JP2001523443A - 病的免疫応答を抑制するサイトカインおよびマイトジェンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)サンプル中における組成物(例えば、阻害剤としてＩＬ-２またはＴＧＦ-βを含む)の細胞への添加による、免疫グロブリン産生のエキソビボ阻害方法である。また、本発明は、例えば、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)などの自己免疫疾患を、患者に処置細胞を再誘発させて処置する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は一般的に、抗体仲介自己免疫疾患を処置する方法に関する。

【０００２】 （背景技術） 自己免疫疾患は、自己か自己でないかを識別する免疫システムの機能不全によ
っておこる。これらの疾患で、免疫系は自己組織に対して作用し、その応答は最
終的に炎症や組織損傷をもたらす。自己免疫疾患は２つの基本的部類に分類され
る：全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧
血、血小板減少性紫斑病、グレーブス病、シェーグレン症および皮膚筋炎などの
抗体仲介疾患と、橋本病、多発性筋炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、真性糖尿
病、慢性関節リウマチおよび硬皮症などの細胞仲介疾患である。

【０００３】 多くの自己免疫疾患において、組織損傷は抗体の元の組織に対する産生によっ
て引き起こされる。この抗体は自己抗体と言われている。哺乳動物によって産生
され、哺乳動物自体の組織に対する結合部位を持つためである。この異常のうち
いくつかは、循環する抗体量の特有な漸増と漸減を有し、やがて徴候に変化をも
たらす。

【０００４】 抗体仲介自己免疫異常の種々のタイプの中でもＳＬＥは充分研究され考証され
ている異常である。ＳＬＥは一般化した自己免疫の異常であり、核、細胞質およ
び細胞表面の抗原に対する様々な自己抗体でのＢ細胞の活動過多を特徴とする。
この自己免疫疾患は、遺伝的および環境的な促進因子による多因性病原を有する
(参照：Hahn, B.H., Dobois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 69-7
6 (D.J. Wallace et al. ads., Williams and Wilkins, Baltimore))。ＳＬＥで
説明されている多数のリンパ球欠損は、調節Ｔ細胞の機能不全であり、Ｂ細胞の
機能を抑制する(Horwitz, D.A., Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997
), pp. 155-194 (D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimor
e))。調節Ｔ細胞は、胞溶解性またはサイトカイン仲介メカニズムによる抗体合 成を下方制御する。後者はトランスフォーミング成長因子-β(ＴＧＦβ)と他の 抑制的サイトカインを必要とする(Wahl, S.M. (1994), J Exp Med 180:1587-190
)。 循環Ｂリンパ球自発的分泌Ｉｇは、活動性ＳＬＥの患者で増加する(Klinman
, D.M. et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404-1410)。インビトロ中でポリ クローナルＩｇＧおよび自己抗体を持続的に産生するには、Ｔ細胞の助力が必要
である(Shivakumar, S. et al. (1989), J Immunel 143:103-112)。

【０００５】 ＳＬＥの臨床的症状は、発疹(特に、顔面の蝶型紅斑)、糸球体腎炎、肋膜炎、
心膜炎および中枢神経系関与がある。患者の大部分は女性であり、比較的若い( 診断時の平均年齢は２９才である)。

【０００６】 ＳＬＥに対する処置は臨床的症状によって変わる。穏やかな臨床症状である患
者は、非ステロイド性抗炎症剤等の簡単な処置で効き目がでる。しかしさらに重
い症状に対しては、通常、プレドニゾンなどの強い抗炎症性および免疫抑制作用
をもつステロイドが必要となる。他の強力な免疫抑制剤として、アザチオプリン
とシクロホスファミドを使用することができる。ステロイドおよび他の免疫抑制
剤は、哺乳動物の免疫システムが全体的に低下するために副作用が生じる。現在
、ＳＬＥに対する理想的な処置はなく、疾患を治すことができない。

【０００７】 現在、ＳＬＥに対する感受性または抵抗性を高める遺伝子の同定、疾患を引き
起こす抗原性決定子の同定、生存かアポトーシスかを決定づけるＴ細胞活性化の
分子メカニズム、Ｔ細胞の機能を決定するサイトカイン、および自己抗体を形成
するＢ細胞の特性が、かなり注目されている。ＳＬＥのＴ細胞調節不全について
多くの例証が叙述されている(参照：Horwitz, D.A. et al., Duobois’Lupus Er
ythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83-96 (D.J. Wallace et al. ads., Wiliam
s and Wilkins, Baltimore)。あるリンパ球の一次役割が免疫応答の下方調節で あることは充分認められているが、これらの細胞の産生で必要とされる同一性お
よびメカニズムの解明は進んでいない。

【０００８】 インターロイキン-２(ＩＬ-２)は、これまで抗原非特異的Ｔ促成遺伝子細胞の
産生で重要な役割を果たすと考えられている。マウスに与えられる抗-ＩＬ-２抗
体(移植片対宿主病の誘導物と一致する)はＳＬＥの特色をもたらす(Via, C.S. e
t al. (1993), Intemational Immunol. 5:565-572)。ＩＬ-２が抑制の産生にお いて直接的または間接的に重要であるかどうかが議論されている(Fast, L.D. (1
992), J. Immunol. 149:1510-1515; Hirohata, S. et al. (1989), J. Immunol.
142.3104-3112; Baylor, C.E. (1992), Advances Exp. Med. Biol. 319:125-13
5)。最近、ＩＬ-２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞中で非分解メカニズムによりＨＩＶ応答 を促成するＣＤ８＋細胞を誘発することがわかった。この効果はサイトカイン仲
介であるが、特定のサイトカインは同定されていない(Kinter, A.L. et a1. Pro
c. Nalt Acad. Sci. USA 92:10985-10989; Barker, T.D. et al. (1996), J. Im
munol. 156.4478-4483)。ＩＬ-２のＴ細胞産生はＳＬＥで減少する(Horwitz, D.
A. et al. (1997), Dubois' Lupus Erythematosus, 5th Ed. (1997), pp. 83-96
, D.J. Wallace et al. eds., Williams and Wilkins, Baltimore)。

【０００９】 ＳＬＥ患者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞は、ポリクローナルＩgＧ産生を抑制するよ りむしろ維持する(Linker-Israeli, M. et al. (1990), Arthritis Rheum. 33:1
216-1225)。健康な提供者のＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激してＩg産生を強めることがで
きる(Takahashi, T. et al. (1991), Clin. Immunol. Immunopath. 58:352-365)
。しかしＩＬ-２またはＣＤ４＋Ｔ細胞のどちらも、それ自体では強力な抑制活 性を発生させるＣＤ８＋Ｔ細胞を産出しないことがわかった。ＮＫ細胞を培地に
含めると、強力な抑制活性が現われた(Gray, J.D. et al. (1994) J. Exp. Med.
180:1937-1942)。培地中のＮＫ細胞の働きは、トランスフォーミング成長因子 ベータ(ＴＧＦβ)を活性形態で産出するものと考えられる。非免疫抑制(２-１０
pg/ml)濃度のサイトカインは、ＩgＧおよびＩgＭ産生に対する強力な抑制効果を
産生するための補助因子として働くことが見出された(Gray, J.D. et al (1994)
J. Exp. Med 180:1937-1942)。加えて、ＮＫ細胞は非刺激リンパ球でＴＧＦβ の主要源であると考えられる(Gray, J.D. etaL (1998), J. Immunol. 160:2248-
2254)。

【００１０】 ＴＧＦβは、組織修復、炎症および免疫調節における重要なサイトカインの多
機能性系統群である(Massague, J. (198O), Ann. Rev. Cell Biol. 6:597)。Ｔ ＧＦβは、他の大部分のサイトカインと異なり、その放出タンパク質が生物学的
に不活性であり、特定のレセプターと結合することができない(Sporn, M.B. et
al. (1987) J. Cell Biol. 105:1039-1045)。潜在の複合体が細胞外で切断され 、以下に記すように活性サイトカインを放出する。ＴＧＦβの応答は単核細胞に
偏在する２つの表面レセプター(ＴＧＦβ-Ｒ１とＴＧＦβ-Ｒ２)の相互作用を必
要とする(Massague, J. (1992), Cell 69:1067-1070)。従って、潜在型の活性Ｔ
ＧＦβへの変化は、サイトカインの生物学的効果を決定する重大な段階である。

【００１１】 ＳＬＥ患者はＮＫ細胞によるＴＧＦβの産生が減少することが分かっている。
ＮＫ細胞により産生される構成ＴＧＦβの欠損および誘導されたＴＧＦβの欠損
は、３８人のＳＬＥ患者についての研究で報告されている(Ohtsuka, K. et al.
(1998), J. Immunol. 160.2539-2545)。興味深いことに、組換え型ＩＬ-２、Ｔ ＮＦ-アルファまたはＩＬ-１０拮抗作用物の何れを加えても、ＳＬＥでのＴＧＦ
β欠損を正常化することはできなかった。ＳＬＥでのＴＧＦβ産生の減少は、疾
病の活性と相関しておらず、従って、初期の欠損かも知れない。

【００１２】 ＳＬＥ患者をＴＧＦβ、ＩＬ-２またはその両方の組合せで処置する全身的な 投与は、深刻な副作用を引き起こす。これらのサイトカインは、種々の体組織に
対して非常に多くの影響を与えるので、患者に全身的に送達するのはあまり安全
ではない。従って、本発明の対象は、自己抗体調節制御に応答し、自己抗体産生
を下方制御する細胞集団を増加させる哺乳類細胞を処置する方法およびキットを
提供することである。

【００１３】 （本発明の要旨） ここに概略する目的のように、本発明は、生体外の末梢血単核細胞 (ＰＢＭＣ
)のサンプル中のＩｇ産生を阻害する方法であって、細胞集団に阻害組成物を添 加することを含む方法を提供する。

【００１４】 更なる態様では、本発明は、患者の自己免疫疾患を処置する方法を提供する。
その方法は、患者由来の末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を患者から取り出すこと、お
よびこの細胞を阻害組成物で、Ｉｇ産生を抑制するかまたは調節Ｉｇ産生の減少
を刺激もしくは誘発するのに十分な時間、処理することを含む。次いで、細胞を
患者に再導入すると、自己免疫の症状が改善する。阻害組成物は、好ましくは、
ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組み合わせを含む。

【００１５】 更なる態様では、本発明は、患者の自己免疫疾患の処置用キットを提供する。
そのキットは、抗体仲介自己免疫疾患の患者の細胞を受容するのに適当な細胞処
置容器および少なくとも１用量の阻害組成物を含む。

【００１６】 （図面の簡単な説明） 図１によって示されるのは、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２およびＴＧＦ-β
と共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリン産生が減少す
ることである。ＰＢＭＣ(２×１０⁵／ｗｅｌｌ)を、ＡＩＭ-Ｖ血清を含まない培
地であって、ＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)およびＴＧＦ-β(１０ｐｇ/ｍｌ)を含むか 、または含まない培地中で培養した。３日後、ウェルを３回洗浄し、新たなＡＩ
Ｍ-Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清をウェルから回収し、ＩｇＧ成分をＥＬ ＩＳＡで測定した。

【００１７】 図２によって示されるのは、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの両方により、自発的Ｉ
ｇＧ産生が有意に減少することである。その値は、図１の説明に記載の通りに培
養した１２人のＳＬＥ患者のＰＢＭＣにより産生した平均±ＳＥＭのＩｇＧ(μ ｇ／ｍｌ)を示す。ただし、ＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)のみ、またはＴＧＦ-β(１０
ｐｇ/ｍｌ)のみで培養した細胞もある。

【００１８】 図３Ａおよび３Ｂによって示されるのは、抗ＴＧＦ-βがＩＬ-２の効果を逆転
することである。ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、３日間、ＩＬ-２(１０Ｕ/ｍｌ)の存
在下(黒色バー)、または非存在下(灰色バー)で培養した。これらの培養液中に含
まれていたのは、培地、抗ＴＧＦ-β(１０μｇ/ｍｌ)または対照マウスＩｇＧ１
(１０μｇ/ｍｌ)であった。３日後、ウェルを洗浄し、新たなＡＩＭ-Ｖ培地を加
えた。更に７日後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩｇＧ(図３Ａ)または抗ＮＰ( 図３Ｂ)成分を検定した。

【００１９】 図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃによって示されるのは、抗体産生におけるＤＣ８＋Ｔ
細胞の調節効果である。(Ａ)健康人のＩｇＧ産生の抑制におけるＮＫ細胞とＣＤ
８＋細胞の相乗作用。ＣＤ４＋細胞およびＢ細胞を抗ＣＤ２で刺激し、ＣＤ８＋
細胞およびＮＫ細胞の効果を調べた。ＮＫおよびＣＤ８＋細胞の組み合わせは、
我々が以前報告した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248-2254;
Gray, J.D. et al., (1994), J Exp Med 180; 1937-1942)抗ＣＤ２誘発性ＩｇＧ
産生を顕著に阻害した。(Ｂ)ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞はＳＬＥにおけるＩｇ
Ｇ合成を促進する。健康人の活動性ＳＬＥおよび休止Ｂ細胞と共に患者のＣＤ４
＋細胞が、抗ＣＤ２で刺激された。ＳＬＥ ＣＤ８＋細胞によるＩｇＧ産生の促 進は、ＮＫ細胞の添加により顕著に増加した。(Ｃ)ＳＬＥにおけるＣＤ８＋Ｔ細
胞機能のサイトカインによる正常化。図４Ｂに示す研究と平行して、この患者の
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下または非存在下、抗ＣＤ２で刺激し
た。指示された場合にＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)および／またはＴＧＦ-β(２ｐｇ ／ｍｌ)を加えた。これらサイトカインにより、ＣＤ８＋細胞の助力効果が喪失 し、その細胞がＩｇＧ産生の７５％を阻害した。

【００２０】 図５Ａおよび５Ｂによって示されるのは、非刺激性細胞および抗ＣＤ２刺激性
細胞によるＴＧＦ-β１のリンパ球産生である。健常者ドナーならびにＳＬＥ患 者およびＲＡ患者のＰＢＬを、マイクロタイタープレートに１×１０⁵／ウェル で加えた。幾つかのウェルは、抗ＣＤ２ｍＡｂｓＧＴ２(１：４０)およびＴ１１
(１：８０)であった。３７℃で２日後、上清を回収し、活性ＴＧＦ-β１および 全ＴＧＦ-β１を検定した。有意なｐ値を示す。

【００２１】 本発明は、全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）などの抗体仲介自己免疫疾患を処
置する方法に関し、患者から細胞を取り出し、Ｂ細胞の過剰活性を下方調節する
組成物でもって患者を処置し、自己抗体などのＩｇ抗体の産生を阻害し、自己免
疫疾患を改善する方法に関する。この方策は、抗炎症剤や免疫阻止剤を使用する
現在のほとんどすべての処置形態と異なっている。普通よく用いられるコルチコ
ステロイドは、サイトカインの産生を抑制し、組織の損傷を起こす最終事象を阻
止するが、基にある自己免疫応答を一般に変えることはない。細胞障害剤または
モノクローナル抗体などの実験的に遺伝子工学的に処理された生物剤も、特殊な
リンパ球集団をなくするか、その機能を妨害する。これらの薬剤は、一般に緩和
な効果をもたらすのみであって、また重大な有害副作用を起こす。ある種のサイ
トカインは、患者に全身的に与えられるが、重大な有害副作用の関連する広範な
作用を有している。

【００２２】 一方、本発明の方法による治癒効果では、正常な調節細胞機能が回復し、免疫
系が「再置」される。本方法の他の重要な利点は、重大な有害副作用があまり起
きないことである。サイトカインなどの阻害組成物のごく少量を患者に戻すにす
ぎないので、毒性が最小となる。

【００２３】 ＩｇＧを自発的に分泌する循環Ｂリンパ球が活動性ＳＬＥの患者で増加する（
Blaese, R.M., et al.(1980), Am J. Med. 69: 345-350; Klinman, D.M. et al.
(1991) Arthritis Rheum 34: 1404-1410）。インビトロでのポリクローナルＩｇ
Ｇおよび自己抗体の持続的な産生には、Ｔ細胞の助けを必要とする（Shivakumar
, S. et al.(1989), J Immunol 143: 103-112）。自発的ＩｇＧ産生のＴ細胞に よる調節についての以前の研究によると、健常人ではＣＤ８＋Ｔ細胞が抗体産生
を阻害するのに対し、ＳＬＥではこの細胞が代りにＢ細胞機能を支持する（Link
er-Israeli, M. et al.(1990), Arthritis Rheum 33: 1216-1225）。

【００２４】 従って、本発明は抗体仲介自己免疫疾患を処置する方法に関し、自己免疫疾患
の患者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取りだし、その細胞を阻害組成物で処
置する。

【００２５】 理論に拘束されるわけでないが、本発明方法が作動するには、いくつかのやり
方がある。その第１は、阻害組成物で細胞を処置すると、処置細胞におけるＩｇ
産生が直接抑制され、自己免疫症状の改善につながる。あるいは、または加えて
、細胞の処置は調製細胞を誘導して、他の細胞におけるＩｇ産生の下方調節する
。 本明細書におけるＩｇはすべての形態のＩｇ、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ
などを含む。正味の結果は系におけるＩｇ量の低下である。

【００２６】 このように、本発明は、自己免疫疾患の患者からの末梢血Ｔ細胞の能力を回復
し、この細胞を阻害組成物で生体外で処置することにより抗体産生を下方調節す
る。

【００２７】 従って、本発明は患者の抗体仲介自己免疫疾患を処置する方法を提供する。「
抗体仲介自己免疫疾患」とは、個体が自己の細胞または組織の構成成分に対する
抗体を発生する疾患を意味する。抗体仲介自己免疫疾患には、限定するのではな
いが、全身性エリマトーデス（ＳＬＥ）、天疱瘡、重症筋無力症、溶血性貧血、
血小板減少性紫斑症、グレーブス症、皮膚真菌症、シェーグレン症などがある。
本発明方法による処置に好適な疾患はＳＬＥである。

【００２８】 自己免疫疾患の「処置」とは、自己免疫疾患の少なくとも１つの症状が、本明
細書に記載の方法で改善されることである。その評価は、種々の方法でなされ、
患者側の主観的または客観的な因子を含む。例えば、疾患の免疫原性徴候が調べ
られる。例えば、自発的Ｉｇ抗体および自己抗体産生のレベル、ＳＬＥの場合は
特にＩｇＧ産生のレベルが低下する。全Ｉｇ抗体または自己抗体のレベルが測定
される。限定するものでないが、抗２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）抗体、抗核タン
パク質抗体、抗Ｓｍ、抗Ｒｈｏおよび抗Ｌａである。身体症状が変化する。例え
ば、ＳＬＥの皮疹の消失または減少である。腎機能検査を行って変化を調べる。
炎症に関する組織障害について臨床検査を行う。循環免疫複合体レベルおよび血
清補体レベルの低下も改善の証拠である。ＳＬＥの場合、貧血の減少も見られる
。免疫抑制剤などの薬剤に対する患者の必要性が低下することも処置効果の証で
ある。処置効果について判定方法は、自己免疫疾患分野の当業者にとって明らか
であろう。

【００２９】 「患者」とは、処置の対象となる哺乳動物を意味するが、ヒトが好ましい。あ
る場合において、本発明方法は、実験動物、獣性学分野、疾患モデル動物にも使
用され、これらの動物には、限定ではないが、マウスラット、ハムスターなどの
ゲッシ類および霊長類がある。

【００３０】 本発明では、患者から血液細胞を取り出す。一般に、標準的な方法で患者から
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を取り出す。「末梢血単核細胞」すなわち「ＰＢＭ
Ｃ」とは、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）および単球を意味する。
詳しく下記するように、阻害組成物の主要な作用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＧ産生
を抑制することである。好ましくは、ＰＢＭＣのみを採取する。赤血球または多
形核白血球を患者に残すようにするか、これらを患者にもどす。これは既知の方
法、例えば、白血球分析法(leukophoresis)で行う。一般に５から７リットルの 白血球分析法の工程がなされる。患者からＰＢＭＣを基本的に採取するには、他
の血液成分を戻す。細胞サンプルの採取は、ヘパリンなど抗凝固剤の存在下で、
既知方法により行われる。

【００３１】 一般に、ＰＢＭＣ含有のサンプルは、種々の方法であらかじめ処理される。ま
ず細胞を採取し、次いで採取に際して自動的に濃縮されていなければ、濃縮し、
さらに精製および／または濃縮する。細胞を水洗し、計数し、緩衝液に入れる。

【００３２】 ＰＢＭＣは、標準的方法で処置のためには濃縮する。好ましい態様において、
白血球分析法の採取工程によってＰＢＭＣの濃縮サンプルが無菌の血球パックに
得られ、ある種の試薬および／または阻害組成物を含有する。詳しくは下記する
。一般に、追加の濃縮／精製工程が行なわれる。既知のＦicoll−Ｈypaque密度 勾配遠心法などである。

【００３３】 好ましい態様において、ＰＢＭＣを洗い、血清タンパク質および溶性血液成分
、例えば自己抗体、阻害剤などを既知方法で取り出す。一般に、生理媒質または
緩衝液が加えられて、遠心法が行なわれる。必要に応じて繰り返す。ＰＢＭＣを
生理培養液、好ましくはＡＩＭ−Ｖ血液なしの培地（Ｔechnologie）に再懸濁す
るが（血清がかなりの量の阻害剤を含有するので）、Ｈanksバランス塩溶液（Ｈ
ＢＢＳ）や生理塩緩衝液（ＰＢＳ）も使用される。

【００３４】 一般に、次いで細胞数を数える。一般に１×１０⁹から２×１０⁹の白血球を５
−７リットルの白血球分析法の工程から採取する。これらの細胞を大略２００ｍ
ｌの緩衝液または培地に移す。

【００３５】 好ましい態様において、ＰＢＭＣは１以上の細胞型を富ます。例えば、ＰＢＭ
ＳはＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を富ます。このことは既知である（Gr
ay et al.(1998),J.lmmunol.160:2248,出典明示により本明細書の一部とする。 ）。一般に、これは市販の免疫吸収カラムを用いるか、研究的方法で行なわれる
（ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え、溶出の非接着細胞をＣＤ４、ＣＤ１
６、ＣＤ１１６、ＣＤ７４に対する抗体で処理し、免疫磁気ビードで処理して、
ＣＤ８＋Ｔ細胞に富んだ集団を取る）。

【００３６】 細胞に必要な前処理を一旦ほどこしてから、細胞を阻害組成物で処置する。「
処置」とは、細胞を阻害組成物と共に十分な時間でインキュベートし、Ｉｇおよ
び自己抗体産生を阻害する能力が、特に患者にもどしたときに、発生するように
する。インキュベーションは一般に生理的温度で行なわれる。上記したように、
阻害が起きるのは、処置細胞によるＩｇ産生の直接的抑制の結果か、患者リンパ
臓器におけるＩｇ産生を下方調節する調節細胞の誘導の結果である。

【００３７】 「阻害組成物」、「Ｉｇ産生阻害組成物」または「液素性阻害組成物」は、自
発的Ｉｇおよび自己抗体産生を阻害し得る組成物を意味する。一般に、これらの
組成物はサイトカインである。適切な阻害組成物には、限定でないが、ＩＬ−２
、ＴＧＦ−β、ＣＤ２アクチベーター、例えば、抗ＣＤ２抗体およびＣＤ２リガ
ンド、ＬＦＡ−３、およびこれらの混合物や組合せ物がある。好ましい阻害組成
物はＩＬ−２とＴＧＦ−βの混合物である。

【００３８】 阻害組成物の濃度は、組成物の性質によって変ってくる。好ましい態様におい
ては、ＴＦＧ−βが阻害組成物として用いられる。「形質転換成長因子−β」す
なわち「ＴＧＦ−β」は、ＴＧＦ−βファミリーのいずれか１つを意味する。３
種のイソ型、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３がある。参照、Massag
ue,J.(1980),J.Ann.Rev.Cell Biol 6:597。リンパ球および単球は、このサイト カインのβ１のイソ型である(Kehrl,J.H.et al.(1991),lnt J Cell Cloning 9:4
38-450)。ＴＧＦ−βは、処置される哺乳動物に対して活性であるＴＦＧ−βの すべての型であり得る。ヒトでは、組換えＴＦＧ−βが現在のところ好ましい。
好ましいヒトＴＧＦ−βは、Genzyme Pharmaceuticals，Farmington，MA．から
購入できる。一般に、ＴＧＦ−βの濃度は、細胞懸濁液の約２picogram／ｍｌか
ら約２nanogramであって、約１０ｐｇから約５００ｐｇが好ましく、約５０ｐｇ
から約１５０ｐｇが特に好ましく、１００ｐｇが理想的である。

【００３９】 好ましい態様において、ＩＬ−２が阻害組成物として用いられる。ＩＬ−２は
、処置される哺乳動物に対して活性であるＩＬ−２のすべての型であり得る。ヒ
トでは組換えＩＬ−２が現在のところ好ましい。組換えＩＬ−２はCetus，Emerv
ille、CA.から購入できる。一般に、使用されるＩＬ−２の濃度は、細胞懸濁液 の約１Ｕnit／ｍｌから約１００Ｕ／ｍｌであり、約５Ｕ／ｍｌから約２５Ｕ／ ｍｌが好ましく、１０Ｕ／ｍｌが特に好ましい。好ましい態様においてＩＬ−２
は単独では用いられない。

【００４０】 好ましい態様において、抗ＣＤ２抗体またはＣＤ２リガンドＬＦＡ−３などの
ＣＤアクチベーターは、阻害組成物として用いられる。ＣＤ２はＴリンパ球によ
り発現される細胞表面グリコタンパク質である。「ＣＤ２アクチベーター」とは
、ＣＤ２情報伝達経路を開始する化合物を意味する。好ましいＣＤ２アクチベー
ターには、抗ＣＤ抗体（OKT11,American Type Culture Collection,Rockville M
D）が含まれる。一般に、ＣＤ２アクチベーターの濃度は、ＴＧＦ−βの産生を 誘導するのに十分なものである。抗ＣＤ２抗体の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌから約
１０μｇ／ｍｌの範囲にあり、約１０ｎｇ／ｍｌから約１００ｎｇ／ｍｌが特に
好ましい。

【００４１】 阻害組成物での処置に加えて、いくつかの態様においては、細胞を活性化する
ためにマイトジェンの使用が望まれる。すなわち、多くの残留相細胞は多量のサ
イトカイン受容体を含有していない。Ｃonca navalinＡなどのマイトジェンを 使用すると細胞が刺激されて、サイトカイン受容体が産生し、本発明方法をさら
に効果的にする。ＣonＡなどのマイトジェンを用いるとき、既知方法で知られて
いるように、その濃度範囲は１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌである。さらに
、既知方法のように、ＣｏＡを離す成分、例えばα−メチルマンノシッドと共に
細胞を洗うのが望ましい。

【００４２】 阻害組成物を細胞と共に、効果を発揮するに十分な時間インキュベートする。
好ましい態様において、細胞の阻害組成物での処置に続いて、すぐに患者にもど
す。すなわち、好ましい態様において、細胞と阻害組成物とのインキュベーショ
ンは、約１２から約１２０時間行なわれる。約２４から約７２時間が好ましく、
４８時間が特に好ましい。

【００４３】 ある態様において、細胞を一定の時間インキュベートし、水洗して阻害組成物
を除去し、再びインキュベートする。患者に導入する前に、ここに概記したよう
に細胞を好ましくは水洗し、阻害組成物を除去する。試験すなわち検査のために
、さらなるインキュベーションも行うことができ、数時間から数日間である。患
者への導入前にＩｇ産生の検査をしょうとするときは、細胞を数日間インキュベ
ートすると、Ｉｇ産生（またはその非産生）が明らかになる。

【００４４】 細胞を一旦処置して、患者に自動的に再移行する前に細胞を検査することがで
きる。例えば、細胞を採取して行う。無菌検査、グラム染色、微生物学的検査、
ＬＡＬ試験、マイコフラズマ検査、細胞型同定のためのフローサイトメトリー、
機能検査などである。同様に、これらの検査などの試験を処置の前や後に行うこ
とができる。

【００４５】 好ましい態様において、Ｉｇ産生の定量や定性（すなわちタイプについて）が
なされる。例えば、Ｉｇの全レベルあるいはＩｇの具体的なタイプが調べられる
。例えば、ＩｇＧやＩｇＭなどのＩｇ類、ＩｇＧ抗ＤＮＡ自己抗体、抗核タンパ
ク質（ＮＰ）抗体などの具体的なタイプについてである。

【００４６】 好ましい態様において、Ｉｇ特にＩｇＧのレベルの検査がＥＬＩＳＡアッセイ
などの既知の方法（Abo et al.(1987),Clin Exp.lmmunol.67:544 and Linker-Is
raeli et al.(1990),Arthritis Rheum 33:1216, 出典明示により本明細書の一部
とする。）で行なわれる。これらの技術は自己抗体などの具体的な抗体のレベル
を検出するのにも用いられる。

【００４７】 好ましい態様において、処置によって産生ＩｇＧおよび自己抗体の量の顕著な
低下が起きる。低下は、少なくとも１０％が好ましく、少なくとも２５％が特に
好ましく、少なくとも５０％が特別に好ましい。多くの態様において７５％以上
の低下がみられる。

【００４８】 好ましい態様において、移行前に全または活性のＴＧＦ−βの量も検査できる
。記載のように、ＴＧＦ−βは移行後に活性化される潜在的前駆物質としてつく
られる。

【００４９】 処置後、細胞を患者に移行すなわち再導入する。一般に既知のよう行なわれ、
通常は静脈投与によって処置細胞を患者に注入すなわち導入する。例えば、無菌
シリンジなどの移行手段を用いて注射により５０ｍｌのＦenwall注入バッグに細
胞を入れる。次いで細胞をすぐに静脈投与によって一定の時間、例えば、１５分
間で患者の自由に流れている静脈に注入する。ある態様では、緩衝剤や塩などの
追加の試薬も加え得る。

【００５０】 細胞を患者に再導入後に、処置の効果を所望に応じて、上記の方法で検査でき
る。すなわち、疾患の免疫原性徴候が検査される。例えば、全Ｉｇまたは特殊な
免疫グロブリンの力価、腎機能、組織障害などが検査される。

【００５１】 処置は必要に応じて繰り返えされる。例えば、数週の期間で週１回、または時
間の期間で数回、例えば、２週間に３−５回なされる。一般に、自己免疫疾患の
症状の改善はなんらかの期間、好ましくは少なくとも数カ月続く。その間に、患
者が症状の再起を感じると、その時点で処置が繰り返される。

【００５２】 好ましい態様において、本発明方法を実行ため、すなわち細胞を阻害組成物と
共にインキュベートするためのキットを提供する。キットはいくつかの成分を含
有する。キットは、抗体仲介自己免疫疾患の患者からの細胞を受容するのに用い
られる細胞処置容器を含む。この容器は無菌である。ある態様において細胞処置
容器は、細胞の採取に用いられる。例えば、入口を介して白血球分析法と共に用
いられる。他の態様では、離した細胞採取容器が用いられる。 細胞処置容器の形および材質は様々であり、当業者によく知られている。一般
に、容器はいくつかの異なる形態を取る。例えば、ＩＶバッグのような柔かいバ
ッグであり、または細胞培養器のような硬い容器である。攪拌できるようになっ
ている。一般に、容器の材質は何でもよいが、生物学的に非活性の物質であり、
例えばガラス、ポリプロピレンやポリエチレンなどを含むプラスチックである。
細胞処置容器は１以上の入口または出口を有し得る。細胞、試薬阻害組成物など
の導入または除去のためのものである。例えば、容器は、患者に再導入する前の
分析のために細胞のフラクションを採取するサンプル採取口を有する。同様に、
容器は、患者に細胞を導入するための出口を有する。例えば、容器はＩＶ装置に
つけるためのアダプターを含み得る。

【００５３】 キットは阻害組成物の少なくとも１つの用量を含む。本明細書での「用量」と
は、サイトカインなどの阻害組成物の１つの量で、作用を発揮するのに十分な量
を意味する。ある場合には、複数量が含まれる。ある態様において、用量の細胞
処置容器への添加は入口を介して行なわれる。あるいは好ましい態様において、
用量は細胞処置容器にすでに存在している。好ましい態様において、用量は安定
性のために乳濁形態にあり、細胞培養液や他の試薬を用いて再生される。

【００５４】 ある態様において、キットは少なくとも１種の試薬を追加的に含む。それには
緩衝液、塩、培養液、タンパク質、薬剤などがある。例えば、マイトジエンが追
加的に含まれ得る。ある態様において、キットはその使用に際しての説明書を追
加的に含む。

【００５５】 下記の実施例は、上記の本発明をより完全に記述したものであり、また、本発
明の種々の態様を実施するために考えられる最上の方法を記述した。これらの実
施例は本発明の範囲を限定するものでなく、説明の目的のために提示される。出
典明示されたすべての引用文献は全体を本明細書の一部とする。

【００５６】 実施例 実施例１ ＩＬ-２およびＴＦＧ-βの混合物によるＰＢＭＣの処置 実施例１によって示されるのは、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２およびＴＦ Ｇ-βで比較的簡単に処置することにより、自発的ポリクローナルＩｇＧおよび 自己抗体産生が顕著に阻害されることである。下記で考察するように、１２人の
活動性ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、ＴＧＦ-βと共に、またはＴＧＦ-βを伴わずに
３日間ＩＬ-２にさらし、洗浄し、そして７日以上培養した。ＩｇＧ分泌の平均 減少は７９％であった。最も強力な阻害効果は、最も顕著なＢ細胞の活動過剰の
場合に観察された。抗核タンパク質(ＮＰ)抗体の自発的産生が観察されたのは４
例あり、ＰＢＭＣのサイトカイン処置により自己抗体産生は、５０から９６％減
少した。ＩＬ-２は、個々の患者におけるＴＧＦ-β-依存性または非依存性の何 れかの機構によるＩｇ産生を阻害した。活動性ＳＬＥ患者における抗ＣＤ２刺激
性ＩｇＧ産生の研究では、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βがＩｇＧ産生におけるＣＤ８
＋Ｔ細胞の促進効果を逆転し、代わりに抑制活性を誘発し得る。

【００５７】 方法 自発的Ｉｇ合成のための研究対象 １２人の対象をＳＬＥ診断で選択した。それらはＳＬＥを分類するＡＲＡ基準
(Arnett, F.C. et al., (1998), Arthritis Rheum 31: 315-324)を満たしていた
。これらの患者はすべて女性であり、スペイン人８人、アフリカ系アメリカ人２
人、そしてアジア人２人であった。それぞれの患者の年齢および病歴を表１に示
す。５人が入院患者で、７人は外来患者であった。コルチコイドステロイドおよ
び抗マラリア薬を受けている患者たちも見られる。８人の患者が未処置であった
。疾患活動性を、ＳＬＡＭ(Liang, M.H. et al., (1989), Arthritis Rheum 32:
1107-1148)およびＳＬＥＤＡＩ(Bombardier, C. et al., (1992), Arthritis Rh
eum 35:630-640)で評価すると、それぞれ平均値１６．５および１３．４であっ た。 表１ ＳＬＥ患者のプロフィール

【表１】

【表２】

【００５８】 試薬 組換え体ＴＧＦ-βおよびモノクローナル抗ＴＧＦ-β(1D11.16)抗体、ネズミ ＩｇＧ１は、Dr. Bruce Pratt(Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA)から
好意的に提供された。組換え体ＩＬ-１０およびモノクローナル抗ＩＬ-１０(JES
3-19F1)抗体および対照ラットＩｇＧ２ａは、Dr. Satwant Narula(Schering Plo
ugh Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ)から好意的に提供された。対照マウスＩ
ｇＧ１骨髄腫タンパク質は、Calbiochem, San Diego, CAから購入した。組換え 体ヒトＩＬ-２は、Chiron, Emmeryville, CAより購入した。OKT11を用いた抗Ｃ Ｄ２分泌ハイブリドーマ抗体は、American Type Culture Collection(ATCC)から
得、Rockville、MDおよびGT2は、A. Bernard, Nice, Franceから好意的に提供さ
れた。他の抗体には、J. Unkeless, New York, NYから親切にも提供された抗Ｃ Ｄ４(OKT4、ATCC)、抗ＣＤ８(OKT8、ATCC;CD8、Dako, Carpentaria, CA)、抗Ｃ Ｄ１１ｂ(OKM1、ATCC)、抗ＣＤ１６(3G8)；抗ＣＤ２０(Leu 16, Becton Dickins
on, San Jose, CA)および抗ＣＤ７４(Ｌ243、ATCC)が含まれていた。

【００５９】 末梢血単核細胞の単離 末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、Ficoll-Hypaque(Pharmacia, Piscataway, NJ) 密度勾配遠心分離によりヘパリン化した静脈血から調製した。単核細胞を、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ(Life Technologies, Grand Island, NY)で洗浄し、血
小板を取り除いた。それはＴＧＦ-βを多く含んでいる。

【００６０】 細胞培養の手順 細胞培養の手順は以前述べられている通りである(Wahl, S.M. (1994), J Exp
Med 180: 1587-1590; Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160: 2248-2254)
。簡単に言うと、２ｘ１０⁵のＰＢＭＣを、血清を含まないＡＩＭ-Ｖ培養培地(L
ife Technologies)中、指示されたサイトカインを含むか、または含まない９６-
ウェルの底の平らなマイクロタイタープレートにおいて培養した。培養３日後、
ＰＢＭＣを3回洗浄し、次いで、新たに血清を含まない培地を添加した。更に３ ７℃で７日後、上清を回収し、以前に述べられている(Linker-Israeli, M. et a
l., (1990), Arthritis Rheum 33: 1216-1225)通り固相酵素結合免疫収着検定( ＥＬＩＳＡ)によりウシ胸腺核タンパク質(ＮＰ)と反応する全ＩｇＧおよび自己 抗体を検定する。光学的密度(ＯＤ)の読み値を、陽性および陰性標準を用いる標
準曲線より、ｕｎｉｔｓ／ｍｌ(Ｕ／ｍｌ)に変換した。ＳＬＥ患者(高力価の抗 ＮＰ抗体を有する)および正常人のＰＢＭＣ培養の上清を対照として用いた。

【００６１】 統計学的分析 データをGraph Pad, Prism software(San Diego, CA)を用い分析した。我々は
、データの対数変換および非パラメーター性Mann-Whitney試験後、分散(ANOVA) の分析を使用した。

【００６２】 抗ＣＤ２誘発ＩｇＧ合成 抗ＣＤ２刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞(ＮＫ細胞 と共に、またはＮＫ細胞を伴わずに培養)の効果を、ＳＬＥの患者および正常人 の対照で調査した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、以前述べられている(Gray,
J.D. et al., (1998), J Immunol 160:2248-2254)通りに免疫磁性ビーズを用い
る陰性選択により、ナイロン非付着性リンパ球から調製した。ＣＤ４＋細胞の場
合、ナイロン非付着性細胞をＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ７４に対
する抗体で染色した。同じ抗体を用い、ＣＤ８＋細胞が得られた。ただし、ＣＤ
４をＣＤ８と置き換える。ＣＤ４＋細胞の純度は９５％であり、ＣＤ８＋細胞は
８９％であった。ＮＫ細胞を得るため、ＰＢＭＣをナイロンウールカラムに加え
、そして、溶出した非付着性細胞をＡＥＴ処置ヒツジ赤血球細胞で直にロゼット
した。次いで、非ロゼット画分を抗ＣＤ３および抗ＣＤ７４(抗ＨＬＡ-ＤＲ)抗 体で染色し、免疫磁性ビーズ(Dynal)を用い反応細胞をなくした。得られた群に はＣＤ５６＋が９８％およびＣＤ３が０．５％未満およびＣＤ２０＋リンパ球が
０．５％未満含まれていた。ＳＬＥ Ｂ細胞は、大量のＩｇＧを自発的に分泌す るため、そして、これらの研究用に多数のＢ細胞を調製するための多量の血液を
必要とするため、我々は、健常者ドナーの休止Ｂ細胞をこの研究の患者のＢ細胞
と置き換えた。Ｂ細胞を得るため、ナイロンウール付着性細胞を、直にＳＲＢＣ
でロゼットし、任意のＴ細胞を除去し、単球および機能性ＮＫ細胞を完全に除去
するため５ｍＭ Ｌ-ロイシンメチルエステルで処理した。生じた群ではＣＤ２０
＋は９２％を超え、ＣＤ３＋は０．５％未満であった。

【００６３】 結果 １２人の患者の研究では、自発的ＩｇＧは０．４から１３．７μｇ／ｍｌの範
囲であった(図１)。ＰＢＭＣをＩＬ-２±ＴＧＦ-βに７２時間さらすことにより
、ＩｇＧ合成は、研究した１２例のうち８例で、少なくとも５０％減少した(平 均減少７９％、ｐ＝０．００８、Mann Whitney)。最も劇的な減少は、最も顕著 なＢ細胞の活動過剰の場合に観察された。分泌するＩｇＧ量とＩＬ-２およびＴ ＧＦ-βによる阻害％との関係は、ｒ＝０．６４７、ｐ＝０．０２であった。

【００６４】 ＩＬ-２およびＴＧＦ-β単独の効果を、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組み合わせ
と比較した。図２によって示されるのは、これらサイトカインのそれぞれがまた
ＩＬ-２産生を阻害することである。しかし、対数変換によるデータの通常分布 の達成および複数比較のためのBonnferoni補正の適用の後では、分散の分析から
、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの組合せのみによって有意な阻害(p=0.05)が生ずるこ
とがわかる。

【００６５】 ＩＬ-１０産生はＳＬＥ中では増加しており(Llorente, L. et al., (1993), E
ur Cytokine Network 4:421-427)、このサイトカインはＩＬ-２およびＴＧＦ-β
の両方の産生を阻害し得る。９例において、我々はまた、抗ＩＬ-１０の効果を 調べたが、ＩｇＧ合成の幾分の低下が数例で観察されたのみで、この違いは統計
的に有意でなかった。同様に、ＴＮＦα産生もまたＳＬの一部の患者で減少した
(Jacob, C.O. et al., (1990), Proc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。このサイ トカインはまた、活性ＴＧＦ-βの産生を増加するが(Ohtsuka, K. et al., (198
), J Immunol 160:2539-2545)、ＴＮＦαを培養に加えることにより最小の効果 を生じた(結果示さず)。

【００６６】 抗ＮＰ自己抗体の自発的産生につきＳＬＥ ＰＢＭＣを調査し、有意な力価が ４例みられた。ＰＢＭＣをＩＬ-２またはＩＬ-２およびＴＧＦ-βの何れかにさ らした場合すべてにおいて少なくとも５０％の抗ＮＰ産生が阻害された。ＴＧＦ
-β自身は効果がなかった(表２)。これらの場合、ＩＬ-２自身の効果は、ＩＬ- ２およびＴＧＦ-βの組み合わせの場合と同等であった。

【００６７】 表２ ＳＬＥ中の自発的自己抗体産生におけるＩＬ-２およびＴＧＦ-βによるＰＢＭＣ
処置の効果

【表３】 ^*ベースライン値の％

【００６８】 ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２(１０Ｕ/ｍｌ)およびＴＧＦ-β(１０ｐｇ/ｍ ｌ)に７２時間さらした。その細胞を洗浄し、更に７日間培養した。上清中に放 出された抗ＮＰをＥＬＩＳＡで測定した。

【００６９】 以前、我々が報告したのは、ＩＬ-２により生物学的に活性なＴＧＦ-β(Ohtsu
ka, K. et al., (1998), J Immunol 160: 2539-2545)の産生が増加することであ
る。そのため、自発的Ｉｇ合成におけるＩＬ-２の少なくとも幾つかの効果がＴ ＧＦ-βで仲介される可能性があった。この可能性について、ＩＬ-２の効果が抗
ＴＧＦ-β中性化抗体により逆転され得るかどうか測定することにより調べた。 図３Ａに示した例では、抗ＴＧＦ-βの添加は、自発的ＩｇＧ合成に影響を与え なかった。しかし、ＴＧＦ-βアンタゴニズムは、ＩｇＧ合成におけるＩＬ-２の
阻害効果を破壊した。この患者(表２のケースＣ)のＰＢＭＣもまた、抗ＮＰ抗体
を自発的に産生した。ここで、また、抗ＴＧＦ-βは、抗ＮＰ産生におけるＩＬ-
２の阻害効果を破壊した(図３Ｂ)。この対象では、自発的ＩｇＧおよび自己抗体
合成におけるＩＬ-２の阻害効果はＴＧＦ-βを介していた。抗ＴＧＦ-βのこの 効果は研究した８例のうち４例で記録された。故に、ＩＬ-２の阻害効果は、Ｔ ＧＦ-β依存であるかまたは非依存である。各効果の例を表３に示す。 表３ ＳＬＥ中の自発的ＩｇＧ合成におけるＩＬ-２およびＴＧＦ-βの効果

【表４】 ^*ベースラインＩｇＧ合成の％

【００７０】 我々は、ステロイド治療の開始後２８日のＳＬＥ患者において研究を繰り返す
機会を有した(表４)。処置前に、自発的ＩｇＧ合成はＩｇＧ２μｇ／ｍｌよりも
多かった。ＰＢＭＣをＩＬ-２にさらすと、ＩｇＧ産生を顕著に阻害し、ＴＧＦ-
βは適度な効果を有した。コルチコイドステロイド治療の後、自発的ＩｇＧ産生
は７５％に減少した。上記の通り、ＰＢＭＣをＩＬ-２±ＴＧＦ-βにさらすと、
ＩｇＧ産生は５０％減少した。しかし、この阻害は抗ＴＧＦ-βにより逆転した 。ここでさらに、ＩＬ-２のこの効果が、内在性活性ＴＧＦ-βのアップレギュレ
ーションによるものと説明できた。

【００７１】

【表５】 ＊ベースラインＩｇＧ合成のパーセント

【００７２】 常人についての我々の先の実験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βがＩｇ産
生を下方制御するために活性化ＣＤ＋Ｔ細胞を誘導できることから、本実験でＳ
ＬＥ患者からのＣＤ８＋Ｔ細胞の単離および処置を試みた。これらの実験が不成
功であったのは、自発的Ｉｇ合成の著しい可変性、および細胞分離法のために活
動性ＳＬＥの患者から大量の血液が必要であることのためであった。しかし、抗
ＣＤ２誘導ＩｇＧ合成のＣＤ８＋Ｔ細胞調節におけるＩＬ−２およびＴＧＦ−β
の効果を調べるために、活動性ＳＬＥの患者から十分な血液を得ることができた
。抗ＣＤ３と異なり、抗ＣＤ２モノクローナル抗体の細胞分裂促進性組合わせは
、ＰＢＬを誘導してＩｇＧを産生させないことを、我々は最近に報告している(G
ray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:2248-2254)。これは、抗ＣＤ２がＮ
Ｋを刺激してＴＧＦ−βを産生し、それが順番にＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、Ｉｇ
産生を下方制御するためであった(Gray, J. D. et al. (1988), J Immunol 160:
2248-2254)。この患者において、我々が先に報告したように(Gray J. D. et al.
(1994), J Exp Med 180:1937-1972)、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＩｇＧ合成を増大し、 この増大はＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の組合わせにより著しく強化された(図４ Ａ)。一方、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＳＬＥ ＣＤ８＋Ｔ細胞のヘルパー 効果を無くし、これらの細胞がＩｇＧ産生を抑制することを可能にした。ＩＬ−
２およびＴＧＦ−βのこの阻害効果はＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に依存した(図４Ｂ)
。このように、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βがＣＤ８＋Ｔ細胞により仲介され得る
という証拠が得られている。

【００７３】 これらの実験は、ＰＢＭＣのＩＬ−２およびＴＧＦ−βへの短い暴露が、ＳＬ
Ｅ、特に重症な疾病および著しいＢ細胞活動亢進の患者において、続く自発的ポ
リクローナルＩｇＧおよび自己抗体産生を非常に減少できることを証明した。こ
の実験は、ＩＬ−２が抗体産生を阻害できることを示す先の報告(Hirohata, S.
et al. (1989), J Immunol 142:3104-3112およびFast, L. D. (1992), J Immuno
l 149:1510-1515)を確認し、ピコモル濃度のＴＧＦ−βがこの下方制御の一因と
なり得ることを明らかにする。実験した１２名の患者のグループにおいて、ＩＬ
−２およびＴＧＦ−βのポリクローナルＩｇＧ合成における阻害効果は、ＩＬ−
２単独より大きかった。しかし、ＩＬ−２の阻害活性は不均一であった。実験し
た８名のうち４名において、阻害は中和性抗ＴＧＦ−β ｍＡｂが作用を無くす
ため、ＴＧＦ−β依存的であった。残りの例において、ＩＬ−２の下方制御効果
はＴＧＦ−β非依存的であった。同様に、自発的抗ＮＰ自己抗体産生におけるＴ
ＧＦ−β依存的および非依存的阻害阻害の両方が証明された。我々がまた、ＩＬ
−１０の拮抗およびＴＮＦ−α添加の効果を調べたのは、ＳＬＥにおけるこれら
のサイトカインの産生の異常が先に記載されていたためである(Llorente L. et
al. (1993), Eur Cytokine Network 4:421-427; Jacob, C.O. et al. (1990), P
roc Natl Acad Sci 87:1233-1237)。これらの方法は、しかし、リンパ球が先に 活性化されているとき、自発的Ｉｇ合成に対して極小の効果を有した。

【００７４】 ＳＬＥにおけるＢ細胞活動亢進の程度が疾病活動性と相関するという他の報告
がある(Blaese, R. M. et al. (1980), Am J Med 69:345-350; Klinman, D. M.
et al. (1991), Arthritis Rheum 34:1404-1410)。このことが本試験で起きなか
ったのは、同時薬剤治療によるためであろう。一般に、著しい自発的Ｉｇ合成の
患者は処置せず、一方低いＢ細胞活性の患者にはプレドニゾンを普通に投与した
。我々はコルチコステロイド治療開始後に著しく自発的Ｉｇ合成が減少した一つ
の例を提示する。この患者のＢ細胞はまた処置前に抗ＮＰ抗体を分泌したが、こ
の自己抗体の産生はステロイド治療後に検出されなくなった(データ示さず)。

【００７５】 ＴＧＦ−βは、組織修復、炎症および免疫調節に重要なサイトカインの多機能
性ファミリーから成る(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641)。
ＴＧＦ−βは、不活性前駆体分子として分泌され、細胞外で生物学的活性形に変
換する点で、他のサイトカインと異なる(Massague, J. (1990), Annu Rev Cell
Biol 6597-641; Flaumenhaft, R. et al. (1993), Adv Pharmacol 24:51-76)。 実験的自己免疫脳炎(Weiner, H. L. et al. (1994), Annu Rev Immunol 12:809-
837)および大腸炎(Neurath, M. F. et al. (1996), J Exp Med 183:2605-2516) のような種々の実験的自己免疫モデルは、このサイトカインを産生する。ＴＧＦ
−βは、ナノモル濃度で免疫抑制性であり、ＴおよびＢ細胞増殖、ＮＫ細胞細胞
毒性活性およびＴ細胞細胞毒性の発生を阻害できる(Letterio, J. J. et al. (1
998), Ann Rev Immunol 16:137-162)。対照的に、ＴＧＦ−βはマウスＣＤ４＋ 細胞およびＣＤ８＋細胞の増殖を促進する(Kehrl, J. H. et al. (1986), J Exp
Med 163:1037-1050; Lee, H. M. et al. (1993), J Immunol 151:668-677)、お
よびＢ細胞分化を促進できる(Van Vlasselaer, P. et al. (1992), J Immunol 1
48:2062-2067)と報告されている。

【００７６】 健康な被験者から得たリンパ球で調節Ｔ細胞を発生させるという先の試験にお
いて、使用したＴＧＦ−βのピコモル濃度は、ＴまたはＢ細胞機能の阻害に必要
とされるピコモル濃度より低かった(Ｇray，Ｊ. Ｄ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmun
ol １６０：２２４８−２２５４；Ｇray，Ｊ. Ｄ.ら（１９９４），Ｊ Ｅxp Ｍe
d １８０：１９３７−１９４２)。同様の濃度をＳＬＥ患者での本発明の試験に おいて使用すると、ＴＧＦ−β自体がＩg合成に対して僅かな阻害効果を有して いた。前記の通り、ＴＧＦ−βとＩＬ−２の組み合わせが最も強力な阻害をもた
らした。先の試験において、この効果は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞により仲介された。

【００７７】 ＩＬ−６について、Ｔサプレッサー細胞活性の誘発に対する効果が十分確立さ
れている(Ｈirohata，Ｓ.ら（１９８９），Ｊ Ｉmmunol １４２：３１０４−３ １１２；Ｆast，Ｌ. Ｄ.，Ｊ Ｉmmunol １４９：１５１０−１５１５)が、これ らの効果が直接的なものであるか、または間接的なものであるかどうかは明らか
ではない。マウスにおいて、ＩＬ−２遺伝子の欠失は、塊状リンパ球増殖および
自己免疫疾患を生ずる(Ｓadlack，Ｂ.ら（１９９５），Ｅur Ｊ Ｉmmunol ２５ ：３０５３−３０５９)。ＳＬＥにおいて、負の相関関係がＩＬ−２レベルとＢ 細胞機能亢進との間に報告された(Ｈuang，Ｙ. Ｐ.ら（１９８８），Ｊ Ｉmmuno
l １４１：８２７−８３３)。以前、ＳＬＥにおけるＩＬ−２での自発的Ｉg産生
を阻害しようと試みたが、しかしながら、その結果は極めて変動的であった。強
い阻害を幾つかの場合において観察したが、他のＩＬ−２ではＩg産生が著しく 増大した。我々は、タイミングおよびサイトカイン環境が、この試験において観
察される、より一貫した阻害を説明すると考える。ここで、ＩＬ−２およびＴＧ
Ｆ−βは、全培養期間というよりはむしろ、最初の７２時間の培養の間にしか存
在していなかった。後者の場合におけるＩg合成の向上は、Ｂ細胞分化に対する ＩＬ−２の正の効果により説明することができた(Ｃoffman，Ｒ. Ｌ.ら（１９８
８），Ｉmmunol Ｒev １０２：５−２８)。ＩＬ−２は、抗体産生を幾つかの機 構により下方調節することができる。該報告に記載されているＴＧＦ−β回路に
加えて、ＩＬ−２が誘発する阻害は、ＩＦＮ−γの上方調節(Ｎoble，Ａ.ら（１
９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：５６６−５７１)により、または細胞溶解機構(
Ｓtohl，Ｗ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：５２３１−５２３８；Ｅsse
r，Ｍ. Ｔ.ら（１９９７），Ｊ Ｉmmunol １５８：５６１２−５６１８)により 起こり得る。

【００７８】 以前、抗体合成に対するＮＫ細胞の調節効果を調べて、ＮＫ細胞の直接的効果
は、ＩgＧ合成を上方調節することである(Ｋinter，Ａ.ら（１９９５），Ｐroc
Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ ９２：１０９８５−１０９８９)が、これらのリンパ 球は、健康な被験者においてＣＤ８＋ Ｔ細胞と培養した場合、正反対の効果を 有すると報告した(Ｇray，Ｊ. Ｄ.ら（１９９４），Ｊ Ｅxp Ｍed １８０：１９
３７−１９４２)。しかしながら、ＳＬＥ患者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＮＫ
細胞との組み合わせがＩgＧ産生を高めた(Ｌinker−Ｉsraeli，Ｍ.ら（１９９０
），Ａrthritis Ｒheum ３３：１２１６−１２２５)。これは、本発明の報告に おいて再び観察された。正常な被験者において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞へのＮＫ細胞 の付加は、抗ＣＤ２が刺激するＩgＧ合成を著しく阻害したが、正反対の事象が ＳＬＥにおいて観察された。標準試験から、ＮＫ細胞から得たＴＧＦ−βがＣＤ
８＋ Ｔ細胞の同時刺激を誘発して、ＩgＧおよびＩgＭ産生を下方調節すること を知った(Ｇray，Ｊ. Ｄ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：２２４８−２ ２５４)。この試験において、ＩＬ−２およびＴＧＦ−βは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に
よる中程度の抑制活性を誘発した。従って、ＳＬＥにおいて、ＩＬ−２およびＴ
ＧＦ−βがＢ細胞活性を阻害する少なくとも１つの方法は、調節Ｔ細胞を発生さ
せることによるものであるらしい。加えて、これらまたは他のサイトカインで処
理した他のリンパ球群もまた、ＳＬＥにおけるＢ細胞活性を下方調節し得る。

【００７９】 実施例２ 疾患の活性および重篤度とＴＧＦ−β産生との相関関係 全型および活性型のＴＧＦ−βのリンパ球産生が減少することが分かると、次
に、これらの欠損が疾患の活性および／または重篤度と関連があるかどうかを問
うた。１７人の予期的に試験したＳＬＥ患者から得た血液リンパ球によるＴＧＦ
−β１産生を、１０人の慢性関節リウマチ(ＲＡ)患者および２３人の適合する(m
atched)健康な対照者と比較した。ＲＡにおいて、活性ＴＧＦ−β１のレベルは 、対照より低かったが、ＳＬＥにおいて見出された程度までは減少しなかった。
ピコモル量で検出される構造性ＴＧＦ−β１および抗ＣＤ２刺激の活性ＴＧＦ−
β１のレベルは、最近発症の非常に活性で重篤なＳＬＥで入院した６人の未処置
患者において著しく減少し、処置され活性の低い疾患の１１人の患者においても
同様に減少した。このように、活性ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性とは
関連がなかった。これとは対照的に、全ＴＧＦ−β１産生の減少は、疾患の活性
と逆の相関関係があった。このように、ＴＧＦ−β１の潜在性前駆体のリンパ球
分泌の欠陥は、疾患の活性の結果として生じ得るが、前駆体分子をその活性型に
転換する能力は、内因性細胞欠損となり得るらしい。活性化される時点でのピコ
モル濃度量のＴＧＦ−β１へのＴ細胞の不十分な暴露は、Ｉg合成の下方調節の 欠陥を生じ得る。このように、ＳＬＥにおける活性ＴＧＦ−β１のリンパ球産生
の減少は、この疾患に特徴的なＢ細胞機能亢進の原因であろう。

【００８０】 方法 ≪試験の被験者≫ ＳＬＥの分類に関するアメリカ大学のリウマチ病学基準(Ｔan，Ｅ. Ｍ.ら（１
９８２）、Ａrthritis Ｒheum ２５：１２７１−１２７７)を満たす、ＳＬＥの 診断を受けた１７人の被験者、ＲＡの分類に関するＡＣＲ １９８７ 改定基準 (
Ａrnett，Ｆ. Ｃ.ら（１９８８），Ａrthritis Ｒheum ３１：３１５−３２４) を満たす、ＲＡを患う１０人の被験者、および２３人の健康なドナーを試験した
。ＳＬＥグループは、女性１５人および男性２人(スペイン人１５人、アフリカ 系アメリカ人１人、アジア人１人)からなっていた。平均年齢は、３４.５歳(範 囲：２０−７５歳)であった。６人の患者を入院させて、１１人を外来患者診療 所に通わせた。入院患者は皆、入院するまでは未処置であり、試験した後、彼ら
に第一回用量のコルチコステロイドを投与した。外来患者には、プレドニゾンを
２０mg未満投与し、誰にも細胞毒性薬物を投与しなかった。疾患の活性を、平均
値が各々６.６および７.６であるＳＬＡＭ(Ｌiang，Ｍ. Ｈ.ら（１９８９）、Ａ
rthritis Ｒheum ３２：１１０７−１１１８)およびＳＬＥＤＡＩ(Ｂombardier ，Ｃ.ら（１９９２）、Ａrthritis Ｒheum ３５：６３０−６４０)指数で評価し
た。ＲＡグループは、女性９人および男性１人(スペイン人９人、アジア人１人)
からなっていた。平均年齢は、５０.９歳(範囲：３９−６７歳)であった。患者 は皆、外来患者診療所に通わせ、軽度〜中程度の疾患の活性を有していた。疾患
の平均期間は９.５年であった。１人の患者にマイオクリシン(myochrysine)を投
与し、３人の患者にプレドニゾン(１、１、および２０mg)を投与し、３人の患者
にメトトレキセートを投与し、１人の患者にスルファサラジンを投与した。健康
なドナーを対照として、年齢、性別、および民族グループに関して可能な限り厳
密に適合させた。

【００８１】

【表６】 表５ ＳＬＥ患者の２つのグループの臨床的特徴

【表７】

【００８２】 ≪試薬≫ 使用した抗体は、抗ＣＤ２を分泌するハイブリドーマ(ＯＫＴ１１、アメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectio
n)(ＡＴＣＣ)，Ｒockville，ＭＤ，およびＧＴ２は、Ａlain Ｂernard博士，Ｎi
ce，Ｆranceにより入手可能となった)の上清であった。ＴＧＦ−βイソ型 １、 ２、および３(１Ｄ１１)を認識するモノクローナル抗体、ＴＧＦ−βイソ型 ２ および３(３Ｃ７)に対する抗体、並びにrＴＧＦ−β２は、Ｂruce Ｐratt博士( Ｇenzyme Ｐharmaceuticals，Ｆarmington，ＭＡ)により快く提供された。

【００８３】 ≪血液リンパ球の単離≫ 先に記載した方法(Ｏhtsuka，Ｋ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：２５
３９−２５４５)を使用して、Ｆicoll−Ｈypaque(Ｐharmacia，Ｐiscataway，Ｎ
Ｊ)密度勾配遠心分離により、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)をヘパリン処置した静 脈血から調製した。単核細胞を、５mＭ ＥＤＴＡ(Ｌife Ｔechnologies，Ｇrand
Ｉsland，ＮＹ)を含むＰＢＳで洗浄して、ＴＧＦ−βの豊富な原料である血小 板を取り除いた。連続Ｐercoll(Ｐharmacia)密度勾配によって、末梢血リンパ球
(ＰＢＬ)を遠心分離によりＰＢＭＣから分離した。高密度のリンパ球に富む画分
に残留する単球のパーセンテージは、ＳＬＥにおいて幾分高かった(８.５％ 対
４.３％)。

【００８４】 ≪細胞培養方法≫ 細胞培養方法は、以前に記載されている(Ｏhtsuka，Ｋ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：２５３９−２５４５)。簡単に言えば、１×１０⁵個のリンパ 球を９６ウェルの平底マイクロタイタープレート(Ｇreiner Ｒocky Ｍountain Ｓcientific，Ｓalt Ｌake Ｃity ＵＴ)のウェルに加えた。血清が著しい量の潜
在性ＴＧＦ−βを含むことから、培養をＡＩＭ−Ｖ血清不含有培地(Ｌife Ｔech
nologies)にて行った。抗ＣＤ２を最適濃度で使用して、ＴＧＦ−β産生(ＧＴ２
１：４０およびＴ１１ １：８０)ハイブリドーマ培養上清を得た。先の試験は 、抗ＣＤ２がＰＢＬを強く刺激して、ＴＧＦ−βを産生することを明らかにして
いる(Ｇray，Ｊ. Ｄ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：２２４８−２２５ ４)。

【００８５】 ≪ＴＧＦ−βアッセイ≫ ルシフェラーゼリポーター遺伝子に融合したプラスミノーゲン活性化因子阻害
剤(ＰＡＩ−１)プロモーターを含む発現構築物をトランスフェクトしたイタチ肺
上皮細胞(ＭＬＥＣ)は、Ｄ. Ｂ. Ｒifkin博士，Ｎew Ｙork，ＮＹにより快く提 供された。２×１０⁴／ウェルのＭＬＥＣを上清２００μlと共に３７℃で１８時
間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性に関してアッセイするために、ＭＬ
ＥＣを細胞溶解試薬(Ａnalytical Ｌuminescence，Ａnn Ａrbor，ＭＩ)により溶
解した。次いで、細胞ライゼートをアッセイ緩衝液およびルシフェリン溶液(両 方とも、Ａnalytical Ｌuminescenceから得た)と反応させた後、直ちに、照度計
(Ｌumat，Ｂerthold Ａnalytical Ｉnstruments Ｉnc.，Ｎashua，ＮＨ)で測定 した。全ＴＧＦ−β活性を測定するために、試料を８０℃で３分間加熱して、潜
在性複合体から活性サイトカインを放出させた。上清を加熱することなく、活性
ＴＧＦ−βの活性を測定した。全てのアッセイおいて、幾つかの濃度のrＴＧＦ −βが標準曲線を作成するために含まれていた。同型培養の可変性は１０％未満
であった(Ｏhtsuka，Ｋ.ら（１９９８），Ｊ Ｉmmunol １６０：２５３９−２５
４５)。

【００８６】 ≪統計分析≫ ＧＢＳＴＡＴソフトウェア(Ｐrofessional Ｓtatistics and Ｇraphics Ｃomp
uter Ｐrogram，Ｄynamic Ｍicrosystems Ｉnc.，Ｓilver Ｓpring，ＭＤ)を使 用して行うＭann−Ｗhitney試験およびＳpearman順位相関関係を使用して、結果
の有意性を分析した。

【００８７】 我々は、ＳＬＥまたはＲＡの患者由来のＰＢＬにより産生される構造的および
刺激ＴＧＦ−β１を測定し、正常対照の値と比較した。培養上清中に検出される
サイトカインは、イソ形１、２および３を認識するｍＡｂで中和されたが、イソ
形２および３に対するｍＡＢではされず、結果としてＴＧＦ−β１の産生を確認
する。正常対照と比較して、活性ＴＧＦ−β１の構造的産生はＳＬＥで有意に減
少した(１４±４対５６±２１pg／ml、ｐ＝０.０２、図５)。抗ＣＤ２刺激活性 ＴＧＦ−β１も減少した(８７±２２対３９９±１０３pg／ml、ｐ＝０.００３) 。ＲＡにおいて、構造的ＴＧＦ−β１の平均値は、ＳＬＥ(１９±５pg／mg)と同
様であり、抗ＣＤ２により刺激された後は正常とＳＬＥの中間値であった(１９ ７±５４pg／ml)。

【００８８】 リンパ球により産生された構造的全ＴＧＦ−β１も、正常グループと比較して
ＳＬＥで減少した(２８６±８２対６３１±１８５pg／ml、ｐ＝０.０５)。ＲＡ での値は、正常とＳＬＥの中間値であった(４３５±１６１pg／ml)。抗ＣＤ２の
添加に続き、全ＴＧＦ−β１はＳＬＥで正常対照より幾分増加したが、差異は統
計学的に有意でなかった。ＲＡグループでの値はまた正常とＳＬＥグループの中
間値であった。

【００８９】 ＴＧＦ−β１の減少したレベルと疾病活動性の相関関係の可能性を探すために
、入院ＳＬＥ患者と外来患者とを比較した。これらの二つのグループの臨床的特
徴は、表５に要約する。入院患者の方が若かった；６名中５名が、発症して３ヶ
月以内であった；そして、著しく活動的な疾病に罹患していた；そして殆どが、
腎炎および／または溶血性貧血を伴う重症ＳＬＥであった。比較して、外来患者
は、処置により活動性が低くなった慢性疾病であった。疾病異種性、期間、活動
性および重症度の著しい差異にもかかわらず、構造的および刺激ＴＧＦ−β１産
生は、正常対照と比較して両グループで有意に減少した(表６)。

【００９０】

【表８】 ＊ＰＢＬ １×１０⁵／ウェルを４８時間培養し、懸濁液をＴＧＦ−β１に関し て試験した。 ＳＬＥ患者を２つのグループに分けた。グループ１：入院患者。グループ２：外
来患者。 ｐ値は、示されるＳＬＥグループと正常対照の間の比較を示し、マン‐ホイット
ニー検定で評価した；†ｐ＜０.０５、‡ｐ＜０.０１。

【００９１】 活性および全ＴＧＦ−β１のレベルと疾病活動性との相関関係をみると、全Ｔ
ＧＦ−β１の抗ＣＤ２刺激産生とＳＬＥＤＡＩ(ｒ＝０.５５、ｐ＝０.０３、Ｓ ＬＡＭ指数ではない(−０.４３、ｐ＝１１)の間に有意な負の相関関係があった 。ＳＬＥＤＡＩ指数は、中枢神経系関与および腎臓疾患に重きを置く。このよう
に、ＴＧＦ−β１の前駆体形を分泌するリンパ球の減少した能力は、重症な疾病
と関連するように見える。活性ＴＧＦ−β１のレベルは、疾病活動性と相関しな
かった。

【００９２】 本実験での主な発見は、ＳＬＥでの活性ＴＧＦ−β１の産生減少が、疾病活動
性または重症度と相関しないことである。構造的および刺激活性ＴＧＦ−β１量
の減少は、最近発症したおよび確立した疾病の両方の患者で見られた。更に、こ
の値は、ＳＬＡＭおよびＳＬＥＤＡＩ指数で測定して活動性と、または生体臓器
関与により評価した重症度と相関しなかった。しかし、全ＴＧＦ−β１産生がま
たＳＬＥで減少するが、この欠失は疾病活動性と相関するように見えた。これは
、主として入院ＳＬＥ患者で見られた。全ＴＧＦ−β１産生が主用臓器系関与に
重きを置くＳＬＥＤＡＩ指数と最も相関するというこの発見はまた、疾病重症度
との関係を示す。

【００９３】 この実験はまた、疾病活動性が、確立された疾病のＳＬＥ患者と同等であるＲ
Ａ患者の対象グループを含んだ。ＲＡグループでのＴＧＦ−β１値は、構造的活
性ＴＧＦ−β１以外、正常対照より幾分低いが、欠損の強度はＳＬＥ程著しくな
く、統計的に有意ではなかった。

【００９４】 先に、我々は、ＮＫ細胞がＴＧＦ−βの主なリンパ球源であり、このサイトカ
インを活性形に構造的に産生する唯一のリンパ球集団であることを証明した(Gra
y, J. D. et al., (1988), J. Immunol. 169:2248-2254)。従って、ＮＫ細胞由 来ＴＧＦ−βの抗像的産生はＳＬＥで減少しているとの発見は、興味深かった。
我々はまたＩＬ−２およびＴＮＦ−αの両方が活性ＴＧＦ−βの産生を促進でき
ることを知った。これらのサイトカインの両方の産生は、ＳＬＥで減少する(Gra
y J. D. et al., (1994), J Exp Med 180:1937-1942)。しかし、殆どの患者にお
いて、外来性ＩＬ−２およびＴＮＦ−αはＴＧＦ−βを正常まで再蓄積できなか
った(実施例２)。ＩＬ−１０産生はＳＬＥで増加し(Llorente, L. et al. (1993
), Eur Cytokine Network 4:421))、増加したレベルと疾病活動性の相関関係は 報告されている(Housslau, F. A. et al. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara,
E. et al. (1996), Arthritis Rheum 39:379)。ＩＬ−１０はＩＬ−２、ＴＮＦ
−αおよびＴＮＦ−β産生を阻害できる(実施例２およびMoore, K. W. et al. (
1993), Ann Rev Immunol 11:165-190)。活性ＴＧＦ−βの産生が軽いおよび活動
性の疾病の患者で減少し、ＩＬ−１０の拮抗によってのみ産生欠失を部分的に回
復できたということは(実施例２)、増加したＩＬ−１０産生が、それ自体、ＳＬ
ＥでのＴＧＦ−β１の減少したリンパ球産生の説明となり得ないことを示す。数
個の機構が恐らく関与する。潜伏性前駆体の成熟、活動性形への細胞外変換にお
ける１個またはそれ以上の欠失がこの異常性を説明し得る。

【００９５】 ＴＧＦ−βは、リンパ球増殖およびエフェクター細胞機における十分記録され
た特性を有するが(Letterio, J. J. et al. (1998), Ann Rev. Immunol 16:137-
162)、刺激特性も報告されている(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:6
68-677)。ＴＧＦ−βは、刺激Ｔ細胞およびその産生の上方制御によりサイトカ イン産生を調節する。マウスにおいて、ＴＧＦ−β１は、選択的にＣＤ８⁺Ｔ細 胞の増殖を刺激し(Lee, H. M. et al. (1991), J Immunol 151:668-667)、ナイ ーブな細胞からメモリーＴ細胞への成熟を立証する(Lee, M. H. et al. (1991),
J. Immunol 147:1127-1133)。ヒトにおいて、ＴＧＦ−β１はエフェクターＴ細
胞の強いインデューサーである(Cerwenka, A. et al. (1994), J Immunol 153:4
367-4377)。大量(ナノグラム／ml)が免疫抑制作用に必要であるが、我々が示し たように、少量(ピコグラム／ml)のみが、抗体産生の下方制御効果に関してＣＤ
８⁺Ｔ細胞を共刺激するのに必要である(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol
160:2248-2254)。

【００９６】 これらの実験は、従って、ＴＧＦ−β１の潜伏性前駆体の減少したリンパ球分
泌は疾病活動性の結果としてもたらされ得るが、ＳＬＥにおける減少した活性Ｔ
ＧＦ−β１産生は、さらに複雑であり、数個の異なる機構からもたらされる。ナ
イーブＴ細胞が抗体産生を下方制御するように計画されるには、Ｔ細胞が活性化
される時点でpg／ml量の活性ＴＧＦ−βの存在を必要とすると我々は考え、また
この考えを支持する証拠がある(Gray, J. D. et al. (1998), J Immunol 160:22
48-2254)。従って、決定的な時点での局所環境における活性ＴＧＦ−βのピコモ
ル量の欠失が、Ｔ細胞調節機能の無効に恐らく関与し、ＳＬＥにおけるＢリンパ
球活性を制御するのであろう。

【００９７】 実施例３ マイトジェンでのＳＬＥの処置 本実施例において、ＩｇＧ産生は、ＣｏｎＡのようなマイトジェンを含む阻害
組成物で細胞を処理することにより下方制御される。細胞を、上記実施例に概説
のように調製し、そしてマイトジェンとインキュベートすると、抗体産生が下方
制御された細胞の集団が増加する。この場合、細胞を生理学的濃度のＣｏｎＡと
４から７２時間、標準インキュベーション法を使用してインキュベートする。使
用するＣｏｎＡの濃度は、約０.０１から約１０マイクログラム／mlの範囲であ り得、１マイクログラム／mlが現在好ましい。ＣｏｎＡはSigma(St. Louis, MO)
から入手可能である。

【００９８】 マイトジェンはどのように作用するか知られていないが、ＰＢＭＣ調製物中の
単核細胞においてＴＧＦβの産生を誘導し、次いでＴＧＦβがＴ細胞に作用し、
抗体抑制細胞となると考えられている。 次いで、細胞を必要であれば洗浄し、患者に移植し戻す。

【００９９】 実施例４ サイトカインとマイトジェンの混合物での細胞の処理 本実施例において、ＩｇＧ産生は、サイトカインとマイトジェンの混合物を含
む阻害組成物で細胞を処理することにより下方制御される。細胞を上記実施例の
ように調製し、混合物とインキュベートすると、抗体産生を下方制御された細胞
の集団が増殖する。例えば、生理学的濃度のＣｏｎＡ、ＩＬ−２とＴＧＦβ、ま
たはＣｏｎＡおよびＩｌ−２と、４から７２時間、標準インキュベーション法で
インキュベートする。

【０１００】 細胞をサイトカインおよびマイトジェンとインキュベートした後、次いで、細
胞をＨＢＢＳと洗浄して溶液中のサイトカインおよびマイトジェンを除去する。
次いで、細胞を２００−５００mlのＨＢＢＳ中に懸濁し、哺乳動物に再挿入する
。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１によって示されるのは、ＳＬＥ患者のＰＢＭＣをＩＬ-２お よびＴＧＦ-βと共にインキュベーションすることにより、自発的免疫グロブリ ン産生が減少することである。ＰＢＭＣ(２×１０⁵／ｗｅｌｌ)を、ＡＩＭ-Ｖ血
清を含まない培地であって、ＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)およびＴＧＦ-β(１０ｐｇ/
ｍｌ)を含むか、または含まない培地中で培養した。３日後、ウェルを３回洗浄 し、新たなＡＩＭ-Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清をウェルから回収し、Ｉ ｇＧ成分をＥＬＩＳＡで測定した。

【図２】 図２によって示されるのは、ＩＬ-２およびＴＧＦ-βの両方によ
り、自発的ＩｇＧ産生が有意に減少することである。その値は、図１の説明に記
載の通りに培養した１２人のＳＬＥ患者のＰＢＭＣにより産生した平均±ＳＥＭ
のＩｇＧ(μｇ／ｍｌ)を示す。ただし、ＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)のみ、またはＴ ＧＦ-β(１０ｐｇ/ｍｌ)のみで培養した細胞もある。

【図３】 図３Ａおよび３Ｂによって示されるのは、抗ＴＧＦ-βがＩＬ-２
の効果を逆転することである。ＳＬＥ患者のＰＢＭＣを、３日間、ＩＬ-２(１０
Ｕ/ｍｌ)の存在下(黒色バー)、または非存在下(灰色バー)で培養した。これらの
培養液中に含まれていたのは、培地、抗ＴＧＦ-β(１０μｇ/ｍｌ)または対照マ
ウスＩｇＧ１(１０μｇ/ｍｌ)であった。３日後、ウェルを洗浄し、新たなＡＩ Ｍ-Ｖ培地を加えた。更に７日後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡでＩｇＧ(図３Ａ) または抗ＮＰ(図３Ｂ)成分を検定した。

【図４】 図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃによって示されるのは、抗体産生におけ
るＤＣ８＋Ｔ細胞の調節効果である。(Ａ)健康人のＩｇＧ産生の抑制におけるＮ
Ｋ細胞とＣＤ８＋細胞の相乗作用。ＣＤ４＋細胞およびＢ細胞を抗ＣＤ２で刺激
し、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞の効果を調べた。ＮＫおよびＣＤ８＋細胞の組
み合わせは、我々が以前報告した(Gray, J.D. et al., (1998), J Immunol 160:
2248-2254; Gray, J.D. et al., (1994), J Exp Med 180; 1937-1942)抗ＣＤ２
誘発性ＩｇＧ産生を顕著に阻害した。(Ｂ)ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞はＳＬＥ
におけるＩｇＧ合成を促進する。健康人の活動性ＳＬＥおよび休止Ｂ細胞と共に
患者のＣＤ４＋細胞が、抗ＣＤ２で刺激された。ＳＬＥ ＣＤ８＋細胞によるＩ ｇＧ産生の促進は、ＮＫ細胞の添加により顕著に増加した。(Ｃ)ＳＬＥにおける
ＣＤ８＋Ｔ細胞機能のサイトカインによる正常化。図４Ｂに示す研究と平行して
、この患者のＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在下または非存在下、抗Ｃ
Ｄ２で刺激した。指示された場合にＩＬ-２(１０Ｕ／ｍｌ)および／またはＴＧ Ｆ-β(２ｐｇ／ｍｌ)を加えた。これらサイトカインにより、ＣＤ８＋細胞の助 力効果が喪失し、その細胞がＩｇＧ産生の７５％を阻害した。

【図５】 図５Ａおよび５Ｂによって示されるのは、非刺激性細胞および抗
ＣＤ２刺激性細胞によるＴＧＦ-β１のリンパ球産生である。健常者ドナーなら びにＳＬＥ患者およびＲＡ患者のＰＢＬを、マイクロタイタープレートに１×１
０⁵／ウェルで加えた。幾つかのウェルは、抗ＣＤ２ｍＡｂｓＧＴ２(１：４０) およびＴ１１(１：８０)であった。３７℃で２日後、上清を回収し、活性ＴＧＦ
-β１および全ＴＧＦ-β１を検定した。有意なｐ値を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA94X BB19 CA44 4C084 AA02 AA03 BA44 DA14 MA44 NA14 ZB052 ZB082 4C087 AA01 AA02 BB34 DA19 MA44 NA14 ZB05 ZB08 ZC54

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体外の末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルにおけるＩ
   ｇ産生を阻害する方法であって、阻害組成物を該細胞集団に加えることを含む方
   法。
2. 【請求項２】 患者の自己免疫疾患を処置する方法であって、 ａ）該患者から末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を取り出し、 ｂ）該細胞を阻害組成物で、Ｉｇ産生を阻害するのに十分な時間処置し、 ｃ）該細胞を該患者に再導入する、 ことを含む方法。
3. 【請求項３】 該阻害組成物がＩＬ−２を含む、請求項１または２の方法。
4. 【請求項４】 該阻害組成物がＩＬ−２とＴＧＦ−βの混合物を含む、請求
   項１または２の方法。
5. 【請求項５】 該阻害組成物がＣＤ２アクチベーターを含む、請求項１また
   は２の方法。
6. 【請求項６】 該自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である
   、請求項２の方法。
7. 【請求項７】 患者の自己免疫疾患を処置するためのキットであり、 ａ）抗体仲介自己免疫疾患の患者から細胞を受容するのに適した細胞処置容器
   、 ｂ）少なくとも１用量の阻害組成物 を含むキット。
8. 【請求項８】 処置方法の説明書をさらに含む、請求項７のキット。
9. 【請求項９】 該用量が該細胞処置容器中に含有されている、請求項７のキ
   ット。
10. 【請求項１０】 該用量が凍結乾燥形態にある、請求項７のキット。
11. 【請求項１１】 該細胞処置容器が少なくとも１つの試薬をさらに含有する
    、請求項７のキット。
12. 【請求項１２】 該細胞処置容器が、該細胞のフラクションを分析のために取り
    出し得るサンプル口をさらに含む、請求項７のキット。
13. 【請求項１３】 該細胞処置容器が、該細胞の少なくとも部分を該患者に移行せ
    しめ得るのに適した出口をさらに含む、請求項７のキット。