、T細胞の減少によって移植の失敗、移植の拒絶、白血病の再発、およびウイル
ス誘発性のリンパ球増殖性疾患の頻度が著しく増加した(Martin et al., Blood
66:664-672, 1985; Patterson et al., Br. J. Hematol. 63:221-230, 1986; G
oldman et al., Ann. Intern. Med. 108:806-814, 1988; Lucas et al., Blood
87:2594-2603, 1966)。このようにドナーT細胞の幹細胞への移植は有害と有益
な作用をもっている。幹細胞移植に対するT細胞の促進作用、および移植片−対
−宿主疾患(GVHD)ではなく、移植片−対−腫瘍をよく認識する作用を必要
としている。
挙げると:(1)FK506およびラパマイシンのような薬剤の生体内免疫抑制
効果(Blazar et al., J. Immunol. 153:1836-1846, 1994; Dupont et al., J.
Immunol. 144:251-258, 1990; Morris, Ann. NY Acad. Sci. 685:68-72, 1993;
Blazar et al., J. Immunol. 151:5726-5741, 1993)、(2)T細胞決定因子に
対して活性なモノクロナール抗体(mAb)または毒素に結合したmABの、無
傷およびF(ab')2フラグメントを用いたGVHD活性T細胞の生体内標識
化(Gratama et al., Am. J. Kidney Dis. 11:149-152, 1984; Hiruma et al.,
Blood 79:3050-3058, 1992; Anasetti et al., Transplantation 54:844-851, 1
992; Martin et al., Bone Marrow Transplant 3:437-444, 1989) 、(3)I
L−2/サイトカイン受容体相互作用(Herve et al., Blood 76:2639-2640, 19
90) 経由、または共刺激性または接着原性シグナルのブロックによるT細胞活性
化阻害を経由したT細胞のシグナル伝達阻害(Boussiotis et al., J. Exp. Med
. 178:1753-1763, 1993; Gribben et al., Blood 97:4887-4893, 1996; Blazar
et al., Immunol. Rev. 157:79-90, 1997)、(4) 急性GVHD誘導Tヘルパ
ー1型T細胞間のバランスが、それらの細胞が作られるサイトカイン環境を経由
して、抗炎症性Tヘルパー2型T細胞に移ること(Krenger et al., Transplanta
tion 58:1251-1257,1994; Blazar et al., Blood 84:247, 1996, abstract; Kre
gner et al., J. Immunol. 153:585-593, 1995; Fowler et al., Blood 84:3540
-3549, 1994)、(5)T細胞受容体/主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)相
互作用、クラスIIMHC/CD4相互作用、またはクラスIMHC/CD8相互
作用に影響を与えるペプチド誘導体で処置することによる同種異型反応性T細胞
の活性化の調整(Townsend、Korngold(未発表データ))、および(6)供与さ
れた細胞のレシピエント組織に対する攻撃を停止させる遺伝子治療の利用(Bonin
i et al., Science 276:1719-24, 1997)である。
ことを示唆する証拠がある。慢性拒絶反応を管理するために、生涯にわたる免疫
抑制治療を必要とするような固形の臓器同種移植を受けた患者とは異なり、幹細
胞の同種移植には免疫寛容を示す証拠がある。このような大多数の患者はGVH
Dに罹った証拠なく免疫抑制を免れることができる(Storb et al., Blood 80:5
60-561, 1992; Sullivan et al., Semin. Hematol. 28:250-259, 1992)。
如以上のことを一般に含んでいる。この状態は免疫系の適応応答であり、免疫応
答の特質である抗原特異性と記憶に適っている。寛容は成熟動物よりも胎児また
は新生動物においてより容易に生起し、このことは幼若T細胞およびB細胞は寛
容誘導に対する感受性がより高いことを示唆している。さらに、T細胞とB細胞
はその寛容誘導において異なっていることが研究で示された。寛容誘導は一般に
クロナール欠如またはクロナール・アネルギーによってなされる。クロナール欠
如では幼若リンパ球が成熟中に除去される。クロナール・アネルギーでは、末梢
リンパ様器官に存在する成熟リンパ球が機能的に不活性となる。
細胞性免疫を促進する。しかし、T細胞は刺激を受けてその免疫応答も阻害する
。この下方調節の性質をもつT細胞は「サプレッサー細胞」と呼ばれる。
F−β)、インターロイキン4(IL−4)あるいはインターロイキン10(I
L−10)のようなサイトカインを生産することが知られているが、最近までこ
れら調節性細胞の生成に関わるメカニズムはあまり知られていなかった。一般に
考えられていたことは、CD4+T細胞がCD8−T細胞を生成して下方調節活
性を生起すること、およびCD4+細胞によって作られたインターロイキン2(
IL−2)がその作用を仲介することであった。IL−2がサプレッサーT細胞
の生起に重要な役割を持っていることに、たいていの免疫学者は同意するが、こ
のサイトカインが直接に働くのかあるいは間接的に働くのかについては異論があ
る(Via et al., International Immunol. 5:565-572, 1993; Fast, J. Immunol
. 149:1510-1515, 1992; Hirohata et al., J. Immunol. 142:3104-3112, 1989;
Taylor, Advances Exp. Med. Biol. 319:125-135, 1992; Kinter et al., Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 92:10985-10989, 1995)。最近IL−2がCD8+細
胞を生成して、非分解メカニズムによりCD4−T細胞でのHIVの複製を抑制
することが示された。この作用はサイトカイン仲介であるが、この作用を持つ特
異なサイトカインはまだ同定されていない(Baker et al., J. Immunol. 156:44
76-83, 1996; Kinter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10985-9, 1995
)。
梢血リンパ球を使ったモデルが開発された(Hirokawa et al., J. Immunol. 149
:1859-1866, 1992)。このモデルを用いてCD4+T細胞は、強力なサプレッサ
ー細胞となるCD8+T細胞を作る能力を欠いていることが分った。しかし、C
D8+T細胞とNK細胞の組み合わせは、強い抑制性活性を誘導する(Gray et
al., J. Exp. Med. 180: 1937-1942, 1994)。ついでNK細胞は活性型TGF−
βの生成に寄与することが示された。このサイトカインの非免疫抑制の低濃度(
10−100pg/ml)は、IgGおよびIgM生成に対する強い抑制効果を
生み出す補因子として役立つことが報告された(Gray et al., J. Exp. Med. 18
0:1937-1942, 1994)。さらに、NK細胞はTGF−βの主たるリンパ球源であ
ることが示された(Gray et al., J. Immunol. 160:2248-2254, 1998)。
一族である(Border et al., J. Clin. Invest. 90:1-7, 1992; Sporn et al.,
J. Cell Biol. 105:1039-1045, 1987)。TGF−βは、放出されたタンパク質
が生理学的に不活性であり特異な受容体に結合できない点で、他の大部分のサイ
トカインとは異なる(Massague, Cell 69:1067-1070, 1992)。潜伏性から活性
のTGF−βへの転換はこのサイトカインの生理学的作用を決定する重要な段階
である。
の証拠がある。マウス株由来の幹細胞を他の組織不適合な株に移転すると、すべ
てのレシピエントがGVHDによって19日以内に死に至るが、ドナー動物から
NK細胞への同時的移転はこの結末を完全に防止した。すべてのレシピエントマ
ウスは、期間は不定であるが生存した。しかし、この治療効果は中和抗体の投与
によってTGF−βの効果に拮抗させると完全に阻止された(Murphy et al., I
mmunol. Rev. 157:167-176, 1997)。
体生成の下方調節についての報告(Horwitz et al., Arthritis Rheum. 41:838-
844, 1998)と確かに類似しているようである。各々の場合、NK細胞誘導のT
GF−βによって、それぞれの免疫応答を阻止する抑制性リンパ球の生成が起き
る。遺伝的に異種同型交配マウス間での組織適合性の相違は、非近縁のヒト・ド
ナーのそれを反映するであろうから、マウスでの研究は特に興味がある。したが
って、戦略の修正は組織不適合のヒトのGVHDを克服するに違いない。
ことであろう。もう一つは、同種異型幹細胞を受けた免疫不全状態のレシピエン
トをTGF−β、抗CD2モノクロナール抗体、IL−2、あるいはこれらサイ
トカインの組み合わせで処置することであろう。初めの戦略は難しい。というの
は、NK細胞は全リンパ球のわずか10ないし20%より成っているので、移転
に十分な細胞数を採取することが困難である。二番目の戦略は、モノクロナール
抗体およびサイトカインの全身的毒性副作用により制約を受ける。IL−2およ
びTGF−βは異なる体組織に対し様々な作用を有しており、患者に全身的に投
与するのは安全ではない。したがって必要なことは、生体外でGVHDの生起を
抑制する哺乳動物細胞を誘発する方法である。
する効果的な方法を提供するのであろう。生体外でサプレッサーT細胞を生成さ
せるという目標に向けての第一段階は、強力な抑制効果を持つT細胞を同定する
ことである。CD8+細胞に加えてCD4+細胞が強力な抑制効果を持っている
との注目に値する証拠がある。この証拠は以下の知見に依る。先ずCD45RB hi CD4+CD25+T細胞を除去した正常マウス由来の末梢T細胞を無胸腺マ
ウスに注射すると、器官特異的自己免疫疾患が高率で発症する(Powrie F. et a
l., J. Exp. Med. 183:2669-74, 1996)。第二は、新生児期に胸腺を摘出したマ
ウスのある株が多臓器特異性的自己免疫を生起させることである(Powrie F. et
al., J. Exp. Med. 183: 2669-74, 1996; Skaguchi S. et al., J. Exp. Med.
161(1):72-87, 1985)。これらの知見を合わせて考えると、正常な免疫系は自己
反応性T細胞を含んでいることを示すが、この結果は調節性T細胞により防ぎ得
ることを示唆している。この示唆は、上記の自己免疫症候群がCD4+CD25
+T細胞の転換によって防げるとの知見でもって確認されている(Asano, M., e
t al., J. Exp. Med. 184:387-396, 1996; Sakaguchi, S., et al., J. Immunol
. 155:1151-1164, 1995; Papiernik, M., et al., J. Immunol. 158:4642-4653,
1997; Suri-Payer, E., et al., J. Immunol. 160:1212-1218, 1998; Jackson,
A. L., et al., Clin. Immunol. Immunopthol. 54(1):126-133, 1990; Kanegan
e, H., et al., Int. Immunol. 3(12):1349-1356, 1991)。新生マウスは、出生
後一週間まではCD4+CD25+細胞を生成しないので、それを持っていない
(Asano, M., et al., J. Exp. Med. 184:387-396, 1996; Suri-Payer, E., et
al., Eur. J. Immunol. 29:669-677, 1999)。
な抑制因子である(Thornton, A.M., Shevach, E.M., J. Exp. Med. 188:287-29
6, 1998)。T細胞受容体(TCR)を経て活性化後、該T細胞は応答T細胞に
よりIL−2の生産を阻害する(Takahashi, T., et al., Int. Immunol. 10:19
69-80, 1998; Thornton, A.M., Shevach, E.M., J. Immunol. 164(1):183-190,
1999)。阻害性サイトカインを生成する他の調節性T細胞とは異なり(Powrie,
F., et al., J. Exp. Med. 183:2669-74, 1996; Weiner, H.L., et al., Annu.
Rev. Immunol. 12:809-837, 1994)、該細胞は、少なくとも試験管内で、接触依
存性メカニズムによって免疫応答を抑制する(Thornton, A.M., Shevach, E.M.,
J. Immunol. 164(1):183-190, 1999)。他には、新生児様に寛容なマウスでア
ネルギーを調節するCD4+CD25+細胞についての報告がある(Gao, Q., e
t al., Transplantation 68:1891-1897, 1999)。
、またTGF−βはナイーブCD4+細胞を方向づけその性質を生起することを
我々は見出した。したがって、よく知られた免疫抑制効果に加え、TGF−βは
T細胞の成長と生起に肯定的な作用を持っている。TGF−βはCD8+T細胞
とCD4+T細胞の両方を区別するのに重要な役割を果たしサプレッサー細胞と
なる。
細胞を生体外で生成させる戦略が望まれる。このような戦略は、非近縁個体の白
血球細胞に対しCD4+細胞を免疫することを含むであろう。この方法で免疫さ
れたCD4+細胞は活性化されてCD25+となり、自然発生の胸腺誘導CD4
+CD25+細胞と同一でないにしろ、それに類似の抑制性質を生起する。幹細
胞の移植に続いて、CD4+CD25+サプレッサー細胞は、ドナーの造血細胞
により繰り返し再刺激を受けるであろうし、こうして長期にわたる阻害作用を発
揮する。
)サンプル中のT細胞寛容を誘発する方法であって、細胞に阻害誘発組成物を添
加することを含む方法を提供する。阻害誘発組成物は、IL−2、IL−10、
TGF−βまたはそれらの混合物であり得る。
る方法を提供する。この方法は、ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を取り出
すこと、およびこの細胞を阻害誘発組成物で、T細胞寛容を誘発するのに十分な
時間、処理することを含む。次いで、細胞をレシピエント患者に導入する。所望
により、PBMCにCD8+細胞またはCD4+細胞を富み得る。この方法は、
患者への導入前に、処置細胞をドナー幹細胞に加えることをさらに含み得る。
提供する。この方法は、T細胞をTGF−βで処置することを含む。この方法は
、T細胞をTGF−βで、活性化剤と併用して処置することをさらに含み得る。
のキットは、ドナーから細胞を受容するのに適した細胞処置容器、および少なく
とも1用量の阻害誘発組成物を含む。このキットは、説明書および試薬をさらに
含み得る。細胞処置容器は、分析のために細胞の分画を取り出し得るサンプリン
グ口、および細胞の少なくとも部分をレシピエント患者に移転し得るのに適した
出口を含み得る。
)の発現を上方調節し得ることを示す。精製T細胞をPMA(20ng/ml)
およびイオノマイシン(5μM)でTGF−βの存在または不存在下に刺激した
。6時間後に細胞を抗CD40L抗体で染色した。TGF−βの不存在で30%
の陽性細胞があった(実線、パネルA)。100pg/mlのTGF−βでもっ
て、66%の細胞が陽性であった(実線、パネルB)。両パネルの破線は対照抗
体の活性を示す。
現を増加せしめることを示す。精製CD8+細胞を24時間ConA(5μg/
ml)±TGF−β(10pg/ml)±IL−2(10U)で刺激した。最後
の6時間ではモネンシン(2μM)も存在してサイトカイン放出を防いだ。細胞
を最初に抗CD69で染色し、活性化細胞を識別した。ついで細胞を固定し(4
%パラホルムアルデヒド)、浸透化し(0.1%サポニン)、TGF−α抗体で
染色した。
ことを示す。精製T細胞をTGF−β(1ng/ml)の存在または不存在下に
刺激した。TGF−βの不存在で30%の陽性細胞があった(実線、パネルA)
。TGF−βの存在で53%が陽性であった(実線、パネルB)。
とを示す。パネルAは、ドナーT細胞がレシピエント血液細胞を認識し殺す能力
を示す。パネルBでは、精製T細胞を、刺激した同種異型スティムレーター細胞
とともに、表示したサイトカインの存在または不存在下で培養した。48時間後
に細胞を洗い、さらなる3日後に31Cr標識スティムレーターConA芽細胞
に対する細胞毒性活性を調べた。パネルCでは、精製CD8+細胞を表示量のT
GF−βで処理した。48時間後に細胞を洗った。培養5日後に細胞毒性活性を
測定した。
る細胞毒性T細胞活性の抑制を示す。ドナーAからの精製CD8+細胞を、非近
縁のドナーBからの刺激したT細胞除去単核細胞とともに48時間、10pg/
mlのT細胞の存在または不存在で培養した。ついで細胞を洗い、ドナーAから
のT細胞およびドナーBからの刺激した非T細胞に加え、さらに5日間培養した
。ドナーBのクロム標識ConA芽細胞に対するドナーAのT細胞による細胞毒
性を、通常の4時間クロム放出アッセイで測定した。エフェクターと標的との種
々の割合を示す。白丸:ドナーAからのT細胞およびドナーBからの非T細胞、
添加のCD8+なし。黒四角:対照CD8+T細胞を添加。黒丸:TGF−β処
理CD8+を添加。
力な抑制活性を起こすことを示す。2段階共培養法において、ドナーAからの精
製T細胞サブセットを5日間、ドナーBからの刺激された(3000cGy)同
種異型スティムレーター細胞±TGF−β(1ng/ml)で刺激した。第2培
養においては、免疫起動T細胞サブセットと新鮮な同系のT細胞とを1:4の比
率で混合し、これらの細胞をドナーBからの刺激されたスティムレーター細胞と
ともに5日間培養した。ドナーBからのConA芽細胞に対するCTL活性を、
標準的な4日間クロム放出アッセイにより、表示のようなエフェクターと標的細
胞との割合で測定した。図6Aは、TGF−βで免疫起動された同種異型活性化
CD4+CD45RA+細胞が対照のCD4+細胞に比して顕著にCTL活性の
生成を抑制することを示す。示していない追加の対照は、TGF−βと5日間培
養したが、同種異型のMHC刺激のないCD4+細胞である。この細胞は抑制作
用を有しなかった。図6Bでは、試験プロトコールはCD4+CD45RA+を
CD8+CD45RA+に置き換えた以外同じである。これらの条件で、同種異
型抗原での免疫起動CD8+CD45RA+細胞はTGF−βの存在で抑制活性
の生成を高めない。
球(CTL)活性に対する作用を示す。スティムレーターなしで5日間培養され
たCD4+CD45RAの添加は、CTL活性に対する作用を有しなかった(結
果は示さない)。スティムレーターとともにこのT細胞を培養すると、低度から
中程度の阻害活性をもたらした。すべての試験において、このT細胞のTGF−
βの1ng/mlとの培養は同種異型CTL活性を抑制または消失せしめた。
reg および対照CD4+細胞の生成は、上記のようにナイーブCD4+細胞を
同種異型スティムレーター細胞±TGF−βで活性化して行った。第2培養にお
いて、CD4 reg または対照CD4+細胞を応答細胞と直接混合するか、また
は Transwell(商標)チェンバーを用いる半浸透性膜により単離した。Transwel
l はCD4+細胞およびスティムレーター細胞を含有している。示した結果は3
つの独立した実験のひとつである。
の細胞が同種異型抗原に対して強く応答し得るようになり、その活性化表現型へ
の転換が促進され、活力が増加することを示す。精製ナイーブCD4+T細胞の
5日間培養を、スティムレーター細胞なし(灰色部分)、刺激された同種異型ス
ティムレーター細胞とともに(薄い破線)、スティムレーター細胞およびTGF
−β(1ng/ml)とともに(濃い線)で行った。細胞表面および細胞内抗原
の発現をフローサイトメトリーにより測定した。細胞(105)を、FITCコ
ンジュゲート(抗CD4、抗CD25)、フィコエリトリン−コンジュゲート(
抗CD45RA、抗CTLA−4)またはチクローム−コンジュゲート(抗CD
4)mAbで標識した。CTLA−4発現を細胞内染色により分析した。アポト
ーシス細胞を検出するために、アネキシン−V染色を製造者の説明どおり行った
。この実験は各マーカーでの少なくとも5試験についての代表例である。
要することを示す。刺激された同種異型スティムレーター細胞±TGF−β(1
ng/ml)およびCD4 reg で免疫起動されたナイーブCD4+T細胞を細
胞選別によりCD25+とCD25−分画に分けた。図10Aは、免疫起動CD
4+細胞および新鮮T細胞の1:4割合の混合での効果を示す。図10Bは、新
鮮な応答細胞に加えられた免疫起動CD4+T細胞について種々の稀釈でのCT
L活性の生成に対する作用を示す。示した結果はエフェクターと標的細胞の割合
100:1についてである。この結果は3つの同じ実験の代表例である。
しめ得ることを示す。TGF−βの存在で免疫起動したナイーブCD4+細胞の
CD4+CD25+分画を細胞選別により得て、IL−2(10U/ml)の存
在下で5日間培養した。表示の%で新鮮なT細胞に加え、CTL活性の生成に対
する阻害を調べた。刺激したCD4+CD25+細胞を対照とした。
の抑制を示す。ドナーAからのナイーブCD4+T細胞を上記のようにスティム
レーター細胞と混合し、表示の割合で新鮮な応答細胞およびスティムレーター細
胞に加えた。バーは、培養7日後のトリチウム・チミジンの取り込み±SEMを
示す。白いバーは、CD4+細胞添加なしの応答細胞の増殖性応答を示す。斜線
のバーは、TGF−βなしでスティムレーター細胞と混合されたCD4+細胞の
作用を示す。黒いバーは、TGF−βの存在(1ng/ml)でスティムレータ
ー細胞と混合されたCD4+細胞の作用を示す。刺激されたスティムレーター細
胞に加えられた新鮮な応答細胞の増殖性応答に対するCD4+細胞の作用を示す
。バは、トリチウム・チミジンの取り込みの平均値である。
激した同種異型非T細胞±TGF−β(1ng/ml)で5日間刺激した。洗っ
た後、CD4+細胞をDIIで染色し、新鮮な応答T細胞をカルボキシフルオレセ
イン(CFSE)で染色した。対照またはTGF−β免疫起動のCD4+細胞を
、応答T細胞および同種異型スティムレーター細胞に1:4の割合で加えた。5
日後に細胞を採取し、フローサイトメトリーで分析した。CD8+細胞における
CFSE強度の測定をDII陰性細胞に対するゲーティングで行った。TGF−β
免疫起動CD4+細胞を応答細胞に加えると、CD8+細胞による細胞分割が顕
著に低下した。
型抗原に対する増殖性応答をブロックし、CD8+T細胞がその主要な標的であ
ることを示す。図14Aでは、CD4 reg または免疫起動された対照CD4+
細胞を新鮮なT細胞と1:4の割合で混合し(105/ウエル)、刺激されたス
ティムレーター細胞(105/ウエル)とともに5日間3組培養した。この培養
基を[3H]TdRで最後の18時間処理した。図14Bでは、培養CD8+細
胞の表現型を、CD8+細胞をゲーティングするフローサイトメトリーで測定し
た。灰色部分は、スティムレーター細胞なしで5日間培養された細胞を示す。濃
い線は、スティムレーター細胞およびCD4 reg とともに培養されたCD8細
胞を示す。薄い破線は、対照CD4細胞とともに培養されたCD8細胞を示す。
リンパ球を、FITCコンジュゲート(抗CD69)、フィコエリトリン−コン
ジュゲート(抗CD25、抗CD95)またはチクローム−コンジュゲート(抗
CD8)mAbで標識した。アネキシン−V染色、CFSEレベル、ヨウ化プロ
ピジウム染色によるDNA含量も示す。
反復刺激がT細胞を誘発してTGF−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
CD4+T細胞を、SEB(0.01ng/ml)およびスーパー抗原表示細胞
としての刺激B細胞で、TGF−βの有無で、矢印で表示の時点で刺激した。活
性TGF−βを2日または5日後に測定した。
TGF−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。CD4+T細胞を、SEB(
0.01ng/ml)およびスーパー抗原表示細胞としての刺激B細胞で、TG
F−βの有無で、矢印で表示の時点で刺激した。活性TGF−βを2日または5
日後に測定した。
びCD8+T細胞に対する作用を示す。細胞をSEBで5日毎に計3回刺激した
。各T細胞サブセットおよびCD25IL−2受容体活性化マーカーを発現する
細胞を、各刺激後に測定した。パネルAおよびCは、TGF−βの1ng/ml
が最初の刺激時に含まれていると、CD4+T細胞が反復刺激後に培養基中で優
勢なサブセットになることを示す。パネルBおよびDは、SEB刺激細胞による
CD25発現が対照培養基で第3回刺激により低下することを示す。しかし、T
細胞がTGF−βで免疫起動されていると、CD25発現は高いままである。
々の悪性または遺伝性疾患のヒトに、組織不適合性幹細胞を移転することを可能
にする。これは、ドナー細胞を同種異型抗原および/またはサイトカインの併用
で生体外で処置することを伴う。この方法の特に優れた点は、幹細胞移植を容易
にし、かついかなる残存の悪性細胞を攻撃する力を有するドナーT細胞を除去し
ないでよいことである。ドナーと宿主間の寛容状態が達成されると、非処置ドナ
ーT細胞を移転して、好ましい移植片−対−腫瘍の免疫応答を最大にできる。
サイトカインおよびマイトジェンは、インビボ投与されると、重い毒性副作用を
有する。記載の生体外プロトコールはこのような副作用を回避できる。生命を脅
かす疾患の処置に組織不適合性幹細胞を移植し得ることは、医学におけるひとつ
の大きい進歩となろう。
ならない非常に毒性の免疫抑制薬物の使用をなくするか少なくし得ることである
。この薬物は、レシピエントの免疫系を再び増やすドナー誘導リンパ球がその新
しい宿主を「教育する」ようになる能力もブロックする。本発明のような他の処
置を用いない限り、免疫抑制薬物を中止することは難しい。
阻害し、ドナー細胞における寛容状態を誘発することによるGVHDの抑制であ
る。この結果、ドナー細胞がレシピエント細胞を攻撃するのを防止する。驚くべ
きことに、この方法は、処置した細胞の抑制をもたらすだけでなく、ある種のC
D8+およびCD4+T細胞を誘発して、他のドナーT細胞がレシピエント細胞
を殺すのを防ぐ。すなわち、これらの細胞が寛容となる。このことは、本発明方
法によって、ドナー細胞のレシピエント細胞攻撃能力を低下せしめるが、いくつ
かのドナー細胞を誘発して監視的役割を喚起し、他のドナー細胞がレシピエント
宿主に対する免疫攻撃を起こすのを防止することを意味する。直接的な結果は、
ドナーリンパ球がレシピエントの組織適合抗原に対して寛容となるが、新しいリ
ンパ球が腫瘍細胞を攻撃する能力を損なわないことである。
る。極少量の阻害誘発組成物、例えばサイトカインを患者に戻すだけであるので
、最小の毒性しかないはずである。
方法に関する。この方法は、末梢血単核細胞(PBMC)をドナーから取り出し
、その細胞を、一方で抑制性であるが他方で免疫攻撃を防止する監視細胞をつく
る組成物で処置することを含む。
免疫攻撃をブロックすることを示す。理論に縛られる意図でないが、本発明方法
が働くのにいくつかの道があるようである。まず最初に、ドナー細胞が活性化さ
れてレシピエント細胞に対して寛容となる。第2に、ドナー細胞が活性化されて
調節性細胞となる。すなわち、この調節性細胞は、他のドナー細胞がレシピエン
ト細胞に応答して増殖しそれらの細胞を殺すのを防ぐように働く。これらの結果
はGVHD応答の軽減をもたらす。理論に縛られる意図でないが、細胞毒性活性
の阻害は、図に示すように、TGF−βなどの調節性T細胞により細胞上でつく
られた阻害性サイトカインの結果として、または接触依存性メカニズムにより起
きるようである。
ー細胞の生体外処置により、ドナー細胞にレシピエント組織に対する寛容を誘発
し、もってGVHDをなくする。
レシピエント細胞に対する寛容を誘発または確立して、移植片−対−宿主応答を
低下または消失せしめる方法を提供する。本明細書で「T細胞寛容」とは、T細
胞が他の細胞に対する有害な免疫応答を起こさないことを意味する。これは、T
細胞が抗原に応答して増殖しないこと、または細胞毒性T細胞とならないことに
より得る。理論に縛られる意図でないが、これはT細胞のアネルギーまたは死に
よるのであろう。好ましくは、T細胞は、異物としての他の抗原を認識し腫瘍の
殺傷を容易にする能力、および異物抗原に対する一般的な免疫原性応答を保持し
ている。
る。活性化剤および阻害誘発組成物でT細胞集団を生体外で処置して、調節性細
胞を作る。本発明方法を用いて、GVHD応答を抑制または処置する。GVHD
の「処置」とは、GVHDの少なくとも1つの症状が、本明細書に記載の方法で
改善されることである。その評価は、種々の方法で行うことができ、当分野で知
られているように、患者側の主観的または客観的な因子を含む。例えば、GVH
Dは、発疹、肝機能検査値の異常、発熱、疲労や貧血を含む一般的症状を呈する
。
ましい。ある場合において、本発明方法は、実験動物、獣性学分野、疾患モデル
動物にも使用できる。これらの動物には、限定ではないが、マウス、ラット、ハ
ムスターなどのゲッシ類および霊長類がある。
末梢血単核細胞(PBMC)を取り出す。本明細書で「末梢血単核細胞」すなわ
ち「PBMC」とは、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞などを含む)および
単球を意味する。詳しく下記するように、阻害誘発組成物の主要な作用は、CD
8+T細胞またはCD4+T細胞が寛容となり、他のT細胞に寛容を与える能力
をつくるのを可能にすることのようである。したがって、PBMC集団は少なく
ともCD8+またはCD4+T細胞を含むはずである。
すようにするか、これらを患者にもどす。これは既知の方法、例えば、白血球分
析法(leukophoresis)で行う。一般に5から7リットルの白血球分析法の工程を
行う。患者からPBMCを主に取り出し、他の血液成分を戻す。細胞サンプルの
採取は、ヘパリンなど抗凝固剤の存在下で、既知方法により行う。
ない。例えば、ナイーブCD4+T細胞の集団は、図11に示すようにTGF−
βの存在で刺激して増量できる。
ず細胞を採取し、次いで採取に際して自動的に濃縮されていなければ、濃縮し、
さらに精製および/または濃縮する。細胞を水洗し、計数し、緩衝液に再懸濁し
、さらなる精製および活性化のために無菌の閉鎖系に移す。
おいて、白血球分析法の採取工程によってPBMCの濃縮サンプルを無菌の血球
パックに得る。このパックは、試薬や用量の阻害誘発組成物を含有し得る。詳し
くは下記する。一般に、追加の濃縮/精製工程を行なう。既知のFicoll−Hypa
que密度勾配遠心法などである。分離法または濃縮法には、限定でないが、抗原
被覆磁気ビードを用いる磁気分離法、アフィニティー・クロマトグラフィー、モ
ノクローナル抗体と結合するか補体を用いる細胞毒性物質、固体マトリックスに
接着したモノクローナル抗体を用いる「ふるいわけ」を使用することがある。磁
気ビード、アガロースビード、ポリスチレンビードなどの固体マトリックスに接
着した抗体を線維膜およびプラスチック面に移し、直接の分離を可能とする。抗
体が結合した細胞の取り出しまたは濃縮は、細胞懸濁液から固体支持体の物理的
分離で行い得る。厳密な条件および手法は用いる系についての具体的な因子によ
り変る。適当な条件の選択は当分野で既知である。
去できる)または蛍光色素(蛍光活性化細胞選別(FACS)で使用できる)に
コンジュゲートして、細胞分離をなし得る。いかなる技法も、所望の細胞の活力
に影響を与えない限り使用できる。
Nexell Isolex 300i 磁気細胞選別システムで行う。一般的に、無菌状態を保持
し、細胞分離、活性化、サプレッサー細胞機能の生起に使用する方法の標準性を
確保して行う。
凍結するか、下記のようにすぐに使用する。凍結細胞は必要に応じて解凍し使用
できる。
MSO)(Lovolock, J. E. and Bishop, M. W. H., 1959, Nature 183: 1394-13
95; Ashwood-Smith, M. J., 1961, Nature 190: 1204-1205)、ヘタデンプン,グ
リセロ−ル,ポリビニルピロリドン(Rinfret, A. P., 1960, Ann. N.Y. Acad. S
ci. 85: 576)、ポリエチレングリコール(Sloviter, H.A. and Ravdin, R.G., 1
962, Nature 196: 548)、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレング
リコール、i−エリトリトール、D−リビトール、D−マニトール(Rowe, A.W.,
et al., 1962, Fed. Proc. 21: 157)、D−ソルビトール、i−イノシトール、
D−ラクトース、塩化コリン(Bender, M.A., et al., 1960, J. Appl. Physiol
. 15: 520)、アミノ酸(Phan The Tran and Bender, M.A., 1960, Exp. Cell Re
s. 20: 651)、メタノール、アセタミド、グリセロールモノアセテート(Loveloc
k, J.E., 1954. Biochem, J. 56: 256)、無機塩(Phan The Tran and Bender, M
.A.,1960, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 104: 388; Phan The Tran and Bender,
M.A., 1961, in Radiobiology Proceedings of the Third Australian Cnofere
nce on Radiobiology, Ilbery, P.L.T., ed., Butterworth, London, p.59)が
ある。典型的には、細胞を10%DMSO、50%血清、40%RPMI166
0培地に保存する。細胞の分離および精製の方法は米国特許5,888,499(
出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。
成分、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法で取り出す。一般に、生理媒質ま
たは緩衝液を加え、遠心法を行なう。必要に応じて繰り返す。PBMCを生理培
養液、好ましくはAIM−V血清なしの培地(Technologie)に再懸濁するが(
血清がかなりの量のTGF−βの阻害剤を含有するので)、ハンクス緩衝塩類溶
液(HBBS)や生理塩緩衝液(PBS)も使用できる。
7リットル白血球分析法の工程から採取する。これらの細胞を大略200mlの
緩衝液または培地に移す。
BMSはCD8+T細胞またはCD4+T細胞を富ます。幹細胞以外の細胞を富
ますには、市販の免疫吸収カラムを用いるか、研究的方法で行う(PBMCをナ
イロンウールカラムに加え、溶出の非接着細胞をCD4、CD16、CD11b
、CD74に対する抗体で処理し、免疫磁気ビードで処理して、CD8+T細胞
に富んだ集団を取る)。さらに詳しく下記するように、幹細胞、例えばCD34
+幹細胞の分離は、Nexell セパレーターを使用する閉鎖系で既知である。
富んでいる。他の実施態様において、他の細胞型はCD3+CD4−CD8−ま
たはNK細胞に富んでいることがある。
ることであり、TGF−βを含む阻害誘発組成物の必要性を減じるか無くするこ
とである。このように、ある実施態様では富化工程を使用しない。
細胞のみを含むようにし得る。これはモノクローナル抗体を使用してCD45R
O+細胞からCD4+細胞を無くする。この方法は、サプレッサーT細胞の生成
または活性を妨害するかもしれない機能を獲得しているであろうCD4+細胞の
集団を消失せしめる。
。本明細書で「処置」とは、細胞を阻害誘発組成物と共に十分な時間でインキュ
ベートし、特に患者に移植したときに、T細胞寛容を得るようにすることである
。インキュベーションは一般に生理的温度で行う。
なくとも1つの化合物を含む。本明細書で「阻害誘発組成物」とは、T細胞寛容
を誘発し得る組成物を意味する。一般に、この組成物はサイトカインである。適
切な阻害誘発組成物は、限定でないが、IL−10、IL−2、IL−4、IL
−15、TGF−βを含む。
ジン、酸化窒素、ケモカイン、サイトカイン、T細胞アクチベーターを含む。好
ましい実施態様において、T細胞寛容を誘発するのに使用する化合物はサイトカ
インである。
る。阻害誘発組成物は、2以上の同じ類の化合物を含有し得る。すなわち2以上
のサイトカイン、ケモカイン、プロスタグランジンなどを一緒に混合し得る。阻
害誘発組成物はまた、他の類の化合物、例えば、サイトカインとケモカイン、ま
たはサイトカインとプロスタグランジンを含有し得る。 好ましい実施態様において、阻害誘発組成物はTGF−βを含むサイトカイン
の混合物を含有する。
一般的に、生理的濃度、すなわち、所望の作用、調節性細胞の特異的な型を高め
る作用が得られる濃度である。好ましい実施態様おいて、TFG−βを阻害誘発
組成物に用いる。本明細書で「形質転換成長因子−β」すなわち「TGF−β」
は、TGF−βファミリーのいずれか1つを意味する。3種のイソ型、TGF−
β1、TGF−β2、TGF−β3がある。参照、Massague,J.(1980),J.Ann.Re
v.Cell Biol 6:597。リンパ球および単球は、このサイトカインのβ1のイソ型
である(Kehrl,J.H.et al.(1991),lnt J Cell Cloning 9:438-450)。TGF−β
は、処置される哺乳動物に対して活性であるTFG−βのすべての型であり得る
。
β2は、Genzyme Pharmaceuticals,Farmington,MA.から購入できる。一般に
、TGF−βの濃度は、細胞懸濁液の約2picogram/mlから約2nanogramであ
って、約10pgから約500pgが好ましく、約50pgから約150pgが
特に好ましく、100pgが理想的である。一般的に、免疫抑制作用について約
1ng/mlが最適のようである。サプレッサー細胞の生成には、低濃度(例え
ば、約0.1ng/ml)が最適である。
−2は、処置される哺乳動物に対して活性であるIL−2のすべての型であり得
る。ヒトでは組換えIL−2が現在のところ好ましい。組換えIL−2はCetus
,Emerville、CA.から購入できる。一般に、使用されるヒトIL−2の濃度は、
細胞懸濁液の約1Unit/mlから約100U/mlであり、約5U/mlから
約25U/mlが好ましく、10U/mlが特に好ましい。好ましい実施態様で
はIL−2を単独で用いない。
発組成物およびT細胞アクチベーターでT細胞を処置する方法を提供する。他の
T細胞がレシピエント細胞を増殖し殺すのを防止する能力を生起するT細胞集団
を、ここでは「調節性細胞」または「サプレッサー細胞」とよぶ。
る化合物を意味する。適当なT細胞アクチベーターは、抗CD3および抗CD2
8抗体、モノクローナル抗体の抗CD2抗体組合せ、知られておれば特異的自己
抗原、移植レシピエントからの細胞(例えば、同種異型抗原)、IL−2、IL
−4、IL−15およびマイトジェン、例えば、コンカナバリンAやブドウ球菌
性エンテロトキシンB(SEB)を含む。
びT細胞アクチベーターで処置する。例えば、移植レシピエントからの細胞をT
細胞アクチベーターとして、TGF−βを含む阻害誘発組成物と併用できる。同
様に、抗CD3および抗CD28抗体、抗CD2抗体、コンカナバリンA(Co
nA)、ブドウ球菌性エンテロトキシンB(SEB)などのT細胞アクチベータ
ーをTGF−βとともに使用できる。阻害誘発組成物とT細胞アクチベーターの
他の組合せも可能であり、CD2リガンド、LFA−3、LI−2やIL−4、
TGF−αなどのサイトカインを使用する。
などのマイトジェンをサイトカイン受容体発現の促進に用いるとき、既知方法で
知られているように、その濃度範囲は1μg/mlから約10μg/mlである
。さらに、既知方法のように、マイトジェンを離す成分、例えばα−メチルマン
ノシッドと共に細胞を洗うのが望ましい。
体などのCDアクチベーターを活性化剤として用い得る。CD2はTリンパ球に
より発現される細胞表面糖タンパク質である。本明細書で「CD2アクチベータ
ー」とは、CD2情報伝達経路を開始する化合物を意味する。好ましいCD2ア
クチベーターは、抗CD2抗体(OKT11,American Type Culture Collection,Roc
kville MD and GT2, Huets, et al., (1986) J. Immunol. 137: 1420)を含み得
る。一般に、CD2アクチベーターの濃度は、TGF−βの生成を誘導するのに
十分なものである。抗CD2抗体の濃度は、約1ng/mlから約10μg/m
lの範囲にあり、約10ng/mlから約100ng/mlが特に好ましい。
D4+またはCD8+T細胞を活性化する。他のサイトカイン、例えば、IL−
2、IL−4、IL−15をも含む阻害誘発組成物中にTGF−βを使用して、
TGF−βの作用発揮を容易にする。
のように採取)とともにインキュベートする。レシピエント細胞の刺激は、レシ
ピエント細胞がドナー細胞を攻撃できないが、ドナー細胞がレシピエント細胞に
対して寛容となるように行う。インキュベーションは作用が生じるのに十分な時
間行う。一般に4時間から5日であるが、より短いまたは長い時間も可能である
。
する。この活性化は調節性細胞の生成に必要である。理論に縛られる意図でない
が、レシピエント細胞はドナー細胞上のサイトカイン受容体を上方調節し、もっ
てドナー細胞がTGF−β応答性となり、調節性細胞となるのを可能にするよう
である。
成物およびT細胞アクチベーターで処置して、接触依存性抑制を生起せしめる。
この調節性T細胞は非常に強力であり、1%以下にすぎない全T細胞を含むとき
でも抑制作用を発揮する。
与えないで、増量できる。好ましくは、CD4+T細胞を少なくとも1回増量す
る。さらに好ましくは、CD4+T細胞を14回まで増量する。さらに好ましく
は、CD4+T細胞をさらに増量する。
、刺激を繰り返して、活性TGF−βの免疫抑制レベルをつくる。本明細書で「
活性TGF−βの免疫抑制レベル」とは、細胞機能に対する直接的免疫抑制作用
を有するTGF−βの濃度、すなわち、ドナー細胞をレシピエント組織適合性抗
原に対して非応答性とするTGF−βの濃度を意味する。一般的に、TGF−β
の500pg/mlを越える濃度が細胞機能に対する免疫抑制作用を有する。
シピエント患者にすぐに移植する。一般的に、細胞を洗い阻害誘発組成物を除去
した後に行う。この実施態様では、ドナー細胞を阻害誘発組成物で処理または処
置した後、凍結などして保存し得る。
ドナー造血性幹細胞の集団を得ることを含む。幹細胞は血中に非常に小さい%の
白血球を含む。幹細胞を、米国特許5,635,387および4,865,204(
両者を出典明示により本明細書の一部とする)に記載された既知の方法で分離す
るか、Nexell 市販のシステムを用いて採取する。上記したように、CD34+
幹細胞はアフィニティーカラムで濃縮できる。溶出細胞はCD34+幹細胞とリ
ンパ球の混合物である。汚染物であるリンパ球の除去には、一般的に、既知のモ
ノクローナル抗体での染色などの技法や通常の陰性選択法を用いる。
混合し、すぐにレシピエント患者に導入できる。
発組成物を除去し、再びインキュベートする。患者に導入する前に、ここに概記
したように細胞を好ましくは水洗し、阻害誘発組成物を除去する。試験すなわち
検査のために、さらなるインキュベーションも行うことができ、数時間から数日
間である。患者への導入前に細胞特性の検査をしょうとするときは、細胞を数日
間から数週間インキュベートすると、サプレッサー細胞を増量し得る。
ば、細胞を採取して行う。無菌検査、グラム染色、微生物学的検査、LAL試験
、マイコフラズマ検査、細胞型同定のためのフローサイトメトリー、機能検査な
どである。同様に、これらの検査などの試験を処置の前や後に行うことができる
。好ましい分析は標識レシピエント細胞を用いる試験である。処置された寛容ド
ナー細胞をレシピエント細胞の標識集団とともにインキュベートすると、ドナー
細胞が寛容でレシピエント細胞を殺さないことを確認できる。
原に対して非応答性となり、GVHDが防がれる。 好ましい実施態様において、移植の前に全または活性TGF−βの量を検査す
る。本明細書で述べるように、TGF−βは、翻訳後に活性化される潜在性前駆
体としてつくられている。
トの両方のMHCクラスIおよびクラスIIの状態を調べる。好ましくは、非近縁
ドナーがレシピエントHLA抗原に適合し、適合ドナーを同定できなければ1以
上の座 locus で不適合である。レシピエント患者は骨髄隔離を通常受けており
、高量の化学療法を受けており、全身の放射線照射を受けていることもある。
は、処置細胞を患者に注射すなわち導入する。静脈内投与により行い得るが、静
脈内、動脈内、腹腔内の投与もある。例えば、無菌シリンジなどの移転手段を用
いて注射により Fenwall注入バッグに細胞を入れる。次いで細胞をすぐに静脈投
与によって一定の時間、例えば、15分間で患者の自由に流れている静脈に注入
する。ある実施態様では、緩衝剤や塩などの追加の試薬も加え得る。
検査できる。 処置は必要に応じて繰り返し得る。ある期間後に、白血病性細胞が再び現れる
ことがある。ドナー白血球がすでにレシピエント細胞に寛容であるので、白血病
性細胞を異物として認識して殺す非処理ドナーリンパ球の注入を、患者は受ける
ことになる。
すなわち細胞を阻害誘発組成物と共にインキュベートするためのキットを提供す
る。キットはいくつかの成分を含有し得る。キットは、ドナーからの細胞を受容
するのに用いられる細胞処置容器を含む。この容器は無菌である。ある実施態様
において細胞処置容器は、細胞の採取に用いる。例えば、入口を介して白血球分
析法と共に用い得る。他の実施態様では、離した細胞採取容器を用い得る。
に、容器はいくつかの異なる形態を取る。例えば、IVバッグのような柔かいバ
ッグであり、または細胞培養器のような硬い容器である。攪拌できるようになっ
ている。一般に、容器の材質は何でもよいが、生物学的に非活性の物質であり、
例えばガラス、ポリプロピレンやポリエチレンなどを含むプラスチックである。
細胞処置容器は1以上の入口または出口を有し得る。細胞、試薬、阻害組成物な
どの導入または除去のためのものである。例えば、容器は、患者に再導入する前
の分析のために細胞の分画を採取するサンプル採取口を有する。同様に、容器は
、レシピエント患者に細胞を導入するための出口を有する。例えば、容器はIV
装置につけるためのアダプターを含み得る。
」とは、サイトカインなどの阻害誘発組成物の1つの量で、作用を発揮するのに
十分な量を意味する。ある場合には、複数用量を含み得る。ある実施態様におい
て、用量の細胞処置容器への添加は入口を介して行なう。あるいは好ましい実施
態様において、用量は細胞処置容器にすでに存在している。好ましい実施態様に
おいて、用量は安定性のために乳濁形態にあり、細胞培養液や他の試薬を用いて
再構築できる。
には緩衝液、塩、培養液、タンパク質、薬剤などがある。例えば、マイトジエン
を含み得る。 ある実施態様において、キットはその使用に際しての説明書を追加的に含む。
明の種々の態様を実施するために考えられる最上の方法を記述した。これらの実
施例は、本発明の範囲を限定するものでなく、説明の目的のために提示する。出
典明示されたすべての引用文献は全体を本明細書の一部とする。
胞は通常の陰性選別法を用いて調整した。該T細胞はレシピエント細胞を攻撃し
ないよう調整した。この調整のため、レシピエント由来の照射スティムレーター
細胞にCD8+T細胞を混合した。該スティムレーター細胞はレシピエント由来
のT細胞依存性血液細胞から誘導した。ドナーT細胞とレシピエントのスティム
レーター細胞との混合物を異なる濃度で一種以上のサイトカインと48時間培養
した。実施例で用いたサイトカインはTGF−βおよびIL−10であった。こ
の方法は、レシピエント細胞を殺すドナーT細胞の能力を無くした(図4B)。
ドナーT細胞を照射スティムレーター細胞と5日間培養した。ついでドナー細胞
は、レシピエントの放射標識血液細胞のサンプルと4時間培養した。レシピエン
ト細胞が殺されると、培養培地に放射性同位元素が放出される。放出された放射
性同位元素の量を測定することにより、死滅した細胞の割合を算出することがで
きる。図4Aに示す標準の細胞毒性の試験で、ドナー細胞は標識したレシピエン
ト細胞と30対1、15対1、および7.5対1の比率で培養した。ドナーとレ
シピエント細胞のこれらの組み合わせは、エフェクターと標的との割合と名づけ
る。死滅を記号で示す。予期されるとおり、最も高いエフェクターと標的との割
合で死滅の極大を認めた。図4Aにおいて白丸の記号は、ドナー細胞30に対し
レシピエント細胞1を混合すれば該レシピエント細胞の40%が死滅することを
示す。ドナーT細胞が極めて低濃度のTGF−β(0.01または0.1ng/m
l)で処置した場合に、死滅に全く影響しなかった(図4D)。しかしT細胞を
1ng/mlのTGF−βで処置するとレシピエント細胞の死滅は50%減少し
た。図4Bは、T細胞をIL−10で処置すると、死滅が50%減少したことを
示す。T細胞をIL−10とTGF−βの各1ng/mlで処置すると、でき上
がった細胞はレシピエント細胞の死滅を阻止した。つまり死をほとんど検出しな
かった。マイトジェン、サイトカイン、モノクロナール抗体の種々の組み合わせ
は、T細胞を不応答にするために使うことができる。
めの、生体外ドナーCD8+T細胞の処置(すなわちGVHDの阻止) CD8+細胞は、非近縁のドナー細胞に対する個体の細胞毒性免疫応答を抑制
するためTGF−βによって調整できる。この方法でドナーBの組織適合性不適
合の血液単核細胞に対するドナーAの細胞毒性活性を評価できる。抑制細胞を生
起させるため、ドナーA由来の精製CD8+細胞は、加えたTGF−βとドナー
細胞由来の照射T細胞除去の単核細胞と培養した。別にドナーB細胞に対するド
ナーAのT細胞の細胞毒性活性を文献的に立証した。図5は、ドナーA由来のT
GF−βで調整したCD8+T細胞の添加が細胞毒性活性を減弱させたことを示
す。対照のCD8+細胞の添加では最少の作用であった。これらの実験で、ドナ
ーA由来のCD8+T細胞は、ドナーBによって表示される外来抗原により活性
化した。追加のIL−2の必要は無かった。これらの実験で明らかになったこと
は、TGF−βはCD8+T細胞を誘発して抗体の生産を抑制するのみならず、
CD8+細胞も誘発して細胞仲介の免疫応答を抑制することである。
ンによる寛容化 実施例1と同様に、採取したドナーの末梢血単核細胞(PBMC)を滅菌容器
中のハンクス緩衝塩類溶液(HBBS)に入れる。ついで該細胞をマイトジェン
とインキュベートしてレシピエントの組織適合性抗原に不応答となるようリンパ
球を誘発させる。この場合、細胞は標準のインキュベーション技術を用いて4な
いし72時間、生理的濃度のコンカナバリンA(ConA)と培養する。用いる
ConAの濃度は、好ましくは1μg/mlであるが、約0.01から約10μ
g/mlの範囲で変え得る。また別に、0.001から100ng/mlの濃度
でブドウ球菌性エンテロトキシンB(SEB)をマイトジェンとして用いてもよ
い。
増加させる。これらの細胞は、レシピエントに移転すると、GVHDを誘発する
ことなく幹細胞の移植を可能にする。どのようにマイトジェンが働くかは不明で
あるが、調整中に単核細胞がTGF−βの生産を誘発すると考えられ、またTG
F−βはT細胞に作用してサプレッサー細胞になるか、または他のT細胞を不応
答にさせる。
液中に残るマイトジェンを除去する。細胞を200−500mlのHBBSに懸
濁し、幹細胞と混合し、移植の幹細胞を調製するため、骨髄剥離剤で処置した慢
性骨髄性白血病(CML)患者に投与する。
健康を取り戻し白血病細胞がなくなる。もし白血病細胞が再発生すれば、患者は
ドナーのリンパ球の輸液を受け、白血病細胞は再び消失する。
の生産を誘発するための抗CD2モノクロナール抗体の使用 ドナー由来の、採取した幹細胞の豊富な調製物を実施例1と同様に滅菌容器中
のHBBSに入れる。ついで該細胞を抗CD2モノクローナル抗体とインキュベ
ートしてレシピエントの組織適合性抗原に不応答となるようリンパ球を誘発させ
る。この場合、細胞は標準の培養技術を用いて4ないし72時間、抗CD2モノ
クロナール抗体とインキュベートする。抗CD2モノクロナール抗体の濃度は1
0ng/mlないし10μg/mlである。IL−2の1−1000単位を随意
に加えることができる。
が増加する。これらの細胞は、レシピエントに移転するとGVHDを誘発するこ
となく幹細胞の移植を可能にする。調整中に単核細胞がTGF−βの生産を誘発
すると考えられ、またTGF−βはT細胞に作用してサプレッサー細胞となる。
Sで洗浄して溶液中に残る抗体を除去する。細胞を、予め採取した幹細胞と混合
したHBBSの200−500mlに懸濁し、移植の幹細胞を調製するため、骨
髄剥離剤で処置した慢性骨髄性白血病(CML)の患者に投与する。
健康を取り戻し白血病細胞がなくなる。もし白血病細胞が再発生すれば、患者は
ドナーのリンパ球の輸液を受け、白血病細胞は再び消失する。
ンおよびサイトカインによる寛容化 採取したドナーのPBMCを、実施例1と同様に滅菌容器中のHBBSに入れ
る。ついで該細胞をサイトカインおよびマイトジェンとインキュベートしてレシ
ピエントの組織適合性抗原に不応答となるようリンパ球を誘発する。この場合、
細胞は標準のインキュベーション技術を用いて、生理的濃度のConAまたはS
EB、TGE−β、および/またはIL−2、IL−4またはIL−15と4時
間ないし72時間インキュベートする。
BBSで洗浄して溶液中に残るサイトカインおよびマイトジェンを除去する。細
胞を幹細胞と混合したHBBSの200−500mlに懸濁し、移植の幹細胞を
調製するため、骨髄剥離剤で処置した慢性骨髄性白血病(CML)患者に投与す
る。
健康を取り戻し白血病細胞がなくなる。もし白血病細胞が再発生すれば、患者は
ドナーのリンパ球の輸液を受け、白血病細胞は再び消失する。
ェンおよびサイトカインによる寛容化
る。ついで該細胞をサイトカインおよびマイトジェンとインキュベートしてレシ
ピエントの組織適合性抗原に不応答となるようリンパ球を誘発する。この場合、
細胞は標準のインキュベーション技術を用いて、生理的濃度のConAおよびI
L−2と4時間ないし72時間インキュベートする。別の場合にはSEBを用い
得る。
浄して溶液中に残るサイトカインおよびマイトジェンを除去する。細胞を幹細胞
と混合したHBBSの200−500mlに懸濁し、移植の幹細胞を調製するた
め、骨髄剥離剤で処置した慢性骨髄性白血病(CML)患者に投与する。
。まず、TGF−βの存在下、T細胞のPMA(20ng/ml)およびイオノ
マイシン(5μM)による処置は、CD40リガンドの発現を上方調節する(図
1)。第2に、IL−2発現はTGF−βの存在下にConAで刺激されたT細
胞で高い(図3)。第3に、精製CD8+細胞をConA(5μg/ml)±T
GF−β(10pg/ml)±IL−2(10U)で24時間刺激すると、TG
F−βはCD8+細胞によるTNF−α発現を増加する(図2)。
応を当目的に用いる。該反応において、ドナーA由来のT細胞は、ドナーB由来
のPBMCにより表示された外来の組織適合性抗原を確認し、それに応答する。
この応答T細胞は、ドナーB細胞を殺す能力を増殖し発展さす。
ブセットをドナーB由来の照射T細胞除去単核細胞と培養した。該細胞は懸濁下
にTGF−β(1ng/ml)の存在または不存在で5日間培養した。その後、
TGF−βを除去し、該細胞をドナーA由来の新鮮なT細胞およびドナーB由来
の非T細胞に加えた。
生起した。該CD4+T細胞は、同種異型の標的細胞に対するCTL活性が現れ
るのを阻止する能力を有する。2段階共培養実験にて、初めにCD4+CD45
RA+RO−T細胞を、照射した同種異型スティムレーター細胞±TGF−β1
と5日間インキュベートした。ついで該細胞の種々の量を新鮮なT細胞およびス
ティムレーター細胞に加え、CTL活性の生成に対する該細胞の作用を評価した
。対照のCD4+細胞は低度ないし中程度の抑制活性をもっていたのに反し、T
GF−βの存在下に処置した該細胞は、標準の4時間クロム放出試験で、応答T
細胞が同種異型の標的細胞を殺すのをほとんど完全にブロックした(図6A)。
CD4+細胞の活性化は阻害活性の生起に必要であった。刺激なしでTGF−β
と培養したT細胞は該抑制作用(20)を生起しない。TGF−βの存在下に同
種異型抗原で免疫起動したCD4+サプレッサー細胞をここでは「CD4reg
」と呼ぶ。スティムレーター細胞で処置したナイーブCD8+T細胞もまた中程
度の抑制活性を生起するが、CD4+細胞と違って、TGF−βの存在は該活性
を高めなかった(図6B)。
的実験を示す。さらなる実験により、この方法で生成した抑制性CD4+T細胞
は特異な作用様式をもっていることが明らかとなった。阻害性サイトカインを分
泌して抑制する、先に生成したCD8+およびCD4+細胞とは異なり、この同
種異型の特異的調節性CD4+T細胞は接触依存性作用メカニズムをもっている
(図8)。
抗原にかなり激しく応答し、活性化発現型への転換を促進し、活力を高めた。図
9は、培養5日後の対照およびTGF−β調整CD4+細胞の性質を示す。同種
異型刺激CD4+細胞は典型的な特徴を示し、アネキシンV染色により示された
ように、あるものはすでに進行している活性化誘発の細胞死であった。重要なこ
とは、TGF−βの存在下に同種異型活性化したものは随分多く、分画はCD4
を強く染色し、CD25の発現が顕著に増加した。13回の実験によるCD25
発現の平均値は、ナイーブ細胞で検出できないレベルから、TGF−βの存在下
に同種異型活性化CD4+細胞の42.3±3.6%に増加した。対照の同種異型
活性化CD4+細胞の平均値は、34.5±3.8%であった(p<0.01%、
ペアーt検定)。細胞内および細胞表面でのCTLA−4の発現は、対照のCD
4+細胞と比較してCD4regで増加した(細胞内:31.5±4.1%対23
.2±4.5%、p<0.01;表面:10.8±0.9%対5.2±0.4%、p<
0.01)。CD4regの大きな比率は、CD45RAの表面発現を下方調節
した。有意に、アネキシンV染色は顕著に減少し、回収されたCDregの総数
は対照のCD4+細胞を56%上回った。このようにCD4regは対照のCD
4細胞より強く活性化されたが、また活性化誘導のアポトーシスに対しより抵抗
性であった。
(Suri-Paer, E., et al., J. Immunol. 160:1212-1218, 1998; Suri-Paer, E.,
et al., Eur. J. Immunol. 29:669-677, 1999; Thornton, A.M., Shevach, E.M
., J. Exp. Med. 188:287-296, 1998)と同様に、細胞選別によりCD4reg
をC25+とCD25−との分画に分離すると、抑制活性の大部分はCD25+
分画に含まれていることが明らかとなった(図10A)。CD4+CD25−分
画は最少の抑制活性を示した。さらに、わずかな数のCTL活性の生成を著しく
阻害する能力で分るように、CD4+CD25+分画は非常に強力であった。図
10Bは、CD4+サプレッサー細胞の数が総T細胞の25%から3%に低下し
たとき、抑制活性はごくわずか減少したことを示す。わずかに添加したCD4+
でもって、CD25−サブセットで仲介される最少の抑制活性は消失した。
4, 1997)、そのIL−10での反復刺激により生成したCD4+調節性T細胞
とは異なって、TGF−βの存在下で誘導されたCD4regはIL−2に応答
して増殖し、その抑制能力を保持した。CD4regのCD25+分画を細胞選
別により分離し、IL−2と5日間培養した。該細胞はこの期間に7ないし14
倍に増し、3つの別々の実験でその抑制能を維持した。図11は、CD4reg
が全T細胞のわずか5%を含むとき、CTL活性の生成を強く阻害することを示
す。さらに、CD4+CD25細胞の数が全細胞のわずか0.2%に減少したと
き、この抑制活性はそのまま残った。しかし、この抑制T細胞を照射すると抑制
効果は消失した。
抑制され(図12)、応答CD8+キラー前駆体細胞の能力が弱められて活性と
なる(図13)。
図14B)、CD8+T細胞が主要な標的であった。5日間の培養後、フローサ
イトメトリーによってCD8+細胞にゲーティングすると、同種異型活性CD8
+細胞はCD25の顕著な増加、CD69およびFasの発現の増加、ならびに
CSFE標識およびヨウ化プロピジウム標識したエフェクターT細胞による細胞
分割の証拠を示した。さらにあるCD8+細胞は、アネキシンV染色により示さ
れたように、活性化誘導の細胞死を受けた。非常に対照的に、CD4regを含
む培養液中、CD8+細胞によるCD25、CD69およびFasの上方調節は
著しく阻害され、ほとんどどれもアポトーシスあるいは細胞分割を受けなかった
。培養液中CD8+細胞の絶対数の検査から、全体の数からほんのわずかの変化
であることが明らかとなった。このようにCD4regはCD8+細胞をアネル
ギーにさせた。
れているが、その生起に関わるメカニズムはほとんど知られていない。我々は、
スーパー抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシンB(SEB)によるCD4+細胞
の強い刺激、または低濃度のSEBによるCD4+細胞の反復刺激がこれらの細
胞を誘発してTGF−βの免疫抑制レベルをつくるとの確証を得た。
る全活性TGF−βの生成量が増加していることを示す。図16は、低量のSE
BによるCD4+T細胞の反復刺激の作用を示す。T細胞をSEBで刺激すると
、刺激3回目までにかなりの量の活性型TGF−βが生成した。
+T細胞に対するSEBの作用を示す。細胞をSEBで5日毎に計3回刺激した
。各T細胞サブセットおよびCD25IL−2受容体活性化マーカーを発現する
細胞の割合を各刺激後に測定した。パネルAおよびCは、最初の刺激時にTGF
−βの1ng/mlを含んでいることによって、CD4+T細胞が反復刺激後に
培地中で優勢なサブセットになることを示す。パネルBおよびDは、SEB刺激
を受けた細胞によるCD25発現が対照の培地中3回目の刺激により低下するこ
とを示す。しかし、T細胞をTGF−βで免疫起動するとCD25の発現は高い
ままである。このように、T細胞が反復して刺激を受け、20日間の培養後、こ
の細胞のほとんどがCD25+であれば、TGF−βはCD4+細胞に対して優
先的作用を持っているようである。
細胞に向けられる。該サイトカインは、長いまたは反復した刺激によりCD4+
細胞を生成して調節性細胞となり、そしてこの細胞の抑制活性はCD8+細胞の
それよりも強い。
かった場合に、サプレッサー細胞になるよう調整したドナーT細胞を大量移転す
ることにより、GVHDを処置できる。白血球除去法により得た約1×109の
PBMCを、滅菌したロイコパック、すなわちハンクス緩衝塩類溶液(HBBS
)中で濃縮する。PBMCは、適当なモノクロナール抗体で被膜した磁性ビーズ
によってCD4+とCD8+に分離する。細胞を望ましいT細胞アクチベーター
および阻害誘発組成物と最適時間処置し、最大の調節性活性を発揮させる。該細
胞を増量し、レシピエントに移転する。調整したこのT細胞はリンパ器官に移行
しGVHDを抑制する。
系悪性腫瘍、乳癌または腎性細胞癌のような固形癌、および重篤な貧血(サラセ
ミア、鎌状赤血球貧血)のような非悪性疾患などを、不適合の同種異型幹細胞で
処置し得る。
キットである。該キットは容器内に予め入れた適当な濃度のサイトカインを含む
滅菌培養容器を含む。キットの一つの実施態様で、サイトカインは容器中に凍結
乾燥型で存在する。該容器は静脈注射用(IV)バッグのようなバッグが望まし
い。凍結乾燥したサイトカインは、ハンクス緩衝塩類溶液(HBBS)によって
再構成し、ついで細胞を該容器に注入して完全に混合しインキュベートする。更
なる本発明の実施態様で、サイトカインは予め溶液状態で容器内にあって、ただ
なすべきことは洗浄した幹細胞調製物の注入およびインキュベーションである。
(CD40L)の発現を上方調節し得ることを示す。
TGF−α発現を増加せしめることを示す。
増加せしめることを示す。
阻害し得ることを示す。
ト細胞に対する細胞毒性T細胞活性の抑制を示す。
されると、強力な抑制活性を起こすことを示す。
胞毒性リンパ球(CTL)活性に対する作用を示す。
示す。
によって、この細胞が同種異型抗原に対して強く応答し得るようになり、その活
性化表現型への転換が促進され、活力が増加することを示す。
にかなり少数を要することを示す。
害作用を保持せしめ得ることを示す。
るリンパ球増殖の抑制を示す。
4+細胞を、刺激した同種異型非T細胞±TGF−β(1ng/ml)で5日間
刺激した。
T細胞の同種異型抗原に対する増殖性応答をブロックし、CD8+T細胞がその
主要な標的であることを示す。
でのT細胞の反復刺激がT細胞を誘発してTGF−βの免疫抑制レベルをつくる
ことを示す。
胞を誘発してTGF−βの免疫抑制レベルをつくることを示す。
)CD4+およびCD8+T細胞に対する作用を示す。
Claims (17)
- 【請求項1】 生体外の末梢血単球細胞(PBMC)のサンプルにおいてサ
プレッサー細胞を生成せしめる方法であって、阻害誘発組成物を該細胞集団に加
えることを含む方法。 - 【請求項2】 レシピエント患者の移植片−対−宿主疾患を軽減するために
ドナー細胞を処置する方法であって、 a)ドナーから末梢血単球細胞(PBMC)を取り出し、 b)該細胞を阻害誘発組成物で、サプレッサー細胞を生成せしめるのに十分な
時間処置し、 c)該細胞を該患者に導入する、 ことを含む方法。 - 【請求項3】 該阻害誘発組成物がTGF−βを含む、請求項1または2の
方法。 - 【請求項4】 該阻害誘発組成物がIL−2とTGF−βの混合物を含む、
請求項1または2の方法。 - 【請求項5】 該ドナー細胞をT細胞アクチベーターで処理することをさら
に含む、請求項1または2の方法。 - 【請求項6】 該T細胞アクチベーターがレシピエント細胞である、請求項
5の方法。 - 【請求項7】 該組成物方法が、該細胞をドナー幹細胞に、該患者への導入
前に加えることをさらに含む、請求項2の方法。 - 【請求項8】 該PBMCがCD8+細胞に富む、請求項1または2の方法
。 - 【請求項9】 該PBMCがCD4+細胞に富む、請求項1または2の方法
。 - 【請求項10】 ドナー細胞を処置するためのキットであって、 a)ドナーから細胞を受容するのに適した細胞処置容器、 b)少なくとも1用量のT細胞アクチベーター、 を含むキット。
- 【請求項11】 該T細胞アクチベーターがブドウ球菌性エンテロトキシン
Bである、請求項10のキット。 - 【請求項12】 処置方法の説明書をさらに含む、請求項10のキット。
- 【請求項13】 該用量が該細胞処置容器中に含有されている、請求項10
のキット。 - 【請求項14】 該用量が凍結乾燥形態にある、請求項10のキット。
- 【請求項15】 該細胞処置容器が少なくとも1つの試薬をさらに含有する
、請求項10のキット。 - 【請求項16】 該細胞処置容器が、該細胞の分画を分析のために取り出し
得るサンプル口をさらに含む、請求項10のキット。 - 【請求項17】 該細胞処置容器が、該細胞の少なくとも部分を該患者に移
転し得るのに適した出口をさらに含む、請求項10のキット。
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