MX2010011179A - Proceso de manufacturacion de irx-2 modificado. - Google Patents

Abstract

Un método altamente eficiente para hacer una sustancia biológica derivada de célula primaria al purificar células mononucleares (MNCs) en un procesador de células automatizado para remover las células contaminantes al cargar leucocitos sobre el medio de separación de linfocito (LSM) y centrifugar el medio para obtener MNCs purificadas, almacenar las MNCs durante la noche en un sistema de bolsa estéril cerrada, estimular una mezcla de inducción de las MNCs con fitohemaglutinina (PHA) u otro mitógeno y ciprofloxacina en un dispositivo de cultivo celular escalable y producir una sustancia biológica derivada de célula primaria a partir de las MNCs, remover el mitógeno de la mezcla de inducción al filtrar, incubar la mezcla de inducción, clarificar la mezcla de inducción mediante filtración para obtener un sobrenadante biológico derivado de célula primaria, y limpiar el sobrenadante biológico derivado de célula primaria de los agentes adventicios mediante la cromatografía de intercambio aniónico, filtración. Un sistema cerrado previene la contaminación de la sustancia biológica derivada de célula primaria resultante. Un método automatizado para purificar células. Un método para inducir escalablemente células.

Description

PROCESO DE MANUFACTURACION DE IRX-2 MODIFICADO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. Sección 119(e) de la solicitud de patente provisional norteamericana No. 61/044,674, presentada el 14 de Abril del 2008, que es incorporada en la presente por referencia.

Campo de la Invención La presente invención se relaciona a un método para producir cantidades de sustancias biológicas a gran escala. En particular, la presente invención se relaciona a un proceso de manufacturación en escala aumentada de una sustancia biológica derivada de célula primaria.

Descripción de la Técnica Relacionada Hay varios métodos en la técnica utilizados para producir sustancias biológicas a partir de células que generalmente involucran las etapas de estimular las células a través de la incubación y lavado de las células para obtener el producto deseado.

Por ejemplo, la patente norteamericana No. 4,390,623 de Fabricius divulga una preparación de factor de de- crecimiento de célula T ( interleucina-2 ) libre de suero y libre de mitógeno preparada de células de sangre mononucleares periféricas humanas, bovinas o porcinas que se lavan varias veces con un medio de cultivo de tejido liquido y luego se estimulan en el medio de cultivo de tejido suplementado con suero y mitógeno. Las células estimuladas, separadas, se lavan nuevamente con medio de cultivo de tejido fresco para remover sustancialmente todo el suero y el mitógeno. Las células lavadas se suspenden en el medio de cultivo de tejido fresco y se acondicionan bajo condiciones de incubación para transferir el factor de crecimiento en el liquido. El medio de cultivo de tejido separado de las células estimuladas se puede reciclar para estimular células adicionales. El sobrenadante se puede concentrar de 50 a 100 veces sobre un ultrafiltro.

La patente norteamericana No. 4,406,830 de Fabricius divulga un proceso para producir Interleucina-1 (IL-1) (también conocido como factor de activación de linfocito LAF) libre de suero, libre de mitógeno e IL-2 libre de suero, libre de mitógeno al incubar células de sangre mononucleares periféricas (PBL) en un medio de cultivo de tejido liquido libre de suero para remover las proteínas de suero residuales sobre la superficie de las células PBL, al activar las células incubadas con un mitógeno, al lavar las células activadas con un líquido estéril para remover el mitógeno de las células y al acondicionar las células activadas libres de mitógeno, libres de suero en un medio de cultivo de tejido líquido para producir una Interleucina-1 (IL-1), libre de suero, libre de mitógeno, al poner en contacto el medio de cultivo de tejido liquido que contiene IL-1 con glicoproteina de suero de sangre novedosa, y al incubar las células en la presencia de IL-1 y la glicoproteina de suero de sangre novedosa para inducir la síntesis de IL-2 y para transferir la IL-2 (factor de crecimiento de célula T) de las células a la fase líquida del medio de cultivo de tejido para de esta manera producir una IL-2 libre de suero, libre de mitógeno.

La patente norteamericana No. 5,503,828 de Testa divulga un método de producción a gran escala de alfa interferona a través de la inducción y purificación. Una mezcla de subtipos de alfa interferona producidos de leucocitos de sangre periférica se produce al (a) preparar leucocitos de sangre periférica humana al recolectar capas leucocíticas y al lisar glóbulos rojos de la sangre con cloruro de amonio; (b) suspender los leucocitos en una densidad celular de 1-10x106 células/ml en un medio de inducción, que comprende MEM de Eagle que contiene Sales de Earle, L-glutamina, aminoácidos no esenciales, 4.46 mg/ml de Tricina, pH 7.4, 24 yg/ml de sulfato de neomicina, vitaminas B3 y/o C, bicarbonato 'de sodio y entre 0.1 a 1.5 mg/ml de suero agamma humano; (c) adicionar alfa interferona cruda o purificada como un iniciador para los leucocitos suspendidos en el medio de inducción; (d) incubar la suspensión durante un tiempo suficiente a aproximadamente 36 grados C mientras que se agita a 100-300 rpm; (e) adicionar entre 50-500 unidades de hemaglutinina por mi de virus Sendai a la suspensión; (f) incubar durante un tiempo suficiente a aproximadamente 36 grados C mientras que se agita a 100-300 rpm; (h) centrifugar a aproximadamente 2,500 rpm para remover las células y los restos; y (i) recolectar la alfa interferona cruda como producto, sin nunca separar un subtipo de alfa interferona de los otros subtipos presentes en la mezcla alfa.

La patente norteamericana No. 5,350,589 de Morris divulga un método para producir interferonas de Tipo 1 de multisubtipos . El método incluye las etapas de (a) cultivar leucocitos; (b) estimular los leucocitos para producir una interferona cruda; (c) concentrar la interferona cruda para remover los contaminantes de bajo peso molecular; (d) el volumen de liquido para producir una interferona cruda concentrada; (e) remover una cantidad sustancial de albúmina de suero y otros contaminantes de la interferona cruda' concentrada para producir una mezcla de interferona parcialmente purificada que contiene una pluralidad de subtipos; (f) remover sustancialmente toda la albúmina de suero restante y otros contaminantes de la mezcla de interferona parcialmente purificada para generar una mezcla de interferona que tiene una pureza de entre aproximadamente 50% y aproximadamente 80%; y (g) purificar la mezcla de interferona de aproximadamente 50% a aproximadamente 80% para producir una mezcla altamente purificada de interferona Tipo I que tiene una pureza de por lo menos aproximadamente 95% y que contiene no más de aproximadamente 35% en peso de subtipos IFN.alfa.-2 e IFN.alfa.-8.

La patente norteamericana No. 6,896,879 de Talor divulga un método para producir una mezcla de citoquinas que está libre de suero, libre de mitógeno y libre de antibiótico. En el proceso de manufacturación, las células mononucleares se separan de las "capas leucociticas de donador humano mediante la centrifugación de gradiente escalonado y se cultivan con fitohemaglutinina' (PHA) para aumentar la producción y secreción de IL-2 y otras citoquinas de los glóbulos blancos del donador en cultivo. Subsecuentemente, el sobrenadante de cultivo se recolecta asépticamente, se clarifica y se somete a un proceso de exclusión de virus comercial. El sobrenadante luego se concentra además aproximadamente 10 veces por ultrafiltración y microfiltración . En este punto, la Albúmina de Suero Humana, Inj . USP se adiciona y el concentrado luego se regula a un pH fisiológico y se lleva a una concentración de IL-2 objetivo según la demanda de la etiqueta (ejemplo 400 IU/mL) . El concentrado luego se somete a una segunda micro-filtración (filtro clasificado en 0.22 mieras) y se suministra asépticamente en frasquitos de tipo de suero estéril y se etiqueta por su contenido de IL-2. La potencia del producto se mide por la incorporación de timidina radiomarcada por una linea T-linfoide citotóxica (CTLL-2) . El agente inyectable final es además probado por ELISA para la presencia de cinco citoquinas marcadoras: IL-2, IL-?ß, GM-CSF, IFN-? y TNF-OÍ .

Las patentes norteamericanas Nos. 5,632,983; 5,698,194; 6,977,072; 7,153,499; 7,182,942 de Hadden divulgan un método para producir una mezcla de citoquinas natural (NC ) que es una mezcla de citoquinas única de IL-?ß, IL-2, IL-6, IL-8, INF-?, y TNF- . Los glóbulos blancos de capas leucociticas de sangre humana de múltiples donadores negativos del virus de hepatitis negativos de HIV son recolectadas. Las células de los donadores se acumulan y se colocan en capas sobre gradientes hypaque de ficoll (Pharmacia) para producir linfocitos libres de neutrófilos y eritrocitos. En una modalidad preferida para la producción de NCM los linfocitos se lavan y se distribuyen en el medio X vivo-10 media (Whittaker Bioproducts) a matraces (Matraces de Cultivo de Células MicroCELLector . TM. T-25) en los cuales se inmovilizan los estimulantes, es decir, mitógenos . El proceso de inmovilización para los estimulantes es como es descrito por el fabricante para inmovilizar varias sustancias para procedimientos en charola, es decir, separación de células, en , los matraces. Las células se incuban durante 24-48 horas en el medio X vivo-10 con 80 pg/ml de ciprofloxacina (Miles Lab) a 37 grados C en una incubadora de C02/aire. Después de la incubación los sobrenadantes se vacian y se recolectan. La albúmina de suero humana (HSA) se puede adicionar para estabilizar las interleucinas . Generalmente la HSA se utiliza en 0.1 a 0.5% (peso en volumen) . Los sobrenadantes se almacenan a 4 grados C a -70 grados C. Los sobrenadantes acumulados se caracterizan al medir el contenido de citoquina mediante el bioensayo para IL-2 y ELISAs para una o más de las interleucinas IL-l-IL-15, CSFs, TNFs e IFNs. La esterilidad se' prueba mediante el cultivo en caldo de tioglicolato y endotoxina medido por el ensayo de lisado de limulo como es conocido en la técnica. Cada sobrenadante es estandarizado ya sea por concentración o cantidad administrada de modo que se pueden hacer comparaciones. En particular se utiliza la equivalencia de IL-2 para cada sobrenadante. La exclusión de DNA y de virus, si se utiliza, emplea tales técnicas como ultrafiltración, fraccionamiento con etanol, precipitación con polietilenglicol/bentonita y/o el tratamiento de solvente/detergente y se ha utilizado para gamma globulina intravenosa (folleto IGIV News Update) . Se puede ut-ilizar la inactivación fotoquímica, ftalocianina de aluminio o irradiación gamma. Este proceso es además discutido en la presente invención enseguida.

Hay varias limitaciones de los procesos manuales utilizados para producir sustancias biológicas tales como la sensibilidad del operador, potencial para la contaminación en un sistema abierto, relaciones inconsistentes y niveles de proteina totales en el producto final, todos los cuales hacen el producto inadecuado para la producción de grado farmacéutico. Para tratar con estos problemas en el pasado, se realizaron procedimientos difíciles de manejar tales como filtros, almidón, centrifugaciones manuales y lavados. Los procesos previos fueron procedimientos de mesa de trabajo que produjeron lotes inconsistentes y cantidades de producto en pequeña escala.

Otra etapa en el procesamiento de sustancias biológicas que se debe considerar es la remoción de los virus. La seguridad del paciente es importantísima, y en procesos de biotecnología hay un riesgo de virus adventicios que contaminan las células entrantes. Por. consiguiente, se busca etapas de inactivación y remoción para remover los virus que pueden o no pueden estar presentes. Varios logs de evacuación/inactivación son requeridos, según las guías de FDA e ICH. Las agencias regulatorias sugieren la prueba del volumen no procesado para virus potenciales que también se incluyen en los métodos del proceso que proporcionan un mínimo de 4 log 10 de inactivación/remoción del virus para ser considerados significante. Se sugiere que los métodos incluyan dos (o más) etapas ortogonales de preferencia con una dirección a los virus no envueltos. La guía regulatoria sugiere que los estudios de validación deben ser conducidos para caracterizar la habilidad de los métodos de producción para remover/inactivar virus adventicios que exhiben una gama de propiedades bioquímicas y biofísicas para caracterizar la capacidad robusta del proceso.

Para la producción de sustancia biológica derivada de célula primaria, los leucocitos de donadores, células de fuente para producción, de citoquina, se clasifican por los centros de sangre para la presencia de ácido nucleico viral por PCR (NHCV y NHIV) y antígenos virales tradicionales (virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , hepatitis G (HCV) , hepatitis B (HBV) y virus T-linfotrópico humano (HTLV) ) . Sin embargo otros virus, Epstein Barr (EBV) , Citomegalovirus (CMV) y Parvovirus Humano B-19 (B-19) todavía pueden estar presentes en donadores calificados y utilizados para la producción. Los niveles detectables de EBV podrían estar presentes en hasta 100% de donadores saludables (Walling y colaboradores, 2003) . Los niveles de B-19 en individuos asintomáticos se ha reportado que son más grandes que 1012 por mL (Doyle y Corcoran, 2006) y los resultados de infección en un breve periodo de viremia con títulos tan altos como 1014 por mL (Anderson 1985) . Debido al. lavado de las células extensivo utilizado en el proceso biológico derivado de célula primaria, la mayoría de los virus asociados con el plasma son esencialmente removidos de los leucocitos del donador, y cualquier virus detectado en el · volumen de la sustancia biológica derivada de la célula primaria, antes de las etapas de remoción/inactivación corriente abajo, solamente serian aquellos liberados de las células infectadas .

No obstante, se requieren procesos de inactivación/remoción robustos para asegurar la seguridad del producto .

El proceso de producción manual para la sustancia biológica derivada de célula primaria es intensivo en' trabajo y no fácilmente disponible para la escala aumentada y está limitado a volúmenes de fluido estéril que podrían ser manejados por un proceso manual. Por lo tanto, se busca el desarrollo de un proceso pára reducir las manipulaciones manuales, y lograr practicabilidad para la comercialización. Además, se desea un método dé inactivación de virus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para hacer una sustancia biológica derivada de célula primaria al purificar células mononucleares (MNCs) para remover las células contaminantes al cargar leucocitos sobre el medio de separación de linfocitos (LSM) , y lavar y centrifugar el medio para obtener MNCs purificadas con un procesamiento de células automatizado y sistema de lavado, almacenar las MNCs durante la noche en un sistema de bolsa estéril cerrada, estimular una mezcla de inducción de las MNCs con un mitógeno y ciprofloxacina en un sistema de cultivo de células escalable y producir una sustancia biológica derivada de célula primaria a partir de las MNCs en un dispositivo de cultivo de células desechable escalable, remover el mitógeno de la mezcla de inducción por filtración, incubar la mezcla de inducción, clarificar la mezcla de inducción mediante filtración para obtener un sobrenadante de sustancia biológica derivada de célula primaria y limpiar el sobrenadante biológico derivado de célula primaria del DNA . y agentes adventicios al aplicar la cromatografía de intercambio iónico y la filtración de virus de 15 nanómetros con remoción viral adicional posible utilizando ultravioleta-C (UVC) .

La presente invención también proporciona un método automatizado para purificar células al' lavar las células en un procesador de células automatizado, lavar y centrifugar las células automáticamente y obtener células purificadas.

La presente invención además proporciona un método para inducir las células al inducir las células en un sistema de cultivo de células escalable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS DIVERSAS VISTAS DE LOS DIBUJOS Otras ventajas de la presente invención serán fácilmente apreciadas ya que las mismas llegan a ser mejor entendidas por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en relación con los dibujos acompañantes en donde: La FIGURA 1 es una fotografía del perfil de citoquina de la sustancia biológica derivada de célula primaria que se utilizó en experimentos clínicos de Fase II; La FIGURA 2 es una gráfica que compara el proceso de sustancia biológica derivada de célula primaria manual contra la escala comercial de la presente invención; La FIGURA 3 es una fotografía de la centrifugación de la capa leucocítica durante 20 minutos; La FIGURA 4 es una fotografía de la separación de las MNCs; La FIGURA 5 es una gráfica del análisis de población de células de las MNCs purificadas en el procesador de células por la vía de Ac*T diff2; La FIGURA 6 es una fotografía del almacenamiento de la bolsa de FEP durante la noche; La FIGURA 7 es una fotografía de la sustancia biológica derivada de célula primaria de Arreglo de Citoquina (proceso de escala comercial) ; La FIGURA 8 es una fotografía de las células que son mezcladas con medios/inductores y que son transferidas a un dispositivo de cultivo de células desechable; La FIGURA 9 es una fotografía del dispositivo de cultivo de células desechable que está colocado en la incubadora ; La FIGURA 10 es una fotografía del lavado de células con un filtro de Fibra Hueca; La FIGURA 11 es una fotografía del lavado de células con un filtro de Fibra Hueca; La FIGURA 12 es una fotografía de la clarificación del sobrenadante; La FIGURA 13 es una gráfica del ensayo de DTH de péptido especifíceLa FIGURA 14 es una fotografía de la filtración de virus ; La FIGURA 15 es una fotografía de la filtración de virus ; La FIGURA 16 es una fotografía de la remoción del virus a través de una unidad de cromatografía de intercambio aniónico desechable; La FIGURA 17 es una fotografía de la inactivación viral a través de UVC; La FIGURA 18 es una fotografía de un Análisis de Manchado de Western de la sustancia biológica, derivada de célula primaria después del UVC; La FIGURA 19 es una fotografía de un arreglo de citoquina de la sustancia biológica derivada de célula primaria antes y después del UVC; y La FIGURA 20 es una fotografía de la sustancia biológica derivada de célula primaria en volumen lista para la congelación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona generalmente un método para hacer cantidades en gran escala de una sustancia biológica derivada de célula primaria, de preferencia IRX-2, para producción comercial. El método hace el uso novedoso de varias etapas del proceso que son escalables para la cantidad de producto deseada. Las células mononucleares (MNCs) se purifican para remover las células contaminantes al cargar los leucocitos sobre el medio de separación de linfocito (LSM) y al centrifugar el medio para obtener MNCs purificadas con un procesamiento de células automatizado y sistema de lavado. Las MNCs luego se almacenan durante la noche en una bolsa de almacenamiento de linfocito FEP. Una mezcla de inducción de las MNCs se estimula con un mitógeno, de preferencia fitohemaglutinina (PHA) , y ciprofloxacina en un dispositivo de cultivo de células desechable y una sustancia biológica derivada de célula primaria se produce de las MNCs. El mitógeno se remueve de la mezcla de inducción mediante filtración y el modo de filtración de flujo tangencial (TFF) y luego se incuba la mezcla de inducción. La mezcla de inducción se clarifica al filtrar para obtener un sobrenadante biológico derivado de célula primaria. Finalmente, el sobrenadante biológico derivado de célula primaria se limpia del DNA y los agentes adventicios al aplicar la cromatografía de intercambio aniónico y la filtración de 15 nanómetros y opci'onalmente la inactivación adicional mediante ultravioleta-C (UVC) . El producto final luego puede ser colocado en frasquitos y almacenado para la administración futura a un paciente.

Una "sustancia biológica derivada de célula primaria", como se utiliza en la presente, es un conjunto de citoquinas, de preferencia citoquinas naturales y no recombinantes , también previamente conocida como una NCM (mezcla de citoquinas natural) . De preferencia, la sustancia biológica derivada de célula primaria es IRX-2 como es descrito enseguida, y los dos términos se pueden utilizar intercambiablemente por toda esta solicitud sin la derivación del significado propuesto.

"IRX-2" es una sustancia biológica derivada de célula primaria natural, derivada de leucocito, producida por glóbulos blancos humanos purificados (células mononucleares ) estimuladas por fitohemaglutinina (PHA) y ciprofloxacina (CIPRO) . Los componentes activos mayores son interleucina 1ß (IL-?ß), interleucina 2 (IL-2), y ?-interferona (IFN-?). IRX-2 también se ha referido previamente como una "NCM", una mezcla de citoquinas natural, definida y expuesta en las patentes norteamericanas Nos. 6,977,072 y 7,153,499. Brevemente, IRX-2 se prepara en la presencia continua de un antibiótico de 4-aminoquinolona y con la presencia continua o pulsada de un mitógeno, que en la modalidad preferida es PHA. Sin embargo, también se pueden utilizar otros mitógenos. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el IRX-2 contiene una concentración de IL-?ß que varia de 60-6,000 pcg/mL, más de preferencia, de 150-1,800 pcg/mL; una concentración de IL-2 que varia de 600-60,000 pcg/mL, más de preferencia, de 3,000-12,000 pcg/mL, y una concentración de IFN-? que varia de 200-20,000 pcg/mL, más de preferencia, de 1, 000-4,000 pcg/mL.

IRX-2 también puede contener una concentración de IL-6 que varia de 60-6,000 pcg/mL, más de preferencia, de 300-2,000 pcg/mL; una concentración de IL-8 que varia de 6000-600,000 pcg/mL, más de preferencia de 20,000-180,000 pcg/mL; una concentración de TNF-a que varia de 200-20,000 peg/ml, más de preferencia, de 1,000-4,000 pcg/mL. Las citoquinas recombinantes, naturales o pegiladas se pueden utilizar o IRX-2 puede incluir una mezcla de citoquinas recombinantes, naturales o pegiladas. IRX-2 además puede incluir otras citoquinas recombinantes, naturales o pegiladas tal como IL-12, GM-CSF (en una concentración que. varia de 100-10,000 pcg/mL, más de preferencia de 500-2,000 pcg/mL) , y G-CSF.

Para que las células T lleguen a ser activadas para exterminar las células neoplásicas (por ejemplo, células de cáncer de cabeza y cuello) debe ocurrir un número de etapas. Primero, un antigeno celular reconocible a una célula T debe ser presentado a la célula T. El ganglio linfático contiene células que presentan antigeno (APCs) que realizan esta. función. Las APCs también se identifican como células dendriticas y están presentes en el estroma del ganglio linfático. Asi, la primera etapa es la presentación del antigeno por las células dendriticas o APC . Segundo, las células TH1 deben ser desarrolladas de modo que sean especificas al antigeno en cuestión. Tercero, las células T citotóxicas (CTL's) son "ayudadas" a reconocer y luego atacar el material celular extraño que lleva el antigeno después de la movilización del ganglio linfático al sitio de invasión. Esas células TH que secretan las citoquinas interleucina 2 (IL-2) e interferona gamma (IFN-?) son llamadas células THl.y están asociadas con la actividad citotóxica CTL específicamente estimulante y la inmunidad mediada por la célula. Otra clase de células T designadas TH2 secretan principalmente interleucinas 4, (IL-4), 5 (IL-5) , y 10 (IL-10) y promueven la producción de anticuerpos. La "clase" predominante de citoquinas (por ejemplo, TH1 o TH2) producida en el comienzo de una respuesta inmune actúa para "dirigir" el desarrollo de las respuestas inmunes continuas en parte al inhibir la producción del tipo opuesto de citoquinas. Así, la respuesta inmune llega a ser "puntualizada" en ya sea la TH1 (mediada por células" o la dirección TH2 (humoral) por la citoquina(s) presentes tempranamente. Para la iniciación de una respuesta inmune anti-tumor robusta, por lo tanto es crucial tener las citoquinas desviadas a TH1 (por ejemplo, IL-2, IFN-?) presentes durante la fase inicial de la respuesta inmune. El objetivo en la inmunoterapia de cáncer ha sido estimulada producción de un número suficiente de células T citotóxicas especificas de tumor para destruir el tumor .

IRX-2 es un producto de citoquinas producido bajo estándares farmacéuticos de las células mononucleares estimuladas con fitohemaglutinina y ciprofloxacina obtenidas de donadores de sangre saludables, normales. Este producto se propone para ser inyectado de manera local subcutáneamente para alimentarse en los ganglios linfáticos que drenan los cánceres de cabeza y cuello para el tratamiento de los cánceres de cabeza y cuello. Este producto también se puede utilizar para cualquier otro tipo de cáncer o enfermedad infecciosa .

En el proceso . de IRX-2 comercial, la PHA, ciprofloxacina y los elementos celulares se remueven a través de la centrifugación y lavado. El sobrenadante libre de células además se procesa para limpiar los agentes adventicios (DNA, virus) y luego se formula, se esteriliza en filtro y se coloca en frasquitos. La interleucina 2 (IL-2) es un componente de citoquina activo mayor en IRX-2, junto con la gamma interferona (IFN-?), interleucina 1 beta (IL-1 p) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) . Estas citoquinas aumentan la inmunidad mediada por las células principalmente como estimuladores de la ruta TH1. El análisis de IRX-2 también revela la presencia de otros constituyentes de citoquinas en bajos niveles, pero estas citoquinas se consideran que no son criticas en la potencia del producto.

Estos componentes actúan, para aumentar la inmunidad mediada por las células mediante una variedad de actividades: reclutamiento de linfocitos (principalmente por IL-?ß) , regulación hacia arriba de los receptores de crecimiento de linfocito tal como el receptor de IL-2 (IL-2R) (principalmente por IL-?ß, IL-2, IFN-?) , aumento de la proliferación de célula T (principalmente por IL-?ß, IL-2), mantenimiento de una desviación funcional de TH1 (principalmente por IFN-?) , y aumento del procesamiento y presentación de antigeno (tumor) por las células que presentan antigeno tales como macrófagos y células dendriticas (principalmente por IFN-?) que son importantes para la activación completa de las células T que conducen a la destrucción del tumor. IRX-2 promueve la diferenciación y maduración de las células dendriticas. Las células dendriticas maduras se requieren para presentar efectivamente el antigeno a las células T. IRX-2 también induce la producción de células T naive, que son capaces de llegar a ser especificas en la presentación por una célula dendritica madura que tiene antigeno expuestos sobre la misma. TNF-a no se considera que sea un componente activo primario clínicamente, pero los niveles en IRX-2 están cercanos a aquellos de los anteriores; debido a la alta inestabilidad de TNF-a, su contenido se monitorea como un indicador de la estabilidad del producto. La Tabla 1 enseguida proporciona un listado de concentraciones para estas citoquinas en lotes de cGMP utilizados en experimentos Clínicos de Fase I y Fase II.

Tabla 1. Componentes de Citoquinas Primarias de IRX-2 Descripción Bioensayo de ELISA de Citoquinas (pg/mL) IL-2 IL-?ß IL-2 IFN-? TNF- (IU/mL) o Manual 76 418 5263 2028 1356 Manual 145 615 5797 1502 1815 Citoquinas y quimioquinas adicionales en IRX-2 se han identificado mediante ELISA. Estas incluyen IL-6, IL-10, IL-12, IL-8, factor de estimulación de colonia de granulocito (G-CSF) y factor de estimulación de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF) . Los niveles de estas proteínas son mucho menores que las concentraciones de los componentes activos primarios excepto para IL-6 y IL-8. Ellos típicamente están asociados con la respuesta inflamatoria, y son pleyotrópicos (es decir, tienen múltiples mecanismos que dependen de las células circundantes y el medio ambiente de la citoquina) . La Tabla 2 presenta un listado de estas citoquinas y sus niveles en IRX-2.

Tabla 2. Componentes de Citoquinas Primarias de IRX-2.

Además de ELISA, el Arreglo de Citoquinas Humanas RAYBIO (Ray Biotech, Inc.) de las 42 citoquinas más comunes proporciona un perfil o "huella" de citoquinas del producto IRX-2. La FIGURA 1 muestra el perfil de citoquinas del IRX-2 que se utilizó en experimentos clínicos de Fase II.

El producto de citoquina IRX-2 contrasta con la terapia de citoquina previa en las siguientes maneras: (1) se utilizan dosis fisiológicas antes que farmacológicas; (2) el producto se administra perilinfáticamente antes que intratumoralmente o intravenosamente; y (3) la producción es de leucocitos activados antes que basada en la tecnología recombinante con el fin de simular los niveles de citoquina endógenos de las células activadas nativas.

El modo de suministro toma ventaja de las rutas aferentes y eferentes normales de la activación del ganglio linfático. Normalmente, el sistema linfático se drena desde un área de interés, tal como un lecho de tumor, y los antigenos y otros factores asociados con la enfermedad migran en el sistema linfático a los nodos regionales. En los nodos regionales, las células que presentan antigeno (APC o célula dendritica) son responsables para asegurar y procesar estos antigenos relacionados con la enfermedad y presentarlos a las células T, con la proliferación resultante, de células T especificas de antigeno, activadas. Al presentar la sustancia biológica derivada de célula primaria natural y en esta ubicación, antes que sistémicamente, hay una oportunidad para facilitar o movilizar la función de la célula dendritica asi como directamente activar las células T para proliferar y llegar a ser células CTL. Adicionalmente, mediante la aplicación más directa, se permiten menores exposiciones del fármaco y menos sustancia de fármaco de citoquina activa se pierde en la circulación sistémica.

Las dosis de citoquinas individuales se han evaluado para la toxicidad en experimentos clínicos y se encontraron que tienen perfiles de dosis-toxicidad típicos. En contraste, las curvas de dosis-respuesta de citoquina son típicamente en forma de campana. Muchas citoquinas son aprobadas para el uso terapéutico humano o se han evaluado en estudios clínicos de Fase I o FASE II. Cuando se prueba, el perfil de dosis-toxicidad de las citoquinas investigadas no se ha afectado por la administración concomitante de otras citoquinas. Basado en la historia del uso pasado, una gráfica de comparación de dosis recomendadas o evaluadas en el umbral de toxicidad para varias citoquinas y la cantidad de citoquina presente en un curso completo de IRX-2 se muestra en la Tabla 3 junto con el margen probable de seguridad en órdenes de magnitud como sigue.

Tabla 3. Comparación de dosis de citoquina de IRX-2 máximas contra dosis terapéuticas 3 Cálculo: 8000 pg IL-2/mL x 0 021 IU/pg x 20 mL = 3360 IU 4 Nuevas Especificaciones x (10 x 2) mL = dosis máxima IRX-2 acumulativa Dados estos márgenes de seguridad, es improbable que el impacto toxicológico significante resultaría de la dosis de citoquinas individuales contenidas dentro de IRX-2.

Como se utiliza en la presente, "células mononucleares" (MNCs) son células del sistema hematopoyético que no contienen gránulos . Las MNCs incluyen linfocitos, células de plasma, monocitos y macrófagos, y mastocitos.

Como se utiliza en la presente, "agentes adventicios" son virus y toxinas, y frecuentemente agentes infecciosos, que pueden accidentalmente contaminar una linea de células. Los agentes adventicios en la presente invención se desean que sean removidos de la sustancia biológica derivada de célula primaria antes de la administración a un paciente para reducir o eliminar las oportunidades de infección de enfermedades indeseadas.

El proceso de la presente invención se detalla en la columna derecha de la FIGURA 2. Cada una de las etapas en el proceso está disponible para la escalación aumentada para la producción de cantidades grandes de la sustancia biológica derivada de célula primaria.

En la primera etapa del proceso, las MNCs se purifican para remover cualquiera de las células que podrían estar contaminando para la producción de la sustancia biológica derivada de célula primaria a través del uso de un procesador de células, que es un dispositivo centrífugo programable. Este dispositivo es además descrito en los ejemplos enseguida. Las MNCs se enriquecen para ser compuestas de linfocitos y monocitos al cargar las MNCs sobre el Medio de Separación de Linfocito (LSM) y luego al centrifugar las MNCs. De preferencia, se utilizan 300 mL de LSM. Las MNCs de los donadores se purifican simultáneamente, lo cual significa que múltiples donadores pueden ser purificados a la vez. De preferencia, las MNCs de 12 donadores se purifican simultáneamente. La purificación de células mediante la centrifugación de las MNCs es de preferencia en 1500 a 3000 rpm para optimizar la remoción de los granulocitos y los glóbulos rojos de la sangre.

En general, la primera etapa es un método automatizado de purificación de las células al cargar las células a un procesador de células automatizados, al lavar y al centrifugar las células automáticamente y al obtener células purificadas. En otras palabras, el método automatizado puede ser utilizado para cualquiera de las células para las cuales se desea purificación, y no ' está limitado a las MNCs. De manera importante, el uso del procesador de células automatizado permite la escalación aumentada o la escalación disminuida de' las células purificadas a través del ajuste de las especificaciones del procesador de células.

Tal proceso de purificación se ha utilizado previamente para simplemente purificar células para el uso subsecuente de las células. Este no se ha utilizado para producir citoquinas y no se ha utilizado para producir citoquinas naturales.

Las MNCs luego se almacenan durante la noche en un sistema de bolsa estéril cerrada. De preferencia la bolsa es una bolsa de etileno propileno fluorado (FEP) . El uso de las bolsas en la presente invención optimiza la producción de citoquina arriba de los niveles de producción normales. Esto es debido al ambiente de (¼ rico en las bolsas que es óptimo para la producción de citoquinas.

Al siguiente día, una mezcla de inducción de las MNCs se estimula con PHA durante 2 hrs y ciprofloxacina durante 2 horas a 37°C en C02 al 5%. De preferencia, se utilizan 80 pg/mL de ciprofloxacina . La inducción ocurre en un dispositivo de cultivo de células escalable, que permite que cantidades más grandes de mezclas sean inducidas que las que se han inducido previamente. La inducción con el dispositivo de cultivo de células escalable permite la producción de citoquinas en cantidades más grandes que las que se han inducido previamente en el método manual. Asi, en general, la presente invención proporciona un método para inducir células mediante la inducción de células en un sistema de cultivo de células escalable. Las células se pueden inducir para ser cualquier producto celular, tal como las citoquinas inducidas en la presente invención. El proceso no está limitado a la inducción de citoquinas, y se puede inducir cualquier producto deseado.

El PHA luego se remueve de la mezcla de inducción a través de filtración. Más específicamente, la mezcla de inducción se lava con solución salina estéril, las MNCs se recuperan, y luego se resuspenden en el medio de cultivo con 80 g/mL de ciprofloxacina . De preferencia, el nivel de PHA se reduce a menor que <150 ng/mL. De preferencia, el filtro es el filtro de Fibra Hueca Spectrum® CellFlow Plus®, y opera en el modo de flujo tangencial. La mezcla de incubación luego se incuba, de preferencia durante 24 horas. Normalmente, el proceso de lavado de células se utiliza para obtener las células que son utilizadas. La presente invención utiliza el lavado para remover el PHA pero las células se regresan al cultivo con el fin de producir citoquinas adicionales. Los filtros en esta etapa y en cada etapa de proceso son escalables y sé puede utilizar cualquier filtro apropiado. Después de 24 horas se produce la sustancia biológica derivada de célula primaria comprendida de citoguinas de Tipo I (TH1) . La mezcla de inducción luego se clarifica, es decir, se recolecta, para obtener el sobrenadante biológico derivado de célula primaria o de las MNCs. Las células se filtran con una membrana , de fluorodyne con un filtro de 0.45 µp. De preferencia, se utiliza un filtro FLUORODYNE II TM (Pall) y es además descrito en los Ejemplos. Esta etapa automática proporciona ventajas sobre la centrifugación manual previa de la sustancia biológica derivada de célula primaria.

La última etapa en el método de producción es limpiar el sobrenadante biológico derivado de célula primaria del DNA y los agentes adventicios al aplicar la cromatografía de intercambio aniónico y la filtración de virus de 15 nanómetros. Se puede lograr activación viral adicional mediante la aplicación de UVC . Varios agentes adventicios pueden ser limpiados, como es descrito en lo anterior, tales como virus y DNA. Los virus limpiados incluyen, pero no están limitados a, virus de inmunodeficiencia humana (HIV) ,· hepatitis C (HCV) , hepatitis B (HBV) , virus T-linfotrópico humano (HTLV) , virus de simio 40 (SV40), parvovirus porcino (PPV), virus de pseudorrabia (PRV) , hepatitis A (HAV) , virus de diarrea viral bovina (BVDV) , Sindbis, Reo y Adeno virus. De preferencia, las etapas de intercambio aniónico y de filtración de virus de 15 nanómetros eliminan arriba de 4 logio virus.

Cuando se aplica UVC, esta se suministra uniformemente a la sustancia biológica derivada de célula primaria mediante el flujo en espiral del sobrenadante biológico derivado de célula primaria a lo largo de una fuente de irradiación de UVC. De preferencia, la UVC se suministra en una longitud de onda de 254 nm de la sustancia biológica derivada de célula primaria, tiene una dosis de hasta 150 J/m2.

De preferencia, la sustancia biológica derivada de célula primaria única producida es IRX-2 (anteriormente conocida como NCM) . Las citoquinas producidas en IRX-2 incluyen IL-?ß, IL-2, e IFN-?. De preferencia, IL-2 y IL-?ß se producen en una relación 10:1. De preferencia, mayor que 4 L de IRX-2 se produce total en un lote. De preferencia, el sobrenadante biológico derivado de célula primaria se puede concentrar y formular para que se produzcan 300-1800 pg/ml de IL-?ß, 4000-8000 pg/mL de IL-2, 1000-3800 pg/mL de IFN-?, y 1000-4300 pg/mL de TNF-OÍ . La mezcla de inducción opcionalmente puede ser activamente gasificada.

Los datos en la presente muestran que el proceso de IRX-2 es significativamente mejorado por las siguientes mejoras del proceso: (1) purificación de MNC usando el procesador de células automatizado, (2) almacenamiento de MNCs en bolsas FEP VUELIFE® (American Fluoroseal Corporation) , (3) inducción de un dispositivo de cultivo de células escalable, (4) lavado de las células utilizando el sistema de filtro de Fibra Hueca (HF) y (5) clarificación del sobrenadante de cultivo por la vía de la filtración utilizando un filtro de 0.45 µp?, (6) remoción de DNA utilizando la filtración de cromatografía de intercambio aniónico, (7) remoción de virus utilizando filtros de 15 nanómetros dobles en serie y (8) la inactivación viral adicional se puede lograr al aplicar UVC. Una estimación de cada operación unitaria y sus cambios muestra que los parámetros críticos se mantienen dentro de un intervalo de trabajo aceptable y que el proceso es capaz de proporcionar el producto que cumple sus especificaciones.

El proceso comercial además se evaluó al realizar varios lotes con todas las modificaciones del proceso que produjeron todas las citoquinas de IRX-2 en relaciones típicas como se observó previamente con el proceso manual. Lá comparabilídad de los componentes biológicos derivados de célula primaria y la equivalencia biológica se confirmaron mediante el Arreglo de Anticuerpo de Citoquina Humana RAYBIO (RayBiotech, Inc.) y el modelo de vacuna conjugada .con péptido. Basado en estos datos, el proceso comercial es comparable al proceso de IRX-2 manual y produce un producto consistente y reproductible .

Como se muestra en la FIGURA 2, los desarrollos/cambios del proceso de IRX-2 previo se hicieron en cada una de las siguientes etapas de manufacturación. Primero, en la etapa de purificación, hubo un cambio de la centrifugación manual a un procesador de células automatizado. El. almacenamiento durante la noche de las MNCs se cambió del almacenamiento durante la noche de la MNC en tubos de polipropileno al almacenamiento de las MNCs en bolsas FEP VUELIFE®. El lavado de las células se mejoró al cambiar de la centrifugación manual a un sistema de filtro de Fibra Hueca (HF) . La inducción se mejoró y la escalabilidad del proceso se logró al utilizar un dispositivo de cultivo de células desechable (Cell Factory) . También, la recolección/clarificación del sobrenadante de cultivo se mejoró al cambiar de centrifugación manual a la filtración de un solo paso utilizando un filtro de 0.45 µp\. La remoción de DNA se mejoró mediante la filtración con filtro de cromatografía de intercambio aniónico. La remoción del virus se mejoró mediante la filtración con filtros de 15 nanómetros dobles en serie. La inactivación del virus adicional se puede mejorar al aplicar UVC .

Debido a estos cambios, el proceso de manufacturación comercial de IRX-2 se ha mejorado sobre el proceso manual previo. Globalmente, una reducción del tiempo de producción y esfuerzo por el uso del procesador de células automatizado elimina mucho del error y variación producida entre los lotes de IRX-2 en el proceso previo. Por ejemplo, el error del operador se reduce debido a la automatización. La escalación aumentada en volumen se logra debido al diseño y automatización del sistema. Además, se evita la contaminación debido a que se utiliza un sistema de bolsa cerrada, dando el procesamiento aséptico, que es una ventaja inmensa sobre el proceso previo. Las ventajas de la evacuación viral se discuten enseguida.

El método comercial de la manufactura de IRX-2 incluye la evacuación viral mediante filtros de 15N de nanofiltración en serie como una etapa de remoción de virus dedicada y también incluye la remoción de DNA mediante la unidad de cromatografía de intercambio aniónico desechable. Los filtros de 15N se han mostrado que son altamente efectivos en la remoción del virus de inmunodeficiencia humana Tipo 1 (HIV-1), virus de pseudorrabia (PRV), virus de hepatitis A (HAV) , virus de diarrea viral bovina (BVDV) y parvovirus porcino (PPV) . en estudios realizados por el fabricante y los usuarios finales. En contraste, el intercambio aniónico se ha mostrado que es efectivo contra virus objetivos seleccionados. Es fuertemente aconsejado tener dos métodos ortogonales que sean capaces de remover o inactivar una variedad de virus modelo con el fin de mejor asegurar la seguridad del paciente (Puntos a Considerar de FDA, 1993) .

Con el fin de adicionar un método de evacuación viral adicionada al proceso de IRX-2, se adiciona la inactivación de UVC como una etapa de inactivación en la presente invención. ' Como se discute adicionalmente en los Ejemplos enseguida, se condujeron estudios sobre una amplia gama de dosis de UV de 20-150 J/m2 y no mostraron cambio significante en el contenido de citoquina utilizando la ELISA de citoquina, manchado de western, arreglos de citoquina o bioensayo de CTLL-2. Además se desarrolló un nuevo ensayo para TNF-a que mide la bioactividad de esta citoquina inestable. Aunque se detectó alguna disminución en la bioactividad de TNF-a, esta pérdida fue comparable a la pérdida típicamente observada en otras etapas del procesamiento. En estas mismas dosis de UVC (100 J/m2) más grandes que 4· logio de inactivación viral se logró para los virus modelo, PPV y BVDV, y para el virus portado por la sangre, HAV. HIV mínimamente se inactivo con <2 logio de inactivación viral. Utilizando esta tecnología de UVC, múltiples lotes de laboratorio de IRX-2 se produjeron exitosamente en la escala actual y pasaron las especificaciones de liberación en volumen confirmando la capacidad robusta del proceso de UVC. El proceso mejorado proporciona mejor protección de los pacientes al incluir una etapa de inactivación que es robusta y puede inactivar una amplia gama de contaminantes virales incluyendo virus no envueltos tal como hepatitis A y parvovirus B19 y virus envueltos (virus de hepatitis C) .

Los datos en los Ejemplos resumen el desarrollo de una nueva tecnología de inactivación viral y radiación UVC, capaz de complementar los métodos de evacuación viral sin reducir significativamente los rendimientos de citoquina de IRX-2. Basado en estos requerimientos y el material de fuente, los leucocitos humanos, la inactivación de 4 logio del virus de prueba es el objetivo deseado para este procedimiento adicional para ser útil. La inactivación con UVC cuando se combina con los dos métodos existentes de evacuación viral en el proceso de IRX-2, el intercambio aniónico y la filtración de 15N, podría incrementar potencialmente la inactivación/remoción viral global a 12 o más logio de los virus no envueltos.

El desarrollo/cambios en el proceso de IRX-2 se hicieron en las siguientes etapas de la manufacturación : la centrifugación del procesamiento de células automatizado Cobe 2991, uso de bolsas estériles para el almacenamiento de linfocito, la inducción en un dispositivo de cultivo de células desechable, el lavado de las células con filtración de fibra hueca, la remoción de DNA con la cromatografía de intercambio aniónico, la remoción viral con la filtración de 15 nanómetros doble en serie y la inactivación viral adicional mediante UVC. La FIGURA 2 ilustra el proceso de IRX-2 con la adición de la inactivación viral de UVC.

La invención es además descrita en detalle por referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan para propósitos de ilustración solamente, y no se proponen para ser limitativos a menos que se especifique de otra manera. Así, la presente invención no debe ser considerada de ninguna manera como que es limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien, ser considerada que abarca cualquiera y todas las variaciones que llegan a ser evidentes como un resultado de la enseñanza proporcionada en la presente.

EJEMPLO 1 Purificación de MNCs utilizando el procesador de Célula/almacenamiento de bolsa FEP Estudios de Fracción de LSM El propósito de la etapa de purificación de LSM en el proceso de IRX-2 es para remover las células contaminantes (granulocitos , glóbulos rojos de la sangre y plaquetas) que producen una preparación enriquecida de células mononucleares (MNCs) compuestas de linfocitos y monocitos.

Los granulocitos pueden causar pobre rendimiento de citoquina al interferir con el conteo de células preciso de las MNC asi como la interferencia con la inducción de PHA (es decir, al enlazar el PHA) . El limite del proceso real de los granulocitos todavía no se ha determinado. Temprano en el desarrollo del proceso de IRX-2, la remoción de granulocitos se monitoreó en el analizador de hemocitología Coulter Ac»T diff 2 y el límite del proceso se ajustó en NMT 5% (límite de detección del Ac»T diff 2) .

En el proceso previo, las MNCs se purifican manualmente utilizando la centrifugación sobre gradientes de densidad Media de Separación de Linfocito (LSM, equivalente a FICOLL-HYPAQUE 1077 (Sigma) ) . Cada donación se purifica separadamente y hasta 24 donaciones se acumulan justo antes de la inducción de citoquina. Esto da por resultado alta pureza, pero no es adecuado para la escalación aumentada debido a la limitación de procesamiento manual que requiere dos operadores para un desplazamiento de 8-10 hr completo para procesar 24 donadores (12 donadores por operador).

En el proceso modificado de la presente invención, la purificación de LSM se realiza utilizando un sistema de bolsa estéril cerrada y un dispositivo centrifugo programable, un procesador de células. El proceso comercial permite que los leucocitos sean procesados en acumulaciones de donadores de 12. Esto permite a un operador procesar hasta 36 donadores por desplazamiento.

En el proceso comercial, las bolsas se llenan asépticamente y los leucocitos se acumulan. Las bolsas de leucocito se unen asépticamente a un arnés. Los leucocitos se acumulan en una sola bolsa y la bolsa se sella con calor. La bolsa se instala en el procesador de células y las válvulas y la tubería codificada en color se alinea. Los leucocitos se cargan y se centrifugan. Una capa leucocítica se prepara, se concentra y se recolecta. Una segunda bolsa se instala en el procesador de células. La capa leucocítica se coloca en capas sobre LSM en 20 mL/minuto, y se centrifuga durante 20 minutos (FIGURA 3). Las MNCs se separan en una tercera bolsa mostrada en la FIGURA 4. Las células se lavan en los ciclos de lavado programados con solución salina y se resuspenden en medio de cultivo libre de suero.

Resultados Para analizar la factibilidad de usar el procesador de células para la purificación de LSM de las MNCs, el desarrollo inicial del procedimiento involucró purificar las MNCs por la vía de un procesador de células y recolectar asépticamente las células expresadas en fracciones. Estas fracciones se analizaron por la vía del analizador Coulter Ac*T diff 2 y mostró que las MNCs purificadas se pueden recolectar esencialmente libres de granulocitos .

Tabla 4. Análisis del Coulter Ac»T diff 2 de Fracciones de MNC recolectadas Fracción Células Volumen % % % totales (mL) Lin ático Mono Granos (108) 1 0.075 25 n.d. 2 0.025 25 • ___ 3* 20 25 88 9 2.2 4* 15 25 90 7.5 2.4 5* 2.7 25 88 5.9 5.7 6* 1.3 25 89 3.4 7.4 7 0.85 25 88 2.2 9.8, 8 0.48 25 81 3.9 14.7 9 0.30 25 73 4.7 21.9 fracciones acumuladas; n.d. - nada detectado La FIGURA 5 y la Tabla 4 muestran la distribución de células relativa de las fracciones recolectadas del procesador de células. Esto demuestra el potencial para recolectar hasta 100 mL de MNCs del procesador de células que cumplen la pureza requerida' (<5% de granulocitos ) , con un rendimiento total de células tan alto como 4 x 109 células. Esto es igual a un incremento de 10 veces de las células que pueden ser purificadas por un solo operador. Las fracciones que contienen la mayoría de la MNC (Fracciones 3-6) . se recolectaron asépticamente, se acumularon y se lavaron mediante el método de lavado estándar y se almacenaron durante la noche en bolsas FEP.

Las MNCs se utilizaron para producir un lote de IRX-2 con los niveles de citoquinas apropiados de IL-?ß, IL-2 & IFN-? para la producción de IRX-2.

Estudios de Almacenamiento de MNC En el proceso previo, las MNCs purificadas se almacenan durante la noche en tubos de centrífuga- de polipropileno. Debido al volumen grande de las MNCs producidas por corrida utilizando el procesador de células, se implemento una alternativa para el almacenamiento de 40 mL de MNCs de donador individual (aproximadamente 5 x 108) en tubos de polipropileno de 200 mL. Para ' ajusfar los altos rendimientos de células, las bolsas (FEP) se utilizaron para almacenar MNCs durante la noche (37°C, 5% C02) . Las bolsas de almacenamiento FEP se han utilizado para la expansión de células dendriticas, el almacenamiento de linfocitos humanos y la producción de células LAK y son adecuadas para el almacenamiento de linfocitos debido a la alta permeabilidad de gas y bajas propiedades de enlace. Para almacenar las células, la concentración en las bolsas FEP se ajustó para ser equivalente a la concentración de almacenamiento en tubos de polipropileno. La viabilidad de MNC y la concentración de células se monitorearon utilizando el GUAVA VIACOUNT (Guava Technologies) .

La FIGURA 6 muestra el proceso de almacenamiento. Las MNCs se remueven asépticamente de su bolsa y se transfieren asépticamente a la bolsa FEP. Las bolsas FEP se almacenan durante la noche.

Resultados : El procedimiento de · almacenamiento durante la noche se evaluó al comparar la concentración de células y la viabilidad para MNCs purificadas. Las muestras se evaluaron mediante el Guava®Viacount® en el Día 1 (en el tiempo de dilución en las bolsas FEP y Dia 2 (antes de la inducción de PHA) . Como se puede observar en la Tabla 5, las MNCs no mostraron pérdida en la concentración de células y retuvieron alta viabilidad (95%) durante el almacenamiento durante la- noche demostrando la adecuabilidad almacenamiento.

Tabla 5. Análisis de población de células de las MNCs purificadas en el procesador de células por la via de Viacount media 1 s.d.

Caracterización del Tipo de Célula y Estudios de Distribución .

Para evaluar completamente las MNCs producidas sobre el procesador de células, las diversas poblaciones de células en las MNCs purificadas se examinaron para determinar la comparabilidad de las células producidas por el nuevo método contra la purificación de LSM manual. Las MNCs se analizaron utilizando el marcador de diferenciación de células (CD) por la via de la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) para cuantificar las poblaciones de células.

Resultados: En la Tabla 6, los datos sobre la distribución de población de células se presentan tanto para las MNCs preparadas por el método de purificación de LS manual, asi como por el método de procesamiento de células automatizado.

Para el método original, el análisis FACs se realizó en las MNCs acumuladas del Día 2 inmediatamente antes de la inducción de PHA. Para el proceso comercial, las poblaciones de células se muestrean y se probaron tanto en el Día 1 (antes del almacenamiento durante la noche) y el Día 2 (después del almacenamiento durante la noche) .

Tabla 6. Análisis de población de células de las MNCs purificadas en el procesador de células por la vía de FACS Datos presentados como por ciento de células totales (media ± s.d. ) , B Los datos en la Tabla 10 confirman la equivalencia del proceso comercial con el método manual. Las preparaciones de MNC resultantes se produjeron con contenido de granulocito abajo de la especificación actual de =5% como es predicho en la literatura disponible (Brutel de la Riviere y colaboradores 1977) . Estos datos indican que las MNCs generadas por el procesador de células son equivalentes a la distribución de células y la pureza al método estándar.

Se observó que la concentración de monocito (CD14+/CD45+) aparece para ser consistentemente menor en el proceso comercial después de- la incubación (Dia 2) comparado con el método de proceso manual previo. La examinación de la MNC recientemente preparada (Dia 1) reveló que hubo una ligera caída en la población del marcador de monocito (CD14+) de 18% a 12%.

La ligera diferencia en la población de células se investigó adicionalmente al determinar la población de células de la MNC purificada en el procesador de célula inmediatamente después del procesamiento y antes de la incubación durante la noche.

La Tabla 10 muestra que las células mononucleares muestreadas inmediatamente del procesador de células se observa comparable a aquel visto por el proceso previo. Es evidente que estos datos que el tiempo cuando las células son muestreadas y analizadas tienen un efecto grande sobre el perfil de población. En el mismo proceso, las células muestreadas después del almacenamiento durante la noche tiene un desplazamiento ligeramente inferior en el marcador CD14+ CD45+ para monocitos. Este cambio en la población de CD14+ CD45+ se puede atribuir a la activación de los monocitos con linfocitos de donador heterólogos; este es llamado una reacción de linfocito mezclada (MLR) . De acuerdo con la literatura (Jordán & Ritter 2002), esta reacción puede iniciar a las células T para producir citoquinas TH1 (es decir, IL-?ß, TNF-OÍ, y IFN-?) , que son los productos primarios del proceso IRX-2. Puesto que estos son deseados en el producto, el sostenimiento de la acumulación durante la noche no muestra impacto negativo sobre la producción de. IRX-2.

Estudios de Lote de 2-3 L El propósito de este estudio fue producir varios lotes de desarrollo de IRX-2 de 2-3 L utilizando las MNCs purificadas por el procesador de células. La preparación entre células de MNCS purificadas de varias corridas, realizadas en el mismo día se acumuló para producir suficiente células para producir un lote de dispositivo de cultivo de células de 10 apilamientos.

Resultados : La equivalencia de la producción de citoquina del proceso comercial se confirmó por la vía de numerosos ensayos de ELISA y el bíoensayo de CTLL-2. Los intervalos del producto final para las diversas citoquinas fueron predichos al normalizar las citoquinas a una concentración objetivo de 7000 pg/mL de IL-2. Como se puede observar en la Tabla 7, el producto en volumen producido podría ser formulado para pasar todos los ensayos de citoquina y son comparables al producto clínico de Fase I y II.

Tabla 7. Producción de citoquina del IRX-2 producido utilizando MNCs purificadas en el Procesador de Células Datos presentados como media La diferencia principal en el proceso modificado es que las MNCs purificadas resultantes de múltiples donadores (monocitos, células T, células B y células NK) se incuban conjuntamente durante la noche antes de la inducción del mitógeno. Para confirmar no nuevas especies de citoquinas que se producen de este método, especialmente citoquinas TH2 (es decir, IL-3, IL-4 & IL-5) y para probar la comparabilidad de la producción de citoquina de las MNCs generadas por el procesador de células, el IRX-2 del proceso modificado se analizó pro la vía de arreglos de citoquina (Arreglo 3, Anticuerpo de Citoquina Humano RAYBIO ( Ra'yBiotech, Inc.)) que detecta 42 citoquinas humanas, quimioquinas y factores de crecimiento. El análisis de arreglo de estas citoquinas más comunes (Huang y colaboradores, 2001) sobre el IRX-2 de las células generadas en el procesador de células confirmó que el perfil o "huella" del producto IRX-2 comercial es comparable a la composición de citoquina al producto actual y no se induce nueva citoquina (es decir, citoquinas Tipo 2) como se muestra en la FIGURA 7.

EJEMPLO 2 Lavado de la Células utilizando el sistema de Filtro Hueco Se desarrolló un método de lavado de MNC automatizado, que efectivamente remueve la sustancia química del proceso fitohemaglutinina (PHA), un mitógeno, de las MNCs inducidas a niveles comparables con el lavado mediante la centrifugación manual mientras que se mantiene la viabilidad celular y la habilidad para producir citoquinas de IRX-2.

En la segunda etapa del proceso IRX-2, las MNCs acumuladas se inducen para producir citoquinas biológicamente activas mediante la adición de un mitógeno, fitohemaglutinina (PHA) y ciprofloxacina . En conjunción con PHA, la ciprofloxacina estimulas las células a inducir la transcripción de las citoquinas de tipo I incluyendo IL-2 e IFN-?. La FIGURA 8 muestra las células que son mezcladas con los medios/inductores y que son preferidas a un dispositivo de cultivo de células desechable. La FIGURA 9 muestra el dispositivo de cultivo de células desechable que es colocado en la incubadora. Después de la inducción, la mezcla de inducción, el medio de cultivo y las células, se recolectan asépticamente y las células se recuperan por la via de la centrifugación. El dispositivo de cultivo de células se lava con solución salina estéril tres veces y aproximadamente 20% de las células se recuperan de los lavados combinados con aproximadamente 80% de las células que permanecen unidas a la superficie de CF. Las células recuperadas luego se resuspenden en el medio de cultivo X-Vivo 10 fresco con 80 pg/mL de ciprofloxacina y se regresan al dispositivo de cultivo de células. La generación de citoquina ocurre durante un periodo de 24 horas, adicional que produce el IRX-2 en volumen libre de mitógeno.

Para estimar la eficiencia del proceso de lavado y asegurar los residuos mínimos de la impureza del producto, el producto en volumen final se prueba para la PHA residual por la vía de una ELISA. La especificación del producto final para la PHA residual es <150 ng/mL, el límite de detección del ensayo de ELISA de PHA.

En el método mejorado, el lavado ' de las células yla remoción de la PHA se realiza utilizando la filtración de fibra hueca en modo de flujo tangencial como se muestra en las FIGURAS 10 y 11. Además de la producción de citoquina, los parámetros de salida críticos utilizados para demostrar la equivalencia son la remoción de PHA y la recuperación de células viables.

Resultados: Para determinar más precisamente estos bajos niveles residuales de PHA se desarrolló y se validó una nueva ELISA de PHA más sensible. La Tabla 8 compara el contenido de PHA de un lote Clínico de IRX-2 procesado utilizando centrifugación (utilizado en la producción clínica de FASE II) con aquella de seis lotes en la cual el lavado se realizó mediante el método de filtración de fibra hueca. Con el nuevo método, el mitógeno se ha reconocido a un nivel por abajo del límite de especificación para PHA.

Tabla 8. Contenido de PHA después de la remoción por centrifugación o filtración de fibra hueca ¦"¦Datos presentados como media ± s.d fecha del ensayo 11/06/06 Pre-MQ La Tabla 9 presenta el % de recuperación de células de las células lavadas utilizando el método de lavado HF de dos diferentes lotes. Como se puede observar enseguida, la mezcla de inducción recuperada de la fábrica de células después de las dos horas de incubación (marcada "Contenidos de CF") contiene una fracción pequeña de las células de partida (12%) inicialmente inducidas en el dispositivo de cultivo de células. Estos datos confirman, después del proceso de lavado de fibra hueca, que las células se recuperaron con viabilidad adecuada y con pérdida mínima, muy dentro de la variabilidad del ensayo, como es determinado por la exclusión de tinte azul de Tripano.

Tabla 9. Exclusión de tinte azul de Tripano de la MNC recuperada durante el lavado en fibra hueca El análisis de la citoquina producida por las células lavadas por el nuevo método se presenta en la Tabla que muestra las citoquinas de IRX-2 típicas 10. Producción de citoquinas de IRX-2 producida utilizando la filtración con fibra hueca ""¦Datos presentados como media ± s.d Estos datos preliminares confirmaron que el sistema de filtro de Fibra hueca (HF) se puede utilizar para lavar las células, reemplazando la centrifugación manual laboriosa y consumidora de tiempo con remoción de PHA adecuada, recuperación de células y producción de citoquinas en la producción de IRX-2.

EJEMPLO 3 Recolección/clarificación del sobrenadante de cultivo de IRX-2 Se desarrolló un método de clarificación de sobrenadante con filtración de 0.45 mieras, que efectivamente remueven las células del sobrenadante de cultivo y es comparable a la centrifugación manual sin reducir significativamente los rendimientos de citoquina de IRX-2. Se muestra que hay poca a nada de remoción de citoquinas de IRX-2 criticas. La clarificación del sobrenadante se muestra en la FIGURA 12.

Resultados : Durante el proceso de IRX-2 actual el sobrenadante de cultivo que contiene las citoquinas inducidas se clarificó (es decir, remoción de células) utilizando la centrifugación. Con el fin de modernizar y escalar aumentadamente el proceso los inventores evaluaron un filtro de membrana de filtro de 0.45 mieras para la remoción de la célula y la clarificación del sobrenadante. El mismo material de membrana de PVDF se utiliza en otras etapas del proceso de IRX-2 (pre-filtro de intercambio aniónico y el filtro de grado de esterilización del producto final) y se seleccionó para el enlace de proteina mínimo. La evaluación de los datos demuestra la remoción de citoquina mínima cuando el sobrenadante de cultivo de IRX-2 se filtró a través de la membrana fluorodyne (Tabla 11) . El filtro será escalado (utilizando la relación de volumen de lote al área de filtro y en delta P constante) de acuerdo con el tamaño del lote de IRX-2 requerido.

Tabla 11. % de Recuperación de Citoquina utilizando la filtración de PVDF de 0.45 mieras Media ± sd EJEMPLO 4 Lotes de factibilidad .

El propósito de este estudio es producir varios lotes en la escala actual (2-3' L, ) combinando todos los nuevos métodos para la producción de IRX-2. Este estudio confirmará que estos métodos "escalables" , automatizados para producir IRX-2 son comparables al proceso de IRX-2 manual.

Resultados: Tres lotes de factibilidad se produjeron utilizando toda la modificación del proceso resumida en esta solicitud. El análisis de citoquina del producto de IRX-2 utilizando el proceso modificado completo se presenta en la Tabla 12. Estos lotes se normalizaron a una concentración de IL-2 objetivo de 7000 pg/mL y se compararon con dos lotes clínicos producidos por el proceso manual. El análisis de estos lotes mostró que el nuevo proceso produjo IRX-2 en los intervalos de citoquina típicos.

Tabla 12. Análisis de Citoquina de IRX-2 Producido por el Proceso Comercial La remoción de PHA por la* vía del método de lavado de fibra hueca también se confirmó que proporciona producto aceptable con niveles de PHA que cumplen la especificación de liberación de QC de <150 ng/mL (Tabla 13) y proporciona una dosis típica de 50 ng/kg, muy por abajo del nivel de administración segura (167 ng/kg) o nivel de toxicidad (833,000 ng/kg) por 4 órdenes de magnitud. Esto claramente demuestra los bajos niveles del mitógeno del proceso residual que representan un producto seguro.

Tabla 13. Contenido de PHA después de la remoción mediante centrifugación o fibra hueca *Antes de la cromatografía de intercambio aniónico filtración viral Además de la prueba analítica, el IRX-2 producido por el proceso modificado también mostró desempeño de equivalencia en un modelo in vivo, el modelo de vacuna de conjugado de péptido. IRX-2 se ha mostrado que induce una respuesta de célula T en ratones como es medido por la generación de células T citotóxicas o hipersensibilidad de tipo retardada, DTH (Naylor y Hadden 2003) . Las muestras de tanto el proceso manual como IRX-2 hecho por el proceso comercial ambas indujeron reacción de hipersensibilidad de tipo retardada (DTH) en ratones utilizando el conjugado de péptido de PS A-KLH como antigeno (Tabla 14 y FIGURA 13) . Esto confirma el desempeño biológico equivalente en un modelo in vivo y proporciona datos que sustentan la comparabilidad del IRX-2 hecho por el proceso modificado.

Tabla 14: Estudios de Actividad In Vivo que Evalúan el IRX-2 del Proceso Manual contra el IRX-2 del Proceso Comercial Protocolo: Los ratones se inmunizaron con la vacuna de conjugado de PSMA-KLH e IRX-2. preparado ya sea por el proceso estándar o el proceso modificado. Los ratones recibieron 9 inyecciones adicionales de IRX-2 solo y se reforzaron en el día 14 y 28. La respuesta de DTH a los péptidos se midió como el incremento en el hinchamiento de la planta de la pata 9 días después de la inmunización de refuerzo.

Conclusión Los datos en la presente muestran que el proceso de IRX-2 es significativamente mejorado por las mejoras del proceso propuestas: (1) purificación de NC utilizando el procesador de células automatizado, (2) almacenamiento de MNCs en bolsas FEP, (3) lavado de las células utilizando el sistema de filtro de Fibra Hueca (HF) , (4) inducción y generación de citoquina en un dispositivo de cultivo decélulas desechable, y (5) clasificación del sobrenadante de cultivo por la vía de la filtración utilizando el filtro de 0.45 µ?? de PVDF. Una estimación de cada operación unitaria y sus cambios muestra que los parámetros críticos se mantienen dentro de un intervalo de trabajo aceptable y que el proceso es capaz de proporcionar el producto que cumple sus especificaciones. El proceso además se evaluó al realizar varios lotes con todas las modificaciones del proceso que produjeron todas las citoquinas de IRX-2 en relaciones típicas como se observó previamente con el proceso actual. La comparabilidad de los componentes biológicos derivados de célula primaria y la equivalencia biológica se confirmaron por el arreglo de Anticuerpo de Citoquina Humana RAYBIO (RayBiotech, Inc. ) y el modelo de vacuna de conjugado de péptido. Basado en estos datos, el proceso modificado es comprable al proceso de IRX-2 actual y produce un producto consistente y reproductible . Un resumen de. los cambios se puede encontrar en la Tabla 21 adicionalmente enseguida.

EJEMPLO 5 Eliminación de virus Como se estableció anteriormente, el método previo de manufactura de IRX-2 incluye la evacuación viral mediante nanofiltración utilizando filtros de 15N dobles en serie como una etapa de remoción de virus dedicada (mostrada en las FIGURAS 14 y 15) y también incluye la remoción de DNA mediante la unidad de cromatografía de intercambio aniónico desechable (MQ) (mostrada en la FIGURA 16) .

Tratamiento con UVC El sistema UVC, un reactor con un mezclado hidráulico de flujo en espiral novedoso y mostrado en la FIGURA 17, se diseñó para superar estas limitaciones y para dirigirse a la aplicación para el uso en productos de biotecnología (Schmidt y colaboradores, 2005; Schmidt y Kauling, 2007) . Los estudios con la UVC demostraron la efectividad del tratamiento con UVC, en el reactor novedoso, para inactivar virus sin causar daño a la proteína significante ( ang y colaboradores 2004). Las soluciones de inhibidor de Alfaa-proteinasa (Alphai PI) de virus y enclavadas simuladas se probaron con varias de dosis de UVC . Las muestras de virus se analizaron para la infectividad residual y se amplificaron mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las muestras enclavadas simuladas también se analizaron para la integridad de la proteina. Alphai PI, una proteina de plasma se seleccionó como la proteina objetivo debido a la presencia de aminoácidos que absorben UV mediante lo cual el daño inducido por UV podría ser fácilmente detectado por una disminución en la actividad biológica. Se probó un panel diverso de virus que incluyen virus envueltos y no envueltos con genoma de RNA o DNA de una sola hebra o doble hebra, larga o corta. El tratamiento con UVC del Alphai-PI dio por resultado una inactivación de arriba de 4 log10 de SV40, PPV, HAV, Sindbis, Reo y Adenovirus demostrando que todos los virus de prueba se inactivaron sin considerar el tipo de ácido nucleico o la presencia de una envoltura .

En este estudio, los virus con los genomas más pequeños se encontraron que son aquellos más sensibles al tratamiento con UVC y la detección de amplicones de PCR =2.0 kb se correlacionó con la infectividad viral. Las dosis que lograron inactivación del virus significante produjeron recuperación de >90% de actividad de proteína aun en la ausencia de enfriadores. La cinética de la inactivación viral fue relativamente lineal y no persistió fracción resistente pequeña de virus. Además, PPV se mostró que es un modelo adecuado para B19 en estudios de irradiación de UV por ambos de los ensayos de PCR y de infectividad . Un resumen del desarrollo del proceso para el tratamiento con UVC se lista en la Tabla 22 adicionalmente enseguida.

Sistema de UVC UVivatec® En el reactor UVC, el flujo en espiral hidráulico novedoso a lo largo de una fuente de irradiación que induce mezclado altamente eficiente . en una corriente de fluido, de modo que altas dosis de irradiación de UVC se pueden suministrar igual y uniformemente por toda la solución de esta manera los tiempos de residencia requeridos en la cámara de irradiación son extremadamente cortos y es controlable el trabamiento con UVC (Wang y colaboradores, 2004; Schmidt y colaboradores, 2005; Schmidt y Kauling, 2007). Un conducto tubular de poli ( tetrafluoroeteleno ) que se forma en espiral alrededor de un tubo de cuarzo con una fuente de UVC concéntrica (254 nm) forma la cámara de irradiación del reactor (Figura 38) . A medida que las corrientes de fluido se mueven espiralmente a lo largo de la lámpara se generan flujos circulantes secundarios (vórtices de Dean) que proporcionan mezclado altamente eficiente que optimizan la exposición del virus a la fuente de luz UV y permiten la irradiación uniforme y controlable del volumen completo.

Para optimizar la actividad virucida del UVC y minimizar el daño a la proteina el sistema de UVC utiliza irradiación de UVC en una longitud de onda de 254 nm. Esta longitud de onda se seleccionó para dirigirse específicamente al componente de ácido nucleico del virus. La Figura 39 ilustra como se inactivan los virus en esta longitud de onda mientras que las proteínas son relativamente no afectadas (Schmidt y colaboradores 2007).

Además, las dosis requeridas para inactivar virus es 10 veces menor que aquellas previas descritas por la irradiación UV utilizada para el producto de plasma, 1000-2000 J/m2 (Chin y colaboradores 1995, Chin y colaboradores 1997, Caillet-Fauquet y colaboradores 2004, Sugawara y colaboradores 2001).

La dosificación de UVC es típicamente descrita en unidades de fluencia de UV y es dependiente de (1) la irradiancia promedio emitida por la lámpara (2) el tiempo de residencia en la cámara de irradiación y (3) la densidad óptica de la solución de prueba, (W s/cm2 = J/cm2) (Wang y colaboradores, 2004; Li y colaboradores 2005). Antes del tratamiento con UVC, el 25 de la solución se mide para determinar la interferencia generada por la solución de proteína y basado en el A254 se calcula el gasto de flujo requerido para lograr la dosis requerida.

Estudios de Evacuación Viral El proceso comercial de IRX-2 incluye dos métodos de evacuación viral validados mostrados para remover o inactivar hasta 11 logio de contaminación viral adventicia (es decir, cromatografía de intercambio aniónico y filtración de 15 nm) . Un tercer método, inactivación del virus con UV 8UVC) , se evaluó para el uso en el proceso de IRX-2. Consistente con los datos previamente publicados con la tecnología de UVC (Wang y colaboradores, 2004; Schmidt y colaboradores, 2005; Schmidt y Kauling, 2007), las dosis conocidas para exterminar virus no envueltos adventicios, hasta 150 J/m2, muestran inactivación mínima de las citoquinas de IRX-2.

La dosis de 100 J/m2 se mostró que inactiva 4 logs de varios virus objetivo incluyendo PPV, y HAV (Wang y colaboradores, 2004; Schmidt y colaboradores, 2005; Schmidt y Kauling, 2007) y se mostró, que tiene efecto mínimo sobre la citoquina de IRX-2. Por lo tanto se seleccionó como la dosis objetivo para IRX-2.

La elección de los virus utilizados para este estudio se basó en la naturaleza y origen del material de partida y las materias primas utilizadas en la producción (es decir, el producto biotecnológico derivado de leucocitos humanos) . Cada virus utilizado es un virus relevante que puede contaminar el material de fuente (en este caso la sangre humana) o un modelo reconocido para la especie contaminante esperada. Además, los virus de modelo se seleccionaron por su habilidad para crecer y crear un extracto de alto titulo (en el medio libre de suero o de baja proteina) y su facilidad de detección en un ensayo sensible y confiable. Los virus utilizados para este estudio fueron: HIV-1, BVDV, HAV, y PPV. Los virus utilizados representan una amplia gama de propiedades físico químicas con el fin de probar completamente la habilidad de los sistemas de UVC para eliminar virus. No se esperó que el UVC en estos bajos intervalos de dosis <100 J/m2 sería efectivo contra virus envueltos más grandes. Por lo tanto, el virus de pseudorrabia (PRV), suplente típico para los virus de DNA envueltos, grandes, no se probó en este estudio preliminar.

La capacidad de evacuación viral del UVC en IRX-2 se confirmó en dos estudios de evacuación viral. La muestra de IRX-2 (aproximadamente 50 mi) se recolectó con los virus modelo y portados por la sangre y se expusieron a dosis de UVC que varían de 40-150 J/m2. La Tabla' 15 muestra los resultados en 100 J/m2 y demostró que la tecnología de UVC puede proporcionar 4 logio de inactivación de virus.

Tabla 15. Resumen de Evacuación Viral Tipo de Logio de Evacuación Viral Virus Mustang-Q 15 jN Doble UVC* Total PPV 4.30 >7.24 7.37 >18.9 HIV-1 >4.39 >4.18 1.93 >10.5 HAV ND+ >5.28 5.90 >11.2 BVDV ND+ >6.01** 5.31 >11.3** PRV >4.6 >6.45 nd+ >10.9 100 J/M2; "Calculado de . un solo filtro de 15N; +No determinado Bajo las condiciones del proceso escaladas hacia abajo, la UVC demostró arriba de 4 logsio de evacuación viral para tres de los virus probados, PPV, HAV & BVDV. Arriba de 7 logs de PPV se inactivaron con UVC. El PPV, un modelo para B-19, es uno de los virus más pequeños y más difíciles de -inactivar por otros métodos, solvente/detergente, pH o calor (Chin y colaboradores, 1995) . Estudios recientes han confirmado la adaptabilidad del PPV para hacer un modelo adecuado para B-19 en comparación paralela durante la inactivación con UVC ·' (Wang y colaboradores, 2004). El parvovirus humano, B-19, puede alcanzar >1012 IU/mL en el plasma humano y es un peligro potencial para los productos derivados de la sangre (Doley y Corcoran 2006) . El HIV-1 fue menos eficientemente inactivado por UVC, 1.9 logs, posiblemente debido a su tamaño de genoma más grande (80-110 nm) , que potencialmente lo hace más difícil de inactivar con UVC (Wang y colaboradores, 2004) pero cuando se adicionó al proceso de IRX-2 se incrementa la evacuación viral a arriba de 10 Logsio- Este estudio valida la efectividad de la etapa de UVC para el proceso de IRX-2. Además, la UVC demostró arriba de 4 logs de remoción de PPV, HAV y BVDV, proporcionando de esta manera una etapa de evacuación viral adicional en el proceso de IRX-2. Con la adición de UVC, los datos indican que la evacuación total a través de las etapas del proceso validadas acumulativas se mostró que es =10.5 logs para HIV- 1, =11.2 para HAV, >11.3 para BVDV y >18.9 logs para PPV.

UVC de Lote de 2-3 L Para evaluar completamente el sistema de UVC, se prepararon 4 lotes utilizando el nuevo proceso incluyendo todos los cambios del proceso combinados que incluyen el procesamiento con UVC (Tabla 16) .

Tabla 16. Por ciento de recuperación de IRX-2 durante UVC en la Escala Comercial Resultados : El tratamiento con UVC de lotes a escala de laboratorio producidos en la escala actual, 2-3.5 L mostraron menos pérdida detectable de la bioactividad de TNF- con un por .ciento medio de recuperación de bioactividad de TNF-a de 93% y 92% por ELISA, confirmando de esta manera los descubrimientos originales en los estudios de escala pequeña, específicamente que IRX-2 no es afectado por la irradiación de UVC bajo estas condiciones. Todas las otras citoquinas mediante ELISA o el bioensayo (CTLL-2) mostraron muy buena recuperación de las citoquinas de IRX-2 en una dosis de 100 J/m2 que efectivamente inactivo los virus no envueltos, HAV y PPV.

• El análisis de arreglo, Ray Biotech, de las citoquinas más comunes (Huang y colaboradores, 2001)- sobre IRX-2 del IRX-2 procesado con UVC reveló aspectos del producto de IRX-2 comparables enla composición de citoquina antes y después del tratamiento con UVC (FIGURA 19) .

Conclusión Los datos en la presente muestran que el proceso de IRX-2 es significativamente mejorado por la adición del proceso propuesto de la inactivación con UVC y se puede validar como un método de la inactivación viral. La adición de una etapa de inactivación cumple con los requerimientos reguladores y se adiciona a los métodos de inactivación/remoción viral robustos actualmente en el proceso de IRX-2. La estimación de esta operación unitaria y sus cambios muestra que los parámetros críticos se mantiene dentro de un intervalo de trabajo aceptable y que el proceso es capaz de proporcionar el producto que cumple sus especificaciones. Después de la inactivación con UVC, el producto en volumen de IRX-2 se puede congelar (mostrado en la FIGURA 20) y preparar para la distribución a los pacientes .

Por toda esta solicitud, varias publicaciones, incluyendo las patentes norteamericanas, son referenciadas por autor y año y las patentes por número. Las citas completas para las publicaciones se listan enseguida. Las descripciones de estas publicaciones y patentes en sus totalidades se incorporan en la presente por referencia en esta solicitud con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

La invención se ha descrito de una manera ilustrativa, y se va a entender que la terminología que se ha utilizado se propone para estar en la naturaleza de las palabras de descripción antes que de limitación.

Obviamente, muchas modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en vista de las enseñanzas anteriores. Por lo tanto, se va a entender que dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención se puede practicar de otra manera diferente de cómo es descrita específicamente .

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un método para hacer una sustancia biológica derivada de célula primaria, caracterizado porque incluye las etapas de: purificar células mononucleares (MNCs) para remover las células contaminantes al cargar leucocitos sobre el medio de separación de linfocitos (LSM) , y lavar y centrifugar el medio para obtener MNCs purificadas con un procesamiento de células automatizado y sistema de lavado; almacenar las MNCs durante la noche en un sistema de bolsa estéril cerrada; estimular una mezcla de inducción de las MNCs con un mitógeno y ciprofloxacina en un sistema de cultivo de células desechable y producir una sustancia biológica derivada de célula primaria de las MNCs; remover el mitógeno de la mezcla de inducción por filtración; incubar la mezcla de inducción; clarificar la mezcla de inducción al filtrar para obtener un sobrenadante biológico derivado de célula primaria ; remover el DNA del sobrenadante biológico derivado de célula primaria mediante la cromatografía de intercambio aniónico; y remover los virus del sobrenadante biológico derivado de célula primaria mediante filtración con filtros de 15 nanómetros dobles en serie.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de purificación es en donde la etapa de purificación además se define como la purificación de MNCs de múltiples donadores simultáneamente.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de purificación además se define como la centrifugación a 1500 a 3000 rpm durante 20 minutos' para optimizar la remoción de granulocitos y glóbulos rojos de la sangre.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la etapa de centrifugación además se define como la remoción de plaquetas a un nivel de abajo de 1.2 x 1010 células.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la etapa de producción además se define como la producción de IL-2 e IL-?ß en una relación de 10: 1.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de estimulación además se define como la estimulación de una mezcla de inducción de las MNCs con un mitógeno y 80 g/mL de ciprofloxacina .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de producción además se define como la producción de IRX-2 que incluye IL-1 ß, IL-2, e IFN-?.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la etapa de producción además se define como la producción de por lo menos 4 L de IRX-2.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la etapa de producción además se define como la producción de un concentrado de citoquina que se puede formular a 300-1800 pg/mL de IL-?ß, 4000-8000 pg/mL de IL-2, 1000-3800 pg/mL de IFN-? y 1000-4300 pg/mL de TNF-a.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la' etapa de remoción de mitógeno además se define como el lavado de la mezcla de inducción con solución, salina estéril, recuperación de MNCs y la suspensión de la MNCs en el medio de cultivo con 80 yg/mL de ciprofloxacina .

11. El método de conformidad con la reivindicación I, caracterizado porque la etapa de estimulación además se define como la estimulación de una mezcla de inducción de las MNCs con fitohemaglut inina (PHA) y ciprofloxacina .

12. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque la etapa de remoción de mitógeno además se define como la remoción del nivel de PHA a menor que <150 ng/mL.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de remoción de mitógeno además se define como la filtración en el modo de flujo tangencial .

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de incubación además se define como la incubación durante 24 horas.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de clarificación además se define como la clarificación de la mezcla de inducción por filtración con un filtro de 0.45 µp?.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de remoción de virus además se define como la .evacuación de arriba de 4 logio de virus.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de remoción de virus además se define como la evacuación de virus seleccionado del grupo que consiste de virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , hepatitis C (HCV) , hepatitis B (HBV) , virus T-linfotrópico humano (HTLV) , virus de simio 40 (SV40), parvovirus porcino (PPV), virus de pseudorrabia (PRV), hepatitis A (HAV) , virus de diarrea viral bovina (BVDV) , Sindbis, Reo y Adenovirus.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además incluye la etapa de limpiar el sobrenadante biológico derivado de célula primaria de agentes adventicios al aplicar ultravioleta-C (UVC) al sobrenadante biológico derivado de célula primaria.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa de aplicación de UVC además se define como el suministro de manera uniforme de UVC mediante el flujo en espiral del sobrenadante biológico derivado de célula primaria a lo largo de una fuente de irradiación de UVC.

20. El método de conformidad' con la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa de suministro de manera uniforme además se define como el suministro de manera uniforme de UVC en una longitud de onda de 254 nm de la sustancia biológica derivada de célula primaria.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la etapa de suministro de manera uniforme además se define como el suministro de manera uniforme de UVC en una dosis de hasta 150 J/m2.

22. Un método automatizado para purificar células, caracterizado porque incluye las etapas de: cargar las células en un procesador de células automatizado; lavar y centrifugar las células automáticamente; obtener las células purificadas.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque además incluye la etapa de ajusfar las especificaciones del procesador de células automatizado para escalar la cantidad de células purificadas.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la etapa de carga además se define como la carga de leucocitos sobre el medio de separación de linfocito (LSM) en el procesador de células automatizado.

25. Un método para inducir células, caracterizado porque incluye la etapa de: inducir las células en un sistema de cultivo de células escalable; y producir un producto celular.

26. El método, de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la etapa de producción además se define como la producción de citoquinas de IRX-2.

27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque las citoquinas además se definen como IL-?ß, 1L-2 e IFN-?. ·