ES2198774T3 - Utilizacion de citoquinas y nitrogenos para inhibir respuestas inmunes patologicas. - Google Patents
Utilizacion de citoquinas y nitrogenos para inhibir respuestas inmunes patologicas.Info
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Abstract
Utilización de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), tratadas con IL-2 o TGF-Beta, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.
Description
Utilización de citoquinas y nitrógenos para
inhibir respuestas inmunes patológicas.
El campo de la invención trata de la utilización
de una composición que comprende la IL-2 o el
TGF-\beta para el tratamiento de enfermedades
auto-inmunes mediadas por anticuerpos.
Las enfermedades auto-inmunes
están causadas por el fallo del sistema inmune para diferenciar lo
propio de lo extraño. En estas enfermedades, el sistema inmune
reacciona contra los propios tejidos y esta respuesta causa, en
última instancia, inflamación y lesión tisular. Las enfermedades
auto-inmunes se pueden clasificar en dos categorías
básicas: enfermedades mediadas por anticuerpos como el lupus
sistémico eritematoso (LSE), el pénfigo vulgar, la miastenia
gravis, la anemia hemolítica, la trombocitopenia púrpura, la
enfermedad de Greaves, la enfermedad de Sjogrens y la
dermatomiositis; y las enfermedades mediadas por células como la
enfermedad de Hashimoto, la polimiositis, la enfermedad
inflamatoria de los intestinos, la esclerosis múltiple, la diabetes
mellitus, la artritis reumatoide y la esclerodermia.
En muchas enfermedades
auto-inmunes, la lesión tisular está causada por la
producción de anticuerpos contra el tejido nativo. Estos anticuerpos
se denominan auto-anticuerpos, ya que son
producidos por un mamífero y tienen sitios de unión con los tejidos
del propio mamífero. Algunas de estas enfermedades presentan unos
aumentos y disminuciones característicos de la cantidad de
auto-anticuerpos circulantes causantes de los
diversos síntomas con el tiempo.
De los diferentes tipos de enfermedades
auto-inmunes mediadas por anticuerpos, el LSE es una
enfermedad que se ha estudiado con detalle y está bien documentada.
El LSE es una enfermedad de auto-inmunidad
generalizada caracterizada por la hiperactividad de células B con
numerosos auto-anticuerpos contra los antígenos
nucleares, citoplasmáticos y de superficie celular. Esta enfermedad
auto-inmune tiene una patogénesis multifactorial
con factores desencadenantes ambientales (revisado en Hahan, B.H.,
Dubois Lupus Erythematosus, 5ª Ed. (1997), pp. 69-76
(D.J. Wallace y col., eds., Williams y Wilkins, Baltimore)). Entre
los numerosos defectos descritos en linfocitos, el defecto en el
LSE es un fallo de las células T reguladoras para inhibir la función
B (Horwitz, D.A., Dubois, Lupus Erythematosus, 5ª Ed. (1997), pp.
155-194 (D.J. Wallace y col., Williams y Wilkins,
Baltimore)). Las células T reguladoras pueden regular negativamente
la síntesis de anticuerpos mediante mecanismos líticos o mediados
por citoquinas. El último mecanismo implica el factor de crecimiento
transformante de tipo beta (TGF-\beta) y
otras citoquinas inhibidoras (Wahl, S.M. (1994), J. Exp. Med.
180:1587-1590). Los linfocitos B circulantes que
secretan espontáneamente Ig se hallan aumentados en pacientes con
LSE activo (Klinman, D.M., y col., (1991) Arthritis Rheum
34:1404-1410). La producción sostenida de IgG y
anticuerpos policlonales in vitro requiere linfocitos T
auxiliares (Zhivakumar, S. y col., (1989) J. Immunolo.
143:103-112).
Las manifestaciones clínicas del LSE incluyen una
erupción cutánea (especialmente en la cara en forma de
"mariposa"), glomerulonefritis, pleuresía, pericarditis e
implicación del sistema nervioso central. Muchos de los pacientes
son mujeres y relativamente jóvenes (edad media al diagnóstico de 29
años).
El tratamiento del LSE depende de las
manifestaciones clínicas. Algunos pacientes con síntomas clínicos
ligeros responden a medidas simples como los agentes
anti-inflamatorios no-esteroideos.
Sin embargo, síntomas mucho más severos requieren esteroides con
potente acción anti-inflamatoria e inmunosupresora
como la prednisona. Otros fármacos potentes inmunosupresores que
pueden utilizarse son la azatioprina y la ciclofosfamida. Los
esteroides y otros fármacos inmunosupresores tienen efectos
secundarios debido a la reducción global del sistema inmune de
mamíferos. En la actualidad, no existe un tratamiento ideal para el
LSE y por lo tanto la enfermedad no se puede curar.
Actualmente, la atención se ha focalizado en la
identificación de genes que aumentan la susceptibilidad de la
resistencia a LSE, en la identificación de determinantes
antigénicos que desencadenan la enfermedad, en los mecanismos
moleculares de la activación de células T que dan como resultado la
supervivencia o apoptosis celular y en las citoquinas que determinan
la función de las células T y las propiedades de las células B
formadoras de auto-anticuerpos. Se han
descrito muchos ejemplos de disregulación de células T en el LSE
(revisado en Horwitz, D.A. y col., Dubois Lupus Erythematosus, 5ª
Ed. (1997), pp. 83-96 (D.J. Wallace y col., eds.
Williams y Wilkins, Baltimore). Aunque está bien establecido que la
función principal de algunos linfocitos es regular negativamente
las respuestas inmunes, el progreso para elucidar la identidad y
los mecanismos necesarios para la generación de estas células ha
sido lento.
Previamente, se consideró que la
interleuquina-2 (IL-2) presentaba
una función importante en la generación de células T supresoras
no-específicas de antígenos. Los anticuerpos
anti-IL-2 producidos en ratones
coinciden con la inducción de la enfermedad injerto contra huésped
producida en algunos casos de LSE (Via, C.S. y col. (1993)
International Immunol. 5:565-572). El que la
IL-2 sea directa o indirectamente importante para
generar la supresión ha sido tema de controversia (Fast, L.D.
(1992), J. Immunol. 149:1510-1515; Hirohata, S. y
col. (1989), J. Immunol. 142:3104-3112; Baylor, CE
(1992), Advances Exp. Med. Biol. 319:125-135.
Recientemente, se ha demostrado que la IL-2 induce
las células CD8+ a suprimir la replicación del VIH en las células T
CD4+ mediante un mecanismo no-lítico. Este efecto
está mediado por citoquinas, aunque todavía no se ha identificado la
citoquina específica (Kinter, Al.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92:10985-10989; Barker, T.D. y col., (1996), J.
Immunol. 156:4478-4483). La producción de
células T de IL-2 está disminuida en el LSE
(Horwitz, D.A. y col., (1997), Dubois Lupus Erytematosus, 5ª Ed.
(1997), pp. 83- 96, D. J. Wallace y col., Eds. Williams and Wilkins,
Baltimore).
Las células T CD8+ de los individuos LSE
mantienen en lugar de suprimir la producción de IgG policlonal
(Linker-Israeli, M. y col. (1990), Arthritis Rheum.
33:1216-1225). Las células T CD8+ de donantes sanos
pueden estimularse para incrementar la producción de Ig (Takahashi,
T. y col., (1991), Clin. Immunol. Immunopath.
58:352-365). Sin embargo, no se ha demostrado que la
IL-2, como las células T CD4+, por ellas mismas,
indujeran las células T CD8+ a desarrollar una actividad
fuertemente supresora. Cuando se incluyeron las células NK
("natural killer" del inglés) en los cultivos, apareció una
actividad fuertemente supresora (Gray y col., (1994) J. Exp. Med.
180:1937-1942). Se cree que la contribución de las
células NK en el cultivo es producir el factor de crecimiento
transformante de tipo beta (TGF-\beta) en su forma
activa. Se descubrió entonces que concentraciones
no-inmunosupresoras (2-10 pg/ml) de
esta citoquina sirven como co-factores para la
generación de efectos fuertemente supresores en la producción de
IgG e IgM (Gray , J.D., y col. (1994) J.Exp. Med.
180:1937-1942). Además, se cree que las células NK
son la principal fuente de TGF-\beta en los
linfocitos no-estimulados (Gray J.D. y col., (1998)
J. Immunol. 160:2248-2254).
TGF-\beta es una familia
multifuncional de citoquinas de importancia en la reparación
tisular, la inflamación y la inmunoregulación (Massague, J. (1980),
Ann. Rev. Cell. Biol. 6:597). El TGF-\beta, a
diferencia de otras muchas citoquinas, se libera de forma inactiva
biológicamente y es incapaz de unirse a receptores específicos
(Sporn, M.B., (1987) J. Cell Biol. 105:1039-1045).
El complejo latente se corta extracelularmente para liberar la
citoquina activa tal como se indicó anteriormente. La respuesta al
TGF-\beta requiere la interacción de dos
receptores de superficie (TGF\beta-R1) y
TGF\beta-R2) descubiertos de forma ubicuitaria en
las células mononucleares (Massague, J. (1992) Cell
69:1067-1070). En consecuencia, la conversión del
TGF\beta latente al activo es la etapa crítica que determina los
efectos biológicos de esta citoquina.
Se halló que los pacientes LSE presentaban una
producción reducida de TGF\beta por las células NK. Los defectos
en el TGF\beta constitutivo producido por las células Nk, así
como el TGF\beta inducido se han documentado en un estudio de 38
pacientes LSE (Ohtsuk, K. y col., (1998), J. Immunol.
160:2539-2545). Curiosamente, ni la adición de
IL-2 recombinante, ni del TNF-alfa,
ni del antagonismo de IL-10 pudieron normalizar el
defecto del TGF\beta en el LSE. La producción reducida de
TGF\beta en el LSE no se correlaciona con la actividad de la
enfermedad y en consecuencia puede ser un defecto primario.
La administración sistémica de un tratamiento a
un paciente LSE con TGF\beta, IL-2 o una
combinación de ambos puede provocar graves efectos secundarios.
Estas citoquinas ejercen numerosos efectos sobre los diferentes
tejidos corporales y no son muy seguras para suministrar a un
paciente por vía sistémica. En consecuencia, es un objetivo de la
presente invención proporcionar procedimientos y equipos para el
tratamiento de células de mamífero que sean responsables para el
control de la regulación de
auto-anticuerpos para incrementar la población de
células que regulen negativamente la producción de
auto-anticuerpos.
En un primer aspecto, la primera invención
proporciona la utilización de células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs) tratadas con IL-2 o
TGF-\beta en la preparación de un medicamento para
el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona la utilización de una composición inhibidora que
comprende la IL-2 o el TGF-B en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno
auto-inmune. Las utilizaciones comprenden la
eliminación de las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) del paciente y el tratamiento de las células con una
composición inhibidora durante un tiempo suficiente para suprimir
la producción de Ig, o estimular, o inducir las células para que
ejerzan una regulación negativa de la producción de Ig. Las células
pueden así ser reintroducidas al paciente, resultando en una mejora
de los síntomas auto-inmunes. La composición
inhibidora comprende preferentemente una combinación de
IL-2 y de TGF-\beta.
La Figura 1 muestra que la incubación de PBMC de
pacientes LSE con IL-2 y
TGF-\beta disminuye espontáneamente la producción
de inmunoglobulinas. Los PBMC se cultivaron (2x10^{5}/célula) en
medio AIM-V libre de suero con o sin
IL-2 (10 U/ml) y TGF-\beta (10
pg/ml). Al cabo de 3 días, los pocillos se lavaron tres veces y se
añadió medio fresco AIM-V. Se recogieron los
sobrenadantes de los pocillos después de 7 días y se determinó el
contenido de IgG mediante un ELISA.
La Figura 2 muestra que la IL-2 y
el TGF-\beta reducen espontáneamente la
producción de IgG. Los valores representan la media \pm SEM de IgG
(\mug/ml) producida por los PBMC de 12 pacientes LSE cultivados
tal como se indica en la leyenda de la figura 1, excepto que las
células se incubaron únicamente con IL-2 (10 U/ml)
o con TGF-\beta (10 pg/ml).
Las Figuras 3A y 3B muestran que el
anti-TGF-B puede invertir los
efectos de la IL-2. Los PBMC de pacientes LSE se
cultivaron durante 3 días en presencia (histogramas rellenos) o
ausencia (histogramas de puntos) de
IL-2
\break(10 U/ml). En dichos cultivos se incluyó el medio, el anti-TGF\beta (10 \mug/ml) o la IgG1 de ratón (10 \mug/ml) como control. Después de 3 días, los pocillos se lavaron y se añadió medio fresco AIM-V. Se recogieron los sobrenadantes después de siete días más y se analizaron para conocer su contenido en IgG (Figura 3A) o anti-NP (Figura 3B) mediante ELISA.
Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran los efectos
reguladores de las células T CD8+ en la producción de anticuerpos.
(A) Sinergismo entre las células NK y las células CD8+ en la
supresión de la producción de IgG en un individuo sano. Las células
CD4+ y las células B se estimularon con anti-CD2 y
se examinaron los efectos sobre las células CD8+ y NK. La
combinación de células NK y CD8+ inhibió de forma importante la
producción de IgG inducida por el anti-CD2, tal como
se indicó anteriormente (Gray, J:D. y col. (1998), J. Immunol
160:2248-2254; Gray, J.D. y col., (1994), J.Exp.
Med. 180:1937-1942). (B) Las células NK y las CD8+
incrementan la síntesis de IgG en el LSE. Las células CD4+ de un
paciente con LSE activo y las células B en reposo de un individuo
sano se estimularon con anti-CD2. El incremento de
la producción de IgG por las células CD8+ LSE fue muy marcado por la
adición de células NK. (C) Normalización de la función de las
células T CD8+ producida por citoquinas en el LSE. Paralelamente, al
estudio mostrado en la Fig. 4B, las células T CD4+ de este paciente
se estimularon con anti-CD2 en presencia o ausencia
de células T CD8+. Según la indicación, se añadió
IL-2 (10 U/ml) y/o TGF-\beta (2
pg/ml). Estas citoquinas eliminaron los efectos auxiliares de estas
células CD8+ y las incapacitaron para inhibir la producción de IgG
en un 75%.
Las Figuras 5A y 5B muestran la producción
linfocitaria de TGF-\beta1 por células
no-estimuladas y estimuladas con
anti-CD-2. Se añadieron los PBL de
donantes sanos y de pacientes LSE y AR a placas de microtitulación a
1x10^{5}células/pocillo. Algunos pocillos recibieron mAbs
anti-CD2 (1:40) y T11 (1:80). Al cabo de 2 días a
37ºC, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para estimar
el TGF-B1 activo y total. Los valores de p
significativos se hallan indicados.
La presente invención facilita un procedimiento
de tratamiento de las enfermedades auto-inmunes
mediadas por anticuerpos, como el lupus sistémicos eritematoso
(LSE), mediante eliminación de las células de un paciente y su
tratamiento con una composición que regula negativamente la
hiperactividad de las células B, e inhibe así la producción de
anticuerpos Ig, incluyendo los auto-anticuerpos,
para mejorar los síntomas de la enfermedad
auto-inmune. Esta estrategia se diferencia de casi
todo el resto de modalidades de tratamiento actualmente en uso, que
son tratamientos anti-inflamatorios o
inmunosupresores. Los corticoides comúnmente utilizados suprimen la
producción de citoquinas y bloquean los eventos terminales que
causan la lesión tisular, pero generalmente no alteran la respuesta
auto-inmune citada. Los fármacos citotóxicos, o los
experimentales biológicos diseñados genéticamente como los
anticuerpos monoclonales pueden también disminuir poblaciones
linfocíticas específicas, o interferir con su función. Estos
fármacos son generalmente de un éxito moderado y presentan graves
efectos secundarios. Algunas citoquinas se han suministrado
sistémicamente a pacientes, pero estos agentes también presentan
acciones amplias asociadas con efectos secundarios graves.
En cambio, la estrategia de la presente invención
es producir una remisión al restaurar una función celular reguladora
normal y, en consecuencia, "reajustar" el sistema inmune. Otra
ventaja potencial significativa de esta estrategia es una baja
probabilidad de efectos secundarios graves. Ya que únicamente serán
devueltos a los pacientes cantidades mínimas de las composiciones
inhibidoras como las citoquinas, lo que representaría una toxicidad
mínima.
En pacientes con LSE, los linfocitos B
circulantes que secretan esponténeamente IgG secretoras se hallan
incrementados (Blaese, R. M., y col. (1980), Am. J. Med.
69:345-350; Klinman, D.M. y col. (1991) Arthritis
Rheum. 34:14004-1410). La producción sostenida de
IgG y anticuerpos policlonales in vitro requiere la
presencia de células T auxiliares (Shivakumar, S. y col. (1989), J.
Immunol 143:103-112). Estudios previos de la
regulación de células T sobre la producción espontánea de IgG
muestran que mientras las células T CD8+ inhiben la producción de
anticuerpos en individuos sanos, en el LSE estas células apoyan la
función de célula B (Linker-Israeli, M. y col.,
(1990), Arthritis Rheum. 33:1216-1225).
Según ello, la presente invención posibilita los
procedimientos de tratamiento de las enfermedades
auto-inmunes mediadas por anticuerpos, comprendiendo
dicho tratamiento la extracción de las células mononucleolares de
sangre periférica (PBMC) del paciente con la enfermedad
auto-inmune y el tratamiento de las células con una
composición inhibidora.
El tratamiento de las células mediante una
composición inhibidora conduce a la supresión directa de la
producción de IgG en las células tratadas, lo que puede conducir a
la mejora de los síntomas auto-inmunes. Alternativa
o adicionalmente, el tratamiento de las células induce que las
células reguladoras regulen negativamente la producción de Ig en
otras células. Las Ig en este contexto abarcan todas las formas de
Ig, incluyendo las IgM, IgG, IgE, etc. El resultado neto es una
disminución de la cantidad de Ig en el sistema.
En consecuencia, la presente invención restaura
la capacidad de las células T de sangre periférica de los pacientes
con enfermedades auto-inmunes para regular
negativamente la producción de anticuerpos, mediante el tratamiento
de estas células con una composición inhibidora ex vivo.
\newpage
El término "enfermedades
auto-inmunes mediadas por anticuerpos" hace
referencia a una enfermedad en la que los individuos desarrollan
anticuerpos contra constituyentes de sus propias células o tejidos.
Las enfermedades auto-inmunes mediadas por
anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, el lupus sistémico
eritematoso (LSE), el pénfigo común, la miastenia gravis, la anemia
hemolítica, la trombocitopenia púrpura, la enfermedad de Grave, la
dermatomiositis y la enfermedad de Sjogren. La enfermedad
auto-inmune modelo es el LSE.
El término "tratamiento" de una enfermedad
auto-inmune hace referencia a que por lo menos se
mejora un síntoma de la enfermedad auto-inmuen
mediante la utilización médica ya citada. Esto puede evaluarse de
muy diferentes maneras, incluyendo tanto los factores objetivos
como los subjetivos en relación con el paciente, por ejemplo, se
pueden evaluar las manifestaciones inmunológicas de la enfermedad;
por ejemplo, el nivel espontáneo de anticuerpos Ig y la producción
de auto-anticuerpos, en particular la producción de
IgG en el caso del LSE se reduce. Se pueden cuantificar los niveles
totales de anticuerpos Ig, o de
auto-anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a,
los anticuerpos anti-DNA de cadena doble (dsDNA),
los anticuerpos anti-nucleoproteínas,
anti-Sm, anti-Rho y
anti-La. Se pueden alterar los síntomas físicos,
como la desaparición o la reducción de una erupción en el LSE. Se
pueden analizar las funciones renales para determinar sus
alteraciones y se puede evaluar la lesión tisular relacionada con
la inflamación mediante análisis de laboratorio. Los niveles
disminuidos de los complejos inmunes circulantes y de los niveles
del complemento del suero son una evidencia más de la mejoría. En
el caso del LSE, se puede observar una disminución de la anemia. La
capacidad para disminuir la cantidad de fármacos requeridos por un
paciente, como los inmunosupresores, puede también ser una
indicación del éxito del tratamiento. Otras evaluaciones del éxito
del tratamiento serán evidentes para los expertos en la materia de
la enfermedad auto-inmune en particular.
El término "paciente" significa un sujeto
mamífero a tratar, preferentemente pacientes humanos. En algunos
casos, las utilizaciones de la invención hallan una utilización con
animales de experimentación, en la aplicación veterinaria y en el
desarrollo de modelos animales de la enfermedad, incluyendo, pero
sin limitarse a, roedores incluyendo ratones, ratas y hámsteres y
los primates.
Las utilizaciones médicas proporcionan los medios
para extraer las células sanguíneas de un paciente. En general, las
células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se obtienen del
paciente mediante técnicas estándares. El término "células
mononucleares de sangre periférica" o "PBMCs" hace
referencia a los linfocitos (incluyendo las células T, las células
B, las células NK, etc.) y los monocitos. Como se indica más
adelante de forma más completa, parece ser que el efecto principal
de la composición inhibidora es permitir que las células T CD8+
supriman la producción de IgG. Según ello, la población de PBMC
comprendería las células T CD8+. Preferentemente, se extraen
únicamente las células PBMC, dejando o retornando prácticamente
todas los eritrocitos y leucocitos polimorfonucleados al paciente.
Esto se realiza tal como se conoce en la materia, por ejemplo,
utilizando técnicas de leucoforesis. En general, se realiza una
etapa de leucoforesis de 5 a 7 litros, que extrae esencialmente las
PBMCs del paciente, devolviendo los componentes sanguíneos
restantes. La toma de muestra celular se realiza preferentemente en
presencia de un anticoagulante como la heparina, bien conocida en
la materia.
En general, la muestra que comprende las PBMCs se
puede pretratar de muy diversas maneras. Las células, una vez
recogidas, se pueden además concentrar, si no se ha realizado
simultáneamente con la recogida de muestras, o se puede realizar
posteriormente con la purificación. Las células se pueden lavar,
contar y resuspender en un tampón.
Las PBMCs se concentran generalmente para el
tratamiento, utilizando técnicas estándares en la materia. En una
realización preferida, la etapa de leucoforesis proporciona una
muestra concentrada de PBMCs, en un leukopak estéril que
puede contener reactivos y/o dosis de la composición inhibidora, tal
como se describe más adelante con mayor detalle. En general, se
realiza una etapa adicional de concentración/purificación, como la
conocida centrifugación en gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque.
En una realización preferida, las PBMCs se lavan
para eliminar las proteínas séricas y los componentes sanguíneos
solubles, como los auto-anticuerpos, los
inhibidores, etc., utilizando técnicas bien conocidas en la materia.
En general, esto implica la adición de medios o tampones
fisiológicos, seguido de una centrifugación. Este lavado se
repetirá tantas veces como sea necesario. Las PBMCs se pueden
resuspender en medio fisiológico, preferentemente en medio
AIM-V libre de suero (Life Technologies)(ya que el
suero contiene cantidades significativas de inhibidores), aunque
también se pueden utilizar los tampones como la solución salina
equilibrada de Hanks (HBSS), o la solución fisiológica salina
tamponada.
A continuación, las células se cuentan y se
recogen generalmente de 1x10^{9} a 2x10^{9} glóbulos blancos de
la etapa de leucoforesis de 5-7 litros. Estas
células se resuspenden en 200 ml de tampón o medio.
En una realización preferida, las PBMCs se pueden
enriquecer en uno o más tipos celulares. Por ejemplo, las PBMCs se
pueden enriqueces en células T CD8+ o T CD4+. Esto se realiza tal
como se conoce en la materia, como se describe en Gray y col.
(1998) J. Immunol. 160:2248, incorporado aquí mediante referencias.
En general, esto se realiza utilizando columnas inmunoabsorbentes
disponibles comercialmente, o utilizando procedimientos de
investigación (las PBMCs ser añaden a un columna de lana de nylon y
se eluyen, las células no adherentes se tratan con los anticuerpos
contra CD4, CD16, CD11b y CD74 y se prosigue con el tratamiento con
bolas inmunomagnéticas, obteniéndose una población enriquecida en
células T CD8+).
\newpage
Una vez que las células han sufrido cualquier
pretratamiento necesario, se tratan con una composición inhibidora.
El término "tratado" significa que las células se incuban con
la composición inhibidora durante un periodo de tiempo suficiente
para desarrollar la capacidad de inhibir la producción de Ig y de
auto-anticuerpos, en particular cuando se devuelve
al paciente. La incubación se realizará generalmente a temperatura
fisiológica. Tal como se indicó anteriormente, esto puede ser el
resultado de la supresión directa de la producción de Ig por las
células tratadas, o de la inducción de células reguladoras para
regular negativamente la producción de Ig en los órganos linfoides
de los pacientes.
El término "composición inhibidora" o
"composición inhibidora de la producción de Ig" o
"composición inhibidora humoral" hace referencia a una
composición que puede causar la inhibición de la producción
espontánea de Ig y auto-anticuerpos. Estas
composiciones son las citoquinas. Las composiciones inhibidoras
adecuadas incluyen la IL-2, el
TGF-\beta y los activadores de CD2, incluyendo los
anticuerpos anti-CD2 y el ligando CD2, el
LFA-3, así como las mezclas o combinaciones de
éstos. Una composición inhibidora preferida es una mezcla de
IL-2 y TGF-\beta.
La concentración de la composición inhibidora
variará según la identidad de la composición. En una realización
preferida, se utiliza el TGF-\beta como la
composición inhibidora. El término "factor de crecimiento
transformante -\beta" o "TGF-\beta" hace
referencia a cualquier miembro de la familia de los
TGF-\betas, incluyendo las tres isoformas de
\hbox{TGF- \beta 1}, TGF-\beta2 y TGF-\beta3; ver Massague, J. (1980). J. Ann. Rev. Cell. Biol. 6:597. Lymphocytes and Monocytes produce the \beta1 isoform of this cytokine (Kehrl, J. H. y col., (1991), Int. J. Cell Cloning 9:438-450). El TGF-\beta puede ser cualquier forma de TGF-\beta que sea activa en las células de mamífero a tratar. En los humanos, se prefiere actualmente el
\hbox{TGF- \beta }recombinante. Un TGF-\beta humano preferido puede obtenerse de Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA. En general, la concentración de TGF-\beta utilizada varía desde 2 pg a aproximadamente 2 ng por ml de suspensión celular, preferentemente de 10 pg a aproximadamente 500 pg y todavía más preferentemente de 50 pg a 150 pg e idealmente de 100 pg.
En otra realización preferida, se utiliza la
IL-2 como composición inhibidora. La
IL-2 puede ser cualquier forma de
IL-2 que sea activa en las células de mamífero a
tratar. En humanos, se prefiere actualmente la IL-2
recombinante. Esta IL-2 recombinante puede
obtenerse de Cetus, Emeryville, CA. En general, la concentración de
IL-2 que se utiliza se halla en un intervalo de 1
Unidad/ml de suspensión celular a aproximadamente 100 U/ml,
preferentemente de
\break5 U/ml a aproximadamente 25 U/ml y más preferentemente de 10 U/ml. En una realización preferida, la IL-2 no se utiliza sola.
En una realización preferida, un activador de CD2
como los anticuerpos anti-CD2 o el ligando de CD2,
LFA-3, se utilizan además en la composición
inhibidora. El CD2 es una glicoproteína de superficie celular que
se expresa en los linfocitos T. El término "activador de CD2"
hace referencia a un compuesto que iniciará la vía de señalización
de CD2. Un activador de CD2 preferido comprende los anticuerpos
anti-CD2 (OKT11, American Type Culture Collection,
Rockville MD). En general, la concentración utilizada del activador
de CD2 será suficiente para inducir la producción de
TGF-\beta. La concentración de los anticuerpos
anti-CD2 utilizada se halla en un intervalo de
aproximadamente
\break1 ng/ml a 10 \mug/ml y preferentemente de 10 ng/ml a 100 ng/ml aproximadamente.
Además de utilizar una composición inhibidora, en
algunas realizaciones es deseable utilizar un mitógeno para activar
las células; dado que muchas de las células en fase de reposo no
contienen grandes cantidades de receptores de citoquinas. La
utilización de un mitógeno como la Concanavalina A puede permitir
la estimulación de las células para producir los receptores de
citoquinas, que a su vez harán que la utilización de la invención
sea más eficaz. Cuando se utiliza un mitógeno como la ConA, se
utiliza generalmente tal como se conoce en la materia, a
concentraciones en un intervalo de 1 \mug/ml a aproximadamente 10
\mug/ml. Además, puede ser deseable lavar las células con
componentes que eliminen la ConA, como la
\alpha-metil-manósido, tal como se
conoce en la materia.
La composición inhibidora se incuba con las
células durante un período de tiempo suficiente para causar un
efecto. En una realización preferida, el tratamiento de las células
con la composición inhibidora se prosigue inmediatamente con la
devolución de las células al paciente. Según ello, en una
realización preferida, las células se incuban con la composición
inhibidora durante 12 a 120 horas, preferentemente 24 a
aproximadamente 72 horas y más preferentemente 48 horas.
En una realización, las células se tratan durante
un período de tiempo, se lavan para eliminar la composición
inhibidora y luego pueden reincubarse. Antes de la introducción en
el paciente, las células se lavan preferentemente, tal como se
indicó anteriormente, para eliminar la composición inhibidora.
Además, también se pueden realizar incubaciones para el análisis o
la evaluación, que pueden variar desde una pocas horas a varios
días. Si se desea realizar la evaluación de la producción de Ig
antes de la re-introducción de las células a un
paciente, las células se incubarán durante varios días para
permitir que tenga lugar la producción de Ig (o la falta de lo
mismo).
Una vez que se han tratado las células, se pueden
evaluar o analizar antes de su autotransplantación en el paciente.
Por ejemplo, se puede extraer una muestra para realizar: análisis
de esterilidad; tinción de Gram., estudios microbiólogicos;
estudios de LAL; estudios de micoplasmas; citometría de flujo para
identificar los tipos celulares; estudios funcionales, etc. De
manera similar, estos y otros estudios se pueden realizar antes y
después del tratamiento.
\newpage
En una realización preferida, se puede evaluar la
cantidad o la calidad, es decir, tipo de producción de Ig. Así, por
ejemplo, se pueden evaluar los niveles totales de Ig, o los niveles
de tipos específicos de Igs, por ejemplo, IgG, IgM, etc.; IgG,
auto-anticuerpos anti-DNA,
anticuerpos anti-nucleoproteínas (NP), etc.
En una realización preferida, los niveles de Ig,
en particular IgG, se analizan utilizando técnicas bien conocidas en
la materia, incluyendo ensayos ELISA, tal como se describe en Abo y
col., (1987), Clin. Exp. Immunol. 67:544 y
Linker-Israeli y col., (1990), Atrhritis Rheum.
33:1216, incorporados ambos en las referencias. Estas técnicas
también se pueden utilizar para detectar los niveles de anticuerpos
específicos, como los auto-anticuerpos.
En una realización preferida, el tratamiento da
como resultado una disminución significativa de la cantidad de IgG y
de los auto-anticuerpos producidos, preferentemente
con una disminución por lo menos del 10%, más preferentemente de
por lo menos del 25% e idealmente del 50%. En muchas realizaciones,
se pueden observar disminuciones del 75% o superior.
En una realización preferida, antes del
transplante, también se puede analizar la cantidad de
TGF-\beta total o activo. Tal como se indica aquí,
el TGF-\beta se produce como un precursor
latente que se activa
post-traduccionalmente.
Después del tratamiento, las células se
transplantan o se reintroducen de nuevo en el paciente. Ello se
realiza generalmente, tal como se conoce en la materia, y comprende
la inyección o la introducción de las células tratadas en el
paciente, mediante administración intravenosa, como se apreciará por
los expertos en la materia. Por ejemplo, las células pueden
colocarse en una bolsa de infusión e inyectrse con jeringas
estériles u otros mecanismos de transferencia estériles. Las
células se pueden infundir inmediatamente mediante administración
i.v. durante un período de tiempo, como por ejemplo 15 min,
mediante una línea de flujo i.v. libre en el paciente. En algunas
realizaciones, se pueden añadir también reactivos adicionales como
tampones o sales.
Después de reintroducir las células en el
paciente, se puede evaluar el efecto del tratamiento, si se desea,
tal como se indicó anteriormente. Así, se pueden evaluar las
manifestaciones inmunológicas de la enfermedad; por ejemplo, se
pueden analizar los títulos de Ig totales o de inmunoglobulinas
específicas, realizar pruebas de funciones renales, evaluar la
lesión tisular, etc.
El tratamiento se puede repetir tantas veces como
sea necesario. Por ejemplo, el tratamiento puede realizarse una vez
a la semana durante de varias semanas, o muchas veces a la semana
durante un determinado período de tiempo, por ejemplo
3-5 veces durante un período de dos semanas. En
general, la mejora de los síntomas de la enfermedad
auto-inmune persiste durante cierto tiempo,
preferentemente durante por lo menos unos meses. Con el tiempo, el
paciente puede experimentar una recaída, sufriendo de nuevo los
síntomas, por lo que en esas circunstancias se pueden repetir los
tratamientos.
Los siguientes ejemplos sirven para describir más
completamente la manera de utilizar la invención anteriormente
descrita, así como para exponer los mejores modos contemplados para
llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se sobreentiende
que estos ejemplos se presentan con propósito ilustrativo.
El ejemplo 1 muestra que el tratamiento
relativamente breve de las PBMCs de pacientes LSE con
IL-2 y TGF-\beta puede dar como
resultado la inhibición marcada de la producción espontánea de IgG
y auto-anticuerpos policlonales. Como se describe
más adelante, las PBMC de 12 pacientes con LSE activo se expusieron
a IL-2 con o sin TGF-\beta durante
3 días y luego se lavaron y cultivaron siete días más. La
disminución media en la secreción de IgG fue del 79%. Este efecto
fuertemente inhibidor se observó en los casos con la mayor
hiperactividad de células B. En 4 casos, se observó producción
espontánea de anticuerpos anti-nucleoproteínas
(NP) y el tratamiento con citoquinas de las PBMC disminuyó la
producción de auto-anticuerpos del 50% al 96%. La
IL-2 inhibió la producción de Ig mediante
mecanismos dependientes o independientes de
TGF-\beta en pacientes aislados. En un estudio
sobre la producción de IgG estimulada por anti-CD2
en un paciente con LSE activo, se observó que tanto la
IL-2 como el TGF-\beta pueden
invertir los efectos incrementadores de las células T CD8+ sobre la
producción de IgG e inducir en su lugar una actividad supresora.
Se eligieron 12 individuos con un diagnóstico de
LSE que cumplían con el criterio ARA para la clasificación de LSE
(Arnett, F.C. y col., (1998), Athritis Rheum
31:315-324). Estos pacientes fueron todas mujeres, 8
hispanas, 2 afro-americanas y 2 asiáticas. La
edad de cada paciente y la duración de la enfermedad se muestra en
la Tabla 1. Se hospitalizaron cinco pacientes y 7 fueron pacientes
externos. También se han indicado los pacientes que recibieron
corticosteroides o antimalariales. Ocho pacientes no se trataron. La
actividad de la enfermedad se valoró según los índices SLAM (Liang,
M.H. y col. (1989), Atrhritis Rheum 32:1107-1118) y
SLEDAI (Bombardier, C. y col., (1992), Arthritis Rheum.
35:630-640) con valores medios de 16,5 y 13,4,
respectivamente.
Perfil de los pacientes LSE | ||||||||
Caso | Sexo | Edad | Etnia | Duración | Medicación | SLAM | SLEDAI | IgG (\mug/ml) |
1 | F | 18 | A | 3 años | Nil | 13 | 9 | 13,7 |
2 | F | 37 | H | 6 meses | Nil | 23 | 13 | 13,0 |
3 | F | 29 | H | 1 año | Nil | 15 | 6 | 2,6 |
4 | F | 32 | AA | 4 años | Pred 5 mg | 9 | 6 | 2,5 |
Ohclor 400 mg | ||||||||
5 | F | 57 | A | 5 meses | Nil | 24 | 19 | 2,2 |
6 | F | 55 | H | 5 meses | Nil | 23 | 22 | 1,5 |
7 | F | 27 | H | 3 años | Pred 5 mg | 13 | 17 | 1,0 |
Ohclor 400 mg | ||||||||
8 | F | 21 | HH | 2 años | Nil | 18 | 13 | 1,0 |
9 | F | 36 | A | 15 años | Pred 5 mg | 14 | 8 | 0,8 |
Ohclor 400 mg | ||||||||
Aza 25 mg | ||||||||
10 | F | 41 | H | 4 años | Nil | 15 | 16 | 0,5 |
11 | F | 20 | H | 6 años | Pred 25 mg | 11 | 16 | 0,4 |
12 | F | 25 | 1 año | Nil | 21 | 16 | 0,4 |
El TGF-\beta recombinante y el
anticuerpo monoclonal
anti-TGF-\beta (1D11.16) y una
IgG1 murina fueron proporcionados por el Dr. Bruece Prat (Genzyme
Pharmaceuticals, Farmington, MA). La IL-10
recombinante y el anticuerpo monoclonal anti-IL10
(JES3-19F1) y la IgG2a de rata control fueron
proporcionados por el Dr. Satwant Narula (Schering Plough
Pharmaceuticals, Kenilworth, NJ). La proteína de mieloma IgG1
murina control se obtuvo de Calbiochem, San Diego, CA. La
IL-2 humana recombinante se obtuvo de Chiron,
Emmervylle, CA. Los hibridomas secretores de anticuerpos
anti-CD2, OKT11, se obtuvieron del American Type
Culture Collection (ATCC), Rockville, el MD y GT2 fueron
proporcionados generosamente por A. Bernard, Niza, Francia). Otros
anticuerpos incluyeron: anti-CD4 (OKT4, ATCC),
anti-CD8 (OKT8, ATCC; CD8, Dako, Carpenteria, CA),
anti-CD11b (OKM1, ATC),
anti-CD16(3G8) proporcionados por J.
Unkeless, New York, NY); el anti-CD20 (Leu 16,
Becton Dickinson, San Jose, CA) y el anti-CD47
(L243, ATCC).
Las células mononucleares de sangre periférica
(PBMC) se prepararon a partir de sangre venosa heparinizada mediante
centrifugación en gradiente de densidad (Pharmacia, Piscataway,
NJ). Luego se lavaron con PBS y EDTA 5 mM (Life Technologies, Grand
Island, NY) para eliminar las plaquetas, ricas en
TGF-\beta.
Los procedimientos del cultivo celular se han
descrito previamente (Wahl, S.M. (1994), J.Exp. Med.
180:1587-1590; Gray, J.D. y col., (1998), J Immunol
160:2248-2254). En resumen, se cultivaron 2x10^{5}
células PBMC en medio AIM-V sin suero (Life
Technologies) en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo
plano, con o sin las citoquinas indicadas. Al cabo de tres días de
cultivo, las PBMC se lavaron tres veces y luego se añadión medio
fresco sin suero. Después de 7 días más a 37ºC, se recogieron los
sobrenadantes y se valoró su contenido en IgG y
auto-anticuerpos reactivos con nucleoproteína de
timo de ternera (NP) mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima en fase sólida (ELISA), tal como se describió anteriormente
(Linker-Israeli, M. y col. (1990), Arthritis Rheum
33:1216-1255). Las lecturas de densidad óptica (OD)
se transformaron en unidades/ml (U/ml) a partir de una curva
estándar utilizando estándares positivos y negativos. Se utilizaron
como controles los sobrenadantes del cultivo de PBMC de los
pacientes LSE (con títulos elevados de anticuerpos
anti-NP) y los de individuos normales.
Los resultados se analizaron utilizando un
programa de Prism, Graph Pad (San Diego, CA). Se utilizó el análisis
de la varianza (ANOVA) después de la transformación logarítmica de
los resultados y del test de Mann-Whitney no
paramétrico.
Los efectos de las células T CD8+ cultivadas con
o sin células NK sobre las células T CD4+ estimuladas por
anti-CD2 y las células B se examinaron en un
paciente con LSE y en un control normal. Las células CD4+ y CD8+ se
prepararon a partir de linfocitos no-adherentes al
nylon mediante selección negativa con bolas inmunomagnéticas, tal
como se describió anteriormente (Gray, J.D. y col., (1998), J.
Immunol 160:2248-2254). Para obtener células CD4+,
las células no-adherentes al nylon se
tiñeron con anticuerpos contra CD8, CD16, CD11b y CD74. Los mismos
anticuerpos se utilizaron para obtener células CD8+, excepto que se
sustituyó el CD4 por el CD8. La pureza de las células CD4+ fue del
95% y del 89% para CD8+. Para obtener células NK, se añadieron las
PBMC a una columna de lana de nylon y se eluyeron, las células
no-adherentes se aglutinaron inmediatamente formando
una roseta con los eritrocitos de oveja tratados con AET. La
fracción no aglutinada se tiñó con anticuerpos
anti-CD3 y anti-CD4
(anti-HLA-DR) y se eliminaron las
células reactivas utilizando bolas inmunomagnéticas (Dynal). Esta
población resultante contenía el 98% de linfocitos CD56+ y <0,5%
de CD3+ y <0,5% de CD20+. Dado que las células LSE secretan
espontáneamente grandes cantidades de IgG y que se necesita una gran
cantidad de sangre para preparar un número suficiente de células B
para estos estudios, se sustituyeron las células B de un individuo
donante sano por las células B de un paciente en este estudio. Para
obtener las células B, las células adherentes a la lana de nylon se
aglutinaron inmediatamente con SRBC para eliminar las células T y
se trataron con éster de metil L-leucina 5 mM para
eliminar completamente los monocitos y las células NK funcionales.
La población resultante fue >92% CD20+ y <0,5% CD3+.
En 12 pacientes estudiados, las IgG espontáneas
se hallaron en un intervalo de 0,4 a 13,7 \mug/ml (Fig.1). La
exposición de PBMC a
IL-2+TGF-\beta durante 72 horas
disminuyó la síntesis de IgG en 8 de los 12 casos estudiados en por
lo menos el 50% (media de disminución del 79%, p=0,008, Mann
Whitney). Las disminuciones más dramáticas se observaron en los
casos con mayor hiperactividad de células B. La correlación entre
la cantidad de IgG secretada y el porcentaje de inhibición por
Il-2 y TGF-\beta fue de r=0,647,
p=0,02.
Se compararon los efectos de la
Il-2 y el TGF-\beta solos con los
resultados de la combinación de IL-2 y
TGF-\beta. La Fig. 2 muestra que estas citoquinas
también inhibían la producción de IL-2. Sin embargo,
después de la transformación logarítmica para lograr una
distribución normal de los resultados y aplicar la corrección de
Bonnferoni para comparaciones múltiples, los análisis de varianza
mostraron que sólo la combinación de IL-2 y
TGF-\beta daban como resultado una inhibición
significativa (p=0,05).
En el LSE, la producción de IL-10
está aumentada (Llorente, L. y col., (1993), Eur. Cytokine Network
4:421-427), pudiendo inhibir dicha citoquina la
producción de Il-2 y de
TGF-\beta. En 9 casos también se valoró el efecto
del anti-Il10, pero sólo se observó una modesta
reducción de la síntesis de IgG en algunos individuos y esta
diferencia no fue estadísticamente significativa. De igual modo, la
producción del TNF-\alpha también disminuyó en un
subgrupo de pacientes con LSE (Jacob, C.O. y col., (1990), Proc.
Natl. Acad Sci 87:1233-1237). Aunque esta citoquina
también incrementa la producción del TGF-\beta
activo (Ohtsuka, K. y col., (198), J. Immunol
160:2539-2545), la adición de
\hbox{TNF- \alpha }a los cultivos presentó efectos mínimos (resultados no mostrados). También se examinaron los PBMC LSE para su producción espontánea de auto-anticuerpos anti-NP y se hallaron títulos significativos en 4 casos. En todos los casos, la exposición de PBMC a la IL-2 o a la IL-2 y TGF-\beta inhibieron la producción de anti-NP por lo menos en un 50%. El propio TGF- \beta fue ineficaz (Tabla 2). En estos casos, los efectos de la IL-2 sola fueron equivalentes a la combinación de IL-2 y TGF-\beta.
Efecto del tratamiento de PBMC con IL-2 y TGF-\beta en la producción espontánea de auto-anticuerpos en el LSE | ||||
Anticuerpos anti-nucleoproteínas (U/ml) | ||||
Tratamiento con citoquinas | Caso A: | Caso B: | Caso C: | Caso D: |
Nil | 308 (100)* | 312(100) | 25(100) | 73(100) |
TGF-\beta (10 pg/ml) | 282(92) | 298(96) | 26(104) | ND |
IL-2 \textamp TGF-\beta | 29(10) | 14(4,5) | 12(48) | 35(48) |
IL-2 | 23(7,5) | 10(3) | 11(44) | ND |
* Porcentaje de niveles basales. |
Las PBMC de pacientes LSE se expusieron a
IL-2 (10 u/ml) y TGF-\beta (10
pg/ml) durante 72 horas. Las células se lavaron durante 7 días
adicionales. Se cuantificaron los anti-NP liberados
en los sobrenadantes mediante un ELISA.
Con anterioridad se había publicado que la
IL-2 incrementa la producción del
TGF-\beta activo biológicamente
\break(Ohtsuka, K. y col., (1998), J Immunol 160:2539-2545). Es, por tanto, posible que por lo menos algunos de los efectos de la IL-2 sobre la síntesis espontánea de Ig estuviera mediado por el TGF-\beta. Esta posibilidad se investigó determinando si los efectos de la IL-2 podían ser invertidos por el anticuerpo neutralizante anti-TGF-\beta. En el ejemplo mostrado en la Fig. 3A, la adición de anti-TGF-\beta no afectó la síntesis espontánea de IgG. El antagonismo del
\hbox{TGF- \beta ,}sin embargo, no eliminó los efectos inhibidores de la IL-2 sobre la síntesis de IgG. Las PBMC de este paciente (Caso C en la Tabla 2) también produjeron espontáneamente anticuerpos anti-NP. Aquí también el anti-TGF-\beta eliminó los efectos inhibidores de la IL-2 en la producción de anti-NP (Fig. 3B). En este individuo, por tanto, los efectos inhibidores de la IL-2 en la síntesis espontánea de IgG y autoanticuerpos estuvo mediada por el TGF-\beta. Este efecto de anti-TGF-\beta se documentó en 4 de 8 casos estudiados. Así, los efectos inhibidores de IL-2 podían ser dependientes o independientes del TGF-\beta. Ejemplos de cada efecto se muestran en la Tabla 3.
Efecto de la IL-2 y el TGF-\beta en la síntesis espontánea de IgG en el LSE | ||
Citoquinas añadidas | Paciente A: inhibición de IgG | Paciente B: inhibición de IgG |
dependiente de TGF-\beta (\mug/ml) | independiente de TGF-\beta (\mug/ml) | |
Medio sólo | 2,5 (100) | 2,6(100) |
TGF-\beta (10 pg/ml) | 1,4(56) | 2,5(96) |
IL-2 \textamp TGF-\beta | 0,4(16) | 0,5(19) |
IL-2 \textamp anti-TGF-\beta | 11,6(464) | 0,5(19) |
IL-2 \textamp IgG | 3,6(144) | 0,6(23) |
* Porcentaje del nivel basal de síntesis de IgG |
Tuvimos la oportunidad de repetir el estudio en
pacientes LSE 28 días después de iniciar la terapia con esteroides
(Tabla 4). Antes del tratamiento, la síntesis espontánea de IgG fue
superior a 2 \mug/ml de IgG. La exposición de las PBMC a
IL-2 inhibió fuertemente la producción de IgG y el
TGF-\beta tuvo un efecto moderado. Después de la
terapia con corticosteroides, la producción espontánea de IgG
disminuyó un 75%. Como antes, la exposición de PBMC
a
\breakIL-2 \pm TGF-\beta disminuyó la producción al 50%. Sin embargo, esta inhibición fue invertida por el anti-TGF-\beta. De nuevo, este efecto de la IL-2 podía explicarse por la regulación positiva del TGF-\beta activo endógeno.
Efecto de la terapia corticosteroidea en la síntesis espontánea de IgG en el LSE | ||
Citoquinas añadidas | Antes del tratamiento, Día 0 | Después del tratatamiento, Día 28 |
Nil | 2,2 | 0,6 |
TGF-\beta (10 pg/ml) | 1,2 | 0,4 |
IL-2 (10 U/ml) | 0,4 | 0,3 |
IL-2 \textamp TGF-\beta | 0,7 | 0,3 |
IL-2 \textamp anti-TGF-\beta | ND | 0,8 |
IL-2 \textamp IgG | ND | 0,6 |
* Porcentaje del nivel basal de la síntesis de IgG |
De acuerdo con nuestros estudios previos en
individuos sanos, en donde la IL-2 y el
TGF-\beta pueden inducir las células T CD+ a
regular negativamente la producción de Ig, se intentó aislar y
tratar las células T CD8+ de pacientes LSE en este estudio. Estos
experimentos se realizaron sin éxito debido a la gran variabilidad
de síntesis espontánea de Ig y a la gran cantidad de sangre que se
necesitaba de pacientes con LSE activa para los procesos de
separación. Sin embargo, fue posible obtener bastante sangre de un
paciente con LSE activo para investigar el efecto de
IL-2 y TGF-\beta en la modulación
de células T CD8+ sobre la síntesis de IgG inducida por
anti-CD2. Recientemente, se ha publicado que a
deiferencia del anti-CD3, una combinación mitogénica
de anticuerpos monoclonales anti-CD2 no induce la
producción de IgG en los PBL (Gray, J.D. y col. (1989), J Immunol
160:2248-2254). Esto es debido a que el
anti-CD2 estimulaba las células NK a producir
TGF-\beta, que a su vez inducía las células T
CD8+ a regular negativamente la producción de Ig (Gray, J.D.,
(1998), J Immunol 160:2248-2254). En este paciente,
tal como se publicó anteriormente (Gray, J.D. y col. (1994), J Exp.
Med 180:1937-1942), las células T CD8+
incrementaron la síntesis de IgG y este incremento fue fuertemente
potenciado por la combinación de células NK y células T CD8+ (Fig.
4A). En cambio, la IL-2 y el
TGF-\beta eliminaron los efectos auxiliares de las
células T CD8+ de LSE e incapacitaron estas células para suprimir
la producción de IgG. Este efecto inhibidor de la
IL-2 y el TGF-\beta fue
dependiente de la presencia de células T CD8+ (Fig. 4B). Así, se
obtuvieron evidencias de que los efectos de IL-2 y
del TGF-\beta podían estar mediados por las
células T CD8+.
Estos estudios demostraron que una exposición
corta de PBMC a IL-2 y TGF-\beta
puede disminuir en gran manera la producción espontánea posterior de
IgG y autoanticuerpos policlonales en el LSE, especialmente en
pacientes con enfermedad severa e hiperactividad de células B
marcadas. Este estudio confirma las publicaciones anteriores, al
indicar que la IL-2 puede inhibir la producción de
anticuerpos (Hirohata, S. y col. (1989), J Immunol
142:3104-3112 y Fast, L.D. (1992), J Immunol
149:1510-1515) y muestra que las concentraciones
picomolares del TGF-\beta pueden
contribuir a esta regulación negativa. En el grupo de 12 pacientes
estudiados, el efecto inhibidor de la IL-2 y del
\hbox{TGF- \beta }sobre la síntesis de IgG policlonal fue mayor que el efecto de la IL-2 sola. Sin embargo, los efectos inhibiodores de la IL-2 fueron heterogéneos. En 4 de 8 casos estudiados, la inhibición fue dependiente del TGF-\beta, dado que un anti-TGF-\beta neutralizante eliminó el efecto. En los caos restantes, los efectos reguladores negativos de la IL-2 fueron independientes del TGF-\beta. De modo similar, se ha documentado la inhibición dependiente e independiente del TGF-\beta de la producción espontánea de autoanticuerpos anti-NP. También se investigaron los efectos de antagonización de la IL10 y de la adición del TNF-\alpha por haberse descrito con anterioridad anomalías en la producción de estas citoquinas en el LSE (Llorente L. y col., (1993), Eur. Cytokine Network 4:421-427; Jacob, C.O. y col., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87:1223-1237). Estos procedimientos, sin embargo, tuvieron mínimos efectos sobre la síntesis espontánea de Ig si los linfocitos se habían activado previamente.
Otros autores han publicado que el grado de
hiperactividad de las células B en el LSE se correlaciona con la
actividad de la enfermedad (Blaese, R.M. y col. (1980), Am. J. Med.
69:345-350; Klinman, D.M. y col., (1991), Arthritis
Rheum 34:1404-1410). Hecho que no se produjo en el
presente estudio, debido probablemente a la terapia de fármacos
concurrente. En general, los pacientes con síntesis espontánea de
Ig marcada no estaban en tratamiento, en cambio los pacientes con
menos actividad de células B estaban actualmente recibiendo
prednisona. Presentamos un caso en donde la síntesis espontánea de
IgG disminuyó de forma marcada después de iniciarse la terapia con
corticosteroides. Estas células B del paciente también secretaban
anticuerpos anti-NP antes del tratamiento, pero
después de la terapia con esteroides la producción de este
auto-anticuerpo fue indetectable (resultados no
mostrados).
El TGF-\beta consiste de una
familia multifuncional de citoquinas importante en la reparación
tisular, inflamación e inmunoregulación (Massague, J. (1990), Annu
Rev Cell Biol 6597-641). El
TGF-\beta se diferencia de muchas otras
citoquinas en que se secreta como una molécula precursora inerte y
se convierte en su forma biológica activa extracelularmente
(Massague, J (1990), Annu Rev Cell Biol 6597-641;
Flaumenhaft, R. y col. (1993), Adv. Pharmacol
24:51-76). Las células reguladoras T en diversos
modelos auto-inmunes experimentales como la
encefalitis auto-inmune experimental (Weiner, H.L. y
col., (1994), Annu Rev Immunol 12:809-837) y la
colitis (Neurath, MF y col. (1996), J. Exp Med
183:2605-2516) producen esta citoquina. El
TGF-\beta es inmunosupresor a concentraciones
nanomolares y puede inhibir la proliferación de células T y B, la
actividad citotóxica de células NK y la generación de citotoxicidad
de células T (Letterio, JJ y col., (1998), Ann Rev Immunol
16:137-162). Por el contrario, se ha publicado que
el
\hbox{TGF- \beta }promueve el crecimiento de células CD4+ y de CD8+ (Kehrl, J.H. y col. (1986), J Exp Med 163:1037-1050; Lee, H M y col. (1993), J Immunol 151:668-677) y puede promover la diferenciación de células B (Van Vlasselaer, P. y col. (1992), J Immunol 148:2062-2067).
En nuestros estudios previos con linfocitos de
individuos sanos para generar células T reguladoras, las
concentraciones picomolares del TGF-\beta
utilizadas fueron menores que las requeridas para la inhibición de
la función de células T o B (Gray, J. D. y col., (1998), J Immunol
160:2248-2254; Gray, J.D. y col (1994), J. Exp. Med
180:1937-1942). Las concentraciones similares se
utilizaron en los estudios presentes con pacientes LSE y el propio
TGF-\beta tuvo efectos inhibidores modestos en la
síntesis de Ig. Como antes, una combinación de IL-2
y TGF-\beta produjo la inhibición más potente. En
nuestros estudios previos, este efecto fue mediado por células T
CD8+.
La IL-2 tiene efectos bien
establecidos sobre la inducción de la actividad de células
supresoras T (Hirohata, S. y col., (1989), J. Immunol
142:3104-3112; Fast, L.D. J Immunol
149:1510-1515), pero todavía no está claro si estos
efectos son directos o indirectos. En el ratón, la deleción del gen
de IL-2 da como resultado una linfoproliferación
masiva y la enfermedad auto-inmune (Sadlack, B. y
col., (1995), Eur. J. Immunol 25:3053-3059). En el
LSE, se describió una correlación negativa entre los niveles de
IL-2 y la hiperactividad de células B (Huang, Y.P. y
col. (1988), J Immunol 141:827-833). Anteriormente,
se había intentado inhibir la producción espontánea de Ig en el LSE
con IL-2, pero, sin embargo, los resultados fueron
extremadamente variables. Mientras en algunos casos se observó una
fuerte inhibición, en otros la IL-2 incrementó de
forma importante la producción de Ig. Por lo que se cree que el
tiempo y el entorno de citoquinas explican la inhibición más
consistente observada en este estudio. Aquí la IL-2
y el TGF-\beta estuvieron presentes únicamente
durante las 72 horas iniciales del cultivo, en lugar de todo el
periodo de cultivo. El incremento de la síntesis de Ig en el último
caso podría explicarse por los efectos positivos de la
IL-2 sobre la diferenciación de células B (Coffman,
R.L. y col. (1988) Immunol Rev 102:5-28). La
IL-2 puede regular negativamente la producción de
anticuerpos mediante varios mecanismos. Además del circuito del
TGF-\beta descrito en el informe, puede tener
lugar una inhibición inducida por IL-2 mediante
regulación positiva del IFN-\gamma (Noble, A. y
col. (1998), J Immunol 160:566-571), o mediante
mecanismos citolíticos (Stohl, W. y col., (1998), J Immunol
160:5231-5238; Esser, M.T. y col. (1997), J Immunol
158:5612-5618). Anteriormente, se habían investigado
los efectos reguladores de las células NK sobre la síntesis de
anticuerpos y se había publicado que mientras el efecto directo de
las células NK es regular positivamente la síntesis de IgG (Kinter,
A. y col. (1995), Proc Natl Acad Sci USA
92:10985-10989), estos linfocitos presentaban el
efecto opuesto cuando se cultivaban con células T CD8+ en
individuos sanos (Gray, J.D. y col., (1994), J Exp Med
180:1937-1942). En los pacientes LSE, sin embargo,
la combinación de células T CD8+ y de células NK incrementaron la
producción de IgG (linker-Israeli, M. y col.
(1990), Arthritis Rheum 33:1216-1225). Esto se
observó de nuevo en el presente informe. Mientras que en individuos
normales, la adición de células NK a células T CD8+ inhibía
fuertemente la síntesis de IgG estimulada por
anti-CD2, en el LSE se observó lo contrario. A
partir de los estudios con individuos sanos, se demostró que el
TGF-\beta derivado de las células NK inducía las
células T CD8+ co-estimuladas a regular
negativamente la producción de IgG e IgM (Gray,JD y col., (1998),
J Immunol 160:2248-2254). En este estudio, la
IL-2 y el TGF-\beta indujeron una
actividad supresora moderada de las células T CD8+. Lo que indica
que, seguramente en el LSE, por lo menos una de las vías por las
que la IL-2 y el TGF-\beta inhiben
la actividad de células B se realiza mediante la generación de
células T reguladoras. Además, otras poblaciones de linfocitos
tratados con éstas u otras citoquinas pueden también regular
negativamente la actividad de las células B en el LSE.
Una vez demostrado que disminuye la producción de
las formas totales y activas del TGF-\beta por
los linfocitos, nos preguntamos si estos defectos se
correlacionaban con la actividad y/o gravedad de la enfermedad. La
producción del TGF-\beta1 por los linfocitos
sanguíneos de 17 pacientes LSE estudiados prospectivamente se
comparó con la de 10 pacientes con artritis reumatoide (AR) y 23
controles emparejados sanos. En la AR, los niveles del
TGF-\beta1 activo fueron inferiores a los
controles, pero no disminuyeron en la misma magnitud hallada en el
LSE. Los niveles del TGF-\beta1 constitutivo y del
activo estimulado por anti-CD2 detectados en
cantidades picomolares se redujeron de forma importante en 6
pacientes no tratados y hospitalizados con LSE de reciente
aparición, muy activo y severo, y se redujo de forma similar en 11
pacientes en tratamiento y con la enfermedad menos activa. En
consecuencia, la producción disminuida de
TGF-\beta1 activo no se correlacionó con la
actividad de la enfermedad. En cambio, la producción disminuida de
TGF-\beta1 total se correlacionó inversamente con
la actividad de la enfermedad. Así, parece ser que aunque la
secreción mermada del precursor del TGF-\beta1
latente por los linfocitos puede ser una consecuencia de la
actividad de la enfermedad, la capacidad para convertir la molécula
precursora en su forma activa puede ser un defecto celular
intrínseco. La exposición insuficiente de las células T a
cantidades picomolares de TGF-\beta1 en el momento
de su activación puede ser el resultado de un defecto en la
regulación negativa de la síntesis de Ig.
Así, la producción disminuida de
TGF-\beta1 activo por los linfocitos en el LSE
puede contribuir a la hiperactividad de las células B,
característica de esta enfermedad.
Se estudiaron 17 individuos con un diagnóstico de
LSE que cumplían con los criterios del American College of
Rheumatology para la clasificación de LSE (Tan, E.M. y col.,
(1982), Arthritis Rheum 25:1271-1277), 10 individuos
con AR que cumplían con los criterios revisados de la ACR de 1987
para la clasificación de RA (Arnett, F.C. y col., (1988), Arthritis
Rheum 31:315-324) y 23 individuos sanos. El grupo
de LSE consistió de 15 mujeres y 2 hombres (15 hispanos, 1
afro-americano, 1 asiático). La media de edad fue de
34,5 años (intervalo de 20-75 años).
Seis pacientes se hospitalizaron y 11 siguieron un control externo.
Todos los pacientes hospitalizados no habían sido tratados antes de
la admisión y fueron estudiados antes de recibir la primera dosis de
corticosteroides. Los pacientes externos recibieron menos de 20 mg
de prednisona sin que ninguno recibiera fármacos citotóxicos. La
actividad de la enfermedad se valoró con los índices SLAM (Liang,
M.H. y col., (1989), Arthritis Rheum 32:1107-1118)
y SLEDAI (Bombardier, C. y col., 1992), Arthritis Rheum
35:630-640) con valores medios de 6,6 y 7,6,
respectivamente. El grupo AR consistió de 9 mujeres y 1 hombre (9
hispanos, 1 asiático). La media de edad fue de 50,9 años (intervalo
de edad de 39-67 años). Todos los pacientes
siguieron un régimen de clínica externa y tenían una enfermedad
ligera a moderadamente activa. La media de duración de la
enfermedad fue de 9,5 años. Un paciente recibió miocrisina, 3
pacientes recibieron prednisona (1,1, y 20 mg), 3 pacientes
recibieron metotrexato y un paciente recibió sulfasalazina. Los
donantes sanos sirvieron como controles, emparejándose lo más
estrechamente posible según la edad, sexo y grupo étnico.
Características clínicas de los dos grupos de pacientes LSE | |||
Resultados clínicos | Hospitalizados (n=6) | Externos (n=11) | Valor p |
Edad | 26,8 | 38,6 | 1,037 |
Sexo (H/M) Grupo étnico | 6/0 | 9/2 | |
(H/AA/A) | 5/0/1 | 10/10 | |
Duración de la enfermedad | 0,71 | 8,25 | 0,051 |
(años) |
Características clínicas de los dos grupos de pacientes LSE | |||
Resultados clínicos | Hospitalizados (n=6) | Externos (n=11) | Valor p |
Actividad de la enfermedad | |||
SLAM | 13,3 | 2,9 | 0,014 |
SLEDAI | 15,7 | 4,1 | 0,006 |
Dosis de prednisona | 41,2 | 7,8 | 0,008 |
(mg/día) | 83% | 9% | 0,028 |
Enfermedad renal activa | 67% | 9% | 0,064 |
Anemia hemolítica | 466,7 | 33,0 | 0,064 |
Anti-DNA (título) | 47,5 | 98,6 | 0,008 |
C3 | 13,7 | 18,6 | 0,127 |
C4 |
Los anticuerpos utilizados fueron los
sobrenadantes de hibridomas secretores de anti-CD2
(OKT11, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD y GT2
proporcionados por el Dr. Alain Bernard, Niza, Francia). Un
anticuerpo monoclonal que reconoce las isoformas de
TGF-\beta 1, 2 y 3 (1D11), un anticuerpo contra
las isoformas de TGF-\beta 2 y 3 (3C7) y el
rTGF-B2 fueron proporcionados por el Dr. Bruce
Pratt (Genzyme Pharmaceuticals, Farmington, MA).
Se prepararon células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) a partir de sangre venosa heparinizada mediante
centrifugación en gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) según los
procedimientos descritos anteriormente (Ohtsuka, K. y col., (1998),
J Immunol 160:2539-2545). Las células mononucleares
se lavaron con PBS y EDTA 5 mM (Life Technologies, Grand Island,
NY) para eliminar las plaquetas, que son una fuente rica en
TGF-\beta. Los linfocitos de sangre periférica se
separaron de los PBMC mediante centrifugación con gradiente de
densidad continua de Percoll (Pharmacia). El porcentaje de
monocitos que permaneció en la fracción de densidad elevada
enriquecida en linfocitos fue algo superior en el LSE (8,5%
versus 4,3%).
Los procedimientos para los cultivos de células
se han descrito con anterioridad (Ohtsuka, K. y col.,
(1998),
\breakJ Immunol 160:2539-2545). En resumen, se añadieron 1x10^{5} linfocitos a la placa de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Rocky Mountain Scientific, Salt Lake City UT). Los cultivos se llevaron a cabo en medio
\hbox{AIM-V}sin suero (Life Technologies), ya que el suero contiene cantidades significativas de TGF-\beta latente. El anti-CD2 se utilizó a las concentraciones óptimas para inducir la producción de TGF-\gamma (GT2 1:40 y T11 1:80) en los sobrenadantes de los cultivos de hibridomas. Estudios previos ya habían demostrado que el anti-CD2 estimula fuertemente los PBL para producir TGF-\beta (Gray, JD y col., (1998), J Immunol 160:2248-2254).
Las células epiteliales de pulmón de visón
(MLEC), que habían sido transfectadas con una construcción de
expresión que contenía un promotor (PAl-1) del
inhibidor del activador del plasminógeno fusionado con el gen
marcador de la luciferasa, fueron proporcionadas por el Dr. D. B.
Rifkin, New York, NY. Se incubaron MLEC a 2x10^{4}/pocillo con 200
\mul de sobrenadantes durante 18 h a 37ºC. Para valorar la
actividad luciferasa, se lisaron las células MLEC mediante un
reactivo de lisis celular (Analytical Luminescence, Ann Arbor, MI).
Los lisados celulares se hicieron reaccionar luego con el tampón de
ensayo y la solución de luciferasa (ambos de Analytical
Luminiscence), inmediatamente antes de cuantificarse en un
luminómetro (Lumat, Berthold Analytical Instruments Inc., Nashua,
NH). Para cuantificar la actividad del TGF-\beta
total, se calentaron muestras a 80ºC durante 3 minutos para liberar
la citoquina activa del complejo latente. Se cuantificó la
actividad del TGF-\beta sin calentar los
sobrenadantes. En todos los ensayos, concentraciones varias de
rTGF-\beta se incluyeron para generar una curva
estándar. La variabilidad de los cultivos replicados fue inferior
al 10 por ciento (Ohtsuka,K. y col. (1998), J Immunol
160:2539-2545).
\newpage
La significación de los resultados se analizó
utilizando el test de Mann-Whitney y la
correlación de rango de Sperman con el programa GBSTAT (Professional
Statistics and Graphics Computer Program, Dynamic Microsystems
Inc., Silver Spring, MD).
Se cuantificó el TGF-\beta1
constitutivo y estimulado producido por los PBL de pacientes con LSE
o AR y se compararon estos valores con los valores de controles
normales. La citoquina detectada en los sobrenadantes de los
cultivos se neutralizó mediante mABs que reconocían las isoformas
1, 2 y 3, pero no las isoformas 2 y 3, resultado que confirmó la
producción de TGF-\beta1. En comparación con los
controles normales, la producción constitutiva de
TGF-\beta1 activa disminuyó significativamente en
el LSE (14 \pm 5 versus 56 \pm 21 pg/ml, p = 0,02, Fig.
5). También disminuyó el TGF-\beta1
activo estimulado por el anti-CD2 (87 \pm 22
versus 399 \pm 103 pg/ml, p = 0,003). En la AR, el
valor medio para el TGF-\beta1 constitutivo fue
similar al del LSE (19 \pm 5 pg/ml) y después de la estimulación
por anti-CD2 fue intermedio entre el valor normal y
el del LSE (197 \pm 54 pg/ml).
El TGF-\beta1 total
constitutivo producido por los linfocitos también disminuyó en el
LSE en comparación con el grupo normal (268 \pm 82 versus
631 \pm 185 pg/ml, p = 0,05). El valor en la AR fue
intermedia entre el normal y el de LSE (435 \pm 161 pg/ml).
Después de la adición de anti-CD2, el
TGF-\beta1 total aumentó en el LSE algo más que en
los controles normales, aunque las diferencias no fueron
significativas estadísticamente. Los valores en el grupo de AR
fueron de nuevo intermedios entre el grupo normal y el de LSE.
Para buscar una posible relación entre los
niveles disminuidos de TGF-\beta1 y la actividad
de la enfermedad, se compararon los pacientes de LSE hospitalizados
con los de régimen externo. Las características clínicas de estos
dos grupos se resumen en la Tabla 5. Aquellos que se hospitalizaron
eran más jóvenes; 5 de 6 presentaron síntomas durante menos de 3
meses; tuvieron una enfermedad marcadamente activa; y la mayoría
presentó LSE severo con nefritis y/o anemia hemolítica. El grupo de
pacientes externos, por el contrario, tenía una enfermedad crónica
que se volvió menos activa tras el tratamiento. A pesar de esta
diferencia marcada en la heterogeneidad, duración, actividad y
severidad de la enfermedad, tanto la producción constitutiva como la
estimulada del TGF-\beta1 activo disminuyeron
significativamente en ambos grupos en comparación con los controles
normales (Tabla 6).
Comparación de la producción de TGF-\beta1 por los linfocitos de dos grupos de pacientes con LSE* | |||
LSE | |||
Normal (n=23) | Grupo 1 (n=6) | Grupo 2 (n=11) | |
TGF-\beta1 activo (pg/ml) | |||
Constitutivo | 56 \pm 21 | 21 \pm 14 \dag | 10 \pm 4 \dag |
CD2 estimulado | 399 \pm 103 | 117 \pm 52 \dag | 70 \pm 19 É |
TGF-\beta1 total (pg/ml) | |||
Constitutivo | 631 \pm 185 | 132 \pm 44 \dag | 365 \pm 120 |
CD2 estimulado | 771 \pm 136 | 226 \pm 74 \dag | 667 \pm 166 |
* Se cultivaron 1x10^{5} PBL /pocillo durante 48 horas y se analizaron los sobrenadantes para el TGF-\beta1. | |||
Los pacientes LSE se dividieron en 2 grupos. Grupo 1: pacientes hospitalizados. Grupo 2: pacientes externos. | |||
Los valores p indican la comparación entre el grupo LSE y los controles normales valorado según el test | |||
de Mann-Whitney; | |||
\dag p < 0,05 | |||
É p < 0,01 |
Si se compara la correlación entre los niveles de
TGF-\beta1 activo y total con la actividad de la
enfermedad, hubo una correlación negativa significativa entre la
producción estimulada por anti-CD2 de
TGF-\beta1 total y el SLEDAI (r=-0,55, p=0,03,
pero sin el índice SLAM (-0,43, p=11). El índice SLEDAI se valoró
según la implicación del sistema nervioso central y de enfermedad
renal. Así, una capacidad disminuida de los linfocitos para
secretar la forma precursora del TGF-\beta1
parece estar asociada con la enfermedad severa. Los niveles de
TGF-\beta1 activo no se correlacionaron con la
actividad de la enfermedad.
El principal hallazgo en este ejemplo fue que la
producción reducida de TGF-\beta1 activo en
LSE no se correlaciona con la actividad o gravedad de la
enfermedad. Cantidades decrecientes de TGF-\beta1
activo constitutivo y estimulado se hallaron en ambos grupos de
pacientes, con aparición reciente de la enfermedad y con la
enfermedad establecida. Además, los valores no se correlacionaron
con la actividad, según se cuantificó por los índices de SLAM y
SLEDAI, o la gravedad valorada por la implicación de órganos
vitales. Sin embargo, mientras que la producción del
TGF-\beta1 total también disminuyó en el LSE,
este defecto parece correlacionarse con la actividad de la
enfermedad. El hecho de que la producción de
TGF-\beta1 total se correlacionara más
estrechamente con el índice de SLEDAI, valorado según la
implicación de los principales sistemas orgánicos, también sugiere
una relación con la gravedad de la enfermedad.
Este estudio también incluyó un grupo control de
pacientes AR cuya actividad de la enfermedad fue comparable a la de
los pacientes LSE con enfermedad establecida. Aunque, los valores
de TGF-\beta1 en el grupo de AR fueron algo
inferiores a los valores de los controles normales, con la excepción
del TGF- \beta1 activo constitutivo, la magnitud del defecto no
fue tan marcada como en el LSE y no fue estadísticamente
significativa.
Previamente, ya documentamos que las células NK
son la fuente de linfocitos principal para el
TGF-\beta y la única población de linfocitos que
produce constitutivamente esta citoquina en su forma activa (Gray,
J.D. y col., (1998),
\breakJ. Immunol 160:2248-2254). En consecuencia, fue interesante hallar que la producción constitutiva del TGF-B derivado de células NK estaba disminuida en el LSE. También se demostró que tanto la IL-2 como el TNF-\alpha podían incrementar la producción de TGF-\beta activo. La producción de ambas citoquinas está disminuida en el LSE (Gray, J.D. y col. (1994), J Exp Med 180:1937-1942). Sin embargo, en muchos pacientes, la IL-2 y el TNF-\alpha exógenos no pudieron restaurar la producción normal de TGF-\beta (Ejemplo 2). La producción de IL10 está incrementada en el LSE (Llorente, L. y col., (1993), Eur Cytokine Network 4:421)) y se han publicado correlaciones entre los niveles elevados y la actividad de la enfermedad (Housslau, FA y col. (1995), Lupus 4:393-395; Haglwara, E. y col. (1996), Arthritis Rheum 39:379). La IL10 puede inhibir la producción de IL-2, TNF-\alpha y TGF-\beta (Ejemplo 2 y Moore, K.W. y col. (1993), Ann Rev Immunol 11:165-190). Los hallazgos de que la producción del TGF-\beta activo disminuye tanto en pacientes con una enfermedad moderada como con una enfermedad activa, y el hecho de que podría únicamente invertir parcialmente el defecto de producción antagonizando con IL10 (Ejemplo 2), sugiere que la producción incrementada de IL10, por ella misma, no puede tenerse en cuenta en la producción disminuida del TGF-\beta1 activo por los linfocitos en el LSE. Algunos mecanismos están probablemente implicados. Seguramente, uno o más defectos en la conversión extracelular del precursor latente a la forma activa y madura pueden explicar esta anomalía.
Aunque las propiedades inhibidoras del
TGF-\beta están bien documentadas en la
proliferación de linfocitos y la función celular efectora (Letterio,
J.J. y col. (1998), Ann Rev Immunol 16:137-162),
también se han publicado propiedades estimuladoras (Lee, H.M. y
col. (1991), J Immunol 151:668-677). El
TGF-\beta modula la producción de citoquinas por
las células T estimuladas, así como la regula positivamente su
producción. En los ratones, el TGF-\beta1 activa
selectivamente las células T CD8+ para que proliferen (Lee, H.M. y
col. (1991), J Immunol 151:668-677) y aumenta la
maduración de las células T "naives" a células T de memoria
(Lee,H.M. y col. (1991), J Immunol 153:4367- 4377). En el hombre, el
TGF-\beta1 es un potente inductor de células T
efectoras (Cerwenka A y col. (1994) J Immunol
153:4367-4377). Mientras que se necesitan grandes
cantidades (nanogramos/ml) para obtener efectos
inmuno-supresores, hemos demostrado que únicamente
se necesitan cantidades pequeñas (picogramos/ml) para
co-estimular las células T CD8+ para regular
negativamente la producción de anticuerpos (Gray, J.D. y col.
(1998), J Immunol 160:2248-2254).
Estos estudios sugieren, en consecuencia, que
mientras la secreción linfocítica defectuosa del precursor del
\hbox{TGF- \beta 1}latente puede resultar como consecuencia de la actividad de la enfermedad, la producción del TGF-\beta1 activo disminuida en el LSE es más compleja y puede ser el resultado de diversos mecanismos distintos. Se propuso que la programación de células T "naives" para regular negativamente la producción de anticuerpos requiere la presencia de cantidades de pg/ml del TGF-\beta activo en el momento que es activado, hipótesis que se soporta por evidencias halladas en ciertas publicaciones (Gray, J.D. y col. (1998), J Immunol 160:2248-2254). En consecuencia, la ausencia de cantidades picomolares del TGF-\beta activo, en el entorno local en un momento crítico, podría posiblemente ser responsable de la ineficacia de la función reguladora de células T para controlar la actividad de linfocitos B en el LSE.
En este ejemplo, la producción de IgG se regula
negativamente tratando las células con una composición inhibidora
que comprende un mitógeno como la ConA. Las células se prepararon
tal como se indicó en los ejemplos anteriores y luego se incubaron
con mitógenos para aumentar la población de células para regular
negativamente la producción de anticuerpos. En este caso, las
células se incubaron con concentraciones fisiológicas de Con A
durante 4 a 72 horas, utilizando técnicas de incubación estándar.
La concentración de ConA utilizada puede variar desde
aproximadamente 0,01 a 10 microgramos/ml, siendo 1 \mug/ml la
concentración actual preferida. La Con A está disponible por
Sigma
\break(St. Louis, MO).
Aunque no se sabe como trabajan los mitógenos, se
cree que inducen la producción del TGF-\beta por
los monocitos en la preparación de PBMCs y luego el
TGF-\beta actúa sobre las células T para
convertirlas en células supresoras de anticuerpos.
Si es necesario, las células se lavan y se
transplantan a continuación al paciente.
En este ejemplo, la producción de IgG se regula
negativamente tratando las células con una composición inhibidora
que comprende una mezcla de citoquinas y mitógenos. Las células se
preparan tal como se indicó en los ejemplos anteriores y luego se
incuban con la mezcla para aumentar la población de células que
regulan negativamente la producción de anticuerpos, como las
concentraciones fisiológicas de ConA, IL-2 y
TGF-\beta, o Con A e IL-2, durante
4 ó 72 horas utilizando técnicas de incubación estándar.
Después de que las células se han incubado con
citoquinas y mitógeno, las células se lavan con HBBS para eliminar
cualquier citoquina y mitógeno que hubiera en la solución. Las
células se resuspenden a continuación en 200-500 ml
de HBBS y se reintroducen en el mamífero.
Claims (15)
1. Utilización de células mononucleares de sangre
periférica (PBMCs), tratadas con IL-2 o
TGF-\beta, en la preparación de un medicamento
para el tratamiento de una enfermedad
auto-inmune.
2. Utilización de una composición inhibidora que
comprende la IL-2 o el
TGF-\beta en la preparación de un medicamento para
el tratamiento de una enfermedad auto-inmune.
3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en donde el mencionado medicamento se
prepara poniendo en contacto la composición inhibidora con las
células mononucleares extraídas de la sangre de un paciente
diagnosticado de una enfermedad auto-inmune, y en
donde dicho medicamento se reintroduce en el mencionado paciente
para suprimir la mencionada enfermedad
auto-inmune.
4. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición
inhibidora comprende la IL-2.
5. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición
inhibidora comprende el TGF-\beta.
6. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición
inhibidora comprende además un activador CD2.
7. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición inhibidora
comprende el TGF-\beta y un activador CD2.
8. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la mencionada composición
inhibidora comprende la IL-2 y el
TGF-\beta.
9. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición inhibidora
comprende la IL-2, el TGF-\beta y
un activador CD2.
10. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6, 7, o 9, en donde el mencionado activador CD2 es
un anticuerpo anti-CD2.
11. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6, 7, o 9, en donde el mencionado activador CD2
comprende anticuerpos anti-CD2.
12. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 6, 7, o 9, en donde el mencionado activador CD2 es
el ligando de CD2 LFA-3.
13. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde las mencionadas células están
enriquecidas en células T CD4+.
14. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde las mencionadas células están
enriquecidas en células T CD8+.
15. Utilización de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde la mencionada enfermedad
auto-inmune es el lupus sistémico eritematoso
(LSE).
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