DE69813868T2

DE69813868T2 - Verwendung von zytokinen und mitogenen für inhibierung von pathologischen immunantworten

Info

Publication number: DE69813868T2
Application number: DE69813868T
Authority: DE
Inventors: A. David HORWITZ
Original assignee: University of Southern California USC
Current assignee: University of Southern California USC
Priority date: 1997-11-05
Filing date: 1998-11-05
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2018-11-06
Also published as: CA2309115C; US6228359B1; CA2309115A1; PT1028738E; ATE238061T1; WO1999025366A1; AU747767B2; EP1028738A1; DK1028738T3; ES2198774T3; JP2001523443A; DE69813868D1; JP4309047B2; EP1028738B1; AU1382799A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Das Gebiet der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Zusammensetzung, die IL-2 oder TGF-β umfasst, zur Behandlung von antikörpervermittelten Autoimmunerkrankungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Autoimmunerkrankungen werden dadurch ausgelöst, dass das Immunsystem nicht in der Lage ist, Eigenes von Fremdem zu unterscheiden. Bei derartigen Erkrankungen reagiert das Immunsystem gegen das eigene Gewebe, und diese Reaktion führt letztendlich zu Entzündungen und Gewebeschäden. Autoimmunerkrankungen können in zwei grundlegende Kategorien eingeteilt werden: antikörpervermittelte Erkrankungen, wie z. B. systemischer Lupus erythematodes (SLE), Pemphigus vulgaris, Myasthenia gravis, hämolytische Anämie, Werlhof-Krankheit, Basedow-Krankheit, Sjorgen-Syndrom und Dermatomyositis; sowie zellvermittelte Erkrankungen, wie z. B. Hashimoto-Krankheit, Polymyositis, Darmentzündung, multiple Sklerose, Diabetes mellitus, primärchronische Polyarthritis und Sklerodermie.
Bei vielen Autoimmunerkrankungen kommt es durch die Produktion von Antikörpern zu Gewebeschädigungen im eigenen Gewebe. Diese Antikörper werden als Autoantikörper bezeichnet, da sie von einem Säugetier gebildet werden und Bindungsstellen zum eigenen Gewebe des Säugetiers aufweisen. Bei einigen dieser Erkrankungen ist eine charakteristische Zu- und Abnahme der Menge an zirkulierenden Autokörpern gegeben, wodurch im Laufe der Zeit unterschiedliche Symptome hervorgerufen werden.
Unter den unterschiedlichen Arten von antikörpervermittelten Autoimmunerkrankungen, stellt SLE eine Erkrankung dar, die weitreichend erforscht und dokumentiert worden ist. SLE ist eine Störung allgemeiner Autoimmunität, die durch eine B-Zellen-Hyper aktivität mit zahlreichen Autoantikörpern gegen Kern-, Cytoplasma- und Zelloberflächen-Antigene gekennzeichnet ist. Diese Autoimmunerkrankung weist eine multifaktorielle Pathogenese mit genetischen sowie umweltbedingten krankheitsverursachenden Faktoren (besprochen in Hahn, B. H., Dubois' Lupus Erythematosus, 5. Aufl., 69–79 (1997), (D. J. Wallace et al. (Hrsg.), Williams and Wilkins, Baltimore, USA)). Zu den zahlreichen Lymphozyten-Defekten bei SLE gehört auch ein Versagen der regulierenden T-Zellen, die B-Zellen-Funktion zu hemmen (Horwitz, D. A., Dubois' Lupus Erythematosus, 5. Aufl., 155–194 (1997), (D. J. Wallace et al. (Hrsg.), Williams and Wilkins, Baltimore, USA)). Regulierende T-Zellen können die Antiköpersynthese durch lytische oder cytokinvermittelte Mechanismen herunterregeln. Letztere schließen den transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGFβ) und andere hemmende Cytokine ein (Wahl, S. M., J. Exp. Med. 180, 1587–190 (1994)). Zirkulierende B-Lymphozyten, die spontan Ig ausscheiden, sind in Patienten mit aktiver SLE vermehrt vorhanden (Klinman, D. M., et al., Arthritis Rheum. 34, 1404–1410 (1991)). Die anhaltende Produktion von polyklonalem IgG und Autoantikörpern in vitro macht die Hilfe von T-Zellen notwendig (Shivakumar, S., et al., J. Immunol. 143, 103–112 (1989)).
Klinische Symptome von SLE schließen einen Ausschlag (insbesondere im Gesicht in "Schmetterlings"-förmigen Verteilung), Glomerulonephritis, Pleuritis, Perikarditis und den Befall des Zentralnervensystems ein. Die meisten der Patienten sind Frauen und noch relativ jung (Durchschnittsalter bei der Diagnose ist 29).
Die Behandlung von SLE ist von den klinischen Symptomen abhängig. Manche Patienten mit gemäßigten klinischen Symptomen sprechen auf einfache Maßnahmen wie entzündungshemmende Nicht-Steroid-Wirkstoffe an. Schwerere Symptome machen jedoch im Allgemeinen den Einsatz von Steroiden mit starker entzündungshemmender und immunsuppressiver Wirkung, wie z. B. Prednison, erforderlich. Andere verwendbare starke immunsuppressive Medikamente sind Azathioprin und Cyclophosphamid. Steroide und andere immunsuppressive Medikamente haben Nebenwirkungen aufgrund der allge meinen Schwächung des Immunsystems des Säugetiers. Gegenwärtig gibt es keine ideale Behandlung für SLE, und die Krankheit kann nicht geheilt werden.
Derzeitig ist beträchtliche Aufmerksamkeit auf die Identität der Gene, die die Anfälligkeit für oder Widerstandsfähigkeit gegen SLE verstärken, die Identifizierung der Antigendeterminanten, die die Erkrankung auslösen, die molekularen Mechanismen der T-Zellen-Aktivierung, die zum Überleben oder zu Apoptose führen, Cytokine, die die T-Zellen-Funktion bestimmen, sowie die Eigenschaften der die Autoantikörper bildenden B-Zellen gelenkt. Zahlreiche Beispiele von T-Zellen-Regulationsstörungen bei SLE wurden eräutert (besprochen in Horwitz, D. A., et al., Dubois' Lupus Erythematosus, 5. Aufl., 83–96 (1997), (D. J. Wallace et al. (Hrsg.), Williams and Wilkins, Baltimore, USA)). Obwohl es weithin anerkannt ist, dass die Hauptfunktion gewisser Lymphozyten in der Abschwächung von Immunreaktionen liegt, wurden bei der Erforschung der Identität und der für die Erzeugung dieser Zellen notwendigen Mechanismen nur langsam Fortschritte erzielt.
Interleukin-2 (IL-2) wurde bereits als wichtig für die Erzeugung von unspezifischen Antigen-T-Suppressor-Zellen erachtet. An Mäuse verabreichte Anti-IL-2-Antikörper führten, zusammen mit gleichzeitiger Induktion der Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion, zu mehreren Merkmalen von SLE (Via, C. S., et al., International Immunol. 5, 565–572 (1993)). Ob IL-2 direkt oder indirekt für die Herbeiführung der Suppression von Bedeutung ist, ist kontroversiell (Fast, L. D., J. Immunol. 149, 1510–1515 (1992); Hirohata, S., et al., J. Immunol. 142, 3104-3112 (1989); Baylor, C. E., Advances Exp. Med. Biol. 319, 125–135 (1992)). Vor kurzem wurde herausgefunden, dass IL-2 CD8+ Zellen dazu anregt, die HIV-Replikation in CD4+ T-Zellen durch einen nichtlytischen Mechanismus zu unterdrücken. Diese Wirkung wird durch Cytokin ausgelöst, doch spezifische Cytokine konnten nicht identifiziert werden (Kinter, A. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10985-10989; Barken, T. D., et al., J. Immunol. 156, 4478–4483 (1996)). Bei SLE ist die T-Zellen-Produktion von IL-2 herabgesetzt (Horwitz, D. A., et al., Dubois' Lupus Erythe matosus, 5. Aufl., 83–96 (1997), (D. J. Wallace et al. (Hrsg.), Williams and Wilkins, Baltimore, USA)).
CD8+ T-Zellen von Patienten mit SLE halten die polyklonale IgG-Produktion viel mehr aufrecht, als dass sie sie unterdrücken (Linker-Israeli, M., et al., Arthritis Rheum. 33, 1216–1225 (1990)). CD8+ T-Zellen von gesunden Spendern können dazu angeregt werden, die Ig-Produktion zu verstärken (Takahashi, T., et al., Clin. Immunol. Immunopath. 58, 352–365 (1991)). Es wurde jedoch festgestellt, dass weder IL-2 noch CD4+ T-Zellen alleine CD8+ T-Zellen dazu bringen können, eine starke suppressive Aktivität zu entwickeln. Als NK-Zellen in die Kulturen integriert wurden, kam es zu einer starken suppressiven Aktivität (Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)). Es wird geglaubt, dass es der Beitrag der NK-Zellen in der Kultur war, transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGFβ) in seiner aktiven Form zu produzieren. Es wurde herausgefunden, dass nicht immunsuppressive Konzentrationen dieses Cytokins (2–10 pg/ml) als Cofaktor für die Erzeugung starker suppressiver Wirkungen auf die IgG- und IgM-Produktion dienten (Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)). Darüber hinaus wird geglaubt, dass NK-Zellen die Hauptquelle von TGFβ in nichtstimulierten Lymphozyten ist (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)).
TGFβ gehört zu einer mulitfunktionellen Familie von Cytokinen, die wichtig für die Gewebereparation bei Entzündungen und Immunregulierung sind (Massague, J., Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597 (1980)). TGFβ unterscheidet sich von den meisten Cytokinen dadurch, dass das freigesetzte Protein biologisch inaktiv ist, und bestimmte Rezeptoren nicht binden kann (Sporn, M. B., et al., J. Cell Biol. 105, 1039–1045 (1987)). Der latente Komplex wird extrazellulär gespalten, um aktive Cytokine, wie oben erläutert, freizusetzen. Die Antwort auf TGFβ erfordert die Wechselwirkung zweier Oberflächenrezeptoren (TGFβ-R1 und TGFβ-R2), die in einkernigen Zellen überall zu finden sind (Massague, J., Cell 69, 1067–1070 (1992)). Somit ist die Umwandlung von latentem zu aktivem TGFβ der entscheidende Schritt, der die biologische Wirkung dieses Cytokins bestimmt.
Es wurde festgestellt, das SLE-Patienten bei NK-Zellen eine verringerte TGFβ-Produktion aufweisen. Defekte bei von NK-Zellen produziertem konstitutiven TGFβ sowie induziertem TGFβ wurden in einer Studie mit 38 SLE-Patienten belegt (Ohtsuka, K., et al., J. Immunol. 160, 2539–2545 (1998)). Interessanterweise konnte weder die Zugabe von rekombinantem IL-2 oder TNF-α, noch die Gegenwirkung von IL-10 den TGFβ-Defekt bei SLE normalisieren. Es bestand keine Korrelation zwischen der verringerten TGFβ-Produktion bei SLE und der Aktivität der Erkrankung. Es könnte sich daher um einen Primärdefekt handeln.
Die Behandlung eines SLE-Patienten durch systemische Verabreichung von systemischem TGFβ, IL-2 oder einer Kombination davon kann zu schweren Nebenwirkungen führen. Diese Cytokine haben zahlreiche Auswirkungen auf unterschiedliche Körpergewebe und lassen sich nicht sehr sicher systemisch einem Patienten verabreichen. Es ist daher ein Ziel der Erfindung, Verfahren und Sets für die Behandlung von Säugetierzellen bereitzustellen, um die Population von Zellen zu erhöhen, die die Autoantikörper-Produktion herabsetzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von einkernigen Peripherblutzellen (PBMCs) vor, die mit IL-2 oder TGF-β behandelt wurden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
In einem zusätzlichen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Hemmzusammensetzung, die IL-2 oder TGF-β umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung vor. Die Anwendungen umfassen die Entnahme einkerniger Peripherblutzellen (PBMC) aus dem Patienten und die Behandlung der Zellen mit einer Hemmzusammensetzung über einen ausreichenden Zeitraum, um die Ig-Produktion zu unterdrücken oder zu stimulieren oder Zellen dazu an zuregen, die Ig-Produktion herabzusetzen. Die Zellen können dann dem Patienten wieder zugeführt werden, wodurch es zu einer Verbesserung der Auotimmunsymptome kommt. Die Hemmzusammensetzung umfasst vorzugsweise eine Kombination aus IL-2 und TGF-β.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt, dass die Inkubation der PBMC eines SLE-Patienten mit IL-2 und TGF-β die spontane Immunoglobulin-Produktion verringert. PBMC (2 × 10⁵/Napf) wurde in einem serumfreien AIM-V-Medium mit oder ohne IL-2 (10 U/ml) und TGF-β (10 pg/ml) kultiviert. Nach 3 Tagen wurden die Vertiefungen dreimal gewaschen und frisches AIM-V-Medium zugegeben. Nach weiteren 7 Tagen wurden Flüssigkeitsüberstände aus den Näpfen gewonnen und der IgG-Gehalt mittels ELISA bestimmt.
2 zeigt, dass sowohl IL-2 als auch TGF-β die spontane IgG-Produktion deutlich verringern. Die Werte repräsentieren den Mittelwert ± SEM von IgG (μg/ml), das von den PBMC der 12 SLE-Patienten produziert wurde, die wie in der Legende von 1 beschrieben kultiviert wurden, mit Ausnahme, das manche Zellen auch mit IL-2 (10 U/ml) oder TGF-β (10 pg/ml) allein inkubiert wurden.
Die 3A und 3B zeigen, dass das Anti-TGF-β die Wirkung von IL-2 umkehren kann. PBMC der SLE-Patienten wurde für drei Tage in Gegenwart (volle Balken) oder Abwesenheit (gepunktete Balken) von IL-2 (10 U/ml) kultiviert. Eingeschlossen in diesen Kulturen war Medium, Anti-TGF-β (10 μg/ml) oder IgG1 der Vergleichsmaus (10 μg/ml). Flüssigkeitsüberstände wurden nach weiteren sieben Tagen gewonnen und auf den Gehalt an IgG (3A) oder Anti-NP (3B) durch ELISA untersucht.
Die 4A, 4B und 4C veranschaulichen die regulierende Wirkung von CD8+ T-Zellen auf die Antikörperproduktion. (A) Synergetische Wirkung zwischen NK-Zellen und CD8+ Zellen bei der Suppression der IgG-Produktion bei einer gesunden Versuchsperson. CD4+ Zellen und B-Zellen wurden mit Anti-CD2 stimuliert und die Wirkung der CD8+ Zellen und NK-Zellen untersucht. Die Kombination von NK- und CD8+ Zellen hemmte deutlich die Anti-CD2 induzierte IgG-Produktion, über die bereits berichtet wurde (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248.2254 (1998); Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)). (B) NK-Zellen und CD8+ Zellen steigern die IgG-Synthese bei SLE. CD4+ Zellen eines Patienten mit aktiver SLE sowie ruhende B-Zellen einer gesunden Versuchsperson wurden mit Anti-CD2 stimuliert. Die Steigerung der IgG-Produktion durch SLE CD8+ Zellen wurde durch die Zugabe von NK-Zellen deutlich erhöht. (C) Cytokin-Normalisierung der CD8+ T-Zellenfunktion bei SLE. Parallel zu der in 4B gezeigten Studie wurden CD4+ T-Zellen dieses Patienten mit Anti-CD3 in Gegenwart oder Abwesenheit von CD8+ T-Zellen stimuliert. IL-2 (10 U/ml) und/oder TGF-β (2 pg/ml) wurden wie angezeigt zugegeben. Diese Cytokine hoben die Helfereffekte der CD8+ Zellen auf und ermöglichten es diesen, die IgG-Produktion zu 75% zu hemmen.
Die 5A und 5B veranschaulichen die Lymphozyten-Produktion von TGF-β1 durch nichtstimulierte und Anti-CD2 stimulierte Zellen. PBL von gesunden Spendern sowie SLE-Patienten und RA wurden zu den Mikrotiterplatten mit 1 × 10⁵/Napf zugegeben. Einige Näpfe erhielten die Anti-CD2 mAbs GT2 (1 : 40) und T11 (1 : 80). Nach 2 Tagen bei 37 °C wurden Flüssigkeitsüberstände geerntet und auf aktiven TGF-β1 und Gesamtgehalt an 1-GF-β1 untersucht. Signifikante p-Werte sind angezeigt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung ermöglicht ein Verfahren zur Behandlung von antikörpervermittelten Autoimmunerkrankungen, wie z. B. systemischem Lupus erythematodes (SLE), durch Entnahme von Zellen aus einem Patienten und Behandeln derselben mit einer Zusammensetzung, die die B-Zellen-Hyperaktivität herabsetzt und somit die Produktion von Ig-Antikörpern, einschließlich Autoantikörpern, hemmt, um die Symptome der Autoimmunerkrankung zu verbessern. Diese Strategie steht im Gegensatz zu den meisten der derzeit verwendeten Behandlungsmethoden, die entweder entzündungshemmend oder immunsuppressiv sind. Herkömmlich verwendete Corticosteroide unterdrücken die Cytokin-Produktion und blockieren die terminalen Ereignisse, die Gewebeschädigungen verursachen, verändern jedoch im Allgemeinen nicht die zugrunde liegende Autoimmunantwort. Zellschädigende Medikamente oder experimentell genetisch manipulierte Biologicals, wie z. B. monoklonare Antikörper, können ebenso spezielle Lymphozyten-Populationen auslöschen oder ihre Funktion stören. Diese Medikamente sind im Allgemeinen nur wenig erfolgreich und besitzen schwer wiegende schädliche Nebenwirkungen. Patienten wurden gewisse Cytokine systemisch verabreicht, doch auch diese Wirkstoffe weisen weit reichende Wirkungen auf, die mit ernsten schädlichen Nebenwirkungen verbunden sind.
Im Gegensatz dazu ist es die Strategie der vorliegenden Erfindung, eine Remission zu erzielen, indem die normale Zellregelungsfunktion und somit das Immunsystem "zurückgesetzt" wird. Ein weiterer signifikanter potentieller Vorteil dieser Strategie ist, dass nur eine geringe Wahrscheinlichkeit besteht, dass schwere schädliche Nebenwirkungen entstehen. Da dem Patienten lediglich Spurenmengen der Hemmzusammensetzungen wie Cytokine zugeführt werden, sollte nur eine minimale Toxizität bestehen.
Zirkulierende B-Lymphozyten, die spontan IgG ausscheiden, sind bei Patienten mit aktivem SLE in erhöhtem Maße zu finden (Blease, R. M., et al., Am. J. Med. 69, 345–350 (1980); Klinman, D. M., et al., Arthritis Rheum. 34, 1404–1410 (1991)). Anhaltende Produktion von polyklonalem IgG und Autoantikörpern in vitro macht die Hilfe von T-Zellen notwendig (Shivakumar, S., et al., J. Immunol. 143, 103–112 (1989)). Frühere Studien über T-Zellen-Regulation von spontaner IgG-Produktion zeigen, dass während CDB+ T-Zellen die Antikörperproduktion bei gesunden Personen hemmen, diese Zellen bei SLE stattdessen die B-Zellen-Funktion unterstützen (Linker-Israeli, M., et al., Arthritis Rheum. 33, 1216–1225 (1990)).
Dementsprechend ermöglicht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von antikörpervermittelten Autoimmunerkrankungen, welche die Entnahme einkerniger Peripherblutzellen (PBMCs) aus dem Patienten mit Autoimmunerkrankung und das Behandeln der Zellen mit einer Hemmzusammensetzung umfassen.
Die Behandlung der Zellen mit einer Hemmzusammensetzung führen in den behandelten Zellen zur direkten Suppression der Ig-Produktion, was in einer Verbesserung der Autoimmunsymptome resultieren kann. Alternativ oder zusätzlich regt die Behandlung der Zellen regulatorische Zellen dazu an, die Ig-Produktion in anderen Zellen herabzuregeln. Ig schließt in diesem Zusammenhang sämtliche Ig-Formen ein, einschließlich IgM, IgG, IgE, etc. Das Endergebnis ist eine Verringerung der Ig-Menge im System.
Somit stellt die vorliegende Erfindung die Fähigkeit der Peripherblut-T-Zellen des Patienten mit Autoimmunerkrankung, die Antikörperproduktion durch die Ex-vivo-Behandlung derselben mit einer Hemmzusammensetzung herabzuregeln, wieder her.
Mit "antikörpervermittelten Autoimmunerkrankungen" sind hierin Krankheiten gemeint, bei denen die Personen Antikörper gegen Bestandteile ihrer eigenen Zellen oder Gewebe bilden. Antikörpervermittelte Autoimmunerkrankungen schließen systemischen Lupus erythematodes (SLE), Pemphigus vulgaris, Myasthenia gravis, hämolytische Anämie, Werlhof-Krankheit, Basedow-Krankheit, Dermatomyositis und Sjorgen-Syndrom ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die bevorzugte Autoimmunerkrankung ist SLE.
Mit "Behandlung" einer Autoimmunerkrankung ist hierin gemeint, dass zumindest ein Symptom der Autoimmunerkrankung durch die hierin erläuterte medizinische Verwendung verbessert wird. Dies kann auf verschiedene Arten evaluiert werden, einschließlich sowohl objektiver als auch subjektiver Faktoren seitens des Patienten. Es können z. B. immunologische Symptome der Erkrankung evaluiert werden. So ist z. B. der Spiegel spontaner Ig-Antikörper- und Autoantikörperproduktion, im Falle von SLE insbesondere der IgG-Produktion, verringert. Es kann der gesamte Ig-Antikörperspiegel, oder Autoantikörper, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Anti-Doppelstrang-DNA-(-ds DNA-) Antiköper, Anti-Nucleoprotein-Antikörper, Anti-SM, Anti-Rho und Anti-La, gemessen werden. Physische Symptome können verändert werden, wie z. B. das Verschwinden oder die Verringerung eines Ausschlags bei SLE. Um die Veränderungen zu bestimmen, können Nierenfunktionstests durchgeführt werden, laboratorisches Beweismaterial einer Gewebeschädigung im Bezug auf Entzündungen kann evaluiert werden. Niedrigere Spiegel an zirkulierenden Immunkomplexen sowie Serumkomplementspiegel stellen weitere Beweise für eine Verbesserung dar. Im Falle von SLE kann auch eine Verringerung der Anämie beobachtet werden. Die Fähigkeit, die ansonsten vom Patienten benötigten Medikamente, wie z. B. Immunsuppressiva, zu senken, kann ebenso ein Anzeichen für eine erfolgreiche Behandlung sein. Andere Evaluierungsmethoden für eine erfolgreiche Behandlung sind für Fachleute auf dem Gebiet der jeweiligen Autoimmunerkrankung offensichtlich.
Als "Patient" wird hierin ein zu behandelndes Säugetiersubjekt bezeichnet, wobei menschliche Patienten bevorzugt sind. In manchen Fällen werden die Anwendungen der Erfindung bei Versuchstieren eingesetzt, in veterinärmedizinischen Anwendungen und bei der Entwicklung von tierischen Modellen für eine Erkrankung, einschließlich, jedoch nicht aussschließlich, mit Nagetieren, wie z. B. Mäusen, Ratten und Hamstern, sowie Primaten.
Die medizinischen Anwendungen sehen das Entfernen von Blutzellen aus einem Patienten vor. Im Allgemeinen werden einkernige Peripherblutzellen (PBMCs) mittels Standardverfahren einem Patienten abgenommen. Unter "einkernigen Peripherblutzellen" oder "PBMCs" sind hierin Lymphozyten (einschließlich T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, etc.) und Monozyten zu verstehen. Wie untenstehend noch umfassender erläutert wird, scheint der Haupteffekt der Hemmzusammensetzung darin zu liegen, dass sie CD8+ T-Zellen befähigt, die IgG-Produktion zu unterdrücken. Dementsprechend sollte die PBMC-Population CD8+ T-Zellen umfassen. Vorzugsweise werden nur PBMCs abgenommen, und im Wesentlichen alle roten Blutzellen und polymorphonuclearen Leuko zyten entweder zurückgelassen oder dem Patienten wieder zugeführt. Dies wird wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, z. B. mittels Leukophorese-Verfahren, durchgeführt. Im Allgemeinen wird ein 5- bis 7-Liter-Leukophorese-Schritt vorgenommen, der einem Patienten im Wesentlichen die PBMCs abnimmt und diesem die übrigen Blutbestandteile wieder zuführt. Das Ziehen der Zellprobe wird vorzugsweise, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, in Gegenwart eines Antikoagulans wie Heparin durchgeführt.
Im Allgemeinen kann die die PBMCs umfassende Probe auf zahlreiche unterschiedliche Arten vorbehandelt werden. Nach der Gewinnung können die Zellen generell zusätzlich konzentriert werden, wenn dies nicht gleichzeitig mit der Gewinnung vorgenommen wurde, oder weiter gereinigt und/oder konzentriert werden. Die Zellen können gewaschen, gezählt und in Puffer resuspendiert werden.
Die PBMCs werden im Allgemeinen mittels auf dem Gebiet eingesetzter Standardverfahren für die Behandlung konzentriert. In einer bevorzugten Ausführungsform resultiert aus dem Leukophorese-Gewinnungsschritt eine konzentrierte PBMC-Probe in einem sterilen Leukopak, die Reagenzien und/oder Dosen der Hemmzusammensetzung enthalten kann, wie untenstehend umfassender erläutert wird. Generell wird ein zusätzlicher Konzentrations-/Reinigungs-Schritt, wie z. B. auf dem Gebiet bekannte Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation, durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die PBMCs dann gewaschen, um unter Anwendung auf dem Gebiet weithin bekannter Verfahren Serumproteine und lösliche Blutbestandteile, wie z. B. Autoantikörper, Hemmstoffe, etc., zu entfernen. Dies involviert im Allgemeinen die Zugabe von physiologischen Medien oder Puffern, gefolgt von Zentrifugation. Falls notwendig kann dieser Schritt wiederholt werden. Die Zellen können in physiologischen Medien, vorzugsweise serumfreiem AIM-V-Medium (Life Technologies) (da Serum signifikante Mengen an Hemmstoffen enthält), resuspendiert werden, obwohl auch Puffer wie Hanks Balanced Salt Solution (HBBS) oder gepufferte physiologische Kochsalzlösung verwendet werden können.
Anschließend werden im Allgemeinen die Zellen gezählt, und zwar werden generell 1 × 10⁹ bis 2 × 10⁹ weiße Blutkörperchen aus einem 5- bis 7-Liter-Leukophorese-Schritt gewonnen. Diese Zellen werden in ungefähr 200 ml Puffer oder Medium gelöst.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die PBMCs an einer oder mehreren Zellarten angereichert sein. Die PBMCs können z. B. an CD8+ T-Zellen oder CD4+ T-Zellen angereichert sein. Dies erfolgt nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren, wie von Gray et al., J. Immunol. 160, 2248 (1998), beschrieben und hierin durch Verweis aufgenommen. Im Allgemeinen werden dafür im Handel erhältliche immunabsorbierende Säulen oder Forschungsverfahren herangezogen (die PBMCs werden zu einer Nylon-Woll-Säule zugegeben, und die eluierten, nicht anhaftenden Zellen werden mit Antikörpern gegen CD4, CD16, CD11b und CD74, gefolgt von einer Behandlung mit Immunmagnetperlen, behandelt, wodurch eine an CD8+ T-Zellen angereicherte Population erhalten wird).
Wenn die Zellen den notwendigen Vorbehandlungen unterzogen worden sind, werden sie mit einer Hemmzusammensetzung behandelt. Unter "behandeln" ist hierin zu verstehen, dass die Zellen mit der Hemmzusammensetzung für eine Zeitspanne inkubiert werden, die ausreicht, um die Fähigkeit, die Ig- und Autoantikörperproduktion, insbesondere nach der Wiedereinführung in den Patienten, zu hemmen, auszubilden. Die Inkubation erfolgt generell bei physiologischer Temperatur. Wie obenstehend festgestellt wurde, kann dies das Ergebnis direkter Suppression der Ig-Produktion durch die behandelten Zellen sein, oder durch Induktion regulatorischer Zellen, um die Ig-Produktion in den Lymphorganen des Patienten herabzuregeln, erfolgen.
Als "Hemmzusammensetzung" oder "Ig-Produktion-Hemmstoff-Zusammensetzung" oder "Körperflüssigkeits-Hemmstoff-Zusammensetzung" wird hierin ein Zusammensetzung bezeichnet, die die Hemmung spontanter Ig- und Autoantikörperproduktion verursachen kann. Diese Zusammensetzungen sind Cytokine. Geeignete Hemmzusammensetzungen schließen IL-2, TGF-β und CD2-Aktivatoren, einschließlich Anti-CD2-Antikör per und des CD2-Liganden LFA-3, sowie Gemische oder Kombinationen davon ein. Eine bevorzugte Hemmzusammensetzung ist ein Gemisch aus IL-2 und TGF-β.
Die Konzentration der Hemmzusammensetzung variiert je nach Art der Zusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird TGF-β als Hemmzusammensetzung verwendet. Unter "transfomierendem Wachstumsfaktor-β" oder "TGF-β" wird ein beliebiger Vertreter der Familie der TGF-βs, einschließlich der drei Isoformen TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3, verstanden (siehe Massague, J., J. Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597 (1980)). Lymphozyten und Monozyten produzieren die β1-Isoform diese Cytokins (Kehrl, J. H., et al., Int. J. Cell Cloning 9, 438–450 (1991)). Das TGF-β kann eine beliebige Form von TGFβ sein, das auf den zu behandelnden Säugetierzellen aktiv ist. Beim Menschen wird derzeit rekombiniertes TGF-β bevorzugt. Ein bevorzugter menschlicher TGF-β ist bei Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA, USA, erhältlich. Im Allgemeinen liegt die verwendete TGF-β-Konzentration vorzugsweise in einem Bereich von etwa 10 pg bis etwa 500 pg, insbesondere von etwa 50 pg bis etwa 150 pg und Idealerweise bei 100 pg.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird IL-2 als Hemmzusammensetzung verwendet. Das IL-2 kann eine beliebige Form von IL-2 sein, das auf den zu behandelnden Säugetierzellen aktiv ist. Beim Menschen wird derzeit rekombiniertes IL-2 bevorzugt. Rekombiniertes IL-2 ist bei Cetus, Emeryville, CA, USA, erhältlich. Im Allgemeinen liegt die verwendete IL-2-Konzentration in einem Bereich von etwa 1 U/ml Zellsuspension bis etwa 100 U/ml, vorzugsweise von etwa 5 U/ml bis etwa 25 U/ml, insbesondere bei 10 U/ml. In einer bevorzugten Ausführungsform wird IL-2 nicht allein verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden in der Hemmzusammensetzung darüber hinaus ein CD2-Atkivator wie Anti-CD2-Antikörper oder der CD2-Ligand LFA-3 verwendet. CD2 ist ein Zelloberflächen-Glykoprotein, das durch T-Lymphozyten exprimiert wird. Mit "CD2-Aktivator" ist hierin eine Verbindung gemeint, die den CD2-Signalisierungsweg initiiert. Ein bevorzugter CD2-Aktivator umfasst Anti-CD2-Antikörper (OKT11, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Im Allgemeinen wird eine ausreichende Konzentration des CD2-Aktivators eingesetzt, um die Produktion von TGF-β anzuregen. Die verwendete Konzentration von Anti-CD2-Antikörpern liegt in einem Bereich von etwa 1 ng/ml bis etwa 10 μg/ml, vorzugsweise von etwa 10 ng/ml bis etwa 100 ng/ml.
Zusätzlich zur Verwendung einer Hemmzusammensetzung ist es bei manchen Ausführunsformen wünschenswert, ein Mitogen einzusetzen, um die Zellen zu aktivieren; d. h. viele der sich im Ruhezustand befindenden Zellen enthalten keine großen Mengen an Cytokin-Rezeptoren. Die Verwendung eines Mitogens wie Concanavalin A kann die Zellen dazu stimulieren lassen, Cytokin-REzeptoren zu produzieren, wodurch die Anwendungen der Erfindung wiederum effektiver werden. Wenn ein Mitogen wie ConA verwendet wird, wird es im Allgemeinen wie auf dem Gebiet bekannt verwendet, und zwar in Konzentrationen von 1 μg/ml bis etwa 10 μg/ml. Zusätzlich kann es erwünscht sein, die Zellen mit Komponenten wie α-Methylmannosid wie auf dem Gebiet bekannt zu waschen, um das ConA zu entfernen.
Die Hemmzusammensetzung wird mit den Zellen für einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, um eine Wirkung zu erzielen. In einer bevorzugten Ausführungsform soll auf die Behandlung der Zellen mit der Hemmzusammensetzung eine sofortige Transplantation zurück in den Patienten erfolgen. Dementsprechend werden die Zellen in einer bevorzugten Ausführungsform mit der Hemmzusammensetzung für etwa 12 bis etwa 120 h, vorzugsweise für etwa 24 bis etwa 72 h, insbesondere für 48 h, inkubiert.
In einer Ausführungsform werden die Zellen für eine Zeitspanne behandelt und gewaschen, um die Hemmzusammensetzung zu entfernen, und können dann reinkubiert werden. Bevor die Zellen in den Patienten zurückgeführt werden, werden sie vorzugsweise wie hierin erläutert gewaschen, um die Hemmzusammensetzung zu entfernen. Weitere Inkubationen können zur Prüfung oder Evaluierung durchgeführt werden, wobei sie von wenigen Stunden bis zu mehreren Tagen dauern können. Wenn eine Eva luierung der Ig-Produktion vor der Einführung in einen Patienten erwünscht ist, werden die Zellen für mehrere Tage inkubiert, um das Auftreten von Ig-Produktion (oder deren Fehlen) zu ermöglichen.
Wenn die Zellen behandelt worden sind, können sie vor der Autotransplantation zurück in den Patienten evaluiert oder getestet werden. Es kann z. B. eine Probe gezogen werden, um folgende Testverfahren durchzuführen: Sterilitätsüberprüfung, Gram-Färbung, mikrobiologische Studien, LAL-Untersuchungen, Mycoplasma-Untersuchungen, Durchflusszytometrie, um Zelltypen zu identifizieren, funktionelle Studien, etc. Diese und andere Lymphozyten-Untersuchungen können in ähnlicher Weise sowohl vor als auch nach der Behandlung durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Quantität oder Qualität, d.h. die Art, der Ig-Produktion evaluiert werden. So kann z. B. der Gesamtspiegel an Ig, oder die Spiegel bestimmter Arten von Ig, z. B. IgG, IgM, etc., oder IgG-Anti-DNA-Autoantikörper, Anti-Nucleoprotein- (-NP-) Antikörper etc., evaluiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Ig-Spiegel, insbesondere der IgG-Spiegel, anhand weithin bekannter Verfahren, einschließlich ELISA-Analysen wie in Abo et al., Clin. Exp. Immunol. 67, 544 (1987) und in Linker-Israeli et al., Arthritis Rheum. 33, 1216 (1990) beschrieben, die hiermit ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind, untersucht. Diese Verfahren können auch dafür verwendet werden, spezifische Antikörperspiegel, wie z. B. Autoantikörper, zu detektieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform, führt die Behandlung zu einer signifikanten Abnahme der produzierten Menge an IgG und Autoantikörpern, wobei vorzugweise eine Abnahme von zumindest 10%, noch bevorzugter zumindest 25%, und insbesondere zumindest 50% erzielt wird. In manchen Ausführungsformen können Abnahmen von 75% oder mehr beobachtet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, kann vor der Transplantation die Gesamtmenge an TGF-β oder die Menge an aktivem TGF-β untersucht werden. Wie hierin festgestellt wurde, ist TGF-β als ein latenter Vorläufer ausgebildet, der posttranslationell aktiviert wird.
Nach der Behandlung werden die Zellen in den Patienten transplantiert oder zurückgeführt. Dies erfolgt im Allgemeinen nach auf dem Gebiet bekannten Verfahren und umfasst üblicherweise das Injizieren oder Einführen der behandelten Zellen zurück in den Patienten via intravenöser Verabreichung, wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist. Die Zellen können durch Injektion mittels steriler Spritzen oder anderer steriler Übertragungsvorrichtungen z. B. in einen 50-ml-Fenwall-Infusionsbeutel gefüllt werden. Die Zellen können dann sofort via intravenöser Verabreichung über einen Zeitraum von z. B. 15 min über eine Freifluss-IV-Leitung in den Patienten infundiert werden. Bei manchen Ausführungsformen können auch zusätzliche Reagenzien wie Puffer oder Salze zugesetzt werden.
Nach dem Wiedereinführen der Zellen in den Patienten kann die Wirkung der Behandlung falls gewünscht wie oben allgemein erläutert evaluiert werden. So kann eine Evaluierung der immunologischen Symptome der Erkrankung durchgeführt werden, wie z. B. die Bestimmung der Titer des gesamten Ig oder spezifischen Immunglobulins, Nierenfunktionstests, Evaluierung der Gewebeschäden, etc.
Die Behandlung nach Bedarf oder Wunsch wiederholt werden. Die Behandlung kann z. B. einmal pro Woche über einen Zeitraum von mehreren Wochen oder mehrere Male pro Woche über einen gewissen Zeitraum, z. B. 3- bis 5-mal über zwei Wochen, durchgeführt werden. Im Allgemeinen hält die Verbesserung der Autoimmunerkrankungssymptome für einen gewissen Zeitraum an, vorzugsweise zumindest für Monate. Mit der Zeit kann es beim Patienten zu einem Rückfall der Symptome kommen. Zu diesem Zeitpunkt können die Behandlungen wiederholt werden.
Die folgenden Beispiele dienen einer umfassenderen Beschreibung der Art und Weise, wie die oben dargestellte Erfindung anzuwenden ist, sowie der Erläuterung der als am besten erachteten Methoden, verschiedene Aspekte der Erfindung auszuführen. Es versteht sich, dass diese Beispiele zu Illustrationszwecken angeführt sind.
BEISPIELE
Beispiel 1
Behandlung von PBMCs mit einem Gemisch aus IL-2 und TGF-β
Beispiel 1 zeigt, dass die relativ kurze Behandlung der PBMCs von SLE-Patienten mit IL-2 und TGF-β in einer deutlichen Hemmung spontaner polyklonaler IgG- und Autoantikörperproduktion resultieren kann. Wie untenstehend ausgeführt wurden PBMCs von 12 Patienten mit aktiver SLE für 3 Tage IL-2 mit oder ohne TGF-β ausgesetzt, dann gewaschen und für weitere sieben Tage kultiviert. Die durchschnittliche Abnahme der IgG-Sekretion betrug 79%. Die stärkste Hemmwirkung konnte bei Fällen mit der deutlichsten B-Zellen-Hyperaktivität beobachtet werden. Bei vier Fällen wurde eine spontane Produktion von Anti-Nucleoprotein- (-NP-) Antikörpern beobachtet, und die Cytokin-Behandlung der PBMC senkte die Autoantikörperproduktion um 50 bis 96%. IL-2 hemmte die Ig-Produktion bei einzelnen Patienten nach entweder TGF-β-abhängigen oder -unabhängigen Mechanismen. In einer Studie über Anti-CD2 stimulierte Ig-Produktion bei einem Patienten mit aktiver SLE berichteten die Erfinder, dass IL-2 und TGF-β die verstärkende Wirkung der CD8+ T-Zellen auf die IgG-Produktion umkehren und stattdessen eine suppressive Aktivität anregen können.
Verfahren
Versuchspersonen für spontane Ig-Synthese
Zwölf Versuchspersonen, bei denen SLE, die die ARA-Kriterien der SLE-Klassifizierung erfüllte (Arnett, F. C., et al., Arthritis Rheum. 31, 315–324 (1998)), diagnostiziert worden war, wurden ausgewählt. Alle dieser Patienten waren weiblichen Geschlechts, 8 Hispano-Amerikanerinnen, 2 Afro-Amerikanerinnen und 2 Asiatinnen. Das Alter sowie die Dauer der Erkrankung der Patientinnen sind in Tabelle 1 angeführt. Fünf Patientinnen wurden stationär und sieben ambulant behandelt. Patientinnen, denen Corticosteroide oder Malariamittel verabreicht wurden, sind ebenfalls gekennzeichnet. Die Erkrankungsaktivität wurde mittels SLAM- (Liang, M. H., et al., Arthritis Rheum. 32, 1107–1118 (1989)) und SLEDAI-Indices (Bombardier, C., et al., Arthritis Rheum. 35, 630–640 (1992)) mit Mittelwerten von 16,5 bzw. 13,4. Tabelle 1 Profil der SLE-Patientinnen
Reagenzien
Rekombinierter TGF-β und monoklonaler Anti-TGF-β-Antikörper (1D11.16), murines IgG1 wurden freundlicherweise von Dr. Bruce Pratt (Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA, USA) zur Verfügung gestellt. Rekombiniertes IL-10, monoklonaler Anti-IL-10-Antikörper (JES3-19F1) und IgG2a einer Kontrollratte wurden freundlicherweise von Dr. Satwant Narula (Schering Plough Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ, USA) zur Verfügung gestellt. Murines Kontroll-IgG1-Myelomprotein wurde bei Calbiochem, San Diego, CA, USA, erstanden. Rekombinantes menschliches IL-2 wurde bei Chiron, Emmeryville, CA, USA erstanden. Die verwendeten Anti-CD2 ausscheidenden Hybridom-Antikörper OKT11 stammten von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD, USA, und MD und GT2 wurden großzügigerweise von A. Bernanrd, Nizza, Frankreich zur Verfügung gestellt. Weitere Antikörper schlossen Anti-CD4 (OKT4, ATCC), Anti-CD8 (OKT8, ATCC; CD8, Dako, Carpaneteria, CA, USA), Anti-CD11 b (OKM1, ATCC), Anti-CD16 (3G8, freundlicherweise von J. Unkeless, New York, NY, USA zur Verfügung gestellt), Anti-CD20 (Leu 16, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) und Anti-CD74 (L243, ATCC) ein.
Isolierung einkerniger Blutzellen
Einkernige Peripherblutzellen (PBMC) wurden aus heparinisiertem, venösem Blut mittels Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) Dichte-Gradienten-Zentrifugation zubereitet. Die einkernigen Zellen wurden in PBS mit 5mM EDTA (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) gewaschen, um Plättchen, die eine reichhaltige Quelle an TGF-β darstellen, zu entfernen.
Zellkulturverfahren
Verfahren für Zellkulturen wurden vorhergehend beschrieben (Wahl, S. M., J. Exp. Med. 180, 1587–1590 (1994); Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)). Kurz gesagt wurden 2 × 10⁵ PBMC in serumfreiem AIM-V-Kulturmedium (Life Technologies) in den Vertiefungen der 96-Napf Mikrotiter-Platte mit oder ohne den angegebenen Cytokinen kultiviert. Nach drei Tagen wurden die PBMC dreimal gewaschen und danach fri sches serumfreies Medium zugegeben. Nach weiteren sieben Tagen bei 37°C wurden Flüssigkeitsüberstände abgeschöpft und mittels Festphasen-ELISA, wie zuvor beschrieben (Linker-Israeli, M., et al., Arthritis Rheum. 33, 1216–1225 (1990)), auf Gesamt-IgG und Autoantikörper, die mit Kalbsthymusnucleoprotein (NP) reaktiv sind, untersucht. Die optische Dichte (OD) Meßdaten wurden aus einer Standardkurve mittels positiver und negativer Standards in Einheiten/ml (units/ml, U/ml) umgerechnet. Flüssigkeitsüberstände der PBMC-Kulturen der SLE-Patientinnen (mit hohen Titern an Anti-NP-Antikörpern) und von gesunden Personen wurden als Kontrollprobe verwendet.
Statistische Analyse
Die Daten wurden mittels Graph Pad, Prism software (San Diego, CA, USA) analysiert. Die Erfinder wandten nach der Logarithmus-Transformation der Daten eine Varianzanalyse (ANOVA) und den nicht-parametrischen Mann-Whitney-Test an.
Anti-CD2 induzierte IgG-Synthese
Die Auswirkungen von CD8+ T-Zellen, die mit oder ohne NK-Zellen kultiviert wurden, auf Anti-CD2-stimulierte CD4+ T-Zellen und B-Zellen wurden bei einem Patienten mit SLE als Normalkontrolle untersucht. CD4+ und CD8+ Zellen wurden aus nicht an Nylon anhaftenden Lymphozyten durch negative Selektion mittels Immunmagnetperlen, wie zuvorergehend beschrieben (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)), zubereitet. Um die CD4+ Zellen zu erhalten, wurden die nicht an Nylon haftenden Zellen mit Antiköpern gegen CD8, CD16, CD11 b und CD74 gefärbt. Dieselben Antikörper wurden dazu verwendet, CD8+ Zellen zu erhalten, mit der Ausnahme, dass CD4 durch CD8 ersetzt wurde. Die Reinheit der CD4+ Zellen lag bei 95% und die der CD8+ Zellen bei 89%. Um NK-Zellen zu erhalten, wurde PBMC zu einer Nylon-Woll-Säule zugegeben, und die eluierten, nicht anhaftenden Zellen wurden umgehend mit mit AET behandelten roten Schafsblutkörperchen rosettiert. Die nicht rosettierende Fraktion wurde dann mit Anti-CD3- und Anti-CD74-Antikörpern (Anti-HLA-DR) gefärbt, und mittels Immunmagnetperlen von reagierenden Zellen befreit. Die so erhaltene Population enthielt 98% CD56+, <0,5% CD3+ und <0,5% CD20+ Lymphozyten. Da SLE-B-Zellen spontan große Mengen an IgG ausscheiden, und aufgrund der großen Menge an Blut, die für die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl an B-Zellen für diese Studien notwendig wäre, ersetzten die Erfinder in dieser Untersuchung die B-Zellen der Patienten durch ruhende B-Zellen eines gesunden Spenders. Um die B-Zellen zu erhalten, wurden an Nylon-Wolle anhaftende Zellen umgehend mit SRBC rosettiert, um jegliche T-Zellen zu entfernen, und mit 5 mM L-Leucinmethylester behandelt, um sämtliche Monozyten und funktionellen NK-Zellen zu beseitigen. Die resultierende Population enthielt >92% CD20+ und <0,5% CD3+.
Ergebnisse
Bei den zwölf untersuchten Patientinnen lag das spontane IgG in einem Bereich von 0,4 bis 13,7 μg/ml (1). Durch das Einwirkenlassen von IL-2 und TGF-β auf die PBMC für 72 h nahm die IgG-Synthese bei 8 von 12 untersuchten Fällen um zumindest 50 (durchschnittliche Abnahme 79%, p = 0,008, Mann-Whitney) ab. Die drastischste Abnahme konnte bei den Fällen mit der deutlichsten B-Zellen-Hyperaktivität beobachtet werden. Die Korrelation zwischen der Menge an ausgeschiedenem IgG und der prozentuellen Hemmung durch IL-2 und TGF-β betrug r = 0,647, p = 0,02.
Die Erfinder verglichen die alleinigen Effekte von IL-2 und TGF-β mit den Effekten der Korbination von IL-2 und TGF-β. 2 zeigt, dass jedes dieser Cytokine auch die IL-2-Produktion hemmte. Nach erfolgter Logarithmus-Transformation, um einer Normalverteilung der Daten zu erhalten, und Bonferoni-Korrektur für multiple Vergleiche, enthüllte die Varianzanalyse jedoch, dass lediglich die Kombination von IL-2 und TGF-β zu einer signifikanten Hemmung (p = 0,05) führte.
Bei SLE ist die IL-10-Produktion erhöht (Llorente, L., et al., Eur. Cytokine Network 4, 421–427 (1993)), und dieses Cytokin kann die Produktion von IL-2 sowie TGF-β hemmen. Bei neun Fällen untersuchten die Erfinder auch die Wirkung von Anti-IL-10, und konnten bei manchen Versuchspersonen nur eine geringfügige Abnahme der IgG-Synthese beobachten, wobei dieser Unterschied statistisch nicht signifikant war. Ähnlich ist bei einer Untergruppe an Patienten mit SLE die TNFα-Produktion gesenkt (Jacob, C. O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 1233–1237 (1990)). Obwohl dieses Cytokin auch die Produktion von aktivem TGF-β erhöht (Ohtsuka, K., et al., J. Immunol. 160, 2539–2545 (1998)), führte die Zugabe von TNFα zu den Kulturen nur zu minimalen Effekten (Ergebnisse nicht angezeigt).
Die Erfinder untersuchten zudem SLE PBMC auf spontane Produktion von Anti-NP-Autoantikörpern, und fanden in vier Fällen signifikante Titer. Bei allen Fällen hemmte ein Einwirkenlassen von entweder IL-2 oder IL-2 und TGF-β auf PBMC die Anti-NP-Pro-duktion um mindestens 50%. TGF-β alleine war unwirksam (Tabelle 2). Bei diesen Fällen waren die Effekte von IL-2 allein äquivalent zu denen der Kombination von IL-2 und TGF-β. Tabelle 2 Auswirkung der Behandlung von PBMC mit IL-2 und TGF-β auf die spontane Autoantikörperproduktion bei SLE
PBMC von SLE-Patienten wurde für 72 h IL-2 (10 U/ml) und TGF-β (10 pg/ml) ausgesetzt. Die Zellen wurden gewaschen und für sieben weitere Tage kultiviert. Das in die Flüssigkeitsüberstände abgegebene Anti-NP wurde mittels ELISA gemessen.
Die Erfinder haben zuvor berichtet, dass IL-2 die Produktion von biologisch aktivem TGF-β erhöht (Ohtsuka, K., et al., J. Immunol. 160, 2539–2545 (1998)). Aus diesem Grund war es möglich, dass zumindest manche der Effekte von IL-2 auf die spontane Ig-Syn-these durch TGF-β zustande gekommen waren. Diese Möglichkeit wurde untersucht, indem bestimmt wurde, ob die Effekte von IL-2. durch einen neutralisierenden Anti-TGF-β-Antikörper umgekehrt werden könnten. In dem in 3A gezeigten Beispiel hatte die Zugabe von Anti-TGF-β keine Auswirkung auf die spontane IgG-Synthese. PBMC dieses Patienten (Fall C in Tabelle 2) produzierten auch spontan Anti-NP-Antikörper. Hierbei hob Anti-TGF-β zudem die hemmenden Effekte von IL-2 auf die Anti-NP-Produktion auf (3B). Bei dieser Versuchsperson waren daher die Hemmeffekte von IL-2 auf die spontane IgG- und Autoantikörpersynthese durch TGF-β zustande gekommen. Diese Wirkung von Anti-TGF-β wurde in 4 von 8 untersuchten Fällen belegt. Somit könnten die Hemmeffekte von IL-2 entweder TGF-β-abhängig oder -unabhängig sein. Beispiele jeder Wirkung sind in Tabelle 3 aufgelistet.
Tabelle 3 Auswirkung von IL-2 und TGF-β auf die spontane IgG-Synthese bei SLE
Die Erfinder hatten die Möglichkeit, die Untersuchung eines SLE-Patienten 28 Tage nach Beginn der Steroid-Therapie zu wiederholen (Tabelle 4). Vor der Behandlung lag die spontane IgG-Synthese bei mehr als 2 μg/ml IgG. Das Einwirkenlassen von IL-2 auf PBMC hemmte die IgG-Produktion deutlich, und TGF-β zeigte mäßige Wirkung. Nach erfolgter Corticosteroid-Therapie nahm die spontane IgG-Produktion um 75% ab. Wie zuvor senkte das Einwirkenlassen von IL-2 ± TGF-β die IgG-Produktion um 50%. Diese Hemmung wurde jedoch durch Anti-TGF-β umgekehrt. Auch hier könnte diese Wirkung wiederum durch eine Zunahme an endogenem aktiven TGF-β erklärt werden. Tabelle 4 Auswirkung von Corticosteroid-Therapie auf die spontane IgG-Synthese bei SLE
Angesichts vorheriger Untersuchungen mit gesunden Versuchspersonen, die gezeigt hatten, dass IL-2 und TGF-β aktivierte CD+ T-Zellen dazu anregen können, die Ig-Produktion zu senken, versuchten die Erfinder, CD8+ T-Zellen aus SLE-Patienten dieser Studie zu isolieren und zu behandeln. Diese Versuche waren nicht erfolgreich, da die spontane Ig-Synthese deutliche Schwankungen aufwies und für Zelltrennungsverfahren große Mengen an Blut von Patienten mit aktiver SLE notwendig wären. Die Erfinder konnten jedoch einem Patienten mit aktiver SLE ausreichend Blut abnehmen, um die Auswirkung von IL-2 und TGF-β auf CD8+ T-Zellenmodulation von Anti-CD2-induzierter IgG-Synthese zu untersuchen. Die Erfinder hatten jüngst: berichtet, dass, anders als Anti- CD3, eine mitogene Kombination aus monoklonalen Anti-CD2-Antikörpern PBL nicht dazu anregen würde, IgG zu produzieren (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)). Dies war darauf zurückzuführen, dass Anti-CD2 NK-Zellen dazu veranlasste, TGF-β zu produzieren, was wiederum CD8+ T-Zellen zu einer Senkung der Ig-Produktion anregte (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)). Bei diesem Patienten verstärkten die CD8+ T-Zellen, wie die Erfinder bereits berichtet haben (Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)), die IgG-Synthese, wobei diese Steigerung durch die Kombination von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen deutlich potenziert wurde (4A). IL-2 und TGF-β hingegen hoben die Helfereffekte von SLE CD8+ T-Zellen auf, und ermöglichten es diesen, die IgG-Produktion zu unterdrücken. Diese Hemmwirkung von IL-2 und TGF-β war abhängig von der Gegenwart von CD8+ T-Zellen ( 4B). Somit wurde der Beweis erbracht, dass die Effekte von IL-2 und TGF-β durch CD8+ T-Zellen zustande kommen können.
Die Untersuchungen zeigen, dass ein kurzes Einwirkenlassen von IL-2 und TGF-β auf PBMC die folgende spontane polyklonale IgG- und Autoantikörperproduktion bei SLE, v.a. bei Patienten mit schwerer Erkrankung und deutlicher B-Zellen-Hyperaktivität, beträchtlich herabsetzen kann. Die Studie bestätigt frühere Berichte, die zeigen, dass IL-2 die Antikörperproduktion hemmen kann (Hirohata, S., et al., J. Immunol. 142, 3104-3112 (1989), und Fast, L. D., J. Immunol. 149, 1510–1515 (1992)), und offenbart, dass Picomol-Konzentrationen von TGF-β zu dieser Senkung beitragen können. Bei der untersuchten Gruppe von 12 Patienten war die Hemmwirkung von IL-2 und TGF-β auf die polyklonale IgG-Synthese stärker als die Wirkung von IL-2 allein. Die Hemmwirkung von IL-2 war jedoch heterogen. Bei 4 von 8 untersuchten Fällen war die Hemmung TGF-β-abhängig, insofern, dass ein neutralisierender Anti-TGF-β-mAb die Wirkung aufhob. Bei den restlichen Fällen war die herabregelnde Wirkung von IL-2 TGF-β-unabhängig. In ähnlicher Weise wurde sowohl TGF-β-abhängige als auch TGF-β-unabhängige Hemmung der spontanen Anti-NP-Autoantikörperproduktion belegt. Die Erfinder untersuchten darüber hinaus die Auswirkungen einer Bekämpfung von IL-10 und der Zugabe von TNF-α, da vorhergehend Abnormalitäten bei der Produktion dieser Cytokine bei SLE beschrieben worden waren (Llorente, L., et al., Eur. Cytokine Network 4, 421–427 (1993); Jacob, C. O., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 1233–1237 (1990)). Diese Vorgehensweise hatte jedoch nur minimale Auswirkungen auf die spontane Ig-Synthese, wo Lymphozyten vorhergehend aktiviert worden waren.
Andere haben berichtet, dass das Ausmaß an B-Zellen-Hyperaktivität bei SLE mit der Erkrankungsaktivität korreliert (Blease, R. M., et al., Am. J. Med. 69, 345–350 (1980); Klinman, D. M., et al., Arthritis Rheum. 34, 1404–1410 (1991)). Bei der vorliegenden Studie war dies nicht der Fall, was möglicherweise auf eine gleichzeitige medikamentöse Behandlung zurückzuführen ist. Im Allgemeinen wurden Patienten mit deutlicher spontaner Ig-Synthese nicht behandelt, während Patienten mit geringerer B-Zellen-Aktivität Prednison erhielten. Die Erfinder führten einen Fall an, wo die spontane IgG-Synthese nach Beginn der Corticosteroid-Therapie deutlich abnahm. Die B-Zellen dieses Patienten hatten vor der Behandlung auch Anti-NP-Antikörper ausgeschieden, und die Produktion dieser Autoantikörper war nach der Steroid-Therapie nicht mehr feststellbar (Ergebnisse nicht angeführt).
TG1-β besteht aus einer multifunktionellen Familie von Cytokinen, die wichtig für die Gewebereparatur, bei Entzündungen und Immunregulation sind (Massague, )., Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597–641 (1990)). TGF-β unterscheidet sich von den meisten anderen Cytokinen insofern, dass es als inertes Vorläufermolekül ausgeschieden wird, und extrazellulär in seine aktive biologische Form umgewandelt wird (die wichtig für die Gewebereparation, bei Entzündungen und Immunregulation sind (Massague, J., Ann. Rev. Cell Biol. 6, 597–641 (1990); Flaumenhaft, R., et al., Adv. Pharmacol. 24, 51–76 (1993)). Regulatorische T-Zellen produzieren in verschiedenen experimentellen Autoimmunmadellen wie experimentelle Autoimmunenzephalitis (Weinen, H. L., et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 809–837 (1994) und -colitis (Neurath, M. F., et al., J. Exp. Med. 183, 2605-2516 (1996)) dieses Cytokin. TGF-β ist in nanomolaren Konzentrationen immunsuppressiv und kann die T- und B-Zellen-Vermehrung, cytotoxische NK-Zellenaktivität sowie die Erzeugung von T-Zellen-Cytotoxizität hemmen (Letterio, J. J., et al., Ann. Rev. Immu nol. 16, 137–162 (1998)). Es wurde hingegen berichtet, dass TGF-β das Wachstum von murinen CD4+ Zellen und CD8+ Zellen fördert (Kehrt, J. H., et al., J. Exp. Med. 163, 1037–1050 (1986); Lee, H. M., et al., J. Immunol. 151, 668–677 (1993)) und die B-Zellen-Differenzierung vorantreiben kann (Van Vlasselaer, P., et al., J. Immunol. 148, 2062-2067 (1992)).
In vorhergehenden Untersuchungen der Erfinder mit Lymphozyten von gesunden Versuchspersonen, um regulatorische T-Zellen zu generieren, wurden geringere picomolare Konzentrationen an TGF-β verwendet, als für die Hemmung der T- oder B-Zellen-Funktion notwendig sind (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998); Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)). In den vorliegenden Untersuchungen mit SLE-Patienten wurden ähnliche Konzentrationen verwendet, und TGF-β allein hatte mäßige Hemmwirkung auf die Ig-Synthese. Wie zuvor führte eine Kombination aus IL-2 und TGF-β zur stärksten Hemmung. In den früheren Untersuchungen der Erfinder wurde diese Wirkung durch CD8+ T-Zellen herbeigeführt.
IL-2 hat eindeutig nachgewiesene Effekte auf die Induktion der T-Suppressorzellenaktivität (Hirohata, S., et al., J. Immunol. 142, 3104-3112 (1989); Fast, L. D., J. Immunol. 149, 1510–1515), es ist jedoch unklar, ob diese direkt oder indirekt sind. Bei Mäusen führt ein Auslöschen der IL-2-Gene zu massiver Lymphoproliferation und Autoimmunerkrankungen (Sadlack, B., et al., Eur. J. Immunol. 25, 3053–3059 (1995)). Bei SLE wurde eine negative Korrelation zwischen IL-2-Spiegel und B-Zellen-Hyperaktivität berichtet (Huang, Y. P., et al., J. Immunol. 141, 827–833 (1988)). Die Erfinder versuchten zuvor, die spontane Ig-Produktion bei SLE mit IL-2 zu hemmen, wobei die Ergebnisse jedoch sehr variabel waren. Während die Erfinder ein manchen Fällen eine starke Hemmung beobachteten, war bei anderen durch IL-2 die Ig-Produktion deutlich erhöht. Die Erfinder glaubbn, dass die in dieser Studie beobachtete beständigere Hemmung auf die zeitliche Steuerung und das Cytokin-Milieu zurückzuführen ist. Hierbei waren IL-2 und TGF-β nur während der ersten 72 h der Kultivierung, im Gegensatz zur gesamten Kultivierungsperiode, vorhanden. Die Steigerung der Ig-Synthese in letzterem Fall könnte durch die positiven Effekte von IL-2 auf die B-Zellen-Differenzierung zu erklären sein (Coffman, R. L., et al., Immunol. Rev. 102, 5–28 (1988)). IL-2 kann die Antikörperproduktion durch mehrere Mechanismen senken. Zusätzlich zu dem im Bericht beschriebenen TGF-β-Zyklus kann eine IL-2 induzierte Hemmung durch eine Steigerung von IFN-γ (Noble, A., et al., J. Immunol. 160, 566–571 (1998)) oder durch zytolytische Mechanismen verursacht werden (Stohl, W., et al., J. Immunol. 160, 5231–5238 (1998); Esser, M. T., et al., J. Immunol. 158, 5612–5618 (1997)).
Die Erfinder hatten vorher die regulatorische Wirkung von NK-Zellen auf die Antikörpersynthese untersucht, und berichtet, dass, während die direkte Wirkung von NK-Zellen darin besteht, die IgG-Synthese anzuheben (Kinter, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10985-10989 (1995)), diese Lymphozyten die entgegengesetzte Wirkung aufweisen, wenn sie mit CD8+ T-Zellen in gesunden Versuchspersonen kultiviert werden (Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)). Bei SLE-Patienten jedoch verstärkte die Kombination von CD8+ T-Zellen und NK-Zellen die IgG-Produktion (Linker-Israeli, M., et al., Arthritis Rheum. 33, 1216–1225 (1990)). Dies wurde auch im vorliegenden Bericht beobachtet. Während bei gesunden Versuchspersonen die Zugabe von NK-Zellen zu CD8+ T-Zellen die Anti-CD2 stimulierte IgG-Synthese deutlich hemmte, wurde bei SLE das Gegenteil beobachtet. Aus Untersuchungen mit Gesunden hatten die Erfinder erfahren, dass aus NK-Zellen stammendes TGF-β mitstimulierte CD8+ T-Zellen dazu anregte, die IgG- und IgM-Produktion herabzusenken (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)). In dieser Studie führten IL-2 und TGF-β zu einer mäßigen suppressiven Aktivität durch CD8+ T-Zellen. Es ist daher wahrscheinlich, dass bei SLE zumindest eine Art, wie IL-2 und TGF-β β-Zellen-Aktivität hemmen, darin besteht, dass regulatorische T-Zellen generiert werden. Zusätzlich können andere Lymphozyten-Populationen, die mit diesen oder anderen Cytokinen behandelt wurden, die B-Zellen-Aktivität bei SLE herabsetzen.
Beispiel 2
Korrelation zwischen TGF-β-Produktion und Erkrankungsaktivität und -grad
Nachdem gezeigt worden ist, dass die Lymphozyten-Produktion sämtlicher TGF-β-Arten sowie seiner aktiven Formen reduziert ist, untersuchten die Erfinder als nächstes, ob diese Defekte mit der Erkrankungsaktivität und/oder der Schwere der Erkrankung korrelieren. Die TGF-β1-Produktion durch Blutlymphozyten wurde bei SLE-Patienten prospektiv untersucht, und mit 10 Patienten mit rheumatischer Arthritis (RA) und 23 passenden gesunden Kontrollpersonen verglichen. Bei den RA-Patienten war der Spiegel an aktivem TGF-β1 niedriger als bei den Kontrollpersonen, jedoch nicht so niedrig wie bei den SLE-Patienten. Die gemessenen, picomolaren Spiegel an konstitutivem und Anti-CD2 stimuliertem aktivem TGF-β1 waren bei 6 nicht behandelten Patienten, die mit vor kurzem ausgebrochenem, schwerem und sehr aktivem SLE stationär worden waren, deutlich herabgesetzt, und auch bei 11 behandelten Patienten mit weniger aktiver Erkrankung auf ein ähnliches Niveau gesunken. Somit korrelierte die verringerte Produktion an aktivem TGF-β1 nicht mit der Erkrankungsaktivität, sondern stand im Gegensatz dazu in einer umgekehrten Wechselbeziehung mit der Erkrankungsaktivität. Es scheint daher, dass, obwohl die herabgesetzte Lymphozyten-Sekretion des latenten Vorläufers von TGF-β1 als eine Konsequenz der Erkrankungsaktivität entstehen kann, die Fähigkeit, das Vorläufermolekül in seine aktive Form umzuwandeln, ein intrinsischer Zelldefekt sein kann. Wenn T-Zellen bei ihrer Aktivierung nicht hinreichend picomolaren Konzentrationen von TGF-β1 ausgesetzt werden, kann dies zu einer verminderten Herabregelung der Ig-Synthese führen. Somit kann eine verringerte Lymphozyten-Produktion von aktivem TGF-β1 bei SLE an der charakteristischen B-Zellen-Hyperaktivität der Erkrankung beteiligt sein.
Verfahren
Versuchspersonen
Siebzehn Versuchspersonen, bei denen SLE gemäß der Kriterien des American College of Rheumatology zur Klassifizierung von SLE (Tan, E. M., et al., Arthritis Rheum. 25, 1271–1277 (1982)) diagnostiziert worden war, zehn Versuchspersonen mit RA taut den 1987 überarbeiteten ACR-Kriterien zur Klassifizierung von RA (Arnett, F. C., et al., Arthritis Rheum. 31, 315–324 (1988)) sowie 23 gesunde Spender wurden untersucht. Die SLE-Gruppe setzte sich aus 15 Frauen und 2 Männern (15 Hispano-Amerikanerinnen, 1 Afro-Amerikaner, 1 Asiate) zusammen. Das Durchschnittsalter lag bei 34,5 Jahren (Altersbereich von 20 bis 75 Jahren). Sechs Patienten wurden stationär und 11 ambulant behandelt. Alle stationären Patienten waren vor ihrer Einweisung nicht behandelt worden, und wurden vor der Verabreichung der ersten Dosis an Corticosteroiden untersucht. Die ambulanten Patienten erhielten weniger als 20 mg Prednison sowie keine cytotoxischen Medikamente. Die Erkrankungsaktivität wurde mittels SLAM- (Liang, M. H., et al., Arthritis Rheum. 32, 1107–1118 (1989)) und SLEDAI-Indices (Bombardier, C., et al., Arthritis Rheum. 35, 630–640 (1992)) mit Durchschnittswerten von 6,6 bzw. 7,6 bestimmt. Die RA-Gruppe setzte sich aus 9 Frauen und 1 Mann (9 Hispano-Amerikanerinnen, 1 Asiate) zusammen. Das Durchschnittsalter lag bei 50,9 Jahren (Altersbereich von 39 bis 67 Jahren). Alle Patienten wurden ambulant in einer Klinik behandelt, und die Erkrankung war mäßig aktiv. Die durchschnittliche Erkrankungsdauer betrug 9,5 Jahre. Ein Patient erhielt Myochrisin, 3 Patienten Prednison (1, 1 und 20 mg), 3 Patienten Methotrexat und ein Patient Sulfasalazin. Gesunde Spender dienten als Kontrollpersonen, wobei Alter, Geschlecht und ethnische Zugehörigkeit so genau wie möglich übereinstimmten. Tabelle 5 Klinische Charakteristika der zwei Gruppen von SLE-Patienten
Reagenzien
Die verwendeten Antikörper waren Flüssigkeitsüberstände von Hybridomen, die Anti-CD2 sekretierten (OKT 11, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA, und GT2 zur Verfügung gestellt von Dr. Alain Bernard, Nizza, Frankreich). Ein monoklonaler Antikörper, der die TGF-β-Isoformen 1, 2 & 3 (1D11) erkennt, ein Antikörper gegen die TGF-β-Isoformen 2 & 3 (3C7) sowie TGF-β2 wurden freundlicherweise von Dr. Bruce Pratt (Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA, USA) zur Verfügung gestellt.
Isolierung von Blutlymphozyten
Einkernige Peripherblutzellen (PBMC) wurden aus heparinisiertem, venösem Blut mittels Ficoll-Hypaque- (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) Dichtegradienten-Zentrifugation nach bereits beschriebenen Verfahren (Ohtsuka, K., et al., J. Immunol. 160, 2539–2545 (1998)) hergestellt. Die einkernigen Zellen wurden in PBS mit 5 mM EDTA (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) gewaschen, um Blutplättchen zu entfernen, die eine reichhaltige TGF-β-Quelle darstellen. Peripherblutlymphozyten (PBL) wurden mittels Zentrifugation durch einen kontinuierlichen Percoll-Dichtegradienten (Pharmacia) von den PBMC getrennt. Der in der an Lymphozyten angereicherten Fraktion mit hoher Dichte verbleibenden Monozyten-Prozentsatz war etwas höher bei SLE (8,5% gegenüber 4,3%).
Zellkulturverfahren
Verfahren zur Zellkultivierung sind zuvor beschrieben worden (Ohtsuka, K., et al., J. Immunol. 160, 2539–2545 (1998)). Kurz gesagt wurden die Lymphozyten in die Näpfe einer 96-Napf-Mikrotiterplatte (Greiner Rocky Mountain Scientific, Salt Lake City, UT, USA) gefüllt. Die Kulturen wurden in serumfreiem AIM-V-Medium (Life Technologies) angelegt, da Serum signifikante Mengen an latentem TGF-β enthält. Anti-CD2 wurde in optimalen Konzentrationen verwendet, um Hybridomkultur-Flüssigkeitsüberstände zur TGF-β-Produktion anzuregen (GT2 1 : 40 und T11 1 : 80). Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass Anti-CD2 PBL stark zur TGF-β-Produktion stimuliert (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)).
TGF-β-Analyse
Nerz-Lungen-Epithelzellen (MLEC) wurden mit einem Expressionskonstrukt, das einen Plasminogen-Aktivator-Inhibitor- (Pal-1-) Promotor enthielt, der an ein Luciferase-Reportergen gebunden war, wurden freundlicherweise von Dr. D. B. Rifkin, New York, NY, USA zur Verfügung gestellt. 2 × 10⁴/Napf an MLEC wurde mit 200 μl Flüssigkeitsüberstand für 18 h bei 37°C inkubiert. Um die Luciferase-Atkivität zu analysieren, wurde MLEC durch ein Zell-Lysisreagens (Analtytical Luminescence, Ann Arbor, MI, USA) ly siert. Die Zell-Lysate wurden dann, unmittelbar vor der Messung in einem Luminometer (Lumat, Berthold Analytical Instruments Inc., Nashua, NH, USA) mit einem Analysepuffer und Luciferin-Lösung umgesetzt. Zur Messung der gesamten TGF-β-Aktivität wurden die Proben für 3 min auf 80°C erhitzt, um die aktiven Cytokine aus dem latenten Komplex freizusetzen. Die aktive TGF-β-Aktivität wurde ohne Erhitzen der Flüssigkeitsüberstände bestimmt. Bei sämtlichen Analysen wurden mehrere Konzentrationen an rTGF-β eingeschlossen, um eine Standardkurve zu erzeugen. Die Variabilität der Mehrfachkulturen betrug weniger als 10% (Ohtsuka, K., et al., J. Immunol. 160, 2539–2545 (1998)).
Statistische Analyse
Die Signifikanz der Ergebnisse wurde mittels Mann-Whitney-Test und Spearman-Rangkorrelation unter Verwendung von GBSTAT-Software (Professional Statistics and Graphics Computer Program, Dynamic Microsystems Inc., Silver Spring, MD, USA) analysiert. Die Erfinder bestimmten das konstitutive und stimulierte TGF-β1, das bei SLE- oder RA-Patienten von PBL produziert worden war, und verglichen diese Werte mit denen der gesunden Kontrollpersonen. Das in den Kulturflüssigkeitsüberständen detektierte Cytokin mittels eines mAb, die die Isoformen 1, 2, & 3, jedoch nicht die Isoformen 2 & 3, erkennt, neutralisiert, wobei das Ergebnis die TGF-β1-Produktion bestätigte. Verglichen mit den gesunden Kontrollpersonen war die konstitutive Produktion von aktivem TGF-β1 bei SLE deutlich herabgesetzt (14 ± 5 gegenüber 56 ± 21 pg/ml, p = 0,02, 5). Anti-CD2 stimuliertes aktives TGF-β1 war ebenso in geringeren Mengen vorhanden (87 ± 22 gegenüber 399 ± 103 pg/ml, p = 0,003). Bei RA war der Mittelwert an konstituivem TGF-β1 ähnlich wie bei SLE (19 ± 5 pg/ml). Nach der Stimulation durch Anti-CD2 lag er zwischen den Werten der gesunden Personen und der SLE-Patienten (197 ± 54 pg/ml).
Das gesamte, von Lymphzyten produzierte, konstitutive TGF-β1 war bei SLE im Vergleich zur gesunden Gruppe ebenso gesunken (286 ± 82 versus 631 ± 185 pg/ml, p = 0,05). Der Wert der RA-Patienten lag zwischen dem gesunden und dem SLE-Wert (435 ± 161 pg/ml). Nach der Zugabe von Anti-CD2 nahm die Gesamtmenge an TGF-β1 bei SLE etwas mehr zu als bei den gesunden Kontrollpersonen, so dass die Unterschiede statistisch nicht signifikant waren. Die Werte der RA-Gruappe lagen wiederum zwischen denen der gesunden und der SLE-Gruppe.
Um eine mögliche Beziehung zwischen herabgesetzten TGF-β1-Spiegeln und Erkrankungsaktivität ausfindig zu machen, verglichen die Erfinder stationäre SLE-Patienten mit ambulant behandelten Patienten. Die klinischen Charakteristika dieser zwei Gruppen sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Stationäre Patienten waren jünger; 5 von 6 zeigten Symptome für weniger als 3 Monate; die Erkrankung war deutlich aktiver; und die meisten hatte schweren SLE mit Nephritis und/oder hämolytischer Anämie. Die ambulante Gruppe hatte im Gegensatz dazu eine chronische Erkrankung, deren Aktivität nach der Behandlung abgenommen hatte. Trotz dieser deutlichen Unterschiede in der Erkrankunsheterogenität, Dauer, Aktivität und Schwere waren bei beiden Gruppen sowohl die konstitutive als auch die stimulierte aktive TGF-β1-Produktion wesentlich niedriger als bei den gesunden Kontrollpersonen (Tabelle 6).
Tabelle 6 Vergleich der TGF-β1-Produktion durch Lymphozyten bei zwei Gruppen von Patienten mit SLE*
Die SLE-Patienten wurden in zwei Gruppen geteilt. Gruppe 1: stationäre Patienten, Gruppe 2: ambulant behandelte Patienten.
p-Werte zeigen den Vergleich zwischen der jeweiligen SLE-Gruppe und den gesunden Kontrollpersonen wie mittels Mann-Whitney-Test bestimmt; † p < 0,05, ≠ p < 0,01.
Auf der Suche nach Korrelationen zwischen den Spiegeln an aktivem und Gesamt-TGF-β1 und der Erkrankungsaktivität, fanden die Erfinder eine negative Korrelation zwischen Anti-CD2-stimulierter Produktion an gesamten TGF-β1 und dem SLEDAI-Index (r = –0,55, p = 0,03), jedoch nicht dem SLAM-Index (–0,43, p = 11). Der SLEDAI-Index ist unter Berücksichtigung des Befalls des Zentralnervensystems und Nierenerkrankungen gewichtet. Somit scheint eine verringerte Fähigkeit der Lymphozyten, die Vorläuferform von TGF-β1 auszuscheiden, mit einer schweren Erkrankung verbunden zu sein. Die aktiven TGF-β1-Spiegel korrelieren nicht mit der Erkrankungsaktivität.
Das wichtigste Ergebnis dieses Beispiels ist, dass die verringerte Produktion an aktivem TGF-β1 bei SLE nicht mit der Erkrankungsaktivität oder -schwere korreliert. Verringerte Mengen an konstitutivem und stimuliertem aktivem TGF-β1 wurden sowohl bei Patienten, bei denen die Krankheit erst ausgebrochen war, als auch bei Patienten mit längerer Erkrankung festgestellt. Darüber hinaus korrelierten die Werte weder mit der Aktivität, die durch die SLAM- und SLEDAI-Indices gemessen wurde, noch mit der Schwere, die anhand des Befalls lebenswichtiger Organe bestimmt wurde. Während die TGF-β1-Gesamtproduktion bei SLE ebenfalls herabgesetzt war, schien dieser Defekt nicht mit der Erkrankungsaktivität zu korrelieren. Dies wurde v.a. bei stationären SLE-Patienten festgestellt. Die Feststellung, dass die TGF-β1-Gesamtproduktion am stärksten mit dem SLE-DAI-Index korrelierte, der unter Berücksichtigung des Befalls der wichtigsten Organsysteme gewichtet ist, legt zudem nahe, dass eine Verbindung mit dem Erkrankungsgrad besteht.
Diese Studie schloss auch eine Kontrollgruppe von RA-Patienten ein, deren Erkrankungsaktivität mit SLE-Patienten mit ausgebildeter Krankheit vergleichbar war. Obwohl die TGF-β1-Werte der RA-Gruppe etwas unter denen der gesunden Kontrollpersonen lagen, mit Ausnahme des konstitutiven aktiven TGF-β1, war das Ausmaß des Defekts nicht so deutlich wie bei SLE und statistisch nicht signifikant.
Zuvor haben die Erfinder berichtet, dass NK-Zellen die Hauptlymphozytenquelle von TGF-β sind und die einzige Lymphozytenpopulation darstellen, die dieses Cytokin in seiner aktiven Form konstitutiv produziert (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)). Es war deshalb von Interesse, herauszufinden, dass die konstitutive Produktion des von NK-Zellen stammenden TGF-β bei SLE herabgeregelt war. Die Erfinder lehrten auch, dass IL-2 sowie TNF-α die Produktion von aktivem TGF-β steigern könnten. Bei SLE ist die Produktion beider Cytokine herabgesetzt (Gray, J. D., et al., J. Exp. Med. 180, 1937–1942 (1994)). Bei den meisten Patienten jedoch konnte die TGF-β-Produktion durch exogenes IL-2 und TNF-α nicht wieder auf eine normales Niveau gebracht werden (Beispiel 2). Die IL-10-Produktion ist bei SLE erhöht (Llorente, L., et al., Eur. Cytokine Network 4, 421 (1993)), und es wurden Korrelationen zwischen den erhöhten Spiegeln und der Erkrankungsaktivität berichtet (Housslau, F. A., et al., Lupus 4, 393–395 (1995); Haglwara, E., et al., Arthritis Rheum. 39, 379 (1996)). IL-10 kann die IL-2-, TNF-α- und TGF-β-Produktion hemmen (Beispiel 2 und Moore, K. W., et al., Ann. Rev. Immunol. 11, 165–190 (1993)). Die Erkenntnis, dass die Produktion an aktivem TGF-β bei Patienten mit gemäßigter sowie aktiver Erkrankung herabgesetzt ist, und dass die Erfinder den Produktionsdefekt durch entgegen wirkendes IL-10 (Beispiel 2) nur teilweise umkehren konnten, legt nahe, dass eine erhöhte IL-10 Produktion alleine nicht für eine herabgesetzte Lymphozytenproduktion von aktivem TGF-β1 bei SLE verantwortlich sein kann. Wahrscheinlich sind mehrere Mechanismen involviert. Es ist wahrscheinlich, dass ein oder mehrere Defekte bei der extrazellulären Umwandlung des latenten Vorläufers zur reifen, aktiven Form diese Abnormalität erklären können.
Obwohl TGF-β gut dokumentierte, hemmende Eigenschaften auf die Lymphozytenvermehrung und Effektor-Zellfunktion aufweist (Letterio, J. J., et al., Ann. Rev. Immunol. 16, 137–162 (1998)), wurde auch über stimulierende Eigenschaften berichtet (Lee, H. M., et al., J. Immunol. 151, 668–677 (1991)). TGF-β moduliert die Cytokin-Produktion durch stimulierte T-Zellen und erhöht seine Produktion. Bei Mäusen aktiviert TGF-β1 selektiv CD8 + T-Zellen sich zu vermehren (Lee, H. M., et al., J. Immunol. 151, 668–677 (1991)), und erhöht die Reifung naiver Zellen zu Gedächtnis-T-Zellen (Lee, H. M., et al., J. Immunol. 147, 1127–1133 (1991)). Bei Menschen regt TGF-β1 Effektor-T-Zellen wirksam an (Cerwenka, A., et al., J. Immunol. 153, 4367–4377 (19941). Während für immunsuppressive Wirkung große Mengen (Nanogramm/ml) notwendig sind, haben die Erfinder gezeigt, dass für die Mitstimulation der CD8+ T-Zellen zu senkenden Effekten auf die Antikörperproduktion nur geringe Mengen (Picogramm/ml) erforderlich sind (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)).
Diese Untersuchungen legen nahe, dass, während eine verringerte Lymphozyten-Sekretion des latenten Vorläufers von TGF-β1 als Konsequenz der Erkrankungsaktivität entstehen kann, die herabgesetzte aktive TGF-β1-Produktion bei SLE komplexer. ist und durch mehrere unterschiedliche Mechanismen verursacht werden kann. Die Erfinder haben nahe gelegt, dass das Programmieren naiver T-Zellen, die Antikörperproduktion zu senken, die Gegenwart von pg/ml-Mengen an aktivem TGF-β zum Zeitpunkt ihrer Aktivierung notwendig macht, und verfügen über Beweise, die dies unterstützen (Gray, J. D., et al., J. Immunol. 160, 2248-2254 (1998)). Daher könnte ein Fehlen von picomolaren Mengen an aktivem TGF-β in der lokalen Umgebung zu einem kritischen Zeitpunkt möglicherweise für eine ineffektive T-Zellen-Regulationsfunktion, die B-Lymphozyten-Aktivität bei SLE zu kontrollieren, verantwortlich sein.
Beispiel 3
Behandlung von SLE mit Mitogenen
Bei diesem Beispiel ist die IgG-Produktion dadurch gesenkt, dass die Zellen mit einer Hemmzusammensetzung, die ein Mitogen wie Con A umfasst, behandelt sind. Die Zellen werden wie in den obigen Beispielen erläutert hergestellt, und anschließend mit Mitogenen inkubiert, um die Population an Zellen zu erhöhen, die die Antikörperproduktion herabsetzen. In diesem Fall sind die Zellen mit physiologischen Konzentrationen von Con A für 4 bis 72 h mittels Standardinkubationsverfahren inkubiert. Die Konzentration von Con A kann von etwa 0,01 bis etwa 10 Mikrogramm/ml reichen, wobei derzeit 1 Mikrogramm/ml bevorzugt wird. Con A ist bei Sigma (St. Louis, MO, USA) erhältlich.
Obwohl nicht bekannt ist, wie die Mitogene wirken, wird geglaubt, dass sie die Produktion von TGF-β durch Monozyten bei der PBMCs-Zubereitung anregen, und das TGF-β dann bei den T-Zellen bewirkt, zu Antikörper-Suppressorzellen zu werden.
Die Zellen werden dann, falls notwendig, gewaschen und in den Patienten rücktransplantiert.
Beispiel 4
Behandlung der Zellen mit einem Gemisch aus Cytokinen und Mitogenen
In diesem Beispiel ist die IgG-Produktion durch eine Behandlung der Zellen mit einer Hemmzusammensetzung herabgesetzt, die ein Gemisch aus Cytokin und Mitogen umfasst. Die Zellen werden wie in den obigen Beispielen erläutert zubereitet, und anschließend mit dem Gemisch für 4 bis 72 h mittels Standardinkubationsverfahren inkubiert, um die Population an Zellen zu erhöhen, die die Antikörperproduktion senken, wie z. B. physiologische Konzentrationen von Con A, IL-2 und TGF-β, oder Con A und IL-2.
Nachdem die Zellen mit den Cytokinen und Mitogen inkubiert worden sind, werden sie mit HBBS gewaschen, um jegliches Cytokin und Mitogen, das in der Lösung vorhanden ist, zu entfernen. die Zellen werden nun in 200–500 ml HBBS suspendiert und in das Säugetier zurückgeführt.

Claims

Verwendung von einkernigen Peripherblutzellen (PBMCs), die mit IL-2 oder TGF-β behandelt wurden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Verwendung einer Hemmzusammensetzung, die IL-2 oder TGF-β umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, worin das Medikament hergestellt wird, indem die Hemmzusammensetzung mit einkernigen Peripherblutzellen in Kontakt gebracht wird, die einem Patienten abgenommen wurden, bei dem eine Autoimmunerkrankung diagnostiziert worden ist, und worin das Medikament dem Patienten erneut zugeführt wird, um die Autoimmunerkrankung zu unterdrücken.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Hemmzusammensetzung IL-2 umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Hemmzusammensetzung TGF-β umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Hemmzusammensetzung weiters einen CD2-Aktivator umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Hemmzusammensetzung TGF-β und einen CD2-Aktivator umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Hemmzusammensetzung IL-2 und TGF-β umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Hemmzusammensetzung IL-2, TGF-β und einen CD2-Aktivator umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 9, worin der CD2-Aktivator ein Anti-CD2-Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 9, worin der CD2-Aktivator Anti-CD2-Antikörper umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6, 7 oder 9, worin der CD2-Aktivator CD2-Ligand LFA-3 ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Zellen an CD4+ T-Zellen angereichert sind.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Zellen an CD8+ T-Zellen angereichert sind.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist.